EP3322822A1 - Verfahren zum bestimmen einer relativen häufigkeit von verschiedenen genen oder chromosomen eines genoms in einer probe - Google Patents

Verfahren zum bestimmen einer relativen häufigkeit von verschiedenen genen oder chromosomen eines genoms in einer probe

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Publication number
EP3322822A1
EP3322822A1 EP16751173.2A EP16751173A EP3322822A1 EP 3322822 A1 EP3322822 A1 EP 3322822A1 EP 16751173 A EP16751173 A EP 16751173A EP 3322822 A1 EP3322822 A1 EP 3322822A1
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EP
European Patent Office
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dna
chromosomes
different genes
amplified
light
Prior art date
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Pending
Application number
EP16751173.2A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd-Peter ERNST
Jörg SCHRADER
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of EP3322822A1 publication Critical patent/EP3322822A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the invention relates to a method for determining a relative abundance of different genes and / or chromosomes of a genome from which DNA originates in a sample.
  • the present invention relates to a method having the features of the preamble of independent claim 1.
  • the determination of the relative abundance of different chromosomes of a genome can be used to detect trisomies.
  • the determination of the relative abundance of different genes of a genome can be used to identify particular mutations of the genome.
  • apoptotic DNA of the fetus can also be found in the blood plasma-free blood plasma, which can be separated from a blood sample of a pregnant woman, in addition to apoptotic DNA of the pregnant woman.
  • the sex of the fetus can be determined by examining the apoptotic DNA contained in the blood plasma for the presence of portions of the DNA which are present only in the Y chromosome and thus specific for the presence of the Y chromosome in the genome of the fetus .
  • the quantitative polymerase chain reaction (PKR) apoptotic DNA can be examined for the relative abundance of the fetal chromosomes over the pregnant women's chromosomes, for example in order to induce trisomy 21 in the fetus recognize because in a fetus with aneuploidy opposite A fetus with euploidy has an increased relative concentration of fetal DNA and trisomy 21 is the most common form of aneuploidy.
  • the apoptotic DNA in a pregnant woman's blood plasma sample is quantified by quantitative PCR in a method having the features of the preamble of independent claim 1 on the relative abundance of the most likely trisomy-affected chromosomes 13, 18 and 21 of the human genome to investigate.
  • a quantitative PKR the absolute number of amplified specific portions of DNA from each of chromosomes 13, 18 and 21 is determined. If there is a significant increase in the relative abundance of one of these chromosomes, there is trisomy 13, 18, and 21, respectively, in the fetus.
  • the relative frequency of the affected chromosome is increased by 5% because it is not only 0.9 times 2 times that of the Mother present and 0.1 times 2 times from the fetus, d. H. a total of 20 times, but 0.9 times 2 times from the mother and 0, 1 times 3 times from the fetus, d. H. a total of 21 times.
  • this 5% difference in the relative abundance of chromosomes in the study for trisomy of the fetus must be resolved safely.
  • DNA is separated from a suitable sample from the child but subjected to PCR in parallel with DNA from a suitable sample from the potential father to amplify portions of DNA that vary from human to human.
  • these are regions of DNA in which variable repetitions of certain base pair sequences occur, that is, short tandem repeats (STR), with the number of repeats varying from human to human.
  • STR short tandem repeats
  • the reinforced sections are coupled with a luminescence marker.
  • the amplified portions of the DNA are subjected to electrophoresis.
  • the amplified sections are found after electrophoresis runs, which depend on the exact number of repetitions of the sequence of base pairs. This results in the registration of the fluorescent light of the luminescence markers different line patterns depending on the genome. If the lines in the father's line pattern also occur at a significant frequency in the child's line pattern, the proof of paternity is provided.
  • a trisomy is then detected by detecting either three different lengths of STR with fluorescence intensities in the ratio 1: 1: 1, representing three different genetic information, or two different length STRs with fluorescence intensities in the ratio 2: 1; different genetic information is available on the STR, of which one is twice as common as the other.
  • Cytochrome P450 is an enzyme in the liver that was found in 1958 and has a UV absorption maximum at 450 nm in the presence of reducing substances, which gave it its name.
  • the enzyme cytochrome P450 is encoded by the gene P450 CYP2D6 on the chromosome 22 of the human genome, whereby the gene P450 CYP2D6 in different which persons are present in different numbers and forms.
  • CYP2D6 substrates are normally degraded in the liver.
  • CYP2P6 substrates are hardly degraded in the liver.
  • the corresponding persons are called Poor Metabolizer (PM).
  • PM Poor Metabolizer
  • CYP2P6 substrates in the liver are reduced in size.
  • IM Intermediate Metabolizers
  • UM Ultrarapid Metabolizer
  • the invention has for its object to provide a method having the features of the preamble of independent claim 1, with the relative frequency of genes and / or chromosomes in a sample can be determined with sufficient accuracy without performing a complex quantitative PCR, so that For example, a trisomy of a fetus can be detected by the apoptotic DNA of the fetus in a blood plasma sample of his mother.
  • a method for determining a relative abundance of different genes and / or chromosomes of a genome from which DNA originates in a sample in a common amplification step at least one specific portion of the DNA of each of the different genes and / or chromosomes is amplified.
  • the at least one amplified specific portion of the DNA from each of the different genes and / or Chromosomes are labeled with a luminescence marker. This marking can be done in the common amplification step, but in principle also later.
  • the amplified specific sections of DNA from the different genes and / or chromosomes are separated by electrophoresis.
  • the luminescence light is measured cumulatively as the amount of light for each moving in a band or a line in the electrophoresis copies. This amount of light corresponds to a certain amount of the specific sections of DNA from the particular gene or chromosome. With sufficient numbers of the amplified specific sections of the DNA from the different genes and / or chromosomes can be deduced from this result on a relative frequency of different genes and / or chromosomes of a genome, for example, the sex of a fetus from a blood plasma sample of his mother determine.
  • the relative abundance of the Y chromosome to the X chromosome and / or another chromosome in the blood plasma sample is to be determined.
  • the steps of the method according to the invention described so far may also be sufficient to detect the presence of a trisomy in the fetus. For this purpose, however, it may be helpful to carry out further steps in the method according to the invention, as described below.
  • the steps of the method according to the invention described so far are basically sufficient to detect the presence of a gene multiplication of a gene in a genome from which the DNA originates in the examined sample. Similarly, the extent of gene multiplication can be analyzed against at least one other gene that serves as a benchmark.
  • the steps of the method according to the invention described so far basically correspond to those which are also used when carrying out a known and established paternity test. However, differences exist in that the portions of the DNA amplified in the common amplification step are specific portions of the DNA from the different genes and / or chromosomes.
  • the substances which, in the common amplification step, fix the amplified specific portions of the DNA of each of the different genes and / or chromosomes have to be adapted to the method according to the invention.
  • the evaluation must be focused on the recorded amounts of light.
  • the separation of the amplified specific portions of the DNA from the various genes and / or chromosomes can be carried out in particular by known methods of gel or capillary electrophoresis. These are established techniques for which sophisticated laboratory equipment is available.
  • the specific sections of the DNA of each of the different genes and / or chromosomes can be amplified in particular in a common PKR. Immediately with this PKR, the amplified specific sections of the DNA can be labeled with the luminescent marker.
  • primers to be amplified are to be amplified for specific sections of DNA and luminescence markers. How to do this is part of the expertise of a specialist in the field of genetic testing.
