DE69034111T2

DE69034111T2 - Einrichtung zum Nachweis vom Down syndrom durch nichtinvasive Siebtestung des mütterlichen Blutes

Info

Publication number: DE69034111T2
Application number: DE69034111T
Authority: DE
Inventors: James N. Macri
Original assignee: JN Macri Technologies LLC
Current assignee: JN Macri Technologies LLC
Priority date: 1989-01-17
Filing date: 1990-01-16
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2010-01-17
Also published as: DE69026153T2; JP2644373B2; EP0666477A1; ES2210266T3; DE69026153T3; JPH03505128A; AU5093690A; AU629908B2; DK0666477T3; EP0409956B1; EP0409956B2; WO1990008325A1; ES2084689T3; DE69034111D1; DK0409956T3; US5324668A; DE69026153D1; EP0666477B1; ES2084689T5; DK0409956T4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion des fetalen Down-Syndroms (Trisomie 21) beim pränatalen Screening und betrifft ebenfalls weitere, seltenere aber detektierbare chromosomale Trisomien, beispielsweise Trisomie 13 und Trisomie 18. Die vorliegende Erfindung betrifft im speziellen eine verbesserte Detektionseffizienz des Down-Syndroms durch die Messung der Menge der freien Untereinheit des menschlichen chorionalen Gonadotropin (hCG) im Blut schwangerer Frauen.
Down-Syndrom, auch Trisomie 21 genannt, ist die häufigste angeborene Ursache schwerere mentaler Retardation. Das fetale Down-Syndrom kann üblicherweise über eine diagnostische Methode bestimmt werden, die die Amniozentese und die Bestimmung des Karyotyps einschließt. Diese diagnostische Methode ist jedoch invasiv und führt zu Risiken für die Frau und den Fetus. Die Amniozentese und die Bestimmung des Karyotyps werden nicht routinemäßig bei allen Schwangerschaften durchgeführt. Im Gegenteil, ein oder mehrere Screeningverfahren können verwendet werden, um zu bestimmen, wann das Risiko einer Schwangerschaft das Risiko der Durchführung einer invasiven diagnostischen Methode rechtfertigt.
Die Inzidenz des Down-Syndroms nimmt mit steigendem Alter der Mutter signifikant zu. In der Vergangenheit hat sich die pränatale Kontrolle des Down-Syndroms auf schwangere Frauen mit einem Alter von und über 35 konzentriert, ab welchem sich das Risiko für das Down-Syndrom dem Risiko durch die diagnostischen Methoden, die zur Detektion des Down-Syndroms verwendet werden, annähert oder es übersteigt. Das Standardverfahren des pränatalen Screenings umfasste daher eine Auswahl der Frauen auf der Basis des Alters der Mutter für die diagnostische Amniozentese. Das Alter ist jedoch ein ungeeignetes Kriterium für das Screening, da nur ungefähr 20% aller Down-Syndrom Schwangerschaften aus den 5% der schwangeren Frauen mit größtem Risiko, d. h. mit einem Alter von 35 oder älter, durch die Durchführung einer Amniozentese und der Bestimmung des Karyotyps detektiert werden können. Und, da bei gegenwärtiger klinischer Praxis nur ungefähr die Hälfte aller Frauen mit 35 oder älter sich einer Amniozentese oder einer Bestimmung des Karyotyps unterziehen, werden pränatal weniger als 10% der Schwangerschaften mit einem Down-Syndrom detektiert.
Ein Verbindung zwischem gesenkten Level an alpha-Fetoprotein (AFP) in mütterlichem Blut und fetalem Down-Syndrom wurde 1984 entdeckt. Siehe beispielsweise „An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities"; Merkatz, Macri et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 148: 886, 1984; dessen Offenbarung durch die Referenz hier Bestandteil wird. In dieser Publikation wurde bemerkt, dass weitere chromosomale Trisomien, im speziellen Trisomie 13 und Trisomie 18, ebenfalls mit gesenkten AFP-Leveln in mütterlichem Blut assoziiert waren. Die Inzidenz dieser weiteren chromosomalen Trisomien (1 in 5000 Schwangerschaften beziehungsweise 1 in 6600 Schwangerschaften) ist signifikant geringer als das allgmeine a priori-Risiko, welches mit Trisomie 21 (Down-Syndrom) assoziiert ist. Wegen der Verbindung zwischen diesen weiteren chromosomalen Trisomien und gesenkten MSAFP-Leveln werden solche Abnormalitäten ebenfalls im Rahmen eines Screeningprotokolls, welches AFP und die freie Untereinheit des hCGs in mütterlichem Blut und möglicherweise zusätzliche hier beschriebene Marker verwendet, detektiert. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls für Trisomie 21, ebenfalls die Detektion von Trisomie 13 und 18 erreicht werden kann. Die Verbindung zwischen gesenkten AFP-Leveln in mütterlichem Blut und fetalem Down-Syndrom bot die Möglichkeit eines nicht-invasiven Blut-Screenings zur Detektion der Down-Syndrom Fälle bei jungen, scheinbar nicht betroffenen Familien, bei denen ungefähr 80% der Down-Syndrom Fälle vorkommen. Es wird vermutet, dass die Verwendung eines Screeningtestes, der auf geringem AFP (als Screeningmarker) in mütterlichem Blut beruht, zur pränatalen Detektion von ungefähr 20% aller fetalem Down-Syndrom Fälle führen würde.
