DE102008048229B4

DE102008048229B4 - Verfahren zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf Belastungen mit Mikroorganismen

Info

Publication number: DE102008048229B4
Application number: DE200810048229
Authority: DE
Inventors: Thomas Priv.-Doz. Dr. Maskow; Hauke Prof. Dr. Harms; Martina Effenberger
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2011-03-24
Anticipated expiration: 2028-09-17
Also published as: DE102008048229A1

Abstract

Verfahren zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf Belastungen mit Mikroorganismen mit einer Nachweisgrenze von einem Mikroorganismus pro ml zu testender wässriger Flüssigkeit, umfassend die Schritte:
a) kontinuierliche Messung von Temperaturänderungen oder Wärmeproduktionen einer Probe einer zu testenden wässrigen Flüssigkeit in einem Kalorimeter;
b) Bestimmung des Zeitpunktes zu dem eine signifikante Änderung der Wärmeleistung der Probe erreicht ist, wobei eine signifikante Änderung vorliegt bei einer Änderungsrate (±) der Wärmeleistung von ≥ 0,1 mW/l pro Stunde Inkubationszeit.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf Belastungen mit Mikroorganismen.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
Eine schnelle und zuverlässige Bestimmung der Belastung mit Mikroorganismen von wässrigen Flüssigkeiten ist besonders für alle wässrigen Medien interessant, die hygienisch unbedenklich sein sollen oder bei denen schon eine geringe Keimbelastung für die weitere Nutzung Probleme verursacht.

Bestandteil der meisten internationalen und nationalen Richtlinien für die hygienische Qualität von Wässern für die menschliche Ernährung sind koloniebildende Einheiten (KbE). Die Tabelle 1 zeigt Beispiele für solche Festlegungen in nationalen und internationalen Regelwerken. Tabelle 1: Richtlinien für die hygienische Qualität von Trinkwässern (Angaben in KbE)

Richtlinie	Konditioniertes Wasser		Trinkwasser im Verteilernetz
	T = 22°C	T = 37°C	T = 22°C	T = 37°C
EWG (Richtwert) [1]	20	5	100	10
EWG (MAK Wert) [1]	100	20	n. f.	n. f.
Hygieneverordnung Schweiz [2]	100		300
Trinkwasserverordnung Deutschland [3]	n. f.	n. f.	20	100

n. f. – nicht festgelegt; [1] http://www.lenntech.com; [2] Schweizerisches Lebensmittelbuch (SLMB); [3] http://www.bundesrecht.juris.de

Die Bestimmung der KbE basiert auf dem unspezifischen Wachstum von Mikroorganismen auf definierten Medien und der anschließenden visuellen Kontrolle üblicherweise durch das bloße Auge, ggf. auch durch Vergrößerungsgläser oder das Mikroskop. Chemische Reaktionen mit metabolischen Endprodukten oder auch der Verbrauch von Ausgangsstoffen (Säuerung, Alkalisierung, Ausfällung von Schwermetallen durch H₂S, Fluoreszenz von Indol etc.) sind in diese Analysen mit eingeschlossen und äußern sich in besonderen Formen oder Farben der KbE auf den Agarplatten oder in flüssigen Suspensionen.
Natürlich wird bei den KbE die Gesamtzahl der unter den gegebenen Bedingungen vermehrungsfähigen und in der Regel harmlosen Bakterien und Pilze bestimmt. Allerdings deutet das Überschreiten eines Grenzwertes auf hygienische Mängel wie Undichtigkeiten, zu geringen Wasseraustausch im Netz oder auch auf wachstumsfördernde Bedingungen hin (Wassertemperatur, Nährstoffe etc.). Deshalb wird die Gesamtkeimzahl als ein Indikator für die hygienische Qualität der Wässer betrachtet.