  • the PKR can double a number of sections of DNA from each of the different genes and / or chromosomes between 15 and 30 times. With a 20-fold duplication, 1 million copies of a section of DNA present in the sample are created. Even if these copies are not completely present in measuring the amount of light from the luminescent label of the corresponding portion of the DNA, because e.g. For example, if only part of the product of the PCR is subjected to electrophoresis to separate the DNA segments from the various genes and / or chromosomes, this large number of copies will allow an accurate assignment of the amount of light measured to a particular number of the particular DNA segment the sample.
  • PKR should be avoided from saturating so that certain portions of the DNA from the various chromosomes are no longer completely duplicated in the last few cycles of PKR, thereby increasing the correlation between the amount of light measured and the actual number of segments DNA gets lost in the sample.
  • the amplified specific portions of the DNA from the various genes and / or chromosomes can be labeled with the same luminescent dye because the separation of the amplified specific portions of the DNA from the various genes and / or chromosomes is by electrophoresis. This also simplifies the measurement of the amount of light from the luminescent dye and achieves an immediate comparability of the measured amounts of light. In principle, however, several different luminescent dyes can also be used in the process according to the invention.
  • the amount of light measured in relation to the relative abundances of the various genes and / or chromosomes can be multiplied. be tigt.
  • each of the amplified specific sections of DNA from each of the different genes and / or chromosomes should be labeled with a luminescence marker; all amplified specific sections of the DNA must be separated by gel electrophoresis; for each of the amplified specific portions of the DNA, separately measuring a quantity of light of luminescent light from the luminescent marker; and prior to determining the relative abundance of the various genes and / or chromosomes, the amounts of light separately measured for the several specific sections of DNA must be added together for the DNA of each of the different genes and / or chromosomes. In this way, the error that exists between the ratio of the amounts of light and the relative frequency of genes and / or chromosomes of interest is substantially reduced.
  • the individual portions are independently amplified and correspond to multiple, but under exactly the same constraints, performance of the method of the invention relative to the same sample.
  • the number of specific portions of the DNA of each of the various genes and / or chromosomes that are amplified in the common amplification step is the same.
  • this same number may be in a range from 3 to 40, the upper limit being determined by the maximum number of sections of different length that can be separated in electrophoresis, and also by the maximum number of possible non-overlapping sections in the case of genes.
  • 40 sections of the DNA are amplified by three different chromosomes, ie a total of 120 different sections have to be separated by electrophoresis, the different sections are only a few base pairs side by side.
  • a number of about 10 specific stretches of DNA from each of the different chromosomes is found. This results in 30 different sections in three different chromosomes, which can be amplified simultaneously by established PKR and easily separated by established electrophoresis.
  • all specific portions of the DNA differ by at least 4, more preferably 7 or 10 base pairs in length, to allow easy separability of the portions in electrophoresis.
  • the specific portions of the DNA being amplified are vital portions of the DNA, ie, portions of DNA identical to each genome when the subject is viable. This implies that the amplified specific sections of the DNA each have a fixed length and are correspondingly found in electrophoresis after certain running distances.
  • the steps of separating, marking and measuring may also be performed separately for several partial products of the common amplification step and before the step of determining, the amounts of light for the DNA measured for the plurality of partial product quantities are added together by the same of the different genes and / or chromosomes. Also, this increases the amount of light and reduces the error, as with multiple amplified sections of DNA from each of the various genes and / or chromosomes.
  • the steps of separating and measuring for the various partial products do not take place under exactly the same conditions, and the overall expense of carrying out the method according to the invention increases by the additional parallel steps of separating and measuring.
  • the method of the invention is particularly useful for determining the ratio of chromosomes to apoptotic DNA in a blood plasma sample to conclude from analysis of a pregnant woman's blood plasma for trisomy in the fetus.
  • the various chromosomes whose relative abundance is determined may include chromosome 13 and / or chromosome 18 and / or chromosome 21 of the human genome. Trisomy 13, 18 and 21 are the most common forms of trisomy in humans, and they do not occur simultaneously.
  • apoptotic DNA which is contained in total in the blood plasma sample than 10%, can reliably detect a trisomy of the fetus.
  • the luminescence light quantities of light separately measured for the various specific portions of the DNA may be multiplied by normalization factors including different gains, separations, labels, prior to the step of determining the relative frequencies of the genes and / or chromosomes of interest and / or compensate for measurements.
  • normalization factors can be readily determined by subjecting samples having known amounts of the specific portions of DNA to the method of the invention.
  • the method of the invention determines the relative abundance of a gene which may be present in an active and / or inactive variant, then the relative abundance of the gene in its active variant and / or in its inactive variant in the genome can be determined by DNA be examined in the sample.
  • the sections of the DNA to be amplified have to be designed specifically for the respective variant of the DNA of interest.
  • a comparative standard it makes sense to use at least one vital gene in which no gene multiplication occurs.
  • the amount of light measured by the labeled enhanced portion is zero, 0.5, or n times, depending on the type of metabolizer as large as that of the labeled enhanced portion of the comparative scale gene.
  • the relative abundance of a gene is determined by the method according to the invention, this may mean that the relative abundance of a complete functional gene is determined. However, it may also mean that the relative abundance of a substantial part of a gene, ie a so-called motif or locus, is determined. It may also be the relative frequency of the motif or locus within a larger gene.
  • the method according to the invention also differs in these cases from known paternity tests in which specific sections of the DNA are amplified which vary from person to person and have no fixed length, because they are so-called Short Tandem Repeats (STR).
  • STR Short Tandem Repeats
  • Fig. 1 is a flowchart of the method according to the invention.
  • FIG. 2 shows the result of a gel electrophoresis and a measurement of light quantities in the method according to the invention according to FIG. 1.
  • FIG. 1 of an embodiment of the method according to the invention starts from a blood sample 1.
  • a separation step 2 in particular, blood cells are separated from the blood sample 1, and a blood plasma sample 3 containing only apoptotic DNA is obtained.
  • a PKR 4 the blood plasma sample, along with polymerase 5, primers 6 and luminescent dye, is exposed to 7 thermal cycles to initiate a polymerase chain reaction to amplify specific portions of the DNA of the various chromosomes of interest. This typically happens in a so-called thermocycler. With suitable formation of the primer 6, the luminescent dye 7 added to the PKR 4 marks the amplified sections of the DNA.
  • the PKR product 8 thus obtained is subjected to electrophoresis 9 to obtain the various Segments of DNA that were amplified in the PKR 4 to separate.
  • the primers 6 are to be tuned in such a way that the amplified sections are of different lengths and accordingly migrate at different speeds and thus differently far in the electrophoresis 9.
  • measuring 1 1 light quantities are measured by the luminescence marker 7 for the individual DNA sections 10 separated by the electrophoresis 9. It is understood that the amounts of light from the luminescent dye are measured for the same time for the separated DNA sections 10 and under the same conditions.
  • At least the light quantity measurements are carried out under defined conditions, which allow a conclusion on the number of contained in the blood plasma sample 3 sections of the DNA.
  • the amounts of light 12 obtained from the measurement 1 1 are normalized in a step normalizing 13 with respect to the different gains in the PKR 4, separations in the electrophoresis 9 and measurements in the measurement 1 1 by multiplication with normalization factors. From a ratio of sums of the normalized light quantities 14 for the DNA of each of the different chromosomes, then in a step 15, the relative abundance of these chromosomes is determined.
