DE10109259A1 - Verfahren zur Charakterisierung disseminierter und mikrometastasierter Krebszellen und Verwendung des Verfahrens zur in-vitro Diagnose von Krebs - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung disseminierter und mikrometastasierter Krebszellen mittels zytodiagnostischer und generalytischer Untersuchung unter Anwendung der Mikrodissektion und insbesondere der Lasermikrodissektion. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung dieses Verfahrens zur in-vitro Diagnose von Krebs.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung disseminierter und mikrometastasierter Krebszellen mittels zytodiagnostischer und genanalytischer Untersuchung unter Anwendung der Mikrodissektion. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung dieses Verfahrens zur in-vitro Diagnose von Krebs.

Die Isolierung und Charakterisierung von Zellen aus Körperflüssigkeiten ist eine Schlüsseltechnik in der Krebsfrühdiagnose und bildet die Voraussetzung für eine individuelle Therapieplanung (WO 99/10528). Da Tumore ab einem gewissen Stadium Zellen streuen, untersucht man z. B. Ausstriche aus Körperflüssigkeiten auf disseminierte und mikrometastasierte Krebszellen. So kann man krebsartige Gewebeveränderungen detektieren, bevor beispielsweise bildgebende Verfahren dazu in der Lage sind. Bekanntermaßen können Krebszellen aus Körperflüssigkeiten entweder über Immunadsorptionsverfahren oder bestimmte Siebtechniken aus Körperflüssigkeiten isoliert werden (WO 00/06702). Während erstere Verfahren in der Regel auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächenstrukturen und Antikörpern, z. B. Immunobeads, beruhen, nützen die Siebtechniken Größe und Gestalt von Krebszellen aus. Immunadsorptionsverfahren bringen häufig den Nachteil mit sich, daß auch unspezifisch bindende Zellen mit aufgereinigt werden, die dann in einer anschließenden Analyse einen "verunreinigenden Background" bilden können. Mit den Siebtechniken werden heterogene Krebszellgemische isoliert und die benötigte Menge an Ausgangsmaterial ist - wie bei der Immunadsorption - verhältnismäßig groß.

In jüngster Zeit bedient man sich in der molekularen Pathologie der Lasermikrodissektion (DE 196 16 216 A1), um aus Gewebeschnitten einzelne Zellen oder Zellareale herauszulösen. Diese Gewebeschnitte sind wie üblich entweder gefroren oder in Paraffin eingebettet (US-Patent 5,843,657).

In der klinischen Diagnostik werden Abstriche traditionell mit Hilfe der Papanicolaou-Färbung auf dysplastische Zellen untersucht. Da diese Untersuchung allerdings nur auf morphologischen Unterscheidungsmerkmalen aufbaut, ist es in der Regel extrem schwierig, wenn nicht gar unmöglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob sich die betreffende Zelle noch in einem Krebsvorstadium oder bereits in einem Krebsstadium befindet. Andere Arbeiten bedienen sich verschiedenster biochemischer oder molekularer Methoden, wie ELISA, Immunhistochemie, Flow Zytometrie, DNA-Laddering im Agarosegel, um beispielsweise Apoptose- und/oder Angiogenese- Marker zum primären Screening von Zervix-Dyspalsien zu messen (WO 99/24620) oder um anhand chromosomaler Abnormalitäten invasive Zervixkarzinome nachzuweisen (US-Patent 5,919,624). Dieses Screening erfolgt unabhängig von cytologischen Untersuchungen in der Regel an Gewebeschnitten, obwohl die für Papanicolaou-Proben verwendeten Fixationsbedingungen der Gewinnung und Amplifikation von mRNA aus diesen Proben nicht entgegenstehen sollen (Chuaqui R., et al.: Acta Cytologica 43/5 (1999) 831-836). Dies gilt auch für die Gewinnung und Untersuchung von DNA. Aus Papanicolaou-gefärbten Ausstrichen von Karzinom-Zellinie wurden einzelne anhand der Färbung sichtbar gemachte Zellen beliebig entnommen und auf eine k-ras- Mutation untersucht (Zhiqiang Zhang, et al.: Analytical and Quantitative Cytology and Histology 19/6 (1997) 514-518).

Bei Frauen gehören Zervixkarzinome zu den zweithäufigsten Tumoren weltweit. Neben anderen möglicherweise Einfluß nehmenden Faktoren wird angenommen, daß eine HPV-Infektion das auslösende Moment für eine Zervix-Karzinogenese sein kann. Bis zum invasiven Karzinom müssen dann allerdings weitere Ereignisse hinzutreten, welche die infizierten Zellen progressiv bis hin zum invasiven Stadium verändern. Für andere Karzinome gilt ähnliches.

Diese und ähnliche Beurteilungen, d. h. insbesondere eine Unterscheidung zwischen dysplatischen Zellen einerseits und präinvasiven bzw. invasiven Tumoren andererseits sicher vornehmen zu können und darüber hinaus einer dysplastischen Zellen eine prognostische Aussage zuordnen zu können, war Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Überraschenderweise fand man, daß die zytodiagnostisch unterstützte Isolierung einiger weniger Krebszellen aus Körperflüssigkeiten mittels Mikrodissektion eine entsprechende Charakterisierung von Krebszellen gewährleistet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Charakterisierung disseminierter und mikrometastasierter Krebszellen, wobei man

• - Zellen einer Körperflüssigkeit auf einen Träger aufbringt und in-situ zytodiagnostisch untersucht;
• - eine oder mehrere, im Vergleich zu Normalzellen zytodiagnostisch unterscheidbare Zelle(n) mittels Mikrodissektion abtrennt; und
• - an den abgetrennten Zellen wenigstens eine Genanalyse vornimmt.

Der Begriff Krebszelle steht erfindungsgemäß für eine Zelle, die eine oder mehrere mit Krebs, also Entartung im allgemeinen Sinn, in Zusammenhang stehende Modifikation aufweist. Grundlage dieser Definition ist die Vorstellung, daß es sich bei der Entstehung von Krebs um einen kontinuierlichen Veränderungsprozeß handelt. Beispielsweise bedarf es in der Regel mehrerer Veränderungen insbesondere des genetischen Materials bzw. der Expression des genetischen Materials von Zellen auf dem Weg von einer Normalzelle zu einer Krebs- und insbesondere einer Tumorzelle. Der Begriff Krebszelle umfaßt daher Zellen in einem Krebsstadium genauso wie Zellen im einem Krebsvorstadium, also auch Vorstufen von Krebs- und insbesondere Tumorzellen mit krebsartigen bzw. tumorösen Modifikationen. Disseminierte und mikrometastasierte Krebs- und insbesondere Tumorzellen, also Zellen, die sich vom Primärtumor abgelöst haben und in Körperflüssigkeiten zirkulieren, gelten nicht als eigentlicher Tumor im medizinischen Sinn, sie stellen aber die erfindungsgemäß zu charakterisierenden Krebszellen dar.

Der Begriff "disseminierte Krebszelle" definiert sich insbesondere im Verhältnis zu soliden Tumoren, also vor allem Primärtumoren, Metastasen und Rezidiven. Im Gegensatz zu soliden Tumoren können disseminierte Krebszellen im Körper eines Individuums zirkulieren. Dies geschieht in der Regel über körpereigene Transportorgane, vor allem Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut. In der Regel leiten sich disseminierte Krebszellen von einem soliden Tumor dadurch ab, dass sie zunächst Teil eines soliden Tumors, also insbesondere des Tumorgewebes, sind, von dem sie sich in Folge ablösen. Dadurch verlassen disseminierte Krebszellen den durch den soliden Tumor vorgegebenen Körperbereich, insbesondere die vom Tumor befallenen morphologischen Struktureinheiten, beispielsweise das Organ, und gelangen unter anderem an Orte, zu denen ausgehend vom soliden Tumor kein morphologischer Zusammenhang besteht.