Typischerweise werden zur Bestimmung der KbE die Wasserproben auf Agarplatten ausplattiert und bei definierten Bedingungen inkubiert (siehe z. B. Wasserchemische Gesellschaft, Fachgruppe in der GDCh/in Gemeinschaft mit dem Normenausschuss Wasserwesen (NAW) im DIN e. V. (eds.) (2008) DEV plus Norm-Entwürfe der Reihe Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Wiley-VCH, Weinheim, ISBN-10: 3-527-32312-0). Bis Zeltwachstum sichtbar wird (typischerweise bei mehr als 10⁴ Zellen), vergehen oft ein oder mehrere Tage. Die Trinkwasserverordnung verlangt eine Kontrolle nach 24 bzw. 48 h. Sobald Kolonien vorliegen, können diese über die An- oder Abwesenheit spezifischer Enzyme identifiziert werden. Auch hier vergehen weitere Stunden oder auch Tage.
Für das Überprüfen von Wasseraufarbeitungsschritten, Baumaßnahmen im Verteilernetz, Desinfektionsmaßnahmen, neue Trinkwasserreinigungsschritte etc. ist diese lange Wartezeit problematisch, weil bis zum Nachweis der hygienischen Unbedenklichkeit von einer Belastung ausgegangen werden muss und das Wasser beispielsweise zur menschlichen Ernährung oder zum Trinken nicht freigegeben werden kann.
In dem letzten Jahrzehnt sind alternative diagnostische Werkzeuge entwickelt worden. Aber keine dieser Methoden ist so einfach, robust und schnell wie die Bestimmung von KbE. Molekularbiologische Methoden (z. B. die polymerase chain reaction – PCR oder fluorescent in situ hybridization FISH) wurden entwickelt, um die mikrobielle DNA oder RNA zu identifizieren oder bestimmte Bakterientypen selektiv anzuzeigen. Diese Methoden sind schneller und zeigen im Unterschied zu der etablierten KbE-Methode sogar die nicht-kultivierbaren Bakterien/Pilze an (Auckenthaler A, Huggenberger P (2003) Pathogene Mikroorganismen im Grund- und Trinkwasser. Birkhäuser Verlag Basel Boston Berlin). Die molekularbiologischen Methoden erlauben aber nicht, zwischen aktiven und nichtaktiven Organismen zu unterscheiden. Außerdem benötigt eine sich anschließende Gensequenzierung und Sequenzanalyse auch Stunden oder sogar Tage. Die modernen Microarrays für DNA oder auch RNA gestatten die simultane Bestimmung von hunderten unterschiedlicher Gene. Molekularbiologische Methoden allgemein sind aber sehr kostspielig, matrixempfindlich und bei der Vielzahl möglicher Organismen im Wasser auch nicht sehr sicher. Außerdem entstehen in wässrigen Habitaten ständig Mutationen, d. h. das Genprodukt unterliegt einer ständigen Veränderung. Deshalb können molekulare Methoden die klassischen Kultivierungstechniken nicht ersetzen, sondern nur ergänzen.
Bereits in den Zwanzigerjahren des vergangenen Jahrhunderts hat man versucht, mikrobielles Wachstum und Stoffwechsel kalorimetrisch zu analysieren (Battley EH (1987). Energetics of microbial growth. John Wiley & Sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore). So sind beispielsweise in WO 2007/010379 und DE 31 15 807 C2 Verfahren zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf Belastung mit Mikroorganismen beschrieben. Die besten spezifischen Wärmeleistungsparameter wurden dabei mit Mikrokalorimetern erzielt. Auch mit einem modernen Mikrokalorimeter braucht man aber mehr als 10⁶ – 10⁷ aktive Zellen pro ml, um ein auswertbares Signal zu erhalten. Diese Zelldichte liegt um Größenordnungen oberhalb der Zelldichten, die für die hygienische Untersuchung von Trink-, Mineral-, Ab-, Grund- und Oberflächenwasser relevant sind. Aus diesem Grund wurde die Meinung vertreten, dass die Kalorimetrie für solche Untersuchungen ungeeignet sei und diese wurde folglich auch bisher dafür nicht angewandt.