Ein weiteres Screeningverfahren schließt die Messung des Levels an unkonjugiertem Östriol (UE) in mütterlichem Blut ein. Siehe beispielsweise „Maternal blood screening for Down-Syndrome in early pregnancy"; Wald et al., British Journal of Obstetrics and Gynecology (BMJ), Band 95, April 1988, dessen Offenbarung durch die Referenz hier Bestandteil wird. Die Messung von UE ist jedoch eine schlechte Basis für ein Screening.
Erst kürzlich wurde eine Verbindung zwischen erhöhten hCG-Leveln in mütterlichem Blut, einem erhöhten Level der alpha-Untereinheit des hCG (hCG besteht aus zwei Untereinheiten, die hier als alpha-hCG und beta-hCG bezeichnet werden) in mütterlichem Blut und dem fetalem Down-Syndrom entdeckt. Siehe beispielsweise „Abnormal Maternal Serum Chorionic Gonadotropin Levels in Pregnancies with Fetal Chromosome Abnormalities"; Bogart, Pandian & Jones; Prenatal Diagnosis, Band 7, 623–630 (1987), dessen Offenbarung durch die Referenz hier Bestandteil wird. In dem Bogart Artikel wird vermutet, dass die Verwendung der erhöhten hCG-Level in mütterlichem Blut und der erhöhten Level der alpha-Untereinheit des hCG in mütterlichem Blut ungefähr 68% der chromosomal abnormalen Feten detektieren würde. Diese Ergebnisse wurden jedoch von einer Studie über Schwangerschaften in der 18.–25. Woche erhalten, und die betroffenen Fälle scheinen Frauen zu betreffen, für die bereits ein erhöhtes Down-Syndrom Risiko identifiziert wurde.
Wie oben erwähnt, schloss die Evaluation des hCG in mütterlichem Blut durch Screening im allgemeinen nur die Messung des hCG im allgemeinen und zusätzlich die Messung des alpha-hCG ein. Obwohl diese Screeningverfahren das fetale Down-Syndrom detektieren, besteht das Bedürfnis und der Wunsch nach einem Verfahren, welches einen höheren Prozentsatz der fetalen Down-Syndrom Fälle detektiert.
JP-A-54-126723 offenbart die Herstellung von spezifischem hCG und spezifischer anti-hCG Antikörper gegen die beta-Untereinheit.
Die Erfindung nutzt die Entdeckung einer zuvor unbekannten Verbindung zwischen erhöhten freien beta-hCG Leveln in mütterlichem Blut und fetalem Down-Syndrom, zwischen dem Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut und dem Level an AFP in mütterlichem Blut und fetalem Down-Syndrom und zwischen dem Verhältnis des Levels an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut gegenüber dem Level an intaktem hCG-Molekül in mütterlichem Blut und dem fetalen Down-Syndrom. Die Erfindung zeigt auch, dass die Verwendung eines multivariaten Diskriminanzanalyseverfahrens (multivariate discriminant analysis technique) die Detektionseffizienz eines Screeningverfahrens, welches den Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut oder den Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut und den Level an AFP in mütterlichem Blut, oder den Logarithmus eines jeden oder den Logarithmus von beiden verwendet, besonders wenn das Schwangerschaftsstadium ebenfalls als Variable in das Diskriminanzanalyseverfahren miteinbezogen wird, bei einem gewählten Risikogrenzwert verbessert. Das Schwangerschaftsstadium bezeichnet das Alter des Fetuses der schwangeren Frau. Die Detektionseffizienz bezieht sich auf den Prozentsatz der fetalen Down-Syndrom Fälle, die bei einem gewählten Risikogrenzwert richtig detektiert werden. Der Risikogrenzwert wird in einem folgenden Abschnitt ausführlicher erklärt. Die Diskriminanzanalyse ist ein allgemein bekannter Ansatz einer multivariaten Analyse, die die Einteilung einer Population durch eine eindimensionale Risikoabschätzung in 2 oder mehrere Gruppen einschließt. Die Diskriminanzanalyse wird manchmal auch als Möglichkeit beschrieben, eine lineare Kombination unabhängiger Variablen zu erzeugen, um dabei das Problem der Messung von Unterschieden in den Gruppen auf ein eindimensionales Problem zu reduzieren. Die Diskriminanzanalyse kann auch durchgeführt werden, falls eine Fragestellung nur mit einer einzigen Variable verknüpft ist. Eine allgemeine Erörterung der Diskriminanzanalyse kann im „Marketing Research" gefunden werden; Churchill, G. A.; Dryden, 1976; Kapitel 15, Seiten 530–543, dessen Offenbarung durch die Referenz hier Bestandteil wird. Ich habe entdeckt, dass die Anwendung der multivariaten Diskriminanzanalyse auf die Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut, die Level an intaktem hCG in mütterlichem Blut, das Verhältnis des Levels an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut zu dem Level des intakten hCG-Moleküls in mütterlichem Blut, den Level an AFP in mütterlichem Blut, den Level an UE in mütterlichem Blut und das Schwangerschaftsstadium zur Detektion eines höheren Prozentsatzes der fetalen Down-Syndrom Fälle mit einer geringeren