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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Aktivität einer
biologisch wirksamen Substanz, wie etwa eines Enzyms oder eines
Enzymsubstrats in einem histologischen Präparat, insbesondere zur Stoffwechsel-
oder/und Tumordiagnostik.
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Aus
der
DE 195 27 160
C1 ist ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines
Enzyms bekannt, bei dem man die Konzentration eines durch Umsetzung
des Enzyms mit einer Substratlösung
enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung photometrisch bestimmt.
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Aus
der
DE 36 14 470 A1 ist
es bekannt, die Enzymkonzentration über eine Änderung der optischen Dichte
quantitativ zu bestimmen.
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Aus
der
DE 196 40 121
A1 ist ein Verfahren zur Bestimmung einer sich zeitabhängig ändernden Meßgröße bekannt,
wobei der Maximalwert in einem Bereich mit linearem Reaktionsverlauf
ermittelt wird und der Zeitpunkt sowie die Größe des Reaktionszeitfensters
mit dem linearen Bereich variabel ist und von der Art, der Reaktion
und den Reaktionsbedingungen abhängig
ist.
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Bei
diesen bekannten Verfahren wird die Konzentration der zu messenden
Substanz in der Lösung
gemessen und sie gestatten keine unmittelbare Messung an einem Gewebepräparat selbst.
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Übliche Praxis
ist es, histologische Schnittpräparate
mit einem für
eine bestimmte Enzymreaktion spezifischen Farbstoff zu färben, sodaß unter dem
Mikroskop Bereiche unterschiedlicher Farbintensität zu erkennen
sind. Analysen in bezug auf eine Enzymverteilung oder gar Enzymkonzentration
in den verschiedenen Bereichen des Schnittpräparats sind nicht möglich.
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Aus
Lojda et al, 1965, Folia Morphol. 13: 84 ist es bekannt, Dehydrogenasen in
histologischen Strukturen qualitativ ortsaufgelöst darzustellen. Ferner bekannt
ist es, daß die
maximale angenähert
lineare Reaktionsgeschwindigkeit des Umsatzes (V-max) für ein Enzym
unter definierten Bedingungen, wie Temperatur, pH-Wert Ionenkonzentration, spezifisch
ist, und diesen V-max-Wert
zur Quantifizierung des Enzymumsatzes zu verwenden.
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Die
DE 44 11 661 A1 zeigt
schließlich
ein videotechnisches Analyseverfahren zur gleichzeitigen quantitativen
hydrogeologischen Ermittlung einer Vielzahl von chemischen Parametern
eines flüssigen oder
gasförmigen
Mediums, wie etwa Grundwasser, in matrixartigen Reagentienfeldern
anhand von Farbintensitäten.
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Die
DE 197 09 348 A1 zeigt
ein Verfahren zur bildlichen Darstellung der Verteilung verschiedener Molekülgruppen
in einem Gewebe zum Erhalt von Korrelationen zwischen den Konzentrationen
der jeweils untersuchten Molekülgruppen.
Hierzu werden nacheinander die jeweiligen Konzentrationen der interessierenden
Moleküle
jeweils durch einmalige Messung bestimmt, etwa für bestimmte Antikörper spezifische
Fluroeszenzsignale, und die so ermittelten Konzentrationen werden
dann miteinander verglichen.
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Aus
Chikamori et al., "Succinate
dehydrogenase (SDH) activity in single Paramecium cells", Acta histochem
100, 25–36
(1998), ist ein Verfahren zur Messung der SDH-Aktivität in einzelnen
Paramecium-Zellen bekannt, das die Schritte des Oberbegriffs von
Anspruch 1 aufweist.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Verfahren anzugeben, das
eine präzise
Referenzierung auch dann ermöglicht,
wenn das Bild keine gewebefreien Bereiche zeigt.
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Zur
Lösung
der Aufgabe wird ein Verfahren zur Messung der Aktivität einer
biologisch wirksamen Substanz in einem histologischen Präparat nach
Anspruch 1 vorgeschlagen.