Einem besonderen Aspekt zufolge sind disseminierte Krebszellen gekennzeichnet durch ihre relativ geringe Menge bezogen auf gleichermaßen vorhandene Nichtkrebszellen. Man bezeichnet sie daher auch als Restkrebszellen (minimal residual disease, kurz MRD). Betrachtet man beispielsweise zellhaltige Körperflüssigkeiten, so liegt der Anteil disseminierter Krebszellen in der Regel unterhalb von 1 : 1000, meist unterhalb von 1 : 10.000 und in vielen Fällen sogar unterhalb von 1 : 100.000, bezogen auf die Anzahl von Nichtkrebszellen einer zufällig gewonnenen Probe der Körperflüssigkeit. Im Falle von Blut gelten diese Verhältnisse insbesondere in bezug auf mononukleäre Zellen (kurz: MNC).

Unter Charakterisierung werden erfindungsgemäß all jene Maßnahmen verstanden, die an Zellen von Säugern und insbesondere von Menschen durchgeführt werden können, um ein, zwei, drei, vier, fünf, 6 bis 10, 11 bis 20 oder mehr krebsspezifische und/oder krebsassoziierte Gene dieser Zellen qualitativ oder quantitativ zu erfassen. Zur Charakterisierung gehören erfindungsgemäß auch zytodiagnostische Untersuchungsmaßnahmen. Aufgrund der durch die Charakterisierung gewonnenen Ergebnisse kann dann die Identifizierung der Zellen vorgenommen werden. Dies umfaßt erfindungsgemäß nicht nur den qualitativen Nachweis von zirkulierenden Krebszellen, sondern kann auch deren Quantifizierung und/oder Angaben über deren Herkunft und Verhalten, beispielsweise bezüglich der Metastasenbildung oder bei verschiedensten, beispielsweise cytotoxischen Therapieansätzen beinhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf all diejenigen zellhaltigen Körperflüssigkeiten angewendet werden, die disseminierte und mikrometastasierte Krebszellen aufweisen. Dies sind sowohl native Körperflüssigkeiten, die dem Körper entnommen werden oder von diesem ausgeschieden werden, als auch nichtnative Flüssigkeiten, insbesondere Waschflüssigkeiten, die Zellen aus dem Körper und insbesondere bestimmten Körperteilen und Organen enthalten. Beispielsweise kann man die Flüssigkeit in geeigneter Weise dem Körper zunächst zuführen und dann wieder entnehmen. Auch können native mit nichtnativen Flüssigkeiten versetzt sein. Zu nennen sind beispielsweise Blut, Knochenmark, Lymphe, Urin, Sputum, Pankreassekret, Ascites, Ergüsse, Fruchtwasser, Punktate, Waschflüssigkeiten von Organen, z. B. Colon-, Lungen-, Bronchiallavage oder Blasenspülflüssigkeit, Fäces, Aphereseprodukte, Abstriche, insbesondere von Zervix und Schleimhaut, z. B. Mundschleimhaut. Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf die Untersuchung von Abstrichen, insbesondere Zervixabstrichen, gerichtet. Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung untersucht man Waschflüssigkeiten von Organen, insbesondere Colon-, Lungen-, Bronchiallavage oder Blasenspülflüssigkeit. Die Untersuchung von Blut, Knochenmark bildet einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Es kann sich um Körperflüssigkeiten von Säugern, insbesondere Menschen, Nutz- und Haustieren, Labor- und Versuchstieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, etc. und anderen Species handeln.

Derartige Körperflüssigkeiten können direkt auf den Träger aufgebracht werden. Vielfach ist es allerdings von Vorteil, die zellhaltige Körperflüssigkeit zunächst einer vorbereitenden Aufarbeitung zu unterziehen. So kann man beispielsweise zelluläre von nicht-zellulären Bestandteilen trennen. Auch die zellulären Bestandteile können - mit oder ohne Krebszellanreicherung - noch weiter aufgetrennt werden, indem man beispielsweise eine zelihaltige Fraktion isoliert, in der bekanntermaßen Krebszellen mitenthalten sind. Zu diesem Zweck bieten sich vor allem physikalischen Trennverfahren wie die Dichtegradientenzentrifugation oder auch die eingangs angesprochenen Siebtechniken an.

Der verwendete Träger weist in der Regel eine glatte, vorteilhafterweise planare Oberfläche auf. Das Trägermaterial ist zweckmäßigerweise lichtdurchlässig und erforderlichenfalls gegen einen Laserschnitt resistent. Darüber hinaus sollte das Material unter den Anwendungsbedingungen im wesentlichen inert sein, vor allem im Hinblick auf die zur Zytodiagnostik eingesetzten Reagenzien. Brauchbare Trägermaterialien sind daher vor allem färbegängig. Bevorzugte Materialien sind Glase und lichtdurchlässige Kunststoffe. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet man dünne Glas-Objektträger.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Träger einen Zwischenträger auf, der mit dem Träger verbunden und zumindest teilweise von diesem abgelöst werden kann. Insbesondere kann es sich um einen folienbeschichteten Träger handeln. Soweit vorhanden, dient dieser Zwischenträger einerseits zur Aufnahme der Probe, andererseits im Rahmen der anschließenden Abtrennung zum Transfer der abzutrennenden Zellen. Demnach ist der Zwischenträger auf den Träger aufgelegt und gegebenenfalls an diesem befestigt. Teile dieses Zwischenträgers und insbesondere diejenigen Teile, deren Oberfläche mit den abzutrennenden Zellen in Kontakt steht, können vorteilhafterweise mittels Laserschnitt abgetrennt und entnommen werden.

Die Anforderungen an geeignete Zwischenträgermaterialien ergeben sich aus obigen Zweckbestimmungen, insbesondere unter dem Aspekt der Probenaufnahme, der cytodiagnostischen Untersuchung, der Mikrodissektion und insbesondere der Lasermikrodissektion sowie der Genanalyse. So sind geeignete Zwischenträgermaterialien unter den Anwendungsbedingungen im wesentlichen inert. Sie sind färbegängig, insbesondere führt der Einsatz von Färbereagenzien weder zum unspezifischen Ablösen des Zwischenträgers vom Träger, noch zu einer Veränderung der Materialeigenschaften des Zwischenträgers. Vorteilhafterweise bilden sie ein stabiles Rückgrat für die Probe. Dazu ist es von Vorteil, daß die Zellen am Zwischenträgermaterial haften, nicht aber durch dieses in ihren Eigenschaften beeinflußt werden. Geeignete Zwischenträgermaterialien sind lichtdurchlässig und können erforderlichenfalls vom Laser geschnitten werden. Mit Blick auf die anschließende Genanalyse ist es von Vorteil, daß Zwischenträgermaterialien verwendet werden, welche die erforderliche Analytik, insbesondere einen gegebenenfalls erforderlichen Zellaufschluß und vor allem Amplifikationsreaktionen genetischen Materials, insbesondere die PCR, nicht beeinträchtigen. Besonders vorteilhaft sind Zwischenträgermaterialien, auf denen die Zellen kultiviert werden können.

Geeignete Materialien sind dem Fachmann bekannt und werden in Zusammenhang mit der Mikrodissektion und insbesondere der Lasermikrodissektion kommerziell angeboten. Beispielsweise kann man bestimmte Kunststoffe verwenden. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet man Polyesterfolien.