falsch-positiven Rate führt, als jedes andere bekannte Screeningverfahren zur pränatalen Diagnose für das Down-Syndrom. Ich habe weiterhin entdeckt, dass eine noch größere Anzahl der fetalen Down-Syndrom Fälle nur durch die Messungen von Leveln an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut und AFP in mütterlichem Blut und die Anwendung der multivariaten Diskriminanzanalyse auf den Logarithmus einer jeden Messung und das Schwangerschaftsstadium detektiert werden können. Diese und weitere Entdeckungen werden ausführlicher im Abschnitt „Zusammenfassung der Erfindung" und im Abschnitt „Ausführliche Beschreibung der Erfindung" erklärt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Apparat für das Screening von fetalem Down-Syndrom zur Verfügung zu stellen, welcher bei einer bestimmten falsch-positiven Rate einen höheren Prozentsatz an fetalen Down-Syndrom Fällen detektiert als jedes andere pränatale Screeningverfahren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Apparat für das Screening von fetalem Down-Syndrom zur Verfügung zu stellen, der bei einem gegebenen Detektionsprozentsatz eine geringere falsch-positive Rate besitzt als andere bekannte Verfahren.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, multivariate Diskriminanzanalyseapparate für das Screening von Down-Syndrom anzuwenden, um einen höheren Prozentsatz von fetalen Down-Syndrom Fällen mit einer geringeren falsch-positiven Rate zu detektieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Apparates für das Screening von fetalem Down-Syndrom über die Messung des Levels an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Apparates für das Screening von fetalem Down-Syndrom über die Messung des Levels an AFP und freiem beta-hCG in mütterlichem Blut.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der Erfindung ersichtlich.
Um diese und weitere Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung zu erreichen, werden mütterliche Serumlevel an freiem beta-hCG der schwangeren Frau (auch „Patientin") über herkömmliche immunologische Verfahren gemessen, die Immunoversuchsverfahren einschließen, beispielsweise solche, die aus den oben genannten Publikationen bekannt sind, und weitere im Stand der Technik bekannte Verfahren. Der Level an freiem beta-hCG wird dann mit einem Referenzdatensatz verglichen, um das Risiko einer Patientin einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, zu bestimmen. Um die Detektionseffizienz zu verbessern, kann der Level an freiem beta-hCG und das Schwangerschaftsstadium mit einem Referenzdatensatz verglichen werden. Um die Detektionseffizienz weiter zu verbessern, werden die Level an freiem beta-hCG und AFP (auch „Marker") in mütterlichem Blut der Patientin über herkömmliche immunologische Verfahren gemessen, einschließlich im Stand der Technik bekannte Versuchsverfahren, beispielsweise diejenigen, die aus den oben genannten Publikationen bekannt sind. Die Level eines jeden Markers werden dann mit einem Referenzdatensatz verglichen, um das Risiko der Patientin, einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, zu bestimmen. Um die Level der Marker mit einem Referenzdatensatz zu vergleichen, wird ein multivariates Diskriminanzanalyseverfahren verwendet. Genauer gesagt wird das spezifische Risiko einer Patientin über die Bayes-Regel berechnet, das a priori-Risiko der Patientin und die relative Häufigkeit der betroffenen und nicht betroffenen Schwangerschaften werden bestimmt über die Einbeziehung des Logarithmus der quantitativen Patientinnenlevels eines jeden Markers in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, die unter Verwendung der multivariaten Diskriminanzanalyse für die Referenzdaten entwickelt wurde. Falls das Risiko einer Patientin einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen größer als ein bestimmter Grenzwert ist, sollte die Patientin hinsichtlich weiterer Diagnoseverfahren beraten werden, um das Down-Syndrom zu bestätigen. Durch die Einbeziehung des Schwangerschaftsstadiums als Marker zusammen mit dem Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut und dem Level an AFP in mütterlichem Blut wird die Detektionseffizienz weiter verbessert, da der Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut und der Level an AFP in mütterlichem Blut bei einer Anzahl von Proben gemäß einer logarithmischen Gaußverteilungskurve verteilt werden; die größte Detektionseffizienz kann durch die Einbeziehung des Logarithmus der quantitativen Patientinnenlevel eines jeden Markers und das Schwangersstadium in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, die unter Verwendung der multivariaten Diskriminanzanalysen für die Referenzdaten entwickelt wurde, erreicht werden.
