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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen
Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von wenigstens zwei
verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels
wenigstens einer Amplifikationsreaktion, bei der pro zu bestimmender
Zielsequenz wenigstens 3 Primerpaare eingesetzt werden, und anschließendem Nachweis
der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate
durch ein Elektrophoreseverfahren.
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Verfahren
zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von Zielsequenzen
in einer biologischen Probe, d. h. beispielsweise der Nachweis des
Vorliegens bzw. der Abwesenheit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz,
wie beispielsweise eines bestimmten Chromosoms, Gens oder Genabschnitts,
werden in vielen technischen Gebieten eingesetzt. Lediglich beispielsweise
seien Anwendungen in der medizinische Diagnostik, in der Forensik
oder in der Gentechnik genannt.
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Bei
den derzeit bekannten Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder
Abwesenheit von Zielsequenzen in einer biologischen Probe wird zumeist
eine PCR ("Polymerase
Chain Reaction" bzw. "Polymerasekettenreaktion") durchgeführt, bei
der wenigstens ein Primerpaar eingesetzt wird, welches daran angepasst
ist, dass bei der PCR eine in der Zielsequenz vorhandene Nukleinsäuresequenz
mit einer vorbestimmten Länge
amplifiziert wird. Durch den anschließenden Nachweis, welcher beispielsweise
mittels Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese erfolgen kann, dass
das in der PCR erhaltene PCR-Produkt die vorgegebene Länge aufweist,
kann dann die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenz in der
biologischen Probe festgestellt werden. Um dieses Ergebnis zu validieren,
kann das PCR-Produkt auch weitergehend, beispielsweise durch Sequenzierung,
charakterisiert werden.
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Sofern
in solchen Verfahren als Ausgangsmaterial wenige Zellen eingesetzt
werden oder gar eine Einzelzelle eingesetzt wird, müssen in
der PCR in der Regel mehrere unterschiedliche Primerpaare, in der
Praxis bis zu 25 verschiedene Primerpaare, eingesetzt werden, um
mit der geforderten Sicherheit auf die Anwesenheit bzw. Abwesenheit
einer Zielsequenz in der Einzelzelle schließen zu können. Dies liegt daran, dass
in einer Einzelzelle nur ein Genom, d. h. eine sehr geringe Menge
an Nukleinsäure,
enthalten ist, so dass bei der Durchführung einer PCR mit einem Primerpaar
statistisch gesehen nicht in jedem Fall ein PCR-Produkt erhalten
wird, selbst wenn die Zielsequenz in dem Genom der Einzelzelle vorhanden
ist. Bei der Durchführung
der PCR mit nur einem Primerpaar wäre in dem Fall der Abwesenheit
eines PCR-Produktes die Schlussfolgerung, dass die Zielsequenz in
dem Genom der Einzelzelle nicht enthalten ist, mit einem hohen Fehlerrisiko
verbunden. Durch den Einsatz mehrerer Primerpaare, welche daran
angepasst sind, jeweils unterschiedliche Sequenzen aus der Zielsequenz
zu amplifizieren, kann die Aussagekraft des an der Einzelzelle erhaltenen
Ergebnisses erheblich erhöht
werden. Liegt beispielsweise die Wahrscheinlichkeit für die Amplifikation
einer Sequenz aus der Zielsequenz bei der mit der Einzelzelle durchgeführten PCR
pro Primerpaar bei 50%, liegt die Wahrscheinlichkeit dafür, in einer
PCR mit 5 verschiedenen Primerpaaren kein einziges Amplifikationsprodukt zu
erhalten, obwohl die entsprechenden Zielsequenzen in dem Genom der
Einzelzelle vorliegen, bei etwa 3%. Werden hingegen 10 oder gar
100 verschiedene Primerpaare eingesetzt, liegt die Wahrscheinlichkeit
bei etwa 0,1% bzw. 10–29%.