  • FIG. 2 shows schematically above the DNA sections 10 separated as a result of the electrophoresis 9 according to FIG. 1.
  • the various DNA sections have migrated through a different distance s in a gel 16 under the influence of an electric field depending on their length in base pairs bp
  • the separated DNA sections 10 are each four non-overlapping sections of the chromosomes 13, 18 and 21 with equal differences in their length in base pairs bp and correspondingly equal distances ⁇ s in the gel 16.
  • Amounts of light L to luminescent light are applied from each of the separated DNA sections 13-1 to 21-4 in the same order of DNA sections as occur in the gel 16. All amounts of light L are substantially the same.
  • the sum of the amounts of light from the four portions 21 -1 to 21 -4 of the chromosome 21 is larger by 5% than the sums of the amounts of light from the DNA portions 13-1 to 13-4 and 18-1 to 18-4.
  • the sum of the amount of light from the sections of the DNA of chromosome 21 is 5% higher than the sum of the amounts of light L of the luminescent light from the sections of DNA of the other two chromosomes 13 and 18. This corresponds to the presence of a trisomy 21 in a fetus, when the blood sample 1 according to FIG. 1 has been taken by its mother and its apoptotic DNA accounts for 10% of the total apoptotic DNA in the blood plasma sample 3 according to FIG. 1. In trisomy 13 or 18, the amount of light is increased accordingly from the sections of DNA and chromosome 13 and 18, respectively. If no Trisomy 13, 18, or 21, the sums of light levels of the sections of DNA from all three chromosomes are the same.
  • All primers 6 are between 15 and 35 bases long, ideally 18 to 20 bases.
  • the forward primer or the reverse primer at the 5 ' end is coupled to the luminescent dye 7, preferably an isomerically pure luminescent dye, by covalent bonding.
  • Suitable luminescent dyes include, for example, the known luminescent dyes Alexa 350, Alexa 488, AMCA, ATTO 390, fluorescein (5-isomer), 6-FAM, 6-TET, 6-HEX, JOE, NBD, Rhodamine 6G, Rhodamine Green, Rhodamine Red, TAMRA, ROX and Texas Red.
  • the PKR product is denatured.
  • 12 ⁇ formamide, 0.8 ⁇ standard (ROX 500) and 1-10 ⁇ product solution are pipetted together (the most suitable are 1 -2 ⁇ ) and heated in a thermocycler for 2 min at 94 ° C.
  • the samples are then cooled to 4.degree. C. for 5 minutes and then electrophoresed in a GeneMapper_50_POP-7 according to the manufacturer's instructions and the resulting fragments are quantified and analyzed by GeneMapper ID software and GeneScan software under the manufacturer's given conditions.
  • the data is recorded by the software of the manufacturer, and also the process steps are carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the software counts the amounts of light from the luminescent dye and integrally plots the area under the peaks associated with the various separate amplified sections.
  • the GeneMapper and GeneScan software allows these integrated light quantity data to be exported to Excel spreadsheets for further evaluation.
  • sequencers that can be used include the following ABI products:
  • ABI PRISM 3100 or 3100 Avant Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 2.0 Section 5.
  • a ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 1 .0.1 or 1 .1 Section 5.B

Abstract

Zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von dem DNS in einer Probe stammt, werden in einem gemeinsamen Verstärkungsschritt mindestens ein spezifischer Abschnitt (13-1 bis 21 -14) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt, wobei die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21-4) der DNS jeweils eine feste Länge aufweisen. Der mindestens eine verstärkte spezifische Abschnitt (13-1 bis 21-4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome wird mit einem Lumineszenzmarker markiert wird. Die verstärkten spezifischen Abschnitte (18-1 bis 21-4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen werden durch Elektrophorese getrennt. Eine Lichtmenge des Lumineszenzlichts von dem Lumineszenzmarker wird für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessen; und die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms wird aus Verhältnissen der für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lichtmengen bestimmt.

Description

VERFAHREN ZUM BESTIMMEN EINER RELATIVEN HÄUFIGKEIT VON VERSCHIEDENEN GENEN ODER CHROMOSOMEN EINES GENOMS IN EINER PROBE
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von denen DNS in einer Probe stammt. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1.
Die Feststellung der relativen Häufigkeit von verschiedenen Chromosomen eines Genoms kann beispielsweise dazu verwendet werden, Trisomien zu erkennen. Die Feststellung der relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen eines Genoms kann beispielsweise dazu verwendet werden, bestimmte Mutationen des Genoms aufzuzeigen.
STAND DER TECHNIK
Aus der EP 0 994 963 B2 ist es bekannt, dass sich in dem von Blutzellen freien Blutplasma, das von einer Blutprobe einer Schwangeren abgetrennt werden kann, neben apoptotischer DNS der Schwangeren auch apoptotische DNS des Fötus findet. So kann beispielsweise das Geschlecht des Fötus bestimmt werden, indem die in dem Blutplasma enthaltene apoptotische DNS auf das Vorhandensein von Abschnitten der DNS untersucht wird, die nur im Y-Chromosom vorkommen und damit für das Vorhandensein des Y-Chromosoms im Genom des Fötus spezifisch sind. Weiterhin ist es aus der EP 0 994 963 B2 bekannt, dass die apoptotische DNS mit quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (PKR) auf die relative Häufigkeit der Chromosome des Fötus gegenüber den Chromosomen der Schwangeren untersucht werden kann, um beispielsweise eine Trisomie 21 bei dem Fötus zu erkennen, weil bei einem Fötus mit Aneuploidie gegenüber einem Fötus mit Euploidie eine erhöhte relative Konzentration an fötaler DNS auftritt und Trisomie 21 die häufigste Form von Aneuploidie ist.
Außerdem ist es bekannt, die apoptotische DNS in einer Blutplasmaprobe einer Schwangeren durch quantitative PKR in einem Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 auf die relative Häufigkeit der mit der größten Wahrscheinlichkeit von einer Trisomie betroffenen Chromosome 13, 18 und 21 des menschlichen Genoms zu untersuchen. Bei einer solchen quantitativen PKR wird die absolute Anzahl der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der Chromosome 13, 18 und 21 bestimmt. Wenn dabei eine signifikante Erhöhung der relativen Häufigkeit bei einem dieser Chromosome auftritt, liegt eine Trisomie 13, 18 bzw. 21 bei dem Fötus vor. Ausgehend von einem Anteil der fötalen DNS an der gesamten apoptotischen DNS in dem Blutplasma der Mutter von 10 % ist im Falle einer Trisomie des Fötus die relative Häufigkeit des betroffenen Chromosoms um 5 % erhöht, weil es nicht nur 0,9 mal 2 mal von der Mutter vorliegt und 0,1 mal 2 mal von dem Fötus, d. h. insgesamt 20 mal, sondern 0,9 mal 2 mal von der Mutter und 0, 1 mal 3 mal von dem Fötus, d. h. insgesamt 21 mal. Bei der quantitativen PKR muss dieser Unterschied von 5 % in der relativen Häufigkeit der Chromosome bei der Untersuchung auf Trisomie des Fötus sicher aufgelöst werden. Hierzu müssen alle bei der Bestimmung der absoluten Anzahl der einzelnen PKR-Produkte, d. h. der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome, auftretenden Fehler ausreichend reduziert werden. Die für eine solche quantitative PKR benötigten speziellen Mikrotiter-Platten sind sehr kostspielig und bedürfen zur quantitativen Auswertung spezieller Vorrichtungen.