Ein Vorteil des Apparates der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass er einen höheren Prozentsatz an fetalem Down-Syndrom Fällen mit einer geringeren falsch-positiven Rate als andere bekannte Verfahren und Prozesse richtig vorhersagt.
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden klar durch die folgende detailliertere Beschreibung und die folgenden Beispiele.
1 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die die Signifikanzlevel einzelner Marker für Trisomie 21 zeigt.
2 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die die Screeningeffizienz einzelner Marker für das Down-Syndrom zeigt.
3 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die die Screeningeffizienz der Markergemische für das Down-Syndrom zeigt.
4 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die den Anteil der Down-Syndrom Fälle oberhalb eines bestimmten Percentils für die Verteilung der freien beta-Untereinheit des hCG in nicht betroffenen Schwangerschaften zeigt.
5 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die die Effizienz einzelner Marker für das Down-Syndrom zeigt.
6 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die die Screeningeffizienz des Logarithmus für AFP und des Logarithmus für die freie beta-Untereinheit des hCG als Markergemisch in verschiedenen Schwangerschaftsstadiumsbereichen für das Down-Syndrom zeigt.
7 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, die die hochgerechnete Down-Syndrom Screeningeffizienz für AFP, freies beta-hCG und mütterliches Alter in den USA zeigt.
8, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, zeigt die Level der freien beta-Untereinheit des hCG in Trisomie 21 Fällen in Abhängigkeit von verschiedenen Percentils für nicht betroffene Schwangerschaften.
9, auf die in Beispiel 2 verwiesen wird, zeigt die Verteilung der Level der freien beta-Untereinheiten des hCG.
10 ist eine Tabelle, auf die in Beispiel 3 verwiesen wird, die die Screeningeffizienz bei einer Vielzahl von Markerkombination für das Down-Syndrom zeigt.
11 zeigt den Apparat der vorliegenden Erfindung, der zur Ausführung des Detektionsverfahrens verwendet wird.
12 und 13 zeigen das Ablaufdiagram eines Computerprogramms zur Verwendung von Referenzparametern, die im Zusammenhang mit der Bestimmung des spezifischen Risikos einer Patientin einen betroffenen Fetus zu tragen, verwendet werden.
14 zeigt das Ablaufdiagram eines Computerprogramms, welches die Referenzparameter, die in dem Programm der 12 und 13 berechnet wurden, zur Bestimmung des speziellen Risikos der Patientin einen betroffenen Fetus zu tragen, verwendet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Patientin eine mütterliche Blutprobe entnommen. Der Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut wird dann über konventionelle analytische Verfahren bestimmt, wie beispielsweise im Stand der Technik bekannte immunologische Verfahren. Der Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut wird dann zur Bestimmung, ob die Patientin ein erhöhtes Risiko hat einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, mit einem Referenzdatensatz verglichen. Um die Detektionseffiezienz zu erhöhen, können das Schwangerschaftsstadium und der Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut zur Bestimmung, ob der Patient ein erhöhtes Risiko hat einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, mit einem Referenzdatensatz verglichen werden.
Obwohl, wie für den Fachmann ersichtlich ist, für die vorliegende Erfindung jedes bekannte analytische Verfahren zur Bestimmung der Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut verwendet werden kann, muss das gleiche analytische Verfahren für das freie beta-hCG verwendet werden, welches zur Generierung der Referenzdaten für das freie beta-hCG verwendet wurde. Falls ein neues analytisches Verfahren für das freie beta-hCG verwendet wird, muss, basierend auf den Daten des neuen Verfahrens, ein neuer Referenzdatensatz generiert werden.