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Hierbei
wird das Präparat – etwa ein
histologisches Schnittpräparat
oder eine Gewebeprobe – mitsamt
den Reagentien, welche aufgrund der Aktivität der zu messenden Substanz
die jeweilige optische Eigenschaft des Präparats ändern, vor der Bildaufnahmevorrichtung
angeordnet. Die zu messende Substanz bewirkt eine Änderung
der optischen Eigenschaft in jenem Bereich des Präparats,
in dem die zu messende Substanz vorhanden ist. Nimmt man dann nacheinander
mehrere Bilder des Präparats auf,
erkennt man eine Änderung
der optischen Eigenschaft in dem Bereich des Präparats über die Zeit. Die Änderungsgeschwindigkeit,
insbesondere die maximale Änderungsgeschwindigkeit
der optischen Eigenschaft steht in einem vorbekannten proportionalen
Verhältnis
zur Konzentration der Substanz. Man erhält somit aus der zeitlichen Änderung
ein Maß für die Substanzkonzentration,
und zwar in Zuordnung zum jeweils gewählten Bildbereich des Präparats,
zur Unterscheidung zwischen solchen Bildbereichen, in denen die
Substanz aktiv ist, und solchen, in denen sie nicht oder im abweichenden
Maße aktiv ist.
Man erhält
somit eine bildliche Darstellung von Substanzkonzentrationen.
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Der
Referenzwert wird in einem Bereich des Präparats aufgenommen, in dem
keine Aktivitätsmessung
der zu messenden Substanz erfolgen soll, wobei dieser Referenzwert
mit Bilddaten des zumindest einen ausgewählten Bildbereichs verrechnet, insbesondere
davon abgezogen wird.
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Eine
besonders genaue Messung der Substanzkonzentration ist möglich, wenn
die Konzentration der Substanz aus der stärksten zeitlichen Änderung
der optischen Eigenschaft in dem ausgewählten Bildbereich ermittelt
wird, und wenn die Konzentration der Substanz in einem Bereich angenähert linearer
zeitlicher Änderung
der optischen Eigenschaft, insbesondere die Extinktionsänderung,
in dem ausgewählten
Bildbereich ermittelt wird.
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Die
optische Eigenschaft kann die Helligkeit oder/und, die Farbe oder/und
die Farbintensität oder/und
die Zunahme einer Farbstoffkonzentration oder/und die Fluoreszenz
des Präparats
beinhalten.
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Zur
Entfernung von Störkomponenten
kann man vor dem Aufnehmen der mehreren Bilder von dem Präparat zumindest
ein Referenzbild aufnehmen. Dann kann man auf die optische Eigenschäft bezogene
Datenwerte des Referenzbilds mit auf die optische Eigenschaft bezogenen
Datenwerten der nacheinander aufgenommenen Bilder verrechnen, insbesondere
hiervon subtrahieren. Sodann kann die Änderung der optischen Eigenschaft
des gewählten Bildbereichs
durch Vergleich der entstörten,
nacheinander aufgenommenen Bilder ermittelt werden.
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Hierbei
kann das Referenzbild zur Nullwertfestlegung herangezogen werden,
und zur Bestimmung der Konzentration der Substanz nicht deren Absolutwert,
sondern die Differenz der optischen Eigenschaft zwischen dem Referenzbild
und den späteren
Bildern zur Bestimmung der Aktivität der zu messenden Substanz
herangezogen werden.
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Hierbei
kann das Referenzbild denselben Bildausschnitt des Präparats wieder
geben wie die späteren
Meßbilder,
wobei das Referenzbild bevorzugt das erste Bild der nacheinander
aufgenommenen Bilder ist.
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Die
biologisch aktive Substanz kann Enzymsubstrat oder ein Enzym sein,
dessen Aktivität
anhand der zeitlichen Konzentrationsänderung des zugeordneten Enzymsubstrats
oder des zugeordneten Enzymprodukts gemessen wird.
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Zur
Messung von Enzymaktivitäten
hat es sich bewährt,
wenn über
5 bis 30 Minuten, insgesondere 15 Minuten hinweg, nacheinander Einzelbilder mit
einem gleichmäßigen Abstand
von 5 Sekunden bis 2 Minuten, insbesondere 1 Minute, aufgenommen werden.
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Bevorzugt
wird mit der Bildaufnahmevorrichtung im Durchlicht die Extinktionsänderung
im histologischen Schnittpräparat
gemessen, wobei die Kalibrierung mit Filtern, insbesondere Grauwertfiltern,
erfolgen kann.