Bei der Durchführung eines sogenannten Vaterschaftstests wird DNS aus einer geeigneten Probe von dem Kind getrennt, aber parallel zu DNS aus einer geeigneten Probe von dem potentiellen Vater einer PKR unterworfen , um Abschnitte der DNS zu verstärken , die von Mensch zu Mensch variieren. In der Regel handelt es sich dabei um Bereiche der DNS, in denen unterschiedlich häufige Wiederholungen bestimmter Sequenzen von Basenpaaren auftreten, d. h. von sogenannten Short Tandem Repeats (STR), wobei die Anzahl der Wiederholungen von Mensch zu Mensch variiert. Bereits bei der PKR werden die verstärkten Abschnitte mit einem Lumineszenzmarker gekoppelt. Nach der PKR werden die verstärkten Abschnitte der DNS einer Elektrophorese unterworfen. Dabei finden sich die verstärkten Abschnitte nach Laufstrecken bei der Elektrophorese, die von der genauen Anzahl der Wiederholungen der Sequenz von Basenpaaren abhängen. Dadurch ergeben sich bei der Registrierung des Fluoreszenzlichts von den Lumineszenzmarkern je nach Erbgut unterschiedliche Linienmuster. Wenn die Linien in dem Linienmuster des Vaters mit einer signifikanten Häufigkeit auch in dem Linienmuster des Kindes auftreten, ist der Vaterschaftsnachweis erbracht.
DIEGO-ALVAREZ, D. [u.a.]: Application of quantitative fluorescent PCR with short tandem repeat markers to the study of aneuploidies in spontaneous miscarriages. Hum. Reprod. (2005) 20 (5) 1235-43 beschreiben die Anwendung von quantitativer fluoreszenter PKR mit STR- Markern zur Untersuchung von Aneuploidien bei spontanen Fehlgeburten. Verschiedene, für bestimmte Chromosome, darunter die Chromosome 13, 1 8 und 21 des humanen Genoms spezifische Abschnitte der DNS aus einer Probe von dem abgegangenen Fötus werden mit quantitativer PKR verstärkt und fluoreszent markiert. Dann werden die verstärkten Abschnitte durch Elektrophorese getrennt, wobei auch die verstärkten Abschnitte mit unterschiedlich langen STR aufgetrennt werden. Eine Trisomie wird dann dadurch erkannt, dass entweder drei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 1 : 1 : 1 detektiert werden, die für drei verschiedene Erbinformationen stehen, oder zwei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 2:1 , die für zwei in Hinblick auf die STR-Länge verschiedene Erbinformationen stehen, von denen die eine doppelt so häufig vorkommt wie die andere.
SAADI , A.V. [u .a.]: Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) for Prenatal Diagnosis of Chromosomal Aneuploidies. Int. J. Hum. Genet. (2010) 10 (1 -3) 121— 129 beschreiben die Anwendung von quantitative Fluoreszenz-PKR zur pränatalen Diagnostik von chromosomalen Aneuploidien. Auch dabei werden verschiedene, für bestimmte Chromosome, darunter die Chromosome 13, 18 und 21 des humanen Genoms spezifische Abschnitte der DNS aus fötalen Zellen mit quantitativer PKR verstärkt und fluoreszent markiert. Dann werden die verstärkten Abschnitte durch Kapillargelelektrophorese aufgetrennt, wobei auch die verstärkten Abschnitte mit unterschiedlich langen STR aufgetrennt werden. Eine Trisomie wird auch hier dadurch erkannt, dass entweder drei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 1 :1 :1 oder zwei unterschiedlich lange STR mit Fluoreszenzintensitäten im Verhältnis 2:1 detektiert werden.
Cytochrom P450 ist ein Enzym in der Leber, das bereits 1958 gefunden wurde und in Anwesenheit reduzierender Stoffe ein UV-Absorptionsmaximum bei 450 nm aufweist, welches ihm seinen Namen gab. Das Enzym Cytochrom P450 ist durch das Gen P450 CYP2D6 auf dem Chromosom 22 des humanen Genoms codiert, wobei das Gen P450 CYP2D6 bei verschie- denen Personen in unterschiedlicher Anzahl und Form vorliegt. Wenn ein oder zwei voll aktive Allele des Gens auf dem Chromosom 22 vorliegen, werden CYP2D6 Substrate (Pharmaka etc.) in der Leber normal abgebaut. Man nennt die entsprechenden Personen Extensive Metabolizer (EM). Liegen zwei mutierte, inaktive Allele dieses Enzymes auf Chromosom 22 vor, werden CYP2P6 Substrate in der Leber kaum abgebaut. Man nennt die entsprechenden Personen Poor Metabolizer (PM). Liegen heterozygot ein defizientes und ein eingeschränkt funktionales Allel vor, werden CYP2P6 Substrate in der Leber reduziert abgebaut. Man nennt die entsprechenden Personen Intermedite Metabolizer (IM). Liegt eine Genmultiplikation des Gens P450 CYP2P6 in Form von bis zu 12 Extrakopien vor, nennt man die betroffenen Personen Ultrarapid Metabolizer (UM), weil sie zu stark erhöhten Stoffwechselleistungen fähig sind. Die verschiedenen Metabolizer-Typen sind bislang nicht durch ein einfaches Verfahren unterscheidbar.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufzuzeigen, mit dem ohne Durchführung einer aufwändigen quantitativen PKR die relative Häufigkeit von Genen und/oder Chromosomen in einer Probe mit ausreichender Genauigkeit bestimmt werden kann, so dass zum Beispiel eine Trisomie eines Fötus anhand der apoptotischen DNS von dem Fötus in einer Blutplasmaprobe seiner Mutter erkannt werden kann.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von denen DNS in einer Probe stammt, wird in einem gemeinsamen Verstärkungsschritt mindestens ein spezifischer Abschnitt der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt. Der mindestens eine verstärkte spezifische Abschnitt der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome wird mit einem Lumineszenzmarker markiert. Dieses Markieren kann in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt, grundsätzlich aber auch später erfolgen. Die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen werden durch Elektrophorese getrennt. Dies impliziert, dass die spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen, die verstärkt werden, so festgelegt werden, dass ihre Trennung durch Elektrophorese möglich ist. Eine Lichtmenge von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker wird für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessen. Aus Verhältnissen der für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lichtmengen wird dann die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms bestimmt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird kein Lumineszenzlicht von einzelnen Kopien der spezifischen Abschnitte der DNS detektiert. Vielmehr wird das Lumineszenzlicht für die sich bei der Elektrophorese jeweils in einem Band oder einer Linie bewegenden Kopien kumulativ als Lichtmenge gemessen. Diese Lichtmenge entspricht einer bestimmten Menge der spezifischen Abschnitte der DNS von dem jeweiligen Gen oder Chromosom. Bei ausreichender Anzahl der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen kann bereits aus diesem Ergebnis auf eine relative Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms rückgeschlossen werden, um beispielsweise das Geschlecht eines Fötus aus einer Blutplasmaprobe seiner Mutter zu bestimmen. Es versteht sich, dass dazu die relative Häufigkeit des Y-Chromosoms gegenüber dem X-Chromosom und/oder einem anderen Chromosom in der Blutplasmaprobe zu bestimmten ist. Die bis hierher beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch schon ausreichend sein, um das Vorliegen einer Trisomie bei dem Fötus zu erkennen. Hierzu kann es jedoch hilfreich sein, weitere Schritte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen, wie sie im Folgenden beschrieben werden.