Es gehört ebenfalls zum allgemeinen Fachwissen, dass bei der Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper für die beta-Kette des hCG, einige Antikörper spezifisch für das Protein und einige spezifisch für Antigenstellen in den Kohlenhydraten sein werden. Die Messung des Levels an freiem beta-hCG, wie überall in der Beschreibung der Erfindung aufgeführt, schließt die Verwendung von Antikörpern ein, die entweder spezifisch für das Protein oder für die Antigenstellen in den Kohlenhydraten oder für jede andere Stelle des freien beta-hCG sind.
Der Durchschnittsfachmann versteht weiterhin, dass, während die freie alpha-Untereinheit des hCG durch ein einzelnes Gen kodiert ist, die freie beta-Untereinheit durch eine komplexe Familie aus mindestens 7 sehr ähnlichen Genen oder Pseudogenen kodiert ist. Siehe beispielsweise „Human chorionic gonadotropin beta-subunit is encoded by at least 8 genes arranged in tandem and inverted pairs", Boorstein, Vamvakopoules & Fiddes; Nature, Band 300, 2. Dezember 1982, dessen Offenbarung durch die Referenz hier Bestandteil wird. Es ist bekannt, dass nur 3 der 7 freien beta-hCG Gene bei der üblichen freien beta-hCG Produktion in der Plazenta exprimiert werden. Siehe beispielsweise „Fragmentation of the Beta-Subunit of Human Chorionic Gonadotropin Produced by Choriocarcinoma"; Nishimura, Ide, Utsunomiya, Kitajima, Yuki und Mochizuki; Endocrinology, Band 123, Nr. 1, 1988, dessen Lehre durch die Referenz hier Bestandteil wird. Ob die gleichen drei Gene in Krankheitszuständen exprimiert werden, beispielsweise bei der Anwesenheit von fetalem Down-Syndrom, wurde nicht bestimmt. Es ist daher möglich, dass mehrere Formen des freien beta-hCG mit kleinen Aminosäuresequenzunterschieden oder anderen kleinen Unterschieden synthetisiert werden. Es ist weiterhin möglich, dass beim Down-Syndrom eine einzigartige Variante oder Varianten des freien beta-hCG durch die Expression ein oder mehrerer freier beta-hCG Gene produziert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Varianten, falls existent, über herkömmliche immunologische Verfahren zur Messung des freien beta-hCG gemessen. Ein Versuch, der entwickelt wurde, um, falls vorhanden, eine spezifische, mit dem Down-Syndrom assoziierte, freie beta-hCG Variante oder Varianten zu messen, kann zu einer weiteren Erhöhung der Detektionseffizienz führen.
Wir haben zur Unterscheidung von mit Trisomie 21 betroffenen und nicht betroffenen Schwangerschaften, wirksam monoklonale Antikörperversuchsverfahren zur Messung der freien beta-Untereinheit des hCG verwendet. Eine Detektionseffizienz für Trisomie 21 von 83% wurde erreicht. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann die Verwendung von Antikörpern zur Quantifizierung spezieller Analyten in gewissem Ausmaß zu einer Kreuzreaktion mit einer verschiedenen jedoch ähnlichen Substanz führen. Daher kann die Unterscheidung zwischen betroffenen und nicht betroffenen Fällen durch die Gegenwart einer sich von der freien beta-Untereinheit des hCG unterscheidenden Form stattfinden, die aufgrund eines gewissen Grades an Kreuzreaktivität mit den verwendeten Antikörpern, detektiert wird. Falls eine solche aberrierende Form der freien beta-Untereinheit des hCGs identifiziert wird, kann sie als neue biochemische Substanz bezeichnet werden. Daten aus der wissenscahftlichen Literatur deuten tatsächlich darauf hin, dass aberrierende Formen des beta-hCGs erkannt wurden (siehe beispielsweise Nishimura et al., infra).
Von Trisomie 21 betroffene Fälle können auch über eine aberrierende Form der freien beta-Untereinheit des hCGs charakterisiert werden. Falls Trisomie 21 durch die Produktion einer aberrierenden Form der freien beta-Untereinheit des hCG charakterisiert wird, ist der Fachmann in der Lage, spezifische Antikörper gegen eine solche abberrierende Form zu entwickeln, welche zur weiteren Erhöhung der Detektionseffizienz dieses Syndroms führen.
Die Referenzdaten spiegeln den Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut schwangerer Frauen, die Feten mit Down-Syndrom tragen (auch „betroffen") und/oder dem Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut schwangerer Frauen, die normale Feten tragen (auch „nicht betroffen"), wider. Wie allgmein vom Fachmann verstanden, besteht das Screeningverfahren für das fetale Down-Syndrom aus einem vergleichenden Entscheidungsfindungsprozess. Für jede Entscheidungsfindung werden Referenzwerte von erkrankten Patienten oder solchen, die sich im Zustand von Interesse befinden und/oder von nicht erkrankten Patienten oder solchen, die sich nicht im Zustand von Interesse befinden, benötigt. Für die vorliegende Erfindung sind die Referenzwerte der Level an gemessenem(n) Marker oder Markern in mütterlichem Blut, beispielsweise freies beta-hCG von sowohl schwangeren Frauen, die Down-Syndrom-Feten tragen, und von Frauen, die normale Feten tragen. Ein Referenzdatensatz wird durch die Zusammenfassung der Referenzwerte für eine Anzahl von Proben gebildet. Wie für den Fachmann ersichtlich, wird der Referenzdatensatz durch die Einbeziehung einer zunehmenden Anzahl an Referenzwerten verbessert.