In den letzten Jahren wurden miniaturisierte Kalorimeter entwickelt, die man auch als Chip- oder Nanokalorimeter bezeichnet. Man versprach sich von der Miniaturisierung eine Erhöhung der Empfindlichkeit. Inder Tat erlaubten Fortschritte in der Miniaturisierung sogar die Detektion einzelner Zellen (Johannessen, E. A., Weaver, J. M. R., Bourova, L., Svoboda, P., Cobbold, P. H., Cooper, J. M., 2002. Micromachined nanocalorimetric sensor for ultra-low-volume cell-based assays. Anal. Chem. 74, 2190–2197), allerdings sind diese Chipkalorimeter für praktische, hygienische Wasseranalysen wegen des geringen Volumens (0.72 nL) und der erforderlichen hohen Zelldichte ungeeignet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es einen oder mehrere der Nachteile des Standes der Technik zu überwinden oder zu vermindern.
Erfindungsgemäße Lösung
Die Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf Belastungen mit Mikroorganismen mit einer Nachweisgrenze von einem Mikroorganismus pro ml zu testender wässriger Flüssigkeit, umfassend die Schritte:

a) kontinuierliche Messung von Temperaturänderungen oder Wärmeproduktionen einer Probe einer zu testenden wässrigen Flüssigkeit in einem Kalorimeter;
b) Bestimmung des Zeitpunktes zu dem eine signifikante Änderung der Wärmeleistung der Probe erreicht ist, wobei eine signifikante Änderung vorliegt bei einer Änderungsrate (±) der Wärmeleistung von ≥ 0,1 mW/l pro Stunde Inkubationszeit.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass bereits bei Proben mit einer Ausgangskonzentration von einem bis wenigen Mikroorganismen pro ml zu testender wässriger Flüssigkeit eine Belastung der Probe durch kontinuierliche kalorimetrische Messung nachweisbar ist. Die Kontamination mit mikrobiellen Keimen ist dabei in einem deutlich kürzeren Zeitraum möglich, als bei der herkömmlichen Methode durch Bestimmung der KbE. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es nun in kürzerer Zeit festzustellen, ob und in welchem Ausmaß eine wässrige Flüssigkeit mit Mikroorganismen belastet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten. Dabei kommen alle wässrigen Flüssigkeiten in Frage, die bei mindestens einer Temperatur, die mindestens 10°C und höchstens 90°C betragen kann, in flüssigem Aggregatszustand vorliegt. In bevorzugten wässrigen Flüssigkeiten beträgt der Anteil an H₂O mindestens 50%, besonders bevorzugt mehr als 70%. Ganz besonders bevorzugte wässrige Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung sind Trink-, Mineral-, Ab-, Grund-, und/oder Oberflächenwasser.
Die wässrige Flüssigkeit wird dabei auf Belastungen mit Mikroorganismen untersucht. Unter Mikroorganismen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind einzellige Lebewesen zu verstehen und umfassen Bakterien, Archaeen, sowie einzellige Pilze, Algen und Protozoen. Bevorzugt handelt es sich um Mikroorganismen, die in wässriger Umgebung teilungsfähig sind. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Mikroorganismen um Indikatorkeime, insbesondere aerobe mesophile Keime, vom Stamm E. coli, Enterokokken, den Stamm Clostridium perrigens, einzellige Pilze und/oder Protozoen.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Sensitivität auf, die nicht schlechter ist, als die Sensitivität der herkömmlichen KbE-Bestimmung. Die Mindestnachweisgrenze des vorliegenden Verfahrens liegt bei einem Mikroorganismus pro ml (Milliliter) zu testender wässriger Flüssigkeit. Die Sensitivität des Verfahrens kann deutlich höher liegen. Mit einer Mindestnachweisgrenze von einem Mikroorganismus pro ml zu testender Flüssigkeit erfüllt das vorliegende Verfahren alle Anforderungen, die durch gesetzliche Vorgaben und/oder Richtlinien an ein Verfahren zu stellen sind, welches geeignet ist verlässlich die hygienische Qualität von Trinkwasser zu bestimmen (siehe Tabelle 1).