Zytodiagnostische Untersuchungen im erfindungsgemäßen Sinne sind diejenigen Untersuchungen, die man zweckmäßigerweise vor der Mikrodissektion vornimmt. Es handelt sich also insbesondere um Untersuchungen zur Auswahl der mittels Mikrodissektion abzutrennenden Zellen. Diese Untersuchungen ermöglichen eine Unterscheidung einzelner in der Probe vorhandener Zellen und, aufgrund der räumlichen Festlegung dieser Zellen, deren gezielte Auswahl und Abtrennung. Die Unterscheidung der Zellen erfolgt insbesondere optisch. Dabei können die optischen Informationen beispielsweise von einem Betrachter oder von Bilderkennungssystemen aufgenommen und ausgewertet werden. Da zur Auswahl einzelner oder weniger Zellen deren Auflösung erforderlich ist, verwendet man zweckmäßigerweise ein optisches Vergrößerungsmittel, insbesondere ein Mikroskop, bzw. hochauflösende Bilderkennungssysteme. Je nach Art der aufzunehmenden optischen Information kann ein solches Vergrößerungsmittel unterschiedlich ausgelegt sein, beispielsweise als Hellfeld-Mikroskop, Dunkelfeld-Mikroskop, Phasenkontrast-Mikroskop, Reflektionskontrast-Mikroskop, Elektronenmikroskop, Fluoreszenz-Mikroskop, Laserscanning- Mikroskop, CCD-Kamera, etc.

Die Art der aufzunehmenden und auszuwertenden optischen Information hängt im wesentlichen von der Art der zytodiagnostischen Untersuchung ab.

Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung berücksichtigt man morphologische und topologische Kriterien zur Beurteilung des Zelltyps. Zur geeigneten Darstellung der Zellen werden insbesondere bestimmte Färbe- und/oder Markierungstechniken verwendet.

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung führt man Funktionsassays an den Zellen durch und gewinnt so Informationen über den Zustand der zytodiagnostisch untersuchten Zellen.

Brauchbar sind vor allem diejenigen Färbungen, die eine differenzialdiagnostische Aussage über Normalzellen einerseits und Krebszellen andererseits zulassen. Bevorzugt sind die Hämatoxylin- Eosin-Färbung, Feulgen-Färbung, insbesondere als Kernfärbung, Mai-Grünwald-Giemsa-Färbung, insbesondere für Knochenmark, Papanicolaou-Färbung, insbesondere für gynäkologische Abstriche und vor allem für Zervixabstriche, Giemsa-Färbung, insbesondere für lymphatische Zellen.

In vorteilhafter Weise können zwei oder mehrere zytodiagnostische Untersuchungen miteinander kombiniert werden, z. B. Hämatoxylin-Eosin oder Papanicolaou-Färbung mit immunhistologischer Färbung.

Markierungen können beispielsweise proteinchemisch oder nukleinsäureanalytisch vorgenommen werden.

Geeignete proteinchemische Markierungsmethoden basieren vor allem auf der Verwendung markierter Antikörper. Über die Antikörperspezifität lassen sich gezielt einzelne Zellbestandteile, vor allem bestimmte zelluläre Proteine und insbesondere Oberflächenproteine, soweit vorhanden, detektieren. Insbesondere brauchbar sind in diesem Zusammenhang die bekannten immunzytochemischen Methoden zur Identifizierung von Krebszellen.

Nukleinsäureanalytische Markierungsmethoden beruhen vor allem auf der Verwendung bestimmter Nukleinsäuresonden, die mit dem genetischen Material der zytodiagnostisch zu untersuchenden Zellen gegebenenfalls hybridisieren. Wegen der erfindungsgemäßen Anordnung finden hier vor allem in-situ Hybridisierungstechniken Anwendung. Beispielsweise können spezifische Gensonden, wie Sonden zur Bewertung von Amplifikationen (z. B. erbB2), zur Darstellung von Translokationen, zur Darstellung von chromosomalen Aberrationen, beispielsweise über eine CGH-Analyse, u. ä. verwendet werden.

In bestimmten Fällen kann es auch von Vorteil sein, proteinchemische und nukleinsäureanalytische Markierungsmethoden zu kombinieren, beispielsweise einen immunzytochemischen Nachweis mit einer in-situ Hybridisierung.

Die im Rahmen dieser Markierungstechniken zu verwendenden Markierungen sind hinlänglich bekannt. Neben radioaktiven Markierungen sind nicht radioaktive Markierungen, insbesondere fluoreszierende, chemilumineszierende oder enzymatische Markierungen, bevorzugt. Zu den fluoreszierenden Markierungen gehören beispielsweise AMCA, Fluoreszein, CY3, Rhodamin, Texas Red, etc. Zur enzymatischen Markierung gehört vor allem die Umsetzung geeigneter Substrate durch Peroxidasen oder alkalische Phosphatasen, die in der Regel zu colorimetrisch oder fluoreszenzanalytisch bestimmbaren Produkten führen. Dabei können die immunzytochemisch eingesetzten Antikörper bzw. die nukleinsäureanalytisch verwendeten Nukleinsäuresonden diese Markierungen direkt tragen; sie können aber auch geeignete Bindungspartner aufweisen, die wiederum von komplementären, markierten Bindungspartnern erkannt werden können. Zu diesen indirekten Systemen gehören beispielsweise Digoxigenin und anti-Digoxigenin-Antikörper, Biotin und Avidin, Streptavidin oder Extravidin. Insbesondere ermöglicht die große Auswahl an verschiedenen Markierungen die Durchführung unterschiedlicher proteinchemischer und/oder nukleinsäureanalytischer Untersuchungen an ein und derselben Probe, gewünschtenfalls an ein und derselben Zelle.

Erforderlichenfalls kann der in-situ Hybridisierung eine Amplifikationsreaktion, insbesonder eine PCR und vor allem eine in-situ PCR vorausgehen. Beispielsweise kann die Durchführung einer DOP-PCR oder PEP-PCR zur Vorbereitung einer CGH nützlich sein.

Die zytodiagnostische Untersuchung erfolgt erfindungsgemäß in-situ. Der Begriff "in-situ" bezieht sich auf den Zustand des Untersuchungsobjekts und meint Untersuchungen an morphologisch erhaltenen (intakten) Zellstrukturen, beispielsweise Zellverbänden, Zellen, Zellorganellen oder Chromosomen. Je nach Art der anzuwendenden zytodiagnostischen Untersuchung können die Zellen einer zu untersuchenden Körperflüssigkeit auf den Träger aufgebracht und unmittelbar untersucht werden. In der Regel ist aber zunächst eine zweckmäßige Vorbehandlung erforderlich, nämlich insbesondere dann, wenn sich diejenigen Strukturen, die sichtbar gemacht werden sollen, im Inneren der Zellen befinden. Zwecks Färbung kann man die Zellen in üblicher Art und Weise fixieren, beispielsweise mit Ethanol für Papanicolaou-Färbungen, oder auf andere Art und Weise permeabilisieren, beispielsweise durch den Einsatz von Detergentien wie Triton X100 oder SDS, endogene Enzyme inaktivieren, eine RNAse-Behandlung zur Entfernung endogener RNA vornehmen, mit HCl behandeln, Protease-Behandlungen durchführen, chromosomale DNA bei möglichst geringen morphologischen Veränderungen denaturieren, u. ä.