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Grundsätzlich können für die vorgenannte
Untersuchung mit beispielsweise 10 verschiedenen Primerpaaren 10
verschiedene PCR's
durchgeführt
werden, wobei pro PCR jeweils ein Primerpaar eingesetzt wird. Allerdings
müssen
dann 10 verschiedene Reaktionsansätze gehandhabt und nach der
PCR analysiert werden, was sehr zeit- und kostenintensiv ist. Aus
diesem Grund wird in diesem Fall häufig nur eine (Multiplex-)PCR durchgeführt, in
der die 10 verschiedenen Primerpaare eingesetzt werden. In diesem
Fall liegen nach der Durchführung
der PCR die verschiedenen PCR-Produkte
in einer Probe vor, so dass diese, beispielsweise durch Gelelektrophorese,
parallel charakterisiert werden können. Um die PCR-Produkte einfach
zuordnen zu können,
werden die verschiedenen Primerpaare in der Praxis so ausgewählt, dass
jedes Primerpaar ein PCR-Produkt bestimmter, aber von der jedes
anderen PCR-Produkts verschiedener Länge ergibt. Bei der Durchführung einer
PCR mit 10 verschiedenen Primerpaaren ergeben sich somit bis zu
10 verschiedene PCR-Produkte jeweils unterschiedlicher Länge, welche
nach der PCR durch Gelelektrophorese oder durch Kapillarelektrophorese
aufgetrennt und nachfolgend hinsichtlich ihrer Länge charakterisiert werden
müssen.
Dies ist jedoch aufgrund der vielen in einer Probe vorliegenden
PCR-Produkte sehr arbeits- und daher auch kostenintensiv.
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In
der Praxis werden in einer biologischen Probe häufig mehrere Zielsequenzen
gleichzeitig charakterisiert, also beispielsweise parallel bestimmt,
ob eine Einzelzelle, wie ein Polkörper, drei bestimmte Chromosomen
aufweist oder nicht. Für
eine solche Untersuchung sind dann in der Multiplex-PCR entsprechend
mehr Primerpaare einzusetzen und folglich nach der Durchführung der
PCR entsprechend mehr verschiedene PCR-Produkte in einem Probenansatz voneinander
zu trennen und hinsichtlich ihrer Länge zu charakterisieren, was
mit einem noch höheren
Zeit- und Arbeitsaufwand verbunden ist.
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Die
gleichen Probleme ergeben sich, wenn die Charakterisierung von Zielsequenzen
in einer biologischen Probe mit einer LCR ("Ligase Chain Reaction" bzw. "Ligasekettenreaktion") erfolgt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens
zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit
von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen
Probe mittels einer Amplifikationsreaktion, bei der pro zu bestimmender
Zielsequenz mehrere verschiedene Primerpaare eingesetzt werden,
welches selbst bei Einsatz einer Einzelzelle einfach, schnell und
kostengünstig
durchgeführt
werden kann.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe gelöst
durch ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit
von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen
Probe umfassend:
- i) die Durchführung wenigstens
einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion
eine PCR oder eine LCR ist, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz
wenigstens 3 verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, und anschließend
- ii) den Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion
erhaltenen Amplifikate umfassend die Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens,
wobei
die Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass - – sich
alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz
mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge
um maximal x Basenpaare unterscheiden und dass
- – sich
alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz
mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare unterscheiden, wobei
x ≤ z und y > z ist, wobei z das
Auflösungsvermögen des
in dem Schritt ii) durchgeführten
Elektrophoreseverfahrens ist.
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Unter
dem Begriff Auflösungsvermögen des
in dem Verfahrensschritt ii) durchgeführten Elektrophoreseverfahrens
wird im Sinne der vorliegenden Erfindung die Anzahl der Basenpaare
bzw. Basen verstanden, um welche sich zwei verschiedene Nukleinsäurefragmente
mindestens unterscheiden müssen,
damit diese beiden Nukleinsäurefragmente
in dem konkret durchgeführten
Elektrophoreseverfahren so voneinander getrennt werden, dass diese
nach Abschluss der Elektrophorese als unterscheidbare Banden vorliegen.