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Temperaturänderung oder Wärmeproduktion einer Probe einer zu testenden wässrigen Flüssigkeit in einem Kalorimeter kontinuierlich gemessen. Unter „kontinuierlicher Messung” ist dabei eine Messung mit mehr als einem Messpunkt zu verstehen, die über einen vorher festgelegten Zeitraum die Temperaturänderung oder Wärmeproduktion einer zu testenden wässrigen Flüssigkeit unter gleichbleibenden, kontinuierlichen Bedingungen erfasst. Dabei können die Temperaturänderungen oder Wärmeproduktionen ununterbrochen aufgenommen werden oder zu ausgewählten Zeitpunkten während des Messzeitraums bestimmt werden. Insbesondere kann sich die kontinuierliche Messung gemäß Schritt a) dadurch auszeichnen, dass sich dieselbe Probe ununterbrochen in einem Kalorimeter befindet und kontinuierlich oder zu ausgewählten Zeitpunkten vermessen wird oder dem Kalorimeter zu ausgewählten Zeitpunkten Proben einer unter definierten, gleichbleibenden Bedingungen kontinuierlich kultivierten, zu testenden wässrigen Flüssigkeit zur Messung zugeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt also z. B. die Entnahme einer Probe und Verbringung dieser Probe in ein Kalorimeter, in welchem dieselbe Probe unter definierten Bedingungen über den gesamten Untersuchungszeitraum verbleibt und kalorimetrische Messungen ausschließlich an dieser Probe durchgeführt werden. Alternativ kann die zu testende wässrige Flüssigkeit unter definierten Bedingungen kultiviert werden und zu ausgewählten Zeitpunkten eine Probe der kultivierten wässrigen Flüssigkeit entnommen und einer kalorimetrischen Messung unterzogen werden. In beiden Fällen werden mittels erfindungsgemäßer kontinuierlicher kalorimetrischer Messung die über einen vorher festgelegten Zeitraum auftretenden Temperaturänderungen oder Wärmeproduktionen einer zu testenden wässrigen Flüssigkeit unter gleichbleibenden Bedingungen erfasst.
Die Messung von Temperaturänderungen der Probe erfolgt kalorimetrisch. Kalorimeter, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut eignen sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugt sind Mikrokalorimeter, Chip- und/oder Nanokalorimeter sowie Anordnungen von Chipkalorimetern auf einem Array (sogenannte „Enthalpy Arrays”).
Das Probenvolumen, welches eingesetzt werden kann, hängt im Wesentlichen vom verwendeten Kalorimeter ab. Bevorzugt werden Probenvolumina eingesetzt, die ausgewählt sind aus einem Bereich von 0,5 nl bis 100 ml. Besonders bevorzugte Probenvolumina sind ausgewählt aus einem Bereich von 5 μl bis 10 ml, ganz besonders bevorzugt 10 μl bis 4 ml. Bevor die kalorimetrische Messung beginnt, kann die Probe mit anderen Flüssigkeiten wie H₂O, einem Nährmedium, und/oder Antibiotikalösungen vermischt werden, z. B. um das Gesamtvolumen an ein gewünschtes Volumen für ein bestimmtes Kalorimeter anzupassen oder um selektive, definierte Kulturbedingungen für die Mikroorganismen der Probe zu schaffen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die kontinuierliche Messung der Probe im Kalorimeter über einen festgelegten Zeitraum. Insbesondere wird die kontinuierliche Messung gemäß Schritt a) über einen Zeitraum von ≤ 24 h, bevorzugt von ≤ 20 h, besonders bevorzugt von ≤ 12 h durchgeführt.
In Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die kontinuierliche Messung bei einer Ausgangstemperatur bei der die Probe in flüssigem Aggregatszustand vorliegt und ein Wachstum von Mikroorganismen nicht ausgeschlossen ist. Bevorzugt wird die kontinuierliche Messung bei einer Ausgangstemperatur ausgewählt aus dem Bereich von 10°C bis 90°C durchgeführt, besonders bevorzugt ausgewählt aus einem Bereich von 15°C bis 45°C, ganz besonders bevorzugt aus einem Bereich von 20°C bis 36°C.