Zweckmäßigerweise wird unter einer zytodiagnostisch unterscheidbaren Zelle erfindungsgemäß eine Zelle verstanden, die sich aufgrund der verwendeten zytodiagnostischen Untersuchung(en) von einer Normalzelle unterscheiden läßt. Hierzu gehören insbesondere genetisch veränderte Zellen (innerhalb einer Population von Normalzellen), hyperplastische Zellen, dysplatische Zellen, präinvasive Karzinomzellen und invasive Karzinomzellen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine zytodiagnostisch unterscheidbare Zelle eine dysplastische Zelle, womit eine Zelle gemeint ist, die sich aufgrund ihrer Morphologie von einer Normalzelle unterscheiden läßt. Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine zytodiagnostisch unterscheidbare Zelle eine HPV-infizierte Zelle, die gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform auch dysplastisch ist. Besondere Vorteile bietet das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf die Charakterisierung PapIIID- klassifizierter Zellen.

Kriterien für die Einordnung einer Zelle als dysplastische Zelle sind beispielsweise das Kern- Plasma-Verhältnis, eine Anisonukleose, ein heterochromatischer Kern, eine Aneuploidie und eine Koilozytose. Diese Kriterien lassen sich zweckmäßigerweise mit einer Papanicolaou-Färbung oder einer Eosin-Hämatoxylin-Färbung untersuchen.

Zu den Kriterien gehören auch das Auftreten von Proliferationsmarkern, z. B. Ki-67, PCNA, Metastasierungsmarkern, z. B. MUCI, und Angionesefaktoren, z. B. bFGF, bFGFR. Diese Kriterien können beispielsweise mit geeigneten immunzytochemischen Methoden untersucht werden.

Zu geeigneten Kriterien gehören auch Genomveränderungen, beispielsweise Amplifikationen von c-erbB2, c-myc oder Cyklinen. Diese Kriterien können beispielsweise mit zytogenetischen Methoden und insbesondere nukleinsäureanalytisch untersucht werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die auf den Träger aufgebrachten Zellen kultiviert. Zu diesem Zweck sind dem Fachmann geeignete Kulturmedien genauso bekannt wie die Einstellung der übrigen Kulturparameter. Beispielsweise kann man Zellen aus einer Körperflüssigkeit zunächst durch Zentrifugation abtrennen und die so gewonnenen Zytospins auf den Träger aufbringen und unter geeigneten Bedingungen kultivieren. Darüber hinaus lassen sich die Kulturbedingungen gezielt variieren, und so der Einfluß bestimmter Kulturbedingungen auf die Zellen beurteilen. Beispielsweise kann man Wirkstoffe, insbesondere Zytostatika, zusetzen, und so eine Aussage über die Reaktion einzelner Zellen auf den Wirkstoff treffen.

Das Verhalten der Zellen in Kultur, d. h. insbesondere deren Zustand und gegebenenfalls deren Reaktion auf bestimmte Kulturbedingungen, z. B. auf bestimmte Wirkstoffe, wird vorzugsweise anhand von Bioassays bewertet. Beispielsweise können apoptische und nekrotische Zellen anhand der Bindung von markiertem Annexin erkannt werden. Die Unterscheidung zwischen apoptischen und nekrotischen Zellen gelingt beispielsweise durch DNA-interkalierende Farbstoffe, die nur in Kerne nekrotischer Zellen, nicht aber apoptischer Zellen eindringen können. Sofern im Anschluß an eine Kultivierung und gegebenenfalls vorgenommener Bioassays weitere zytodiagnostische Untersuchungen durchgeführt werden, können die Zellen in der oben beschriebenen Art dazu vorbereitet, beispielsweise fixiert werden.

Auf Basis der zytodiagnostischen Untersuchungsergebnisse können dann Zellareale, d. h. Zellgruppen, einzelne Zellen oder Teile von Zellen, z. B. Chromosomen, für die weitere molekularbiologische Charakterisierung ausgewählt werden. Zweckmäßigerweise werden für diese molekularbiologische Analyse die ausgewählten Zellen von weiteren Zellen abgetrennt. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung trennt man dysplastische Zellen oder dysplastische Zellen umfassende Zellareale ab.

Die Abtrennung erfolgt erfindungsgemäß mittels Mikrodissektion. Darunter versteht man die gezielte Entnahme einer oder mehrerer Zellen eines bestimmten Bereichs der Trägeroberfläche. Zu diesem Zweck können Mikronadeln, Mikrokapillaren oder ein Laser, z. B. ein UV-Laser, eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, interessierende Zellverbände mit einem Infrarot- Laser auf einen geeigneten Zwischenträger, beispielsweise eine thermoplastische Folie, aufzuschmelzen und die gewonnenen Areale dann zu entnehmen.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schneidet man bestimmte Bereiche eines Zwischenträgers und mit ihnen die in diesen Bereichen auf der Oberfläche des Zwischenträgers sich befindenden Zellen oder Zellbestandteile heraus. Der Schnitt wird vorzugsweise mit einem Laser ausgeführt (Lasermikrodissektion). Die herausgeschnittenen Bereiche können dann entnommen werden, beispielsweise mit einem Mikromanipulator gepickt werden. Zellen oder Zellbestandteile, welche die nachfolgende Genanalyse beeinträchtigen könnten, können vor dem Herausschneiden selektiv mit Hilfe des Lasers zerstört werden. So können beispielsweise Areale mit dysplastischen Zellen von Normalzellen befreit werden.

Eine zur Durchführung dieser bevorzugten Ausführungsform geeignete Vorrichtung verwendet beispielsweise einen Stickstofflaser von vorzugsweise hoher Strahlqualität, der durch den Auflichtfluoreszenzstrahlengang ins Mikroskop eingekoppelt werden kann. Zweckmäßigerweise sind UV-Laser-Mikrostrahl, Mikroskoptisch und Mikromanipulator miteinander kombiniert und vorteilhafterweise computergesteuert miteinander koordiniert. Geschwindigkeiten von wenigen 100 nm bis zu mehreren µm pro Sekunde garantieren eine hochpräzise Objektpositionierung. Laserfokuslage und optischer Fokus des Mikroskops stimmen dabei möglichst exakt überein. Ein Gerät dieser Art kann beispielsweise von der Firma SL Mikrotest, Jena bezogen werden.

Je nach Menge des abgetrennten Zellmaterials und Art der am abgetrennten Zellmaterial durchzuführenden Genanalysen kann es zweckmäßig sein, zunächst eine Amplifikation des genomischen Materials durchzuführen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Techniken bekannt.

Beispielsweise kann man zur gleichmäßigen, zufällig verteilten Amplifikation von DNA degenerierte Oligonukleotid-Primer verwenden (DOP-PCR). Brauchbare Primer besitzen definierte Sequenzen an den 5'-Enden und an den 3'-Enden, jedoch Random-Hexamer-Sequenzen zwischen den beiden definierten Sequenzen. Die Random-Hexamer-Sequenzen spiegeln alle möglichen Kombinationen der natürlich vorkommenden Nukleotide A, G, C und T wider. DOP-PCR-Primer werden bei niedriger Stringenz an die denaturierte Templat-DNA annealed. Sie hybridisieren in statistisch verteilter Weise mit der Templat-DNA. Die etwa 5 ersten Zyklen werden bei niedriger Stringenz durchgeführt, die restlichen etwa 35 Zyklen hingegen bei stringenteren Bedingungen, d. h. höheren Annealing-Temperaturen. Dies führt zu einer präferentiellen Amplifikation derjenigen Sequenzen, die unter weniger stringenten Bedingungen amplifiziert worden sind. Die Optimierung einzelner Parameter liegt im Bereich fachmännischen Könnens. Kits mit Mitteln zur Durchführung der DOP-PCR sind kommerziell erhältlich.

Ähnliche zur Genomamplifikation brauchbare Techniken sind die PEP-PCR (Primer Extension Preamplification PCR) und die SIA (Sequence Independent Amplification).