Um zu bestimmen, ob eine Patientin ein erhöhtes Risiko hat, einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, muß ein Grenzwert (cut-off) gebildet werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass ein Grenzwert zur Bestimmung, ob ein Patient ein erhöhtes Risiko hat einen Fetus mit Trisomie 13 oder 18 zu tragen, auch für die Identifizierung der Trisomie 21 Fälle wirksam sein kann. Dieser Grenzwert kann durch das Labor, den Arzt oder über eine Fall-zu-Fall Entscheidung für jede Patientin, ermittelt werden. Der Wert des Grenzwertes kann auf verschiedenen Kriterien basieren, einschließlich der Anzahl der Frauen, die sich weiterer invasiver diagnostischer Tests unterziehen würden, dem Durchschnittsrisiko aller Frauen die einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen und die sich weiterer invasiver diagnostischer Tests unterziehen würden, der Entscheidung, dass jede Frau, deren spezielles Patientinnenrisiko höher ist als ein bestimmter Risikowert, wie beispielsweise 1 in 400, sich weiterer invasiver diagnostischer Tests unterziehen sollte oder weiteren im Stand der Technik bekannte Kriterien. Der Grenzwert könnte unter Verwendung einer Reihe von Verfahren gebildet werden, einschließlich Percentilen, durchschnittlichen plus- oder minus Standardabweichung(en), Vielfachen von Mittelwerten, spezifische Patientenrisiken oder weitere im Stand der Technik bekannte Verfahren.
In einem weiteren Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Detektion einer größeren Anzahl der Fälle von fetalem Down-Syndrom, wird der Patientin eine mütterliche Blutprobe entnommen. Der Level des intakten hCG-Moleküls in mütterlichem Blut, des freien beta-hCG, des UE und des AFP (auch „Marker") wird dann über herkömmliche analytische Verfahren, wie im Stand der Technik bekannte immunologische Verfahren, gemessen. Obwohl, wie für den Fachmann offensichtlich, jedes bekannte analytische Verfahren zur Messung des Levels dieser Marker in mütterlichem Blut für die vorliegende Erfindung funktioniert, muß das gleiche analytische Verfahren für jeden Marker verwendet werden, welches zur Generierung der Referenzdaten für einen bestimmten Marker verwendet wurde. Falls ein neues analytisches Verfahren für einen bestimmten Marker verwendet wird, muß, basierend auf dem Datensatz mit dem Verfahren, ein neuer Referenzdatensatz generiert werden.
Das spezifische Risiko einer Patientin einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, wird dann über die Bayes-Regel berechnet, das a priori-Risiko der Patientin und die relative Häufigkeit der betroffenen und nicht betroffenen Schwangerschaftenwerden betsimmt über die Einbeziehung der quantitativen Patientinnenlevel eines jeden Markers (des intakten hCG-Moleküls, des freien beta-hCGs, des UEs und des AFPs) und des Verhältnisses des Levels an freiem beta-hCG gegenüber dem Level an intaktem hCG-Molekül, zusammen mit dem Schwangerschaftsstadium der Patientin in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen, die unter Verwendung der multivariaten Diskriminanzanalyse für die Referenzdaten entwickelt wurde. Die multivariate Diskriminanzanalyse kann mit dem kommerziell erhältlichen statistischen Computerprogrammpaket „Statistical Analysis System" (hergestellt und vertrieben durch SAS Institut Inc.) oder mit anderen Verfahren der multivariaten statitischen Analyse oder anderen im Stand der Technik bekannten statistischen Softwarepaketen ausgeführt werden.
Die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion bietet ein Verfahren, welches den Patientinnenlevel eines jeden Markers mit einem Referenzdatensatz vergleicht. Ein Typ einer Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion ist unten dargestellt, obwohl, wie für den Fachmann offensichtlich sein wird, andere Wahrscheinlichkeitsdichtfunktionen zu ähnlichen Ausführungen führen und daher in der vorliegenden Erfindung Entsprechendes leisten.
Formel für das Down-Syndrom Risiko
Der Index „a" bezieht sich auf die betroffenen Fälle.