Die Einheit des Auflösungsvermögens ist
Basenpaare bzw. Basen, je nachdem ob doppelsträngige Nukleinsäure in einem
nicht denaturierenden Gel elektrophoretisch aufgetrennt wird (Basenpaare)
oder ob einzelsträngige
Nukleinsäure
in einem nicht denaturierenden Gel oder Nukleinsäure in einem denaturierenden
Gel elektrophoretisch aufgetrennt wird (Basen).
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Es
ist bekannt, dass das Auflösungsvermögen eines
Elektrophoreseverfahrens von vielen Faktoren, insbesondere von der
Art des eingesetzten Gels, abhängt.
So ist beispielsweise das Auflösungsvermögen einer
Polyacrylamidgelelektrophorese größer als das einer Agarosegelelektrophorese.
Ferner hängt
das Auflösungsvermögen auch
maßgeblich
von der (Vernet zungs)dichte des Gels ab, wobei gilt, dass je größer die
(Vernetzungs)dichte des Gels ist, umso größer das Auflösungsvermögen ist.
Abgesehen davon hängt
das Auflösungsvermögen auch
von den konkreten Verfahrensparametern ab, wie der bei der Elektrophorese
angelegten Spannung und insbesondere der Dauer der Elektrophorese.
Je länger
die Dauer der Elektrophorese, d. h. die Zeit, für welche an das Gel Spannung
angelegt wird, ist, desto größer ist
das Auflösungsvermögen. Wird
bei der Elektrophorese die Spannung zu gering eingestellt, kann
es aufgrund der zu niedrigen Spannung zu Diffusionseffekten in andere
Richtungen als die Auftrennungsrichtung kommen, so dass unscharfe
Banden erhalten werden, welche zu einer Verringerung des Auflösungsvermögens führen. Mit
einem denaturierenden Gel werden üblicherweise exaktere Größenauftrennungen
erreicht als mit einem nicht denaturierenden Gel. Ferner hängt das
Auflösungsvermögen in geringem
Ausmaß auch
von der Art der Visualisierung der einzelnen bei der Elektrophorese
erhaltenen Banden ab. Mithin wird das Auflösungsvermögen z durch die Summe aller
der vorgenannten Parameter, welche bei dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren
konkret eingesetzten Elektrophoreseverfahren eingestellt werden,
bestimmt.
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Bei üblicher,
dem Fachmann bekannter Verfahrensführung der Elektrophorese ergeben
sich für
die drei bekanntesten Elektrophoreseverfahren beispielsweise folgende
maximale Auflösungsvermögen:
| Polyacrylamidgelelektrophorese: | bis
zu 1 b bzw. bp, |
| Agarosegelelektrophorese: | ca.
10 bis 20 b bzw. bp, |
| Kapillargelelektrophorese: | bis
zu 1 b bzw. bp. |
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Ein
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit einer
Zielsequenz umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die Bestimmung,
ob die Zielsequenz vorhanden ist oder nicht, als auch die Bestimmung,
in welcher Anzahl die Zielsequenz vorhanden ist, also ob eine Monosomie,
Disomie oder Trisomie vorliegt.
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Da
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
die Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden,
dass sich erstens alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich
ihrer Länge
um maximal x Basenpaare, also um weniger als das Auflösungsvermögen z des
in dem Verfahrensschritt ii) eingesetzten Elektrophoreseverfahrens,
unterscheiden, werden für
alle pro zu bestimmender Zielsequenz eingesetzten Primerpaare Amplifikate
mit durch das Elektrophoreseverfahren nicht unterscheidbarer Länge erhalten.
Indem bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
die Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden,
dass sich zweitens alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu
bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare, also um mehr als das Auflösungsvermögen z des
in dem Verfahrensschritt ii) eingesetzten Elektrophoreseverfahrens,
unterscheiden, sind alle pro zu bestimmender Zielsequenz mit den
Primerpaaren erhaltenen Amplifikate in dem eingesetzten Elektrophoreseverfahren
von den für
die jeweils anderen Zielsequenzen erhaltenen Amplifikaten unterscheidbar.