Sowohl für die Genomamplifikation als auch für die anschließenden Genanalysen ist es von Vorteil, Zellen zunächst aufzuschließen. Dies kann in üblicher Weise erfolgen, beispielsweise mit einem Proteinase-K-Verdau.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die mittels Mikrodissektion abgetrennten Zellen oder Zellbestandteile (nachfolgend Dissektate genannt) zunächst weiteren Aufarbeitungsmaßnahmen zugeführt, bei denen die Zellen in der Regel aufgeschlossen und gegebenenfalls bestimmte Bestandteile dieses Aufschlusses aufgereinigt werden.

Zur Isolierung genomischer DNA kann man die Zellen, beispielsweise unter Einwirkung von Detergentien und/oder Proteinasen, lysieren, Proteine entfernen und die DNA, beispielsweise durch Ausfällen mit bekannten organischen Lösungsmitteln, isolieren. Verfahren auf Basis von Guanidinisothiocyanat und Phenol enthaltenden Lösungen werden bevorzugt. Auch eine chromatographische Aufreinigung, d. h. eine Trennung von Nukleinsäuren und anderen Zellbestandteilen und/oder eine Trennung von Nukleinsäuren unterschiedlicher Art, beispielsweise mittels Extraktion an festen Phasen, wie Silikaten und ähnlichem, z. B. mit handelsüblichen Spin- Säulen, kann sinnvoll sein. Weitere bekannte Methoden, wie Sondentechniken, Elektrophorese, Elektroosmose, osmotischer Schock, können zweckmäßig sein. Ähnliche Verfahrensmaßnahmen finden bei der Isolierung von Gesamt-RNA Anwendung. Aus dieser Gesamt-RNA kann wiederum mRNA isoliert werden, indem man z. B. auf Oligo-(dT) basierende Systeme verwendet. Die Wahl eines zweckmäßigen Protokolls unterliegt fachmännischem Wissen.

Wird ein Zwischenträger verwendet, der auch Teil des Dissektats ist, so ist es erfindungsgemäß bevorzugt, das Material des Zwischenträgers in die Aufschlußreaktion und gegebenenfalls auch in die Genomamplifikation und die Genanalyse mit einzubeziehen.

Die isolierten Nukleinsäuren können dann zur weiteren Identifizierung und Charakterisierung in einer Vielzahl von Applikationen eingesetzt werden. Hierzu gehören beispielsweise die PCR, RT- PCR, DD-RT-PCR, cDNA-Synthese, insbesondere mittels der SMART-Technologie, Primerextension, restriktionsenzymatische Verdauung, Southern-Blotting, Markierungs- und Modifizierungsreaktionen, Northern-Blotting, Klonierung, Sequenzierung, in vitro-Transcription oder in vitro-Translation. Einige der vorstehend genannten Applikationen können auch an einer oder wenigen Zellen ohne vorherige Isolierung von Nukleinsäuren vorgenommen werden, insbesondere die RT-PCR. Die Wahl einer geeigneten Applikation hängt nicht nur von der Art der Nukleinsäure, sondern auch von der genetischen Information ab, anhand derer die Krebszellen identifiziert und charakterisiert werden sollen.

Eine Genanalyse im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf jede dem Fachmann erdenkliche Art und Weise vorgenommen werden und beinhaltet insbesondere die Untersuchung auf krebsspezifische und/oder krebsassoziierte Gene sowie Drug-Target-assoziierte Gene. So kann ein erfindungsgemäßes Gen auf DNA-Ebene, auf RNA-Ebene und/oder auf Proteinebene untersucht werden. Auf DNA-Ebene untersucht man vorzugsweise genomische DNA auf Mutationen, Amplifikationen, LOH's, Translokationen und/oder Polymorphismen. Auf RNA-Ebene und auf Proteinebene untersucht man Expressionsprodukte, nämlich vorzugsweise Transkriptionsprodukte wie mRNA bzw. Translationsprodukte wie Proteine. Diese Untersuchungen können das Erstellen von Expressionsprofilen und Proteinfingerprints umfassen. Bevorzugt sind Methoden, mit deren Hilfe die Beteiligung eines Gens am Zustand dissemininierter und mikrometastasierter Zellen zum Untersuchungszeitpunkt bewertet werden kann, z. B. die Untersuchung von mRNA insbesondere im Hinblick auf die in einer Zelle vorhandene Menge an einer bestimmten mRNA. Beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren eine Untersuchung einer Körperflüssigkeit auf Proteine, so handelt es sich insbesondere um diejenigen, die von den krebsspezifischen und/oder krebsassoziierten Genen exprimiert werden. Das Erstellen von Proteinfingerprints stellt eine besondere Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung dar. Im folgenden wird, sofern nichts anderes angegeben ist, umfassend von einer Genanalyse oder einer Untersuchung von Gene gesprochen.

Erfindungsgemäß wird zwischen krebsspezifischen und krebsassoziierten Genen unterschieden. Krebsspezifisch im erfindungsgemäßen Sinn sind solche Gene, anhand derer sich eine zirkulierende Krebszelle als solche erkennen läßt. Krebsassoziierte Gene dagegen sind nicht spezifisch für Krebszellen. Sie können auch in gesunden Zellen oder bei einer Vielzahl verschiedener anderer Erkrankungen, beispielsweise Entzündungen, exprimiert werden. Allerdings kann deren Expression in Krebszellen im Vergleich zu Nichtkrebszellen charakteristisch moduliert sein, so daß weitere Rückschlüsse auf die Art und das Verhalten der Krebszellen möglich sind.

In diesem Sinn ist es natürlich auch möglich, daß ein bestimmtes Gen sowohl zur krebsspezifischen als auch krebsassoziierten Charakterisierung beitragen kann. Beispielsweise kann ein Gen eine Mutation aufweisen, die zur anomalen Expression eines zellzyklus-regulierenden Proteins und infolgedessen zur Entartung der betroffenen Zelle führt. Dieses mutierte Gen ist daher krebsspezifisch und die erfindungsgemäße Untersuchung auf den Nachweis dieses mutierten Gens dient zur krebsspezifischen Charakterisierung. Darüber hinaus kann eine Analyse der anomalen Expression dieses Gens auch zur krebsassoziierten Charakterisierung beitragen, da Art oder Menge entsprechender Expressionsprodukte für den Zellzyklus von Bedeutung sind und dadurch weitere Rückschlüsse auf die Art und das Verhalten der Krebszellen möglich sind.

Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung daher auch ein Verfahren zur Charakterisierung disseminierter und mikrometastasierter bzw. metastasierender Krebszellen anhand von DNA und/oder RNA, wobei man aus Körperflüssigkeit eines Individuums erfindungsgemäß dissektierte Zellen anhand von DNA und/oder mRNA auf wenigstens ein krebsspezifisches und/oder ein krebsassoziiertes Gen untersucht und gewünschtenfalls die gleiche Untersuchung mit Nichtkrebszellen desselben Individuums zum Vergleich durchführt. Vorzugsweise führt man eine multiple Charakterisierung durch, d. h. man führt wenigstens zwei Genanalysen durch, die unterschiedliche Parameter betreffen (Multiparameteranalyse). Dabei kann ein und dasselbe Gen auf verschiedene Art und Weise untersucht werden, beispielsweise anhand von DNA und RNA oder auf Mutationen und LOH's etc. Vorzugsweise werden wenigstens 2, 3, 4, 5, 6 bis 10 oder 10 bis 20 verschiedene Gene in die Untersuchung miteinbezogen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden wenigstens eine Genanalyse, die einen frühen Marker betrifft, und wenigstens eine Genanalyse, die einen späten Marker betrifft, vorgenommen. Frühe Marker sind Veränderungen des genetischen Materials, die auch in Krebsvorstadien gefunden werden, während beim Vorliegen später Marker von einem Krebsstadium auszugehen ist. Insbesondere bieten sich als Untersuchungen auf späte Marker LOH- Analysen mit Hilfe von krebsartspezifischen Mikrosatelliten an, während als frühe Marken Instabilitäten in den entsprechenden Mikrosatelliten untersucht werden können. Demnach betrifft diese Ausführungsform eine wenigstens 2 Parameter (Marker) umfassende Genanalyse.