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Als
Bildaufnahmevorrichtung kann eine Fotokamera, eine Filmkamera oder,
besonders bevorzugt, eine Videokamera verwendet werden, wobei die Änderung
der optischen Eigenschaft im ausgewählten Bildbereich pixelweise
aufge löst
gemessen und ausgewertet wird.
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Die
Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen unter Hinweis
auf die beigefügte Zeichnung
erläutert.
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1 zeigt ein Schema einer
Vorrichtung zur Durchführung
des Verfahrens;
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2 zeigt ein Zeitdiagramm
einer typischen Enzym-Enzymsubstrat-Reaktion;
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3 zeigt ein Meßbeispiel
mit Angabe von Grauwerten; und
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4 zeigt das Meßbeispiel
von 3 nach Umrechnung
der Grauwerte in Extinktionswerte.
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1 zeigt eine Vorrichtung
zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ein Mikroskop 1, hier ein Durchlichtmikroskop, zur Betrachtung
eines zu untersuchenden Präparats 3 ist
mit einer Farb- oder Schwarzweiß-Videokamera 5 zur
Aufnahme eines Bilds von dem Präparat 3 ausgestattet. Das
Mikroskop 1 und die Kamera 5 bilden eine Bildaufnahmevorrichtung,
die in einer hier auf ±0,5°C klimatisierten
Klima- und Verdunklungskammer 7 angeordnet ist. Die Kamera 5 ist über einen
Videorecorder 9 mit einem Computer 11 verbunden,
in dem die von der Kamera 1 oder dem Videorecorder 9 gelieferten Bilder
rechnerisch ausgewertet werden können.
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Die
Klimakammer 7 wird von einem externen Klimagerät 13 klimatisiert,
welches von einem Kyrostatwasserbad 15 mit Kühlwasser
versorgt wird. Sowohl das Klimagerät 13 als auch die
Beleuchtung des Mikroskops 1 werden mit einem Netzteil 17 mit Strom,
hier Gleichstrom, versorgt. Die Videokamera 5 ist mit einem
außerhalb
der Klimakammer 7 angeordneten Steuernetzteil 19 verbunden.
Der Videorecorder 9 ist an einen Videomonitor 21 angeschlossen,
und der Computer 11 an einen Computermonitor 23.
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Zur Überwachung
konstanter Versuchsbedingungen ist nahe dem Präparat 3 ein Temperaturfühler 25 angeordnet,
dessen Ausgang über
ein Temperaturmeßgerät 27 an
einen Kanal eines Zweikanal-Spannung-Zeit-Schreibers 29 angeschlossen
ist. Der andere Kanal des Schreibers 29 erhält ein Signal von
einer Lux-Meßsonde 31,
die auf einem Randbereich des Bildschirms des Computermonitors 23 fixiert
ist, um eventuelle Grundhelligkeitsschwankungen des gesamten Aufnahmesystems
aus Mikroskopbeleuchtung, Kamera 5, Computer 11,
etwa durch Netzspannungsschwankungen, zu überwachen.
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Zur
Messung der Aktivität
einer Substanz in dem histologischen Präparat 3 wird das Präparat 3 mit
Reagentien, insbesondere Farbstoffen, behandelt, welche eine optische
Eigenschaft, wie etwa die Farbintensität des Präparats, durch Aktivität der zu messenden
Substanz, ändern,
um letztlich eine Extinktionsänderung
in dem Präparat
zu bewirken. Das so behandelte Präparat wird unter das Objektiv
des Mikroskops 1 gebracht. Mittels der Videokamera 5 werden
ausgewählte
Bildbereiche Ba (in 1 auf dem
Compurtermonitor 23 dargestellt) der Schnitte bei definierten
Lichtintensitäten
und konstanter Temperatur aufgenommen. Über einen Zeitverlauf von hier
ca. 15 Minuten wird jede Minute ein Bild B aufgenommen. Die resultierenden
Bilddaten werden über eine
Bilderfassungskarte (AD-Wandler) dem Computer 11 übermittelt
und dort mit einem Bildverarbeitungsprogramm verrechnet.