Die bis hierher beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind grundsätzlich ausreichend, um das Vorliegen einer Genmultiplikation eines Gens bei einem Genom zu erkennen, von dem die DNS in der untersuchten Probe stammt. Ebenso kann der Umfang der Genmultiplikation gegenüber mindestens einem anderen Gen, das als Maßstab dient, analysiert werden. Die bis hierher beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen grundsätzlich denjenigen, wie sie auch bei der Durchführung eines bekannten und etablierten Vaterschaftstests zur Anwendung kommen. Unterschiede bestehen jedoch dahingehend, dass die bei dem gemeinsamen Verstärkungsschritt verstärkten Abschnitte der DNS spezifische Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen sind. Das heißt, es handelt sich um Abschnitte, die das Vorhandensein des jeweiligen Gens und/oder Chromosoms im Ursprungsmaterial der DNS anzeigen, und zwar möglichst unabhängig von der spezifischen Erbinformation des in der Probe enthaltenen Gens und/oder Chromosoms. Ein weiterer Unterschied zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem bekannten Vaterschaftstest besteht darin, dass eine quantitative Auswertung des für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt erfassten Lumineszenzlichts erfolgt und daraus auf die Konzentration der entsprechenden DNS und damit der zugehörigen Chromosome in der Probe geschlossen wird, u nd n icht nu r auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein entsprechender DNS in der Probe. Trotz dieser wesentlichen Unterschiede können grundsätzlich dieselben Ausrüstungen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung wie für den bekannten und etablierten Vaterschaftstest verwendet werden. Anzupassen an das erfindungsgemäße Verfahren sind jedoch die Substanzen, die bei dem gemeinsamen Verstärkungsschritt die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome festlegen. Außerdem ist die Auswertung auf die erfassten Lichtmengen zu konzentrieren. Zudem ist es sinnvoll, eine Eichung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf die Verknüpfung der gemessenen Lichtmenge des Lumineszenzlichts von dem Lumi- neszenzmarker für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit dem Vorhandensein einer bestimmten Menge von Abschnitten der DNS von dem jeweiligen Gen und/oder Chromosom in der Probe vorzunehmen. Durch die grundsätzliche Übereinstimmung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem bekannten und etablierten Vaterschaftstest kann zudem auf den für diesen Vaterschaftstest vorhandenen Zulassungen aufgebaut werden, was die Zulassung des erfindungsgemäßen Verfahrens erleichtert.
Die Trennung der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen kann insbesondere durch bekannte Verfahren der Gel- oder Kapillarelektrophorese erfolgen. Hierbei handelt es sich um etablierte Techniken, für deren Anwendung ausgereifte Laborgeräte zur Verfügung stehen. Die spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromo- some können insbesondere in einer gemeinsamen PKR verstärkt werden. Unmittelbar bei dieser PKR können die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS mit dem Lumineszenz- marker markiert werden. Für die PKR sind auf die zu verstärkenden spezifischen Abschnitte der DNS und den Lumineszenzmarker abgestimmte Primer auszuwählen. Wie dies zu geschehen hat, gehört zum Fachwissen eines Fachmanns auf dem Gebiet genetischer Tests.
Die PKR kann eine Anzahl der Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome zwischen 15 und 30 mal verdoppeln. Bei einer 20-fachen Verdopplung werden von einem in der Probe vorhandenen Abschnitt der DNS 1 Millionen Kopien erstellt. Auch wenn diese Kopien nicht vollständig bei dem Messen der Lichtmenge von dem Lumineszenzmarker des entsprechenden Abschnitts der DNS vorhanden sind, weil z. B. nur ein Teil des Produkts der PKR der Elektrophorese zum Trennen der DNS-Abschnitte von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen unterworfen wird, ermöglicht diese große Anzahl der Kopien eine genaue Zuordnung der gemessenen Lichtmenge zu einer bestimmten Anzahl des jeweiligen Abschnitts der DNS in der Probe. Bei der PKR ist jedoch zu vermeiden, dass es zu einer Sättigung kommt, so dass bestimmte Abschnitte der DNS von den verschiedenen Chromosomen bei den letzten Zyklen der PKR nicht mehr vollständig dupliziert werden, wodurch die Korrelation zwischen der gemessenen Lichtmenge und der tatsächlichen Anzahl der Abschnitte der DNS in der Probe verloren geht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen mit demselben Lumineszenzfarbstoff markiert werden, weil die Trennung der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen durch die Elektrophorese erfolgt. Hierdurch wird auch das Messen der Lichtmenge von dem Lumineszenzfarbstoff vereinfacht und eine unmittelbare Vergleichbarkeit der gemessenen Lichtmengen erreicht. Grundsätzlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aber auch mehrere verschiedene Lumineszenzfarbstoffe verwendet werden.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt mehrere nicht überlappende spezifische Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt werden, kann hierdurch die in Bezug auf die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome gemessene Lichtmenge verviel- fältigt werden. Dazu ist dann jeder der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit einem Lumineszenzmarker zu markieren; alle verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS sind durch die Gelelektrophorese zu trennen; für jeden der verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS ist getrennt eine Lichtmenge von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker zu messen; u nd vor d em Sch ritt d es Bestimmens der relativen Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome sind die für die mehreren spezifischen Abschnitte der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome zu addieren. Auf diese Weise wird der Fehler, der zwischen dem Verhältnis der Lichtmengen und der interessierenden relativen Häufigkeit der Gene und/oder Chromosome gegeben ist, wesentlich verringert. Indem die in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt verstärkten Abschnitte der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome nicht miteinander überlappen, werden die einzelnen Abschnitte unabhängig voneinander verstärkt und entsprechen mehreren, aber unter genau denselben Randbedingungen erfolgenden Durchführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf dieselbe Probe.
Vorzugsweise ist die Anzahl von spezifischen Abschnitten der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome, die in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt verstärkt werden, gleich. Diese gleiche Anzahl kann konkret in einem Bereich von 3 bis 40 liegen, wobei die obere Grenze durch die in der Elektrophorese maximal trennbare Anzahl von unterschiedlich langen Abschnitten und bei Genen auch durch die maximale Anzahl von überhaupt möglichen unterschiedlichen nicht überlappenden Abschnitten bestimmt wird. Wenn beispielsweise 40 Abschnitte der DNS von drei verschiedenen Chromosomen verstärkt werden, also insgesamt 120 verschiedene Abschnitte durch die Elektrophorese getrennt werden müssen, liegen die verschiedenen Abschnitte nur noch wenige Basenpaare nebeneinander. Günstig erweist sich eine Zahl von etwa 10 spezifischen Abschnitten der DNS von jedem der verschiedenen Chromosome. Damit resultieren bei drei verschiedenen Chromosomen 30 verschiedene Abschnitte, die durch etablierte PKR problemlos gleichzeitig verstärkt und durch etablierte Elektrophorese einfach getrennt werden können.