Als späten Marker untersucht man insbesondere einen oder mehrere folgender Parameter:
LOH's der Gene p53, DCC, APC, p16 und RB, LOH-Analysen mit Hilfe von krebsartspezifischen Mikrosatelliten, sowie Amplifikationen des Gens c-myc, insbesondere in Zusammenhang mit Zervixkarzinomen; p53-Mutationen, insbesondere in Zusammenhang mit Colonkarzinomen; 11q13- Amplifikation (Cyclin D1), RB-LOH, p53-Muationen, 6p-, 8p-, 4q-LOH (D8S166, D4S1573), insbesondere in Zusammenhang mit Hals- und Kopftumoren; LOH der Loci 1p, 6p, 8p, 11p, 13q, 16q, 17p, 17q, insbesondere in Zusammenhang mit Brusttumoren.

Als frühen Marker untersucht man insbesondere einen oder mehrere folgender Parameter:
Läsionen auf Chromosom 5, z. B. D5S208, D5S432, D5S392, D5S117 und D5S406, insbesondere in Zusammenhang mit Zervixkarzinomen; APC-LOH, k-ras-, z. B. Codon 12-Mutationen, DCC-LOH und DPC4-LOH, insbesondere in Zusammenhang mit Colonkarzinomen; p16-LOH (D9S171, D9S126), 3p-LOH (D3S1067), 17p-LOH (D17S122), D2S123-, D4S1573- Mikrosatelliteninstabilität, insbesondere in Zusammenhang mit Hals- und Kopftumoren; weitere Mikrosatelliteninstabilitäten, insbesondere bei Brusttumoren.

Unabhängig von und auch zusätzlich zur Charakterisierung anhand von DNA und/oder RNA kann man am erfindungsgemäßen Krebszellmaterial auch Proteine, Zucker, Glykosylierungsstrukturen, Ribozyme und ähnliches untersuchen, um disseminierte und mikrometastasierte bzw. metastasierende Krebszellen zu charakterisieren.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vorzugsweise eine oder mehrere der folgenden Genanalysen vorgenommen:

• - Krebsspezifische Mutations- und Amplifikationsanalysen von Onkogenen und Tumorsupressorgenen, beispielsweise k-ras, p53-Mutationen, c-myc-Amplifikationen, erbB2- Amplifikationen, Translokationen t(6; 11), Inv16, t(9; 11), t(8; 21) sowie t(14; 18) und t(11; 14) insbesondere bei Leukämien und weitere in der WO 99/10528 beschriebenen Gene, auf die hier Bezug genommen wird, sowie SNP-Analysen;
• - Krebsspezifische LOH-Analysen von Tumorsupressorgenen und Mikrosatelliten, beispielsweise Zervixkarzinom-spezifische wie D5S208, D5S406, D5S392, D5S432;
  Hals- und Kopftumoren-spezifische wie D4S1573, D3S1067, mithin auch Untersuchungen der Mikrosatelliteninstabilität als Prognosefaktor;
  P16-LOH wie D9S171, D9S126;
  Mammakarzinom-spezifische LOH's, wie D16S265, D11S528, D17S695, D17S926, D17S849, D17S960;
  Blasekarzinom-spezifische LOH's wie D4S171, D4S408, D4S1546;
  Lungenkarzinom-spezifische LOH's: D5S299, D5S346, D2S1245, FHIT, PYGM;
  Kolonkarzinom-spezifische LOH's wie D2S123, D17S250;
  Pankreaskarzinom-spezifische LOH's wie DPC-4;
  sowie die in der WO 99/10528 beschriebenen Gene, auf die hiermit Bezug genommen wird;
• - Krebsspezifische mRNA-Analysen, z. B. tumoröse mRNAs, wie MUC-1-Spleiß-Varianten und morphogene mRNAs, wie Maspin, HCG, Motilin und weitere beispielsweise in der WO 99/10528 beschriebenen Gene, auf die hier Bezug genommen wird;
• - Krebsassoziierte mRNA-Analysen metastasierungs-, zellzyklus-, proliferations-, apoptose-, chemoresistenz- und chemotherapieassoziierter Gene, beispielsweise den in der WO 99/10528 beschriebenen mRNAs und Proteine, insbesondere Analysen tumorbiologisch-relevanter RNA's und Proteine, die das Metastasierungsprofil, d. h. die Expression von Angionese-, Motilitäts-, Adhäsions- und Matrixdegradations-Molekülen, wie bFGF, bFGF-R, VEGF, VEGF-R's, wie VEGF-R1 oder VEGF-R2, E-Cadherin, Integrine, Selectine, MMP's, TIMP's, SF, SF-R u. ä., das Zellzyklus- bzw. Proliferationsprofil, wie Cycline (z. B. das Expressionsverhältnis von Cyclin D, E und B), Ki67, P120, p21, PCNA u. ä., oder das Apoptose-Profil, wie FAS (L+R), INF (L+R), Perform, Granzyme B, BAX, bcl-2, Caspase 3 u. ä. btreffen;
• - krebsassoziierte mRNA- und Protein-Analysen in Zusammenhang mit einer immunologischen Therapie oder Gentherapie;
• - Nachweis gentherapeutisch veränderter Zellen, z. B. über den Nachweis mittels Gentransfer eingebrachter Vektoren;
• - Drug-Target-Analyse, z. B. die Untersuchung von Drug-Target-assoziierten Genen, die oder deren Produkte je nach genetischer Disposition mit Wirkstoffen wechselwirken, insbesondere in gewünschter Weise wirken oder nicht.

Vorteilhafterweise kann zu den vorstehend beschriebenen Genanalysen eine Vergleichsanalyse an cytodiagnostisch unterscheidbaren Zellen, insbesondere Normalzellen, derselben Körperflüssigkeit zum Vergleich durchgeführt werden. Dies gilt vor allem für LOH-Analysen und Amplifikationsanalysen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in-vitro Diagnose von Krebs.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich unabhängig vom Stadium eines Krebses anwenden. Es kann allein oder in Kombination mit anderen Krebsdiagnoseverfahren, wie bildgebenden oder auf herkömmlichen Tumormarkern basierenden Verfahren, eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Früherkennung, beim Auftreten erster Warnzeichen für Krebs oder beispielsweise nach einer Therapie eines Krebses zur Rezidiv-Früherkennung eingesetzt werden. Es eignet sich zur Charakterisierung und Identifizierung sämtlicher Krebsformen, soweit entsprechende disseminierte und/oder mikrometastasierte Krebszellen in den untersuchten Körperflüssigkeiten vorhanden sind. Hierzu gehören beispielsweise Abdominalkrebs, Analkrebs, Beckenkrebs, Gallengangkrebs, Gebärmutterkrebs, Gebärmutterschleimhautkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Gehirnkrebs, Kopf und Nackenkrebs, Lippenkrebs, Mundkrebs, Nierenkrebs, Parotiskrebs, Zungenkrebs, Leistenkrebs, Weichteilkrebs, Lymphome, Leukämien, multiple Leukämien, und bevorzugt Mammakarzinome, Sarkome, Ovarkarzinome, Lungenkarzinome, Pankreaskarzinome, Colonkarzinome, Rectumkarzinome, Prostatakarzinome, Leberkarzinome, Blasenkarzinome, Magenkarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Zervixkarzinome, Endometriumkarzinome, Melanome, Non-Hodgkin-Lymphone und chronische myeloische Leukämien, wobei das erfindungsgemäße Verfahren vor allem im Bereich der Zervix-, Hals- und Kopf- und Colondiagnostik Vorteile bietet.