Mithin werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur gleichzeitigen
Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von wenigstens zwei
verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels
PCR bzw. LCR erheblich weniger Amplifikate mit in der Elektrophorese
unterscheidbarer Länge,
nämlich
eine der Anzahl der zu bestimmenden Zielsequenzen entsprechende
Anzahl an Amplifikaten unter scheidbarer Länge, erhalten als mit den aus
dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Während beispielsweise bei den
aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren für die Charakterisierung von
5 unterschiedlichen Zielsequenzen in einer Einzelzelle mittels PCR
bei Einsatz von 10 verschiedenen Primerpaaren pro Zielsequenz bis
zu 50 PCR-Produkte
mit sich unterscheidender und auch in dem zwecks Nachweis der Amplifikate
eingesetzten Elektrophoreseverfahren unterscheidbarer Länge erhalten werden,
werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
bei dem Einsatz derselben Menge an unterschiedlichen Primerpaaren
5 PCR-Produkte mit
in dem Elektrophoreseverfahren unterscheidbarer Länge erhalten, welche
wesentlich einfacher und schneller hinsichtlich ihrer Länge charakterisiert
werden können
als 50 PCR-Produkte mit unterscheidbarer Länge. Mithin ist das erfindungsgemäße Verfahren
wesentlich weniger arbeits-, zeit- und kostenintensiv als die aus
dem Stand der Technik bekannten Verfahren.
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Dies
sei an einem Gedankenexperiment erläutert. Es soll anhand eines
Polkörpers
bestimmt werden, ob dieser die Chromosomen 13, 18 und 21 enthält. Da in
einem Polkörper
nur ein haploider Chromosomensatz, also eine sehr geringe Menge
an Nukleinsäure
vorliegt, liegt die Wahrscheinlichkeit, bei einer PCR mit einem
Primerpaar gemäß dem Stand
der Technik ein entsprechendes PCR-Produkt zu erhalten bei erfahrungsgemäß deutlich
unterhalb von 100%. Aus diesem Grund werden in der PCR für jedes
zu charakterisierende Chromosom 10 verschiedene Primerpaare eingesetzt.
Aufgrund der großen
Anzahl an pro Zielsequenz eingesetzter Primerpaare kann mit nahezu
100%-iger Sicherheit auf die Anwesenheit des Zielchromosoms geschlossen
werden, wenn in der PCR wenigstens ein PCR-Produkt für ein Primerpaar
erhalten wird, welches für
einen Sequenzabschnitt in dem Zielchromosom spezifisch ist. Alle
Primerpaare für
das Chromosom 13 werden so entworfen, dass alle diese Primerpaare
bei der Amplifikation ein PCR-Produkt mit einer Länge von
100 Basenpaaren ergeben. Ferner werden alle Primerpaare für das Chromosom
18 so entworfen, dass alle diese Primerpaare bei der Amplifikation
ein PCR-Produkt mit einer Länge
von 300 Basenpaaren ergeben, wohingegen alle Primerpaare für das Chromosom
21 so entworfen werden, dass alle diese Primerpaare bei der Amplifikation
ein PCR-Produkt mit einer Länge
von 500 Basenpaaren ergeben. Nach der Durchführung der PCR wird der PCR-Ansatz auf ein Agarosegel
aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt, bevor das Agarosegel mit
Ethidiumbromid gefärbt
und die Anzahl der erhaltenen Banden bestimmt wird. Bei diesem Experiment
können
in dem Agarosegel maximal drei verschiedene DNA-Banden erhalten
werden, nämlich
Banden bei 100, 300 und 500 Basenpaaren, wenn die Chromosomen 13,
18 und 21 in dem Polkörper
vorliegen. Mithin ist die Anforderung an die Trennleistung des Gels
sehr gering. Ferner muss lediglich die An- bzw. Abwesenheit von PCR-Produkten
mit drei spezifischen Längen
festgestellt werden, so dass das Verfahren sehr schnell und mit wenig
Arbeitsaufwand durchgeführt
werden kann.