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Die
Meßreihe
ergibt in den jeweiligen Pixeln oder den ausgewählten Bildbereidien Ba, in
denen die Substanz gemessen werden soll, aufgrund der Aktivität der zu
messenden Substanz eine zeitliche Änderung der jeweiligen optischen
Eigenschaft, etwa eine als Extinktion meßbare zunehmend intensive Färbung. Die
Geschwindigkeit, insbesondere die maximale Geschwindigkeit, der
Zunahme wird als Maß für die Substanzaktivität herangezogen.
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Zur
Verbesserung der Störunempfindlichkeit der
Bildauswertung können
die Daten der einzelnen Pixel des ersten Bildes als Referenzbild
Bref der Bildserie als Nullwerte von denen der nachfolgend aufgenommenen
Bilder abgezogen werden. Dann wählt man
einen Bereich im histologischen Schnitt, der nicht gemessen werden
soll oder/und der keinerlei Gewebesubstanz aufweist (nichtausgewählter Bereich
Bna) aus und ermittelt dort einen Leerwert. Auch dieser Leerwert
wird von den Daten der Pixel der jeweiligen Bilder abgezogen. Dieser
zweistufige Nullwert- und Leerwertabzug führt zu Bildern B ohne die durch
Licht erzeugte unspezifische Färbung
des Farbstoffs, wobei gleichzeitig Veränderungen im System, z. B.
Lichtschwankungen durch Spannungsschwankungen im Versorgungsnetz,
ausgeglichen werden. Durch diese doppelte Nullwert- bzw. Leerwertsubtraktion
können
die Bilder rechnerisch geglättet
werden, d. h. von Rauschen befreit werden. Man erhält Bildinformationen,
die einzig die Änderung
der optischen Eigenschaft über
die Zeit angeben.
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Die
Kalibrierung der Aufnahmevorrichtung kann mittels geeichter Graufilter
erfolgen. Die Umrechnung der gemessenen Extinktion in Substanzkonzentration
erfolgt in bekannter Weise nach dem Lambert-Beerschen Gesetz.
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Was
Enzyme betrifft, so ist die Umsatzrate eines Substrats durch ein
Enzym bei hohem Substratüberschuß hauptsächlich von
der Konzentration dieses Enzyms abhängig, bis es zu einem Mangel
an Substrat oder einer Hemmung durch das Produkt kommt und die Umsatzgeschwindigkeit
sinkt. Zu Beginn des Versuchs benötigt ein Enzymmolekül eine gewisse
Zeit zur Aufnahme des Substrats, zur Umsetzung sowie zur Freigabe
des Produkts, bis es zur maximalen Umsatzgeschwindigkeit kommt.
Wenn hierbei die Produktkonzentration ansteigt, wird die Abgabe
des Produkts erschwert und die Umsatzrate nimmt ab. Die maximale
Reaktionsgeschwindigkeit des Umsatzes (V-max) ist jedoch für ein Enzym
bei definierten Bedingungen, wie Temperatur, pH-Wert, Ionenkonrentration, spezifisch.
Die Messung der Enzymaktivitäten
unter V-max-Bedingungen über
die Zeit gestattet eine Quantifizierung der Enzymaktivität. Der allgemeine
Verlauf einer solchen Enzymkinetik ist schematisch in 2 dargestellt.
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Nach
dem Lambert-Beerschen Gesetz entspricht die Extinktion E dem Logarithmus
aus dem Verhältnis
der Intensität
I
o des eingestrahlten Lichts zur Intensität I des
des durchgelassenen Lichts. Gleichzeitig entspricht sie einer Stoffkonzentration
c bei konstanter durchstrahlter Schichtdicke s in Abhängigkeit
einer stoffspezitischen Konstante.