In einem zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Zeitpunkt bestimmt, zu dem eine signifikante Änderung der Wärmeleistung der Probe erreicht ist. Eine signifikante Änderung der Wärmeleistung ist dann erreicht, wenn die Änderung der Wärmeleistung nicht mehr im Toleranzbereich der Messgenauigkeit des eingesetzten Kalorimeters liegt. Insbesondere liegt eine signifikante Änderung der Wärmeleistung gemäß Schritt b) vor bei einer Änderungsrate (±) der Wärmeleistung von ≥ 0,1 mW/l pro Stunde Inkubationszeit, bevorzugt ≥ 1 mW/l pro Stunde Inkubationszeit, besonders bevorzugt ≥ 3 mW/l pro Stunde Inkubationszeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, dass der Probe während des Zeitraums der kontinuierlichen Messung gemäß Schritt a) eine ausreichende Menge an Sauerstoff zur Verfügung steht, um einen im Wesentlichen aeroben Stoffwechsel von Mikroorganismen zu ermöglichen. Zwar können einige Mikroorganismen sowohl unter aeroben und anaeroben Bedingungen wachsen, eine schnellere Wachstumsrate und damit eine frühere Detektion einer signifikanten Änderung der Wärmeleistung der Probe lässt sich dann erreichen, wenn besonders günstige Wachstumsbedingungen herrschen. Dazu kann insbesondere auch gehören, dass der Probe während der kontinuierlichen Messung gemäß Schritt a) eine ausreichende Menge an Nährstoffen zur Verfügung steht, um eine Vermehrung der Mikroorganismen zu ermöglichen.
Neben der Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf eine Gesamtbelastung mit Mikroorganismen, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu selektiv die Belastung mit ausgewählten Mikroorganismen zu untersuchen. Dies wird im erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise dadurch erreicht, dass die Probe während des Zeitraums der kontinuierlichen Messung gemäß Schritt a) definierten Bedingungen ausgesetzt ist, die bevorzugt das Wachstum bestimmter ausgewählter Mikroorganismen ermöglicht. Bevorzugte Bedingungen sind selektive Medien (enthaltend ausgewählte Kohlenstoffquellen, ausgewählte Energiequellen, ausgewählte Nährsalzzusammensetzungen, Zugabe von Antibiotika oder Bakteriophagen) und/oder anaerobe Bedingungen (ausgewählte terminale Elektronenakzeptoren z. B. Nitrat, Sulfat, dreiwertige Eisenverbindungen etc.). Dem Fachmann sind geeignete Bedingungen aus der Literatur bekannt. Die Auswahl geeigneter Bedingungen hängt im Wesentlichen von der Natur der ausgewählten und zu untersuchenden Mikroorganismen ab.
In einer bevorzugten Ausführungsform erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die parallele Messung mehrerer gleicher oder verschiedener Proben. Die kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Probe so in das Kalorimeter aufgenommen wird, dass mehrere gleiche oder unterschiedliche Proben räumlich getrennt durch inerte Mediumschichten vorliegen und funktional so angeordnet sind, dass die Schritte a) und b) für mehrere Proben parallel mit einem Kalorimeter durchführbar sind. Dabei kann eine Messampulle zum Einsatz kommen, die zuerst mit einer ersten Probe beschickt wird, dann mit einer Schicht eines inerten Mediums versehen wird, wobei diese Schicht so aufgebracht wird, dass die erste Probe abgeschlossen unter der Mediumschicht vorliegt. Dann wird die Messampulle mit einer zweiten Probe beschickt, die ggf. wieder mit einer Schicht eines inerten Mediums überschichtet wird, usw. bis die gewünschte Anzahl an parallel zu messenden Proben getrennt durch inerte Mediumschichten in der Messampulle angeordnet sind.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu messende Probe dem Kalorimeter automatisch, bevorzugt zu vorher ausgewählten Zeitpunkten, zugeführt. Diese Variante des Verfahrens eignet sich besonders für den Einsatz in Verfahren, bei denen die kontinuierliche Messung nicht ununterbrochen an derselben Probe durchgeführt wird, sondern dem Kalorimeter zu ausgewählten Zeitpunkten Proben einer unter definierten Bedingungen kontinuierlich kultivierten, zu testenden wässrigen Flüssigkeit zur Messung zugeführt werden.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in einem weiteren Schritt das Maximum und/oder das Minimum der gemessenen Wärmeleistungskurve oder die Wärmeproduktion zu einem definierten Zeitpunkt, z. B. zu Beginn der Messung oder in einem festgelegten Zeitraum und/oder zu einem bestimmten Zeitpunkt, bestimmt. Diese Angabe kann dann als Maß für die semi-quantitative Bestimmung der Zahl an Mikroorganismen herangezogen werden.