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Unter
Zielsequenz wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine beliebige
Nukleinsäuresequenz
verstanden, wohingegen unter einer biologischen Probe eine Probe
verstanden wird, in der Nukleinsäure
von wenigstens einem Individuum enthalten ist. Mithin kann die biologische
Probe auch Nukleinsäure
von zwei oder mehr Individuen enthalten, also ein Mischprobe sein.
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Erfindungsgemäß werden
die Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu charakterisierenden Zielsequenzen so
ausgewählt,
dass alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate im Wesentlichen
die gleiche Länge
aufweisen, nämlich
sich hinsichtlich ihrer Länge
um maximal x Basenpaare un terscheiden, wobei x kleiner als das Auflösungsvermögen des
eingesetzten Elektrophoreseverfahrens ist, d. h. alle der bei der
Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren
erhältlichen
Amplifikate mit dem eingesetzten Elektrophoreseverfahren hinsichtlich
ihrer Länge
nicht unterscheidbar sind. Indem sich die Amplifikate für eine Zielsequenz
in ihrer Länge
um bis zu dem Auflösungsvermögen des
Elektrophoreseverfahrens unterscheiden können, wird eine gewisse Freiheit
bezüglich
der Konstruktion der Primer gewonnen. Andererseits weisen die einzelnen,
für jede Zielsequenz
erhaltenen Amplifikate im Wesentlichen die gleiche Länge auf,
so dass bei einer entsprechend durchgeführten Elektrophorese immer
noch eine scharfe DNA-Bande erhalten wird.
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In
dem Schritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens können alle
dem Fachmann bekannten Elektrophoreseverfahren eingesetzt werden.
Lediglich beispielsweise seien in diesen Zusammenhang Agarosegelelektrophorese,
Polyacrylamidgelelektrophorese und Kapillarelektrophorese genannt.
Die Art der eingesetzten Methode zur Bestimmung der Länge der
in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate kann
in Abhängigkeit
von dem Unterschied der Länge
zwischen Amplifikaten unterschiedlicher Zielsequenzen und in Abhängigkeit
des geringfügigen
Unterschieds der Länge
der einzelnen, pro Zielsequenz erhaltenen Amplifikate ausgewählt werden.
Ist der Unterscheid in der Längen
der Amplifikate unterschiedlicher Zielsequenzen vergleichsweise
groß,
beträgt
dieser beispielsweise 100 Basenpaare, kann für diesen Zweck beispielsweise
ein Agarosegel, eingesetzt werden, wohingegen andernfalls ein hochauflösendes Polyacrylamidgel
eingesetzt werden sollte.
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Vorzugsweise
werden die Primerpaare für
alle der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass
sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primer paaren erhältlichen Amplifikate in ihrer
Länge um
maximal 10 Basenpaare, weiter bevorzugt um maximal 5 Basenpaare,
ferner bevorzugt um maximal 4 Basenpaare, insbesondere bevorzugt
um maximal 3 Basenpaare, besonders bevorzugt um maximal 2 Basenpaare
und ganz besonders bevorzugt um maximal 1 Basenpaar unterscheiden.
Höchst
bevorzugt werden die Primerpaare für jede der wenigstens zwei
zu charakterisierenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass alle der bei der
Amplifikationsreaktion pro zu charakterisierender Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate bezüglich
ihrer Länge
identisch sind, sich also in ihrer Länge um 0 Basenpaare unterscheiden.
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Um
eine einfache Detektion der einzelnen bei der Amplifikationsreaktion
erhaltenen Amplifikate zu ermöglichen,
wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die
Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so auszuwählen, dass
sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich
ihrer Länge von
den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um mehr als 10 Basenpaare unterscheiden. Vorzugsweise