Vorzugsweise unterscheiden sich alle spezifischen Abschnitte der DNS um mindestens 4, besser 7 oder 10 Basenpaare in ihrer Länge, um eine einfache Trennbarkeit der Abschnitte bei der Elektrophorese zu ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich bei den spezifischen Abschnitten der DNS, die verstärkt werden, um lebenswichtige Abschnitte der DNS, d. h. um Abschnitte der DNS die bei jedem Genom, wenn das jeweilige Individuum lebensfähig ist, identisch vorhanden sind. Dies impliziert, dass die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS jeweils eine feste Länge aufweisen und entsprechend bei der Elektrophorese nach bestimmten Laufstrecken zu finden sind.
Um den statistischen Fehler bei der Zuordnung des Verhältnisses der gemessenen Lichtmenge zu der interessierenden relativen Häufigkeit der Gene und/oder Chromosome in der Probe zu reduzieren, können auch die Schritte des Trennens, des Markierens und des Messens für mehrere Teilprodukte des gemeinsamen Verstärkungsschritts getrennt durchgeführt werden und vor dem Schritt des Bestimmens die für die mehreren Teilproduktmengen gemessenen Lichtmengen für die DNS von jeweils demselben der verschiedenen Gene und/oder Chromosome addiert werden. Auch hierdurch erhöhen sich die Lichtmengen und reduziert sich der Fehler wie bei mehreren verstärkten Abschnitten der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome. Allerdings erfolgen die Schritte des Trennens und des Messens für die verschiedenen Teilprodukte nicht unter genau denselben Bedingungen, und der Gesamtaufwand für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht sich um die zusätzlichen parallel durchgeführten Schritte des Trennens und Messens.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die Bestimmung des Verhältnisses von Chromosomen anhand von apoptotischer DNS in einer Blutplasmaprobe geeignet, um aus der Analyse des Blutplasmas einer Schwangeren auf Trisomie bei dem Fötus zu schließen. Entsprechend können die verschiedenen Chromosome, deren relative Häufigkeit bestimmt wird, das Chromosom 13 und/oder das Chromosom 18 und/oder das Chromosom 21 des humanen Genoms umfassen. Trisomie 13, 18 und 21 sind die häufigsten Formen von Trisomie beim Menschen, und sie treten nicht gleichzeitig auf. Aus der Bestimmung des relativen Verhältnisses der Chromosome 13, 18 und 21 kann daher darauf geschlossen werden, ob bei dem Fötus Trisomie 13, 18 oder 21 vorliegt, weil dann die relative Häufigkeit des entsprechenden Chromosoms gegenüber den anderen beiden Chromosomen, die als Vergleichsmaßstab dienen, signifikant erhöht ist. Bei einem relativen Anteil der apoptotischen DNS des Fötus an der Gesamt- DNS von 10 % ist im Falle einer Trisomie die relative Häufigkeit des betroffenen Chromosoms gegenüber den anderen Chromosomen um 5 % erhöht. Das erfindungsgemäße Verfahren ist problemlos so durchführbar, dass die relative Häufigkeit der verschiedenen Chromosome des Genoms mit einer höheren Genauigkeit als 5 % bestimmt wird. Problemlos erreichbar ist eine Genauigkeit von 2 % oder noch besser. So kann auch bei einem geringeren Anteil der apoptoti- schen DNS des Fötus an der insgesamt in der Blutplasmaprobe enthaltenen apoptotischen DNS als 10 % eine Trisomie des Fötus zuverlässig erkannt werden.
Um die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu maximieren, können die für die verschiedenen spezifischen Abschnitte der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen des Lumineszenzlichts vor dem Schritt des Bestimmens der interessierenden relativen Häufigkeit der Gene und/oder Chromosome mit Normierungsfaktoren multipliziert werden, die unterschiedliche Verstärkungen, Trennungen, Markierungen und/oder Messungen ausgleichen. Diese Normierungsfaktoren können einfach ermittelt werden, indem Proben mit bekannten Mengen der spezifischen Abschnitte der DNS dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden.
Wenn mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die relative Häufigkeit eines Gens bestimmt wird, das in einer aktiven und/oder einer inaktiven Variante vorliegen kann, dann kann die relative Häufigkeit des Gens in seiner aktiven Variante und/oder in seiner inaktiven Variante bei dem Genom anhand der DNS in der Probe untersucht werden. Dazu sind die zu verstärkenden Abschnitte der DNS spezifisch für die jeweils interessierende Variante der DNS auszubilden. Als Vergleichsmaßstab dient dabei sinnvoller Weise mindestens ein lebenswichtiges Gen, bei dem keine Genmultiplikation auftritt. So ist, wenn ein Abschnitt der DNS verstärkt wird, der für ein funktionales Allel des Gens P450 CYP2D6 spezifisch ist, die von dem markierten verstärkten Abschnitt gemessene Lichtmenge je nach Metabolizer-Typ nullmal, 0,5-mal, genauso oder n-mal so groß wie diejenige von dem markierten verstärkten Abschnitt des als Vergleichsmaßstab dienenden Gens.
Wenn mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die relative Häufigkeit eines Gens bestimmt wird, kann dies bedeuten , dass die relative Häufigkeit eines vollständigen funktionalen Gens bestimmt wird. Es kann aber auch bedeuten, dass die relative Häufigkeit eines wesentlichen Teils eines Gen, d. h. eines sogenannten Motivs oder Locus, bestimmt wird. Dabei kann es sich auch um die relative Häufigkeit des Motivs oder Locus innerhalb eines größeren Gens handeln. Durch die Verstärkung von spezifischen Abschnitten der DNS fester Länge unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch in diesen Fällen von bekannten Vaterschaftstests, bei denen spezifische Abschnitte der DNS verstärkt werden, die von Mensch zu Mensch variieren und keine feste Länge aufweisen, weil sie sogenannte Short Tandem Repeats (STR) umfassen. Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es jedoch möglich, zusätzlich spezifische Abschnitte der DNS zu verstärken, die von Mensch zu Mensch variieren und keine feste Länge aufweisen, weil sie unterschiedlich häufige Wiederholungen bestimmter Sequenzen von Basenpaaren umfassen, d. h. von sogenannten Short Tandem Repeats (STR). Diese verstärkten Abschnitte finden sich nach der Elektrophorese bei unterschiedlichen Laufstrecken, die von der genauen Anzahl der Wiederholungen der Sequenz von Basenpaaren abhängen. Dadurch ergeben sich bei der Registrierung des Fluoreszenzlichts von Lumines- zenzmarkern, mit denen auch diese verstärkten Abschnitte markiert werden, je nach Erbgut unterschiedliche Linienmuster. Anhand dieser Linienmuster sind die einzelnen Proben identifizierbar und damit einem bestimmten Genom einer bestimmten Person zuzuordnen, auch wenn das erfindungsgemäße Verfahren parallel an einer Vielzahl von Proben von verschiedenen Personen durchgeführt wird. Dabei reicht für diese Identifizierbarkeit auch innerhalb eines größeren Probenpools die zusätzliche Verstärkung einer geringeren Anzahl von Abschnitten variabler Länge aus, als sie bspw. für einen Vaterschaftsnachweis erforderlich ist.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Lumineszenzmarker die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Lumineszenzmarker, zwei Lumineszenzmarker oder mehr Lumineszenzmarker verwendet werden. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Um- fangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
Fig. 1 ist ein Ablaufdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens; und
Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Gelelektrophorese und einer Messung von Lichtmengen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Fig. 1 .