Das bisher beschriebene Verfahren kann mit einem zusätzlichen Schritt, in dem neben der kalorimetrischen Messung weitere Signale aufgenommen werden, insbesondere Signale einer optischen Transmission, des Sauerstoffpartialdrucks und/oder der Kohlendioxidentwicklung ausgeführt werden. Die Kombination mit solchen anderen Signalwerten, die ebenfalls kontinuierlich und neben oder während der kalorimetrischen Messung erhoben werden können, erlaubt Rückschlüsse auf beispielsweise unterschiedliche Metabolismen und/oder Kopplungen in der Elektronentransportphosphorylierung. Mithilfe dieser zusätzlichen Signalwerte ist eine Zuordnung der festgestellten Mikroorganismenbelastung zu bestimmten Mikroorganismusgruppen oder -typen möglich. Solche Zusammenhänge sind dem Fachmann bekannt (siehe Hansen LD et al. (2004) Use of calorespirometric ratios, heat per CO₂ and heat per O₂, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta 422, 55–61) und er hat keine Schwierigkeiten geeignete Signalwerte auszuwählen und zu erfassen.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden zur bakteriologischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten. Dabei konzentriert sich die Untersuchung auf Mikroorganismen bakteriellen Ursprungs. Durch geeignete Wahl an Bedingungen werden bevorzugt bakterielle Mikroorganismen erfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden zur hygienischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf eine Belastung mit anaerob wachsenden Mikroorganismen. Dabei werden die Bedingungen so gewählt, dass sich bevorzugt anaerob wachsende Mikroorganismen vermehren können. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Probe während der kontinuierlichen Messung unter weitgehendem Ausschluss von O₂ gehalten wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden zur semi-quantitativen Bestimmung der Belastung von wässrigen Flüssigkeiten mit Mikroorganismen. Dabei können neben dem Maximum und/oder dem Minimum der gemessenen Wärmeleistungskurve oder der Wärmeproduktion zu einem definierten Zeitpunkt, z. B. zu Beginn der Messung oder in einem festgelegten Zeitraum und/oder zu einem bestimmten Zeitpunkt, auch Signalform und/oder Signalhöhe herangezogen werden. Diese Angabe kann dann zur semi-quantitativen Bestimmung der Zahl an Mikroorganismen verwendet werden.
Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden zur Bestimmung der Identität von Mikroorganismen in wässrigen Flüssigkeiten.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung eines Kalorimeters in einem der erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Figuren
1. Wärmeleistung unterschiedlicher Modelltrinkwässer (Messtemperatur 36°C; bakterielle Kontamination durch E. coli K12).
2. Zusammenhang zwischen den KbE und dem Auftreten charakteristischer Wärmeleistungssignale (z. B. Beginn, 1. Minimum, 2. Minimum der Wärmeproduktion) für unterschiedlicher Modelltrinkwässer (Messtemperatur 36°C; bakterielle Kontamination durch E. coli K12)
3. Detektionsgrenzen der mikrobiellen Kontamination in 2 unterschiedlich belasteten Modelltrinkwässern (Messtemperatur 36°C; bakterielle Kontamination durch E. coli K12)
4. Ausschnitt der Wärmeleistung eines Trinkwassers.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
1 ml eines Modelltrinkwassers wird mit 2 ml LB-Medium steril vermischt und in die 4 ml Messampulle eines kommerziell verfügbaren Kalorimeters (z. B. TAM II, Thermometric AB, Schweden) getan. Die Ampulle wird enthält einen Luftraum von 1 ml. Sie wird wie in der Gerätebeschreibung angegeben behandelt. Die Messtemperatur war 36°C (Temperaturfestlegung der deutschen Trinkwasserverordnung). Das Nährmedium enthält 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und ist auf einen pH Wert von 7,0 ± 0,2 eingestellt.