Der Index „u" bezieht sich auf die nicht betroffenen Fälle.
(X – M) ist ein Vektor, bei dem jedes Element dem Level jeder Variablen minus dem Mittelwert der Variablen entspricht.
Cov^–1 ist das Inverse der zusammengefassten betroffenenen und nicht betroffenenen Kovarianzmatrix aller Variablen in dem Model.
(X – M) ist der transponierte (X – M) Vektor.
EXP bezieht sich auf die exponentiale Funktion.
|COV| bezieht sich auf die Determinante der Kovarianzmatrix aller Variablen in dem Model für die Referenzdaten.
Wie für den Fachmann ersichtlich, können einzelne Kovarianzmatrizen für betroffene und nicht betroffene Schwangerschaften durch die zusammengefasste Kovarianzmatrix ersetzt werden. Die Formel für das Down-Syndrom Risiko würde dann folgendermaßen aussehen:
|COV| bezieht sich auf die Determinante der Kovarianzmatrix aller Variablen in dem Model für die Referenzdaten.
Zum Zweck der Diskriminanzanalyse wird bezüglich der Ausgangswahrscheinlichkeit des Down-Syndroms ein Wert aus der allgemeinen unselektionierten Population angenommen. Die Ausgangswahrscheinlichkeit beträgt im allgemeinen ungefähr 1 in 800. Bei der multivariaten Diskriminanzanalyse wird eine Entscheidung gefällt, welcher Grenzwert ein postives Testergebnis darstellt. Falls es beispielsweise wünschenswert erscheint, bei einer schwangeren Frau, die mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 in 400 oder höher einen Fetus mit Down-Syndrom trägt, weitere diagnostische Tests durchzuführen, dann soll, falls das Ergebnis der Diskriminanzanalyse zeigt, dass eine schwangere Frau, die mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 in 400 oder höher einen Fetus mit Down-Syndrom trägt, das Testergebnis der schwangeren Frau als positiv betrachtet werden. Falls ein positives Testergebnis angezeigt ist, soll die Patientin bezüglich weiterer diagnostischer Tests beraten werden, um das Down-Syndoom zu bestätigen.
Der Apparat und das Ablaufdiagram eines Computerprograms zur Berechnung der Referenzparameter und der spezifischen Risken ist in den 11 bis 14 gezeigt.
Wie in 11 gezeigt, werden zur Bestimmung der Referenzdaten das Schwangerschaftsstadium, der Level an AFP und der Level an freiem beta-hCG bei betroffenen und nicht betroffenen Schwangerschaften über herkömmliche Verfahren bestimmt. Eine große Anzahl an Proben werden ausgewählt, um die Zuverlässigkeit zu erhöhen. Die Messungen zur Entwicklung der Referenzparameter sind schematisch bei 10 angegeben.
Sobald die Referenzparameter 22 nach dem Eintritt über ein geeignetete Eingabevorrichtung 15 durch die Prozessierungseinheit 20 berechnet sind, kann das spezifische Risiko 25 für eine bestimmte Patientin auf der Basis der für das Individuum spezifischen gemesenen Markerwerten, bei 30 angegeben, berechnet werden.
Das Program zur Bestimmung der Referenzparameter ist in den 12 und 13 gezeigt und das Program zur Berechnung des spezifischen Risikos ist in 14 dargestellt.