Besonders vorteilhaft kann das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen folgender diagnostischer Anwendungen eingesetzt werden:

• - Zur Früherkennung rezidivierender Hals- und Kopftumoren durch Schleimhautabstriche, die gewünschtenfalls direkt an der Operationsnarbe entnommen werden können und insbesondere mit einem tumorspezifischen LOH-Markerset untersucht werden;
• - Diagnostik minimaler disseminierter Krebszellen solider Tumoren und Leukämien vorzugsweise an Blut- und Knochenmarksausstrichen;
• - Colon- und Lungenkarzinomdiagnostik an Ausstrichen, Zytospins oder Zellfraktionen von Colon- bzw. Lungen- und Bronchiallavagen;
• - Diagnostik eines Lymphknotenbefalls an Ausstrichen von Lymphflüssigkeit;
• - Diagnose eines Blasenkarzinoms an Zytospins oder Zellfraktionen von Urin;
• - Diagnose eines Pankreaskarzinoms an Zytospins oder Zellfraktionen von Pankreassekret;
• - Diagnostik eines Zervixkarzinoms, insbesondere zur Früherkennung, an Zervixabstrichen. Besondere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Kombination zytodiagnostischer Untersuchungsmethoden und der molekularbiologischen Analyse mikrodissektierter Zellen oder Zellbestandteile.

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung; es soll die Erfindung aber nicht beschränken.

Es zeigt die Fig. 1 das Herausschneiden von Zellen aus einem Zervixabstrich mit Hilfe eines Lasers. Nach dem Laserschnitt werden die Zellen mit Hilfe eines Mikromanipulators gepickt.

Beispiel: Zervixabstrichdiagnostik 1. Herstellung der folienbeschichteten Objektträger

Glasobjektträger 76 mm × 26 mm werden mit einer 4 µm dicken Polyesterfolie (Firma SL Microtest, Jena) beklebt. Die Folie wird nur am Rand des Objektträgers jeweils an der Folienseite festgeklebt. In Bereichen, in denen mikrodissektiert werden soll, darf die Folie nicht am Objektträger festgeklebt sein. Die so behandelten Objektträger werden über Nacht zur Dekontamination mit UV- Licht bestrahlt. Auf die Folie wird der Zervixabstrich ausgestrichen, 15 min in 96% EtOH fixiert und der Papanicolaou-Färbung unterzogen.

2. Lasermikrodissektion und Aufschluss der Zellen

Zellareale mit dysplastischen Zellen werden neben solchen mit normalen Zellen mit Hilfe eines Lasers herausgeschnitten (Fig. 1). Ein Zellareal enthält mindestens 5 bis 10 Zellen. Die Areale werden mit Hilfe eines Mikromanipulators isoliert und zum Aufschluss über Nacht bei 48°C einem Proteinase K-Verdau unterzogen (15 µl Gesamtvolumen, 0,5% Tween 20, 1,15 mg/ml Proteinase K, 10 µl HF-Puffer ohne MgCl₂, von Boehringer, Mannheim). Danach wird der Aufschluss 10 min bei 97°C inkubiert, kurz abzentrifugiert, und der Überstand wird der Gesamtgenomamplifikation zugeführt.

3. Gesamtgenomamplifikation

Die Amplifikation der gesamten DNA erfolgt in Anlehnung an das Protokoll nach Dietmaier et al., Am J. Pathol., 154(1), 83-95 (1999), in einem Gesamtvolumen von 100 µl und nach folgendem Zyklusprogramm:
1 Zyklus:
92°C 1 min 30 sec
50 Zyklen:
92°C 40 sec
37°C 2 min
Aufheizen auf 55°C mit 10 sec/C
55°C 4 min
68°C 30 sec
1 Zyklus:
68°C 15 min
4°C unendl.

4. LOH-Analyse mit Hilfe der Mikrosatellitenmarker D5S208, D5S406, D5S432

4 µl des PEP-PCR-Ansatzes werden in einen 30 µl-PCR-Ansatz mit 10× Perkin Eimer Puffer II, 2,5 mM MgCl₂, je 0,4 mM dNTP, 0,4 µM sense-Primer (D5S432, D5S208, D5S406) und 0,4 µM antisense-Primer (D5S432, D5S208, D5S406), 1,5 U AmpliTaq-Gold nach dem folgenden Zyklusprogramm behandelt:
1 Zyklus:
10 min 95°C
40 Zyklen:
1 min 94°C
30 sec 56°C
30 sec 72°C
1 Zyklus:
10 min 72°C
4°C unendl.

Die Analyse auf einen Allelverlust oder eine Mikrosatelliteninstabilität erfolgt mittels Kapillarelektrophorese. Hierbei wird das Allelverhältnis in den Normalzellen mit denjenigen der dysplastischen Zellen verglichen. Bei einem prozentualen Unterschied von über 50% der Allelverhältnisse in Wildtyp einerseits und dysplastischen Zellen andererseits wird von einem LOH ausgegangen.

Sinn und Zweck einer solchen Charakterisierung besteht darin, Zellen in Krebsvorstadien von solchen in Krebsstadien zu unterscheiden, wozu eine morphologische Beurteilung in der Regel nicht ausreicht (Dt. Ärzteblatt, 95, Heft 15.10., 1988).

Die Marker D5S432, D5S208 und D5S406 dienen als Progressionsmarker von präkanzerösen zu kanzerösen Gewebeveränderungen der Cervix uteri. Eine LOH-Analyse von lasermikrodissektierten dysplastischen Zellen mit diesen Markern hilft solche Zellen zu identifizieren, die sich noch in einem Vorstadium befinden.

Ergebnisse an 12 Zervixabstrichen, die nach der beschriebenen Methode untersucht wurden, sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.

Tabelle 1

Tabelle 2

Die Papklassifikation ist die vom Pathologen nach ausschließlich morphologischen Kriterien getroffene Einteilung der Zervixabstriche.

Papklassifikation IIw

Vom Pathologen als auffälliges Zellbild, jedoch noch keine Dysplasie aufweisend, aber einer Kontrolle bedürftig, bezeichnet.

Papklassifikation IIID

Umfaßt Cervikale Intraepitheliale Neoplasien I-II, d. h. leichte bis mittelschwere Dysplasien sind im Zellbild vorhanden.

Papklassifikation IV

Umfaßt Cervikale Intraepitheliale Neoplasie III und Carcinoma in situ, d. h. schwere Dysplasien und Krebszellen sind im Zellbild vorhanden.

Die Marker D5S208 und D5S432 stellen eine Region auf Chromosom 5 dar, die in Krebsvorstadien Läsionen aufweist ("frühe Marker"), wohingegen die Gene p53 und RB, sowie c-myc genomische Imbalancen (also LOH's oder Amplifikationen) in Krebszellen darstellen ("späte Marker").

Zielgruppe für die Untersuchung sind Patientinnen mit der Papklassifikation IIID, welche leicht bis schwer dysplastische Zellen im Zervixabstrich aufweisen. Denn die Unterscheidung einer schwer dysplastischen Zelle und einer Krebszelle ist anhand rein morphologischer Kriterien nur schwer zu entscheiden und sehr subjektiv (bis zu 40% falsch negativ bewertete Zervixabstriche durch die Papanicolaou-Klassifikation).