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Übertragen
auf die oben erwähnten V-max-Bedingungen
bedeutet dies, daß man
durch den oben beschriebenen Nullwert- bzw. Leerwertabzug eine Ausgangsintensität I
o' bestimmen
kann. Um nun zu erkennen, welcher gemessene Wert. z. B. einer Extinktion
von 0,1 entspricht, wird das System, d. h. die Kombination aus Kamera,
Mikroskop in der jeweils gewählten
Vergrößerungseinstellung, AD-Wandler
und Bildverarbeitungsprogramm, mit Graufiltern bekannter Extinktion
kalibriert, so daß man
bei ansonsten konstanten Bedingungen die ermtittelten Grauwertänderungen
einer Extinktionsänderung
zuordnen kann. Dabei wird die Ausgangsintensität I
o' als maximal mögliche Aufspreitung
der Kameraempfindlichkeit gesetzt (bei 8 Bit 256 Weile) und die
Abnahme x dieses Werts über
die Zeit in jedem Pixel des Bilds ermittelt (I = I
o – x). Setzt
man diese Werte in die obige Gleichung ein, erhält man eine System-"Extinktionsänderung" (ΔE'), gemäß
die mit dem durch die Kalibrierung
des Systems ermittelten Korrekturfaktor k in Bezichung zur tatsächlichen
Extinktionsänderung
(ΔE) pro
Minute steht.
ΔE/min = ΔE'/min·k 3) -
Mit
Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich,
in jedem Pixel des Bilds die Zunahme der Farbstoffkonzentration
darzustellen.
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Überträgt man die
Verhältnisse
bei den oben stehenden Enzymkinetiken auf dieses Modell, so zeigt
sich, daß die
Farbstoffzunahme unter V-max-Bedingungen proportional zur Enzymkonzentration
im gewählten
Bereich des histologischen Schnitts ist. Stellt man von dem gewählten Gewebsbereich
diesen Anstieg über
die Zeit dar, so ist er etwa in den ersten 15 bis 20 Minuten linear,
bevor er dann durch Substratmnangel oder Produktüberschuß geringer wird. Der Anstieg
der Färbung
in diesen ersten 15 bis 20 Minuten kann also als V-max angesehen
werden. Die 3 und 4 zeigen die relative Grauwertänderung
und die daraus berechnete Extinktionsänderung von vier Meßreihen
mit zugeordneten Regressionsgeraden im Bereich von Vmax, die an
vier Gewebsbereichen eines Präparats
gleichzeitig gemessen wurden.
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Mit
Hilfe dieses Verfahrens ist es also möglich, in jedem Pixel der Bildserie
die Aktivität
verschiedener Enzyme ortsaufgelöst
quantitativ darzustellen. Da die Aktivität der Enzyme eine Funktion
ihrer Konzentration ist, läßt sich
die Enzymmenge in jedem Pixel oder im gewählten Bildbereich Ba über den zugeordneten
Substrat- oder, Produktumsatz messen. Die Bildinformation kann bis
auf zelluläre
und subzelluläre
Ebene aufgelöst
werden, wobei z, B. die Messung der Aktivitäten von Enzymen in einzelnen Mitrochondrien
möglich
ist.
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Kurz
gesagt, wird zum quantitativen Nachweis enzymatischer Aktivität die Extinktion
indirekt gemäß Gleichung
3) ermittelt. Die Grauwertänderung oder
Absorptionsänderung
in einem Pixel oder dem ausgewählten
Bereich Ba wird über
die Zeit gemessen. Die Ergebnisse dieser Messung werden in eine Systemextinktion
E' umgerechnet.
Der Korrekturfaktor k wird durch die Eichung des Systems mit Graufiltern
ermittelt. Die Menge des jeweiligen Enzyms bzw. Substrats wird durch
die Änderung
der Extinktion über
die Zeit gemäß dem Lambert-Beerschen
Gesetz ermittelt.