Die Modellwässer zum Test der Methode wurden wie folgt vorbereitet. Am Tag vor der Messung wurde eine Kolonie von E. coli K12 auf LB-Medium bei 36°C vorkultiviert. Diese Vorkultur wurde wie folgt mit abgekochten Trinkwasser (Probenahmestelle: Wasserhahn im Labor 1.01 im Gebäude 4.1 des Helmholtzzentrums für Umweltforschung – UFZ, Probenahmedatum: 22.02.2008 8:00) steril bei Raumtemperatur gemischt.
C: 1 ml Vorkultur + 1 l abgekochtes Trinkwasser
A: 0.1 ml Vorkultur + 1 l abgekochtes Trinkwasser
B: 1 ml Modellwasser A + 1 l abgekochtes Trinkwasser
C_ALT: 0.1 ml Modellwasser A + 1 l abgekochtes Trinkwasser
Die Modellwässer wurden parallel mit der konventionellen Methode (KbE) untersucht. Die Ergebnisse der kalorimetrischen Messungen und den Vergleich zu den KbE (nach 48 h und 36°C) zeigt . Sobald sich das Wärmesignal signifikant von der Basislinie unterscheidet, zeigt es eine bakterielle Kontamination an.
Der Zeitpunkt zu dem das geschieht, ist proportional zum Logarithmus der KbE ( ). Auch andere charakteristische Signale in der Wärmeproduktion (z. B. das 1. und 2. Minimum) sind proportional zum Logarithmus der Wärmeproduktion und folglich prinzipiell geeignet, eine mikrobielle Kontamination zu quantifizieren ( ).
In ist zu sehen, dass selbst eine Kontamination mit nur einem Keim (1,3 ± 0,6 KbE) schon nach 11,8 Stunden detektierbar ist. Grenzwert/Richtwert relevante Keimzahlen sind schon nach etwas mehr als 7 h detektierbar. Im Kontrollexperiment (konventionellen Methode – KbE) sieht man selbst nach 24 h noch keine Kolonien. Damit ist die Kalorimetrie der konventionellen Methode, die erst nach 48 h eine finale Aussage zulässt, deutlich überlegen.
Analoge Untersuchungen wurden bei 20°C (andere Temperaturfestlegung der deutschen Trinkwasserverordnung) durchgeführt. Diese Messungen bestätigen die Befunde bei 36°C qualitativ. Zwar verlängern sich die Detektionszeiten sowohl des neuen als auch des konventionellen Verfahrens, allerdings wird die Überlegenheit des neuen Verfahrens noch etwas deutlicher.
Beispiel 2:
Ein Trinkwasserprobe (1 ml, Probenahmestelle: Wasserhahn im Labor 1.01 im Gebäude 4.1 des Helmholtzzentrums für Umweltforschung – UFZ, Probenahmedatum: 25.03.2008 8:00) wurde mit 2 ml LB-Medium steril vermischt und in die 4 ml Messampulle eines kommerziell verfügbaren Kalorimeters (TAM II, Thermometric AB, Schweden) getan. Die Ampulle wird enthält einen Luftraum von 1 ml. Sie wird wie in der Gerätebeschreibung angegeben behandelt. Die Messtemperatur war 36°C. Das Nährmedium entspricht Beispiel 1. Die Wasserprobe wurde parallel nach der konventionellen Methode untersucht. Nach 24 Stunden war mit Hilfe der konventionellen Methode noch keine Kontamination erkennbar. Nach 48 Stunden wurden 7,0 ± 3,6 KbE gezählt. Im Gegenzug dazu war die bakterielle Kontamination schon nach 22 Stunden detektierbar, indem sich die Wärmeproduktion signifikant von der Basislinie unterschied ( ).
Eine analoge Untersuchung erfolgte mit abgekochtem Trinkwasser. Hier wurde erwatungsgemäß keine Wärmeproduktion angezeigt.