In diesem Fall greift das molekulare Staging: Zellen eines PapIIID Abstriches, die nur Läsionen in einem oder mehrerer der frühen Marker (auf Chromosom 5) aufweisen, befinden sich noch in einem präkanzerösen Zustand, wohingegen Zellen, die genomische Imbalancen in den späten Markern (p53-LOH, RB-LOH oder c-myc-Amplifikationen) aufweisen, bereits Krebs darstellen.

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß Zellen aus PapIIID klassifizierten Zervixabstrichen bereits Läsionen in den späten Markern haben, d. h. Krebs darstellen.

Referenzbeispiel: Molekularbiologische Untersuchung Analyse der Onkogene E6 und E7 1. Methodik

Humane Papillomaviren werden als Cofaktoren der Entstehung von Cervixcarcinomen angesehen. Hierbei spielen insbesondere die viralen Onkogene E6 und E7 eine Rolle. Von Bedeutung bei der Genese von Carcinomen des Urethrogenital-Traktes sind vor allem die Onkogene der HPV-Typen 16, 18 und 33.

Mit der nachfolgend beschriebenen Methode werden diese Onkogene mittels PCR koamplifiziert.

2. Kontrollen

Positivkontrollen: HPV-16-, HPV-18-, HPV-33 DNA (aus Patienten gewonnene DNA oder Plasmid-DNA).
Negativkontrollen: PCR-Kontrolle mit A-Bidest.

3. Reagenzien PCR (E6)

10× PE PCR-Puffer
25 mM MgCl₂

(PE)
2,5 mM dNTP (je, PE)
Primer 16ME21 SEQ ID No: 1
Primer 16ME49 SEQ ID No: 2
Primer 18ME12 SEQ ID No: 3
Primer 18ME50 SEQ ID No: 4
Primer 33ME19 SEQ ID No: 5
Primer 33ME51 SEQ ID No: 6
Taq-Polymerase Amplitaq-Gold (PE)

PCR (E7)

10× PE PCR-Puffer
25 mM MgCl₂

(PE)
2,5 mM dNTP (je, PE)
Primer 16ME60 SEQ ID No: 7
Primer 16ME78 SEQ ID No: 8
Primer 18ME59 SEQ ID No: 9
Primer 18ME87 SEQ ID No: 10
Primer 33ME62 SEQ ID No: 11
Primer 33ME79 SEQ ID No: 12
Taq-Polymerase Amplitaq-Gold (PE)

Es werden die Thermocycler Perkin-Elmer 2400 oder 9700 verwendet, spezielle Reaktionsgefäße sind nicht erforderlich.

4. Versuchsablauf PCR PCR Ansatz (5 µl)

E6:
19,5 µl A-Bidest
5 µl 10×Puffer (PE)
2 µl dNTP-Mix (2,5 mM; PE)
8 µl 25 mM MgCl₂

2 µl Primer 16ME21 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 16ME49 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 18ME12 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 18ME50 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 33ME19 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 33ME51 (20 µmol/µl)
0,5 µl Taq DNA-Polymerase, Amplitaq-Gold (5 U/µl)
E7:
19,5 µl A-Bidest
5 µl 10×Puffer (PE)
2 µl dNTP-Mix (2,5 mM; PE)
8 µl 25 mM Mg/Cl₂

2 µl Primer 16ME60 (20 pmol/µl)
2 µl Primer 16ME78 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 18ME59 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 18ME87 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 33ME62 (20 µmol/µl)
2 µl Primer 33ME79 (20 µmol/µl)
0,5 µl Taq DNA-Polymerase, Amplitaq-Gold (5 U/µl)

Es werden der Probenanzahl entsprechend die PCR-Ansätze zubereitet (Kontrollen, Standards und Patientenproben) und 3 zusätzliche Proben (Pipettenfehler).

Pro Reaktionsgefäß wurden 47 µl Mix pipettiert. Je 3 µl der zu untersuchenden Proben-DNA bzw. Kontroll-DNA, gelöst in TE-Puffer oder A-Bidest (aus Präparation mit Qiagen-Kits bzw. Trizolaufarbeitung) werden zugegeben.

Die PCR wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

5. Auswertung

Nach Beendigung der PCR (etwa 2,5 Stunden) werden die Amplifikate auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen (9 µl + 1 µl Ladepuffer) und ca. 15-20 min im elektrischen Feld aufgetrennt.

Die Größen der Amplifikate sind:

E6	E7
300 bp HPV 16	200 bp HPV 16
405 bp HPV 18	310 bp HPV 18
347 bp HPV 33	199 bp HPV 33

Analyse p53-LOH, rb-LOH, c-myc-Amplifikationen, DxSy-LOH und p53-Mutationen

Diese Analysen können in anloger Anwendung des Beispiels 3 der PCT/EP 99/05386 bzw. der Referenzbeispiele 10 und 11 der WO 99/10528 durchgeführt werden.

SEQUENCE LISTING

Claims (12)

1. Verfahren zur Charakterisierung disseminierter und mikrometastasierter Krebszellen, wobei man

• - Zellen einer Körperflüssigkeit auf einen Träger aufbringt und in-situ zytodiagnostisch untersucht;
• - eine oder mehrere, im Vergleich zu Normalzellen zytodiagnostisch unterscheidbare Zelle(n) oder Teile davon mittels Mikrodissektion abtrennt; und
• - an den abgetrennten Zellen wenigstens eine Genanalyse vornimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen folienbeschichteten Träger verwendet und mittels Lasermikrodissektion abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen aus Blut, Knochenmark, Lymphe, Urin, Sputum, Pankreassekret, Ascites, Ergüssen, Fruchtwasser, Punktaten, Colon-, Lungen-, Bronchiallavage, Blasenspülflüssigkeit, Cervix- und Mundschleimhautabstrichen, Fäces, Aphareseprodukten verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur zytodiagnostischen Untersuchung die auf den Träger aufgebrachten Zellen oder Teile davon in-situ einer Färbung und/oder Markierung unterzieht.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die auf den Träger aufgebrachten Zellen kultiviert und an ihnen wenigstens einen Bioassay durchführt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgetrennten Zellen oder Teile davon zunächst einer Genomamplifikation unterzieht und dann wenigstens eine krebsspezifische und/oder krebsassoziierte Gen-Analyse vornimmt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man an den abgetrennten Zellen oder Teilen davon einen Proteinfingerprint erstellt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man von nachfolgenden Genanalysen eine oder mehrere vornimmt:

• 1. krebsspezifische Mutations- und Amplifikationsanalysen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen;
• 2. krebsspezifische LOH-Analysen von Tumorsuppressorgenen und Mikrosatelliten;
• 3. krebsspezifische mRNA-Analysen;
• 4. krebsassoziierte mRNA- und Protein-Analysen metastasierungs-, zellzyklus-, proliferations-, apoptose-, chemoresistenz- und chemotherapieasoziierter Gene;
• 5. krebsassoziierte mRNA- und Protein-Analysen in Zusammenhang mit einer immunologischen Therapie oder Gentherapie;
• 6. Analysen zum Nachweis gentherapeutisch veränderter Zellen;
• 7. Drug-Target-assoziierte Gene.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Genanalyse wenigstens eine Untersuchung eines frühen Markers und wenigstens eine Untersuchung eines späten Markers umfaßt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man an den aus der Körperflüssigkeit abgetrennten Zellen wenigstens eine krebsspezifische und/oder krebsassoziierte Gen-Analyse vornimmt, wobei man die gleiche Analyse an Normalzellen derselben Körperflüssigkeit zum Vergleich durchführt.

11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur in-vitro Diagnose von Krebs.

12. Verwendung nach Anspruch 11 zur Früherkennung von Zervixkarzinomen.