werden die Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass
sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich
ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt um
wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens
100 Basenpaare unterscheiden.
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Erfindungsgemäß umfasst
das Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit
von wenigstens zwei verschiede nen Zielsequenzen in einer biologischen
Probe den Verfahrensschritt der Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion,
also einer PCR, einer LCR, mehrerer PCR's oder mehrerer LCR's. Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
eine (Multiplex-)PCR oder eine (Multiplex-)LCR durchgeführt, in
der alle für
die zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit der wenigstens
zwei verschiedenen Zielsequenzen erforderlichen Primerpaare eingesetzt
werden, wenn die Anzahl der eingesetzten Primerpaare eine Multiplex-PCR
oder eine (Multiplex-)LCR zulassen. Alternativ dazu ist es insbesondere
in dem Fall, dass die Anzahl der eingesetzten Primer für eine einzelne
Multiplex-PCR bzw. (Multiplex-)LCR zu groß ist, auch möglich, mehrere
Multiplex-PCR's
bzw. (Multiplex-)PCR's
durchzuführen,
in denen jeweils ein Teil der für
die zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit der wenigstens
zwei verschiedenen Zielsequenzen erforderlichen Primerpaare eingesetzt
werden. Nach der PCR bzw. LCR können die
Einzelproben dann einzeln bezüglich
der vorhandenen PCR-Produkte bzw. LCR-Produkte untersucht werden
oder vorzugsweise zunächst
miteinander vermischt werden, bevor die Länge der erhaltenen PCR-Produkte
bzw. LCR-Produkte bestimmt wird. Diese Ausführungsform kann beispielsweise
angewendet werden, wenn Zielsequenzen aus unterschiedlichen Individuen
charakterisiert werden sollen, wobei zunächst mit der Nukleinsäure eines
jeden Individuums eine PCR bzw. LCR durchgeführt wird, bevor die einzelnen
PCR-Ansätze bzw.
LCR-Ansätze
miteinander vermischt werden und dann die Länge der erhaltenen PCR-Produkte
bzw. LCR-Produkte bestimmt wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder
Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer
biologischen Probe, welche nur wenig Nukleinsäure enthält. Daher eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von
wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer Einzelzelle
oder in einem Polkörper.
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Bei
den wenigstens zwei zu charakterisierenden Zielsequenzen kann es
sich jeweils um eine beliebige Nukleinsäuresequenz handeln. Beispielsweise
kann es sich bei den wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen
jeweils, unabhängig
voneinander, um ein Chromosom, um ein Gen, um einen Genabschnitt
oder um eine nicht-kodierende Nukleinsäuresequenz handeln. Zum Beispiel
können
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
drei unterschiedliche Zielsequenzen bezüglich ihrer Anwesenheit bzw.
Abwesenheit charakterisiert werden, von denen jede ein Chromosom
ist.
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Da
sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere für
den Einsatz vieler Primerpaare eignet, wird in Weiterbildung des
Erfindungsgedankens vorgeschlagen, bei diesem gleichzeitig 3 bis
50 verschiedene Zielsequenzen, vorzugsweise 5 bis 25 verschiedene
Zielsequenzen und besonders bevorzugt 7 bis 15 verschiedene Zielsequenzen
bezüglich
ihrer Anwesenheit bzw. Abwesenheit zu bestimmen.
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Die
Anzahl der pro zu bestimmender Zielsequenz einzusetzenden Primerpaare
hängt zum
einen von der gewünschten
statistischen Sicherheit des Ergebnisses und zum anderen von der
in der biologischen Probe enthaltenen Menge an Nukleinsäure ab.
Je größer die
eingesetzte Nukleinsäuremenge
ist, desto weniger Primerpaare pro zu charakterisierender Zielsequenz
reichen aus, um zu einem aussagekräftigen Ergebnis zu kommen.
Hingegen müssen
umso mehr Primerpaare eingesetzt werden, desto größer die
statistische Sicherheit des Ergebnisses sein soll. Unter Berücksichtigung
der beiden vorgenannten Tendenzen werden in der Amplifikationsreaktion
pro zu bestimmender Zielsequenz vorzugsweise 3 bis 50 Primerpaare,
besonders bevorzugt 4 bis 25 Primerpaare, ganz besonders be vorzugt
5 bis 20 Primerpaare und höchst
bevorzugt, insbesondere in dem Fall des Einsatzes einer Einzelzelle
als biologische Probe, 10 bis 15 Primerpaare eingesetzt.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die wenigstens 3 pro zu bestimmender
Zielsequenz einzusetzenden Primerpaare daran angepasst, in einer
Amplifikationsreaktion nicht überlappende
Bereiche der zu charakterisierender Zielsequenz zu amplifizieren.