Claims

Verfahren zur kalorimetrischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf Belastungen mit Mikroorganismen mit einer Nachweisgrenze von einem Mikroorganismus pro ml zu testender wässriger Flüssigkeit, umfassend die Schritte: a) kontinuierliche Messung von Temperaturänderungen oder Wärmeproduktionen einer Probe einer zu testenden wässrigen Flüssigkeit in einem Kalorimeter; b) Bestimmung des Zeitpunktes zu dem eine signifikante Änderung der Wärmeleistung der Probe erreicht ist, wobei eine signifikante Änderung vorliegt bei einer Änderungsrate (±) der Wärmeleistung von ≥ 0,1 mW/l pro Stunde Inkubationszeit.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass die zu testende wässrige Flüssigkeit ein Trink-, Mineral-, Ab-, Grund- und/oder Oberflächenwasser ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die Mikroorganismen aerobe mesophile Keime, vom Stamm E. coli, Enterokokken, der Stamm Clostridium perrigens, einzellige Pilze und/oder Protozoen sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die Probe ein Volumen umfasst ausgewählt aus dem Bereich von 0,5 nl bis 100 ml.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass das Kalorimeter ein Chip- und/oder Nanokalorimeter oder eine Anordnung von Chipkalorimetern auf einem Array (sogenannter „Enthalpy Array”) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die kontinuierliche Messung gemäß Schritt a) sich dadurch auszeichnet, dass sich dieselbe Probe ununterbrochen in einem Kalorimeter befindet und kontinuierlich oder zu ausgewählten Zeitpunkten vermessen wird oder dem Kalorimeter zu ausgewählten Zeitpunkten Proben einer unter definierten Bedingungen kontinuierlich kultivierten, zu testenden wässrigen Flüssigkeit zur Messung zugeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die kontinuierliche Messung gemäß Schritt a) über einen Zeitraum von ≤ 24 h, bevorzugt von ≤ 20 h, besonders bevorzugt von ≤ 12 h durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die kontinuierliche Messung gemäß Schritt a) mit einer Ausgangstemperatur ausgewählt aus dem Bereich von 10°C bis 90°C durchgeführt wird, bevorzugt bei einer Temperatur von 15°C bis 45°C, besonders bevorzugt von 20°C bis 36°C.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die signifikante Änderung der Wärmeleistung gemäß Schritt b) bei einer Änderungsrate (±) der Wärmeleistung von ≥ 1 mW/l pro Stunde Inkubationszeit, besonders bevorzugt ≥ 3 mW/l pro Stunde Inkubationszeit vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass der Probe während des Zeitraums der kontinuierlichen Messung gemäß Schritt a) eine ausreichende Menge an Sauerstoff zur Verfügung steht, um einen im Wesentlichen aeroben Stoffwechsel von Mikroorganismen zu ermöglichen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass der Probe während er kontinuierlichen Messung gemäß Schritt a) eine ausreichende Menge an Nährstoffen zur Verfügung steht, um eine Vermehrung der Mikroorganismen zu ermöglichen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die Probe während des Zeitraums der kontinuierlichen Messung gemäß Schritt a) definierten Bedingungen ausgesetzt ist, die bevorzugt das Wachstum bestimmter ausgewählter Mikroorganismen ermöglicht, bevorzugte Bedingungen sind selektive Medien und/oder anaerobe Bedingungen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die Probe so in das Kalorimeter aufgenommen wird, dass mehrere gleiche oder unterschiedliche Proben räumlich getrennt durch inerte Mediumschichten vorliegen und funktional so angeordnet sind, dass die Schritte a) und b) für mehrere Proben parallel mit einem Kalorimeter durchführbar sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass die Probe dem Kalorimeter automatisch zugeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass in einem weiteren Schritt das Maximum und/oder das Minimum der gemessenen Wärmeleistungskurve oder die Wärmeproduktion zu einem definierten Zeitpunkt bestimmt wird und als Maß für die semi-quantitative Bestimmung der Zahl an Mikroorganismen herangezogen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, dass neben der kalorimetrischen Messung weitere Signale aufgenommen werden, insbesondere Signale einer optischen Transmission, des Sauerstoffpartialdrucks und/oder der Kohlendioxidentwicklung.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur bakteriologischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten.
Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 12 zur hygienischen Untersuchung von wässrigen Flüssigkeiten auf eine Belastung mit anaerob wachsenden Mikroorganismen.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur semi-quantitativen Bestimmung der Belastung von wässrigen Flüssigkeiten mit Mikroorganismen.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Bestimmung der Identität von Mikroorganismen in wässrigen Flüssigkeiten.
Verwendung eines Kalorimeters in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.