FIGURENBESCHREIBUNG
Das i n Fig. 1 gezeigte Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die relative Häufigkeit verschiedener interessierender Chromosome eines Genoms untersucht wird, geht von einer Blutprobe 1 aus. In einem Schritt Trennen 2 werden insbesondere Blutzellen von der Blutprobe 1 abgetrennt, und es wird eine nur noch apoptoti- sche DNS enthaltende Blutplasmaprobe 3 erhalten. In einer PKR 4 wird die Blutplasmaprobe zusammen mit Polymerase 5, Primern 6 und Lumineszenzfarbstoff 7 thermischen Zyklen ausgesetzt, um eine Polymerasekettenreaktion zur Verstärkung spezifischer Abschnitte der DNS der verschiedenen interessierenden Chromosome auszulösen. Dies geschieht typischerweise in einem sogenannten Thermozykler. Bei geeigneter Ausbildung der Primer 6 markiert der der PKR 4 zugesetzte Lumineszenzfarbstoff 7 die verstärkten Abschnitte der DNS. Das derart gewonnene PKR-Produkt 8 wird einer Elektrophorese 9 unterworfen, um die verschiedenen Abschnitte der DNS, die in der PKR 4 verstärkt wurden, zu trennen. Es versteht sich, dass dazu die Primer 6 so abzustimmen sind, dass die verstärkten Abschnitte unterschiedlich lang sind und entsprechend bei der Elektrophorese 9 unterschiedlich schnell und damit unterschiedlich weit wandern. Anschließend werden in einem Schritt Messen 1 1 Lichtmengen von dem Lumi- neszenzmarker 7 für die einzelnen durch die Elektrophorese 9 getrennten DNS-Abschnitte 10 gemessen. Es versteht sich, dass die Lichtmengen von dem Lumineszenzfarbstoff für gleiche Zeiten für die getrennten DNS-Abschnitte 10 und unter gleichen Bedingungen gemessen werden. Zumindest erfolgt das Lichtmengenmessen unter definierten Bedingungen, die einen Rückschluss auf die Anzahl der in der Blutplasmaprobe 3 enthaltenen Abschnitte der DNS zulassen. Die von dem Messen 1 1 erhaltenen Lichtmengen 12 werden in einem Schritt Normieren 13 bezüglich der unterschiedlichen Verstärkungen in der PKR 4, Trennungen in der Elektrophorese 9 und Messungen bei dem Messen 1 1 durch Multiplikation mit Normierungsfaktoren normiert. Aus einem Verhältnis von Summen der normierten Lichtmengen 14 für die DNS von jedem der verschiedenen Chromosome wird dann in einem Schritt Bestimmen 15 die relative Häufigkeit dieser Chromosome bestimmt.
Fig. 2 zeigt oben schematisch die als Ergebnis der Elektrophorese 9 gemäß Fig. 1 getrennten DNS-Abschnitte 10. Die verschiedenen DNS-Abschnitte sind unter Einfluss eines elektrischen Felds abhängig von ihrer Länge in Basenpaaren bp einen unterschiedlich weiten Weg s in einem Gel 16 gewandert. Dabei handelt es sich bei den getrennten DNS-Abschnitten 10 um jeweils vier nicht überlappende Abschnitte der Chromosome 13, 18 und 21 mit gleichen Unterschieden ihrer Länge in Basenpaaren bp und entsprechend gleichen Abständen Δ s in dem Gel 16. Unten in Fig. 2 sind die Lichtmengen L an Lumineszenzlicht von den einzelnen getrennten DNS-Abschnitten 13-1 bis 21 -4 in derselben Reihenfolge der DNS-Abschnitte aufgetragen, wie sie in dem Gel 16 auftreten. Alle Lichtmengen L sind im Wesentlichen gleich. Die Summe der Lichtmengen von den vier Abschnitten 21 -1 bis 21 -4 des Chromosoms 21 ist jedoch um 5 % größer als die Summen der Lichtmengen von den DNS-Abschnitten 13-1 bis 13-4 und 18-1 bis 18-4. Konkret ist die Summe der Lichtmenge von den Abschnitten der DNS des Chromosoms 21 um 5 % höher als die Summe der Lichtmengen L des Lumineszenzlichts von den Abschnitten der DNS der beiden anderen Chromosomen 13 und 18. Dies entspricht dem Vorliegen einer Trisomie 21 bei einem Fötus, wenn die Blutprobe 1 gemäß Fig. 1 von seiner Mutter genommen wurde und seine apoptotische DNS 10 % der gesamten apoptotischen DNS in der Blutplasmaprobe 3 gemäß Fig. 1 ausmacht. Bei einer Trisomie 13 oder 18 ist entsprechend die Lichtmenge von den Abschnitten der DNS und dem Chromosom 13 bzw. 18 erhöht. Wenn keine Trisomie 13, 18 oder 21 vorliegt, sind die Summen der Lichtmengen der Abschnitte der DNS von allen drei Chromosomen gleich.
Ausführungsbeispiele und Materialien
Primer 6 und Lumineszenzfarbstoff 7:
Alle Primer 6 sind zwischen 15 und 35 Basen lang, im Idealfall 18 bis 20 Basen. Für jeden zu verstärkenden Abschnitt der DNS wird entweder der forward Primer oder der reverse Primer am 5'-Ende mit dem Lumineszenzfarbstoff 7, vorzugsweise einem isomerenreinen Lumineszenzfarbstoff durch kovalente Bindung gekoppelt. Als Lumineszenzfarbstoff eignen sich zum Beispiel die bekannten Lumineszenzfarbstoffe Alexa 350, Alexa 488, AMCA, ATTO 390, Fluorescein (5-lsomer), 6-FAM, 6-TET, 6-HEX, JOE, NBD, Rhodamine 6G, Rhodamine Green, Rhodamine Red, TAMRA, ROX und Texas Red.
PKR 4:
Alle Reagenzien und Geräte sind von Life Technologies GmbH, Darmstadt erhältlich, soweit im Folgenden nichts anderes angegeben ist.
200 ng DNA, 200 μ Μ d NTPs (1 μΙ 1 0m M dNTPs/ 50μΙ), 1 -5 μΙ 10xPuffer, 2-10 μΙ Primer Mastermix (mit je 0,1 bis 20 pmol/μΙ forward und reverse Primer im Verhältnis (1 :1 ) für jedes PKR-Produkt, Primerkonzentration in der PKR 0,1 μΜ bis 20 μΜ) und 5 units / 50 μΙ AmpliTaq Gold werden mit Reinstwasser auf 10-50 μΙ aufgefüllt. Gut geeignet ist ein Ansatzvolumen von 12,5 μΙ, das 1 ,25 μΙ 10 x Goldstar-Pufferlösung und 0,2 μΙ (1 unit) Ampli Taq Gold Polymerase enthält. Es wird folgendes PKR-Protokoll in einem Sensoquest Labcycler (Sensoquest GmbH, Göttingen) angewendet:
Eingangs zur Aktivierung der Taq-Polymerase:
95 °C 1 1 für 1 Minute
96 °C für 2 Minuten
dann
94 °C für 1 Minute
60 °C für 1 Minute
70 °C für 1 ,5 Minuten für 10 Zyklen,
dann
90 °C für 1 Minute
60 °C für 1 Minute
70 °C für 1 ,5 Minuten
für 10 bis 22 Zyklen,
dann
60 °C für 30 Minuten
4 °C Haltetemperatur
Nach der P KR wird das PKR-Produkt denaturiert. Hierzu werden 12 μΙ Formamid, 0,8 μΙ Standard (ROX 500) und 1 - 10 μΙ Produktlösung zusammen pipettiert (am besten geeignet sind 1 -2 μΙ) und in einem Thermocycler für 2 min auf 94 °C erhitzt. Danach werden die Proben für 5 min auf 4 °C gekühlt und anschließend in einem GeneMapper_50_POP-7 nach den Vorgaben des Herstellers durch Elektrophorese aufgetrennt und die entstandenen Fragmente durch GeneMapper ID Software und GeneScan Software unter den vorgegebenen Bedingungen des Herstellers quantifiziert und analysiert. Die Datenaufnahme erfolgt durch die Software des Herstellers, und auch die Prozess-Schritte erfolgen nach den Angaben des Herstellers. Die Software zählt die Lichtmengen von dem Lumineszenzfarbstoff und bildet die Fläche unter den zu den verschiedenen getrennten verstärkten Abschnitte zugehörigen Peaks als Integral ab. Die Software GeneMapper und GeneScan lässt es zu, dass diese integrierten Lichtmengen-Daten in Excel-Tabellen exportiert werden, um sie weiter auszuwerten.