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Beispiel
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Zur
Messung der Dehydrogenase-Aktivität wurden Nematoden der Art
Caenorhabditis elegans zu verschiedenen Bedingungen in Gewebeeinbettungsmittel
inkubiert und tiefgefroren und im Kyrostaten auf eine Dicke von
7 μm geshnitten
und auf mit Polylysin behandelte Objektträger aufgebracht. Die Gewebsschnitte
wurden angetaut, 10 bis 15 Minuten getrocknet und entweder sofort
weiterverwendet oder zum späteren
Gebrauch bei –70°C tiefgefroren. Vor
dem Einbringen in die Meßvorrichtung
wurden die Schnitte mit dem Handrücken aufgetaut und vorsichtig
mit einer Inkubationslösung überschichtet. Diese
Inkubationslösung
enthielt Substrat im Überschuß, Tetrazoliumfarbstoff,
Phenazinmethosulfat (PMS), Cyanid zur Blockierung der Atmungskette
sowie Tris-HCl-Puffer zum Konstanthalten des pH-Werts von 7,4. Nach
dem Auflegen eines Deckglases wurden die Objektträger mit
den Gewebsschnitten in die Klimakammer 7 unter das Mikroskop 1 gelegt
und dort die interessierenden Gewebsbereiche eingestellt. Die Temperatur
betrug konstant 25°C bei ±0,5°C. Der Verlauf
der Reaktion wurde 20 Minuten mit der Videokamera 5 auf
den Recorder 9 aufgezeichnet und entweder sofort zur on-line-Messung oder als
Aufnahme später
im Computer 11 ausgewertet. Mit einem Makro des Bildverarbeitungsprogramms
Optimas 6.1 wurde ein Referenzbild zum Zeitpunkt t0 aufgenommen
und dieses von den weiteren Bildern, die in Minutenabständen aufgenommen
wurden, abgezogen. Fünf
ausgewählte
geometrische Bereiche Ba der Bilder wurden vermessen und deren Daten
eingespeichert. Der erste dieser Bereiche Bna ergab den Leerwert,
und die anderen vier Bereiche Ba dienten als Meßbereiche. Mit Hilfe eines Makros
von Excel 7.0 wurden die Mittelwerte der Grauwerte errechnet
und graphisch dargestellt (3)
und anschließend
in Extinktionswerte E' umgerechnet.
(4).
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Insbesondere
anwendbar ist das Verfahren auch zur Quantifizierung von Stoffwechselenzymen wie
SDH (Succinat-Dehydrogenase), MDH (Malat-Dehydrogenase) und LDH
(Lactat-Dehydrogenase). Weitere NAD-abhängige Stoffwechselenzyme sind
ebenfalls meßbar.
Mit diesem Verfahren lassen sich alle Enzyme quantifizieren, für die eine
spezifische Färbemethode
zur Verfügung
steht, wie etwa die saure Phosphatase, Cytochromoxidase und verschiedene
Proteasen.
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Ferner
nachweisbar ist auch die β-Galactosidase über die
lacZ → β-Galactosidase → Xgal-Reaktion.
Das lac-Z Gen codiert in E. coli für das Enzym β-Galactosidase,
das Lactose in Glucose und Galactose hydrolysiert, und wird in der
Gentechnik als Selektionsmarker und Reportergen verwendet. Die einzubringende
genetische Substanz kann neben speziellen Wirkungsgenen auch das
lac-Z-Gen enthalten. Wenn die β-Galactosidase
expremiert wird, so ist die Sequenz im Genom des Wirtes aufgenommen
worden. Nachgewiesen wird das Vorhandensein der β-Galactosidase mit einem Sitbstratanalogon
Xgal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid), das
in β-Galactose
und ein blaues Chromophor hydrolysiert wird, das im Präparat eine
Färbungsänderung
verursacht. Aus der Geschwindigkeit der Pärbungsänderung läßt sich die Konzentration der β-Galactosidase und
somit die Stärke
der Expression der eingebrachten Sequenz ablesen.
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Außer der
Extinktion kommt als Meßgröße die Anderung
der Fluoreszenzeigenschaften der Substratumsetzung in Frage. Geeignete
Farbstoffe sind z. B. Methyl-Umbellipheryl-Substrate. Hierfür ist eine
besonders empfind1iche Kamera zu verwenden.
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Die Änderung
der Extinktion kann, wie oben beschrieben, mit künstlich zugeführten Farbstoffen ermittelt
werden, wobei aber auch in der Zelle vorhandene native Stoffe zur
Messung der Enzymaktivitäten
herangezogen werden können.
In Frage kommen NAD (Nikotinamid-adenin-dinucleotid) oder FAD (Flavin-adenin-dinucleotid)
und deren Derivate. Die hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens
kommt bei dieser Variante besonders zur Geltung. Zu verwenden ist
hier allerdings eine besonders empfindliche Kamera und UV-Licht.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
lassen sich auch Hemmstoffe von Enzymen unter nahezu vitalen Bedingungen
prüfen,
ohne daß aufwendige
Tierversuche nötig
wären.
Insbesondere anwendbar ist das Verfahren in der Tumordiagnostik,
insbesondere bei der Quantifizierung von Stoff wechselenzymen wie
SDH und LDH in Tumorgeweben.