Wie in 12 und 13 gezeigt, liest das Programm in einer ersten Schleife 100 die Identifikationsdaten ID, das Schwangerschaftsstadium GA, die Mengen an AFP und freiem beta-hCG und einen Code, der anzeigt, ob die Schwangerschaft einer Referenzgruppe durch Trisomie 21 betroffen ist oder nicht betroffen ist, ein, um die Referenzdaten zu entwerfen. Dies ist in Schritt 102 gezeigt. Im Ablaufdiagramm ist das Schwangerschaftsstadium GA durch die Variable X₁ gekennzeichnet, der Logarithmus von AFP durch die Variable X₂ gekennzeichnet und, wie in Schritt 104 gezeigt, der Logarithmus des freien beta durch X₃ gekennzeichnet. Die Summe und die Matrizen des Summenproduktes werden dann, wie in Schritt 106 gezeigt, aufgrund der Mengen an X₁, X₂ und X₃, bestimmt oder errechnet. Die Variable N_Code, die die Anzahl betroffener und nicht betroffener Fälle in der Referenzgruppe anzeigt, wird dann hinzugenommen. Wenn die Schleife beendet ist, wie durch die Flusslinie 110 gezeigt, werden die Mittelwerte, wie durch die Referenznummer 112 angezeigt, durch eine Serie von Schleifen, die durch die Mengen I, J und K bestimmt sind, berechnet. In diesen Schleifen wird die Kovarianzmatrix unter Verwendung der Summenmatrix, die in der Schleife 100 definiert ist, und der Matrix des Summenproduktes, welches in Schleife 100 berechnet wurde, berechnet. Nach diesen Schleifen wird eine Auswahl getroffen, ob die Kovarianzmatrizen für betroffen und nicht betroffen zusammengefasst werden oder nicht. Diese Auswahl wird in den Schritten 114, 116 und 118 eingespeist. Falls die Auswahl in einer Zusammenfassung besteht, werden die Kovarianzen, wie in Schritt 120 gezeigt, zur Bildung einer zusammengefassten Kovarianzmatrix zusammengefasst, die zusammengefasste Kovarianzmatrix wird invertiert, was zu einer invertierten zusammengefassten Kovarianzmatrix IPCM führt, wie bei 122 gezeigt und die Mittelwerte und die invertierte Koovarianzmatrix werden in den Schritten 124 und 126 in einem Ordner gespeichert und ausgedruckt. Falls die Auswahl darin besteht die Kovarianzmatrizen nicht zusammenzufassen, wird jede der beiden Kovarianzmatrizen in den Schritten 123 und 125 invertiert und die Mittelwerte und die invertierte Kovarianzmatrix werden in den Schritten 125 und 127 in einem Ordner gespeichert und ausgedruckt. Diese Mengen umfassen die Referenzparameter für die Berechnung des spezifischen Risikos eines Individuums einen betroffenen Fetus zu tragen.
Wie in 14 gezeigt werden die Referenzparameter, die durch die Ausführung des Programs der 12 und 13 bestimmt wurden, die Referenzparameter, die die Mittelwerte und die invertierte zusammengefasste Kovarianzmatrix umfassen, wie in 130 gezeigt, eingelesen. Die spezielle Patientinnenakte, einschließlich der Patientinnenidentifikation, dem Schwangerschaftsstadiums GA, dem AFP und dem freien beta-hCG werden dann, wie in 132 gezeigt, eingelesen. Das Schwangerschaftsstadium wird dann genauer bei 134 berechnet und die Berechnung des Alters der Mutter wird bei 136 durchgeführt. Bei 138 wird das Ausgangsrisiko, basierend auf dem Alter der Mutter und den Inzidenzdaten bestimmt. Wie in den Beispielen unten diskutiert, ist der Faktor 1/800 ein typischer Wert für ein Berechnungsergebnis.
Bei 140 wird aufgrund des Ausgangsrisikos, die relative Häufigkeit einen betroffenen Fetus (ABT) zu tragen bestimmt, die dem Zähler der oben genannten Gleichungen (1) oder (2) entspricht. Bei 142 wird die relative Häufigkeit, einen nicht betroffenen Fetus multipliziert mit (1 – Ausgangsrisiko) (NT) zu tragen, bestimmt, welche dem zweiten Faktor im Nenner der obigen Gleichungen (1) oder (2) entspricht. Bei 144 wird das spezifische Risiko unter Verwendung der Bayes Regel bestimmt, das heißt, ABN = ABT/(ABT + NT). (Gleichungen (1) und (2)). Bei 146, werden die Ergebnisse, das heißt, das spezifische Risiko ABN der Patientin und die Identifikationsnummer der Patientin ausgedruckt.
Wie für den Fachmann offensichtlich können andere statistische und mathematische Verfahren zur Berechnung der Referenzparameter, andere als das lineare Diskriminanzanalyseverfahren, verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird der Patientin eine Probe mütterlichen Bluts entnommen. Die Level an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut und AFP in mütterlichem Blut (auch „Marker") werden dann über herkömmliche analytische Verfahren, einschließlich immunologischer, im Stand der Technik bekannter Verfahren, gemessen. Obwohl, wie für den Fachmann offensichtlich ist, jedes bekannte analytische Verfahren zur Bestimmung der Level dieser Marker in mütterlichem Blut funktionieren wird, muss das gleiche analytische Verfahren für jeden Marker verwendet werden, welches zur Generierung der Referenzdaten für den bestimmten Marker verwendet wurde. Falls ein neues analytisches Verfahren für einen bestimmten Marker verwendet wird, muss basierend auf den Daten, die mit diesem Verfahren entwickelt wurden, ein neuer Referenzdatensatz generiert werden.
Das spezifische Risiko einer Patientin, einen Fetus mit Down-Syndrom zu tragen, wird dann unter Verwendung der Bayes Regel, des a priori-Risikos der Patientin und der relativen Häufigkeiten für betroffene und nicht betroffene Schwangerschaften, die durch die Einbeziehung der quantitativen Level eines jeden Markers der Patientin zusammen mit dem Schwangerschaftsstadium des