Dabei können
die wenigstens 3 pro zu bestimmender Zielsequenz einzusetzenden
Primerpaare Bindungsstellen in dem kodierenden Bereich der Zielsequenz
oder in dem nicht kodierenden Bereich der Zielsequenz aufweisen.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur gleichzeitigen
Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von wenigstens drei
verschiedenen Zielsequenzen in einer Einzelzelle umfassend:
- i) die Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion,
wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR oder eine
LCR ist, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz wenigstens 3 verschiedene
Primerpaare eingesetzt werden, und anschließend
- ii) den Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion
erhaltenen Amplifikate umfassend die Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens,
wobei
die Primerpaare für
jede der wenigstens drei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass - – alle
der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz
mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate die gleiche Länge
aufweisen und dass
- – sich
alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz
mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten unterscheiden.
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Vorzugsweise
werden die Primerpaare für
jede der wenigstens drei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass
sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich
ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um wenigstens 1 Basenpaar, bevorzugt um wenigstens
3 Basenpaare, besonders bevorzugt um wenigstens 5 Basenpaare und
ganz besonders bevorzugt um wenigstens 10 Basenpaare unterscheiden.
Um eine noch einfachere Unterscheidung zwischen den einzelnen Amplifikaten
zu erhalten, werden die Primerpaare für jede der wenigstens zwei
zu bestimmenden Zielsequenzen bevorzugt so ausgewählt, dass
sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich
ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt um
wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 100
Basenpaare unterscheiden.
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Dieses
Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit
und/oder Abwesenheit aller 46 Chromosomen in einer diploiden hu manen
Einzelzelle bzw. aller 23 Chromosomen in einer haploiden humanen
Einzelzelle.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur gleichzeitigen
Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von wenigstens zwei
verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels
wenigstens einer Amplifikationsreaktion, enthaltend:
- i) ein Protokoll zur Durchführung
einer PCR oder einer LCR als Amplifikationsreaktion,
- ii) ein Protokoll zur Durchführung
eines Elektrophoreseverfahrens, wobei das Auflösungsvermögen des in dem Protokoll beschriebenen
Elektrophoreseverfahrens z Basenpaare bzw. Basen beträgt, sowie
- iii) jeweils wenigstens drei voneinander verschiedene Primerpaare
für jede
der wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen, wobei
die
Primerpaare für
jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt sind,
dass - – sich
alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz
mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge
um maximal x Basenpaare unterscheiden und dass
- – sich
alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz
mit den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge
von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit
den Primerpaaren erhältlichen
Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare unterscheiden, wobei
x ≤ z und y > z ist.
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In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, dass die
in dem erfindungsgemäßen Kit
enthaltenen Primerpaare so ausgewählt sind, dass die sich ergebende
Längendifferenz
x der Amplifikate kleiner gleich 10 Basenpaare, bevorzugt kleiner
gleich 5 Basenpaare, weiter bevorzugt kleiner gleich 4 Basenpaare,
insbesondere bevorzugt kleiner gleich 3 Basenpaare, besonders bevorzugt
kleiner gleich 2 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner gleich
1 Basenpaar und höchst
bevorzugt 0 Basenpaare beträgt.
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Ferner
ist es bevorzugt, dass die in dem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Primerpaare
so ausgewählt
sind, dass die sich ergebende Längendifferenz
y wenigstens 10 Basenpaare, besonders bevorzugt wenigstens 25 Basenpaare,
ganz besonders bevorzugt wenigstens 50 Basenpaare und höchst bevorzugt
wenigstens 100 Basenpaare beträgt.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
das erfindungsgemäße Kit so
viele und derart ausgewählte
Primerpaare, dass es dazu geeignet ist, die An- oder Abwesenheit
aller in der biologischen Probe vorliegenden humanen Chromosomen,
d. h. von 23 oder 46 humanen Chromosomen, zu bestimmen.