Zu den verwendbaren Sequenzern zählen die folgenden ABI-Produkte:
Applied Biosystems 3130 or 3130 xl Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 3.0 Section 5.A GeneMapper ID Software,Version 3.2 GeneScan Software and Windows®
Operating Systems ABI PRISM 3100 or 3100- Avant Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 2.0 Section 5.A ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 1 .0.1 or 1 .1 Section 5.B ABI P
Applied Biosystems 3730 or 3730 xl Genetic Analyzer with Data Collection Software, Version 3.0 Section 5.A GeneMapper ID Software,Version 1 .3 GeneScan Software and Windows® BEZUGSZEICHENLISTE
1 Blutprobe
2 Trennen
3 Blutplasmaprobe
4 PKR
5 Polymerase
6 Prima
7 Lumineszenzfarbstoff
8 PKR-Produkt
9 Elektrophorese
10 getrennte DNS-Abschnitte
1 1 Messen
12 Lichtmengen
3-1 Abschnitt der DNS von Chromosom 13
3-2 Abschnitt der DNS von Chromosom 13
3-3 Abschnitt der DNS von Chromosom 13
3-4 Abschnitt der DNS von Chromosom 13
14 normierte Lichtmengen
15 Bestimmen
16 Gel
17 Normieren
8-1 Abschnitt der DNS von Chromosom 18
8-2 Abschnitt der DNS von Chromosom 18
8-3 Abschnitt der DNS von Chromosom 18
8-4 Abschnitt der DNS von Chromosom 18
1 -1 Abschnitt der DNS von Chromosom 21
1 -2 Abschnitt der DNS von Chromosom 21
1 -3 Abschnitt der DNS von Chromosom 21
1 -4 Abschnitt der DNS von Chromosom 21
bp Basenpaar
s Weg
L Lichtmenge

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zum Bestimmen einer relativen Häufigkeit von verschiedenen Genen und/oder Chromosomen eines Genoms, von dem DNS in einer Probe stammt,
wobei in einem gemeinsamen Verstärkungsschritt mindestens ein spezifischer Abschnitt (13-1 bis 21 -14) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt wird, wobei die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS jeweils eine feste Länge aufweisen,
wobei der mindestens eine verstärkte spezifische Abschnitt (13-1 bis 21 -4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit einem Lumineszenzmarker (7) markiert wird,
wobei Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker (7) für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt erfasst wird und
wobei die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms aus dem für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lumineszenzlicht bestimmt wird,
dadurch gekennzeichnet,
dass die verstärkten spezifischen Abschnitte (18-1 bis 21 -4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen durch Elektrophorese (9) getrennt werden;
dass eine Lichtmenge (12) des Lumineszenzlichts von dem Lumineszenzmarker (7) für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessen wird und
dass die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms aus Verhältnissen der für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome getrennt gemessenen Lichtmengen (12) bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Gene ein Gen, bei dem eine interessierende Genmultiplikation auftreten kann, und ein Gen, bei dem keine Genmultiplikation auftritt, umfassen und/oder die Chromosome das Chromosom 13 und/oder das Chromosom 18 und/oder das Chromosom 21 des humanen Genoms umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Chromosome das Chromosom 13, das Chromosom 18 und das Chromosom 21 des humanen Genoms sind.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Abschnitten (13-1 bis 21 -4) der DNS lebenswichtige Abschnitte der DNS sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen durch Gel- oder Kapillarelektrophorese getrennt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einer gemeinsamen PKR (4) die spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt und die verstärkten spezifischen Abschnitte der DNS mit dem Lumineszenzmarker (7) markiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die PKR eine Anzahl der spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome zwischen 15-mal und 30-mal verdoppelt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS von den verschiedenen Genen und/oder Chromosomen mit demselben Lumineszenzfarbstoff (7) markiert werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt mehrere nicht überlappende spezifische
Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt werden,
wobei jeder der verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome mit einem Lumineszenzmarker (7) markiert wird,
wobei alle verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS durch die Elektrophorese (9) getrennt werden, wobei eine Lichtmenge (12) von Lumineszenzlicht von dem Lumineszenzmarker (7) für jeden der verstärkten spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS getrennt gemessen wird und
wobei vor dem Schritt des Bestimmens (15) die für die mehreren spezifischen Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen (12) für die DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome addiert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass in dem gemeinsamen Verstärkungsschritt eine gleiche Anzahl von spezifischen Abschnitten (13-1 bis 21 -4 der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome verstärkt wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die gleiche Anzahl von spezifischen Abschnitten (13-1 bis 21 -4) der DNS von jedem der verschiedenen Gene und/oder Chromosome in einem Bereich von 3 bis 40 oder von 5 bis 30 oder von 8 bis 15 liegt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich alle spezifischen Abschnitte ( 1 3-1 bis 21 -4) der DNS um mindestens 4, 7 oder 1 0 Basenpaare (bp) in ihrer Länge unterscheiden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte des Trennens und des Messens (1 1 ) für mehrere Teilproduktmengen des gemeinsamen Verstärkungsschritts getrennt durchgeführt werden,
wobei vor dem Schritt des Bestimmens (15) die für die mehreren Teilproduktmengen gemessenen Lichtmengen (12) für die DNS von jeweils demselben der verschiedenen Gene und/oder Chromosome addiert werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS apoptotische DNS und die Probe eine Blutplasmaprobe (3) ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die relative Häufigkeit der verschiedenen Gene und/oder Chromosome des Genoms mit einer Genauigkeit besser als 5 % bestimmt wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt des Bestimmens die für verschiedene spezifische Abschnitte (13-1 bis 21 -4) der DNS getrennt gemessenen Lichtmengen des Lumineszenzlichts mit unterschiedliche Verstärkungen, Trennungen, Markierungen und/oder Messungen ausgleichenden Normierungsfaktoren multipliziert werden.
EP16751173.2A 2015-07-13 2016-07-12 Verfahren zum bestimmen einer relativen häufigkeit von verschiedenen genen oder chromosomen eines genoms in einer probe Pending EP3322822A1 (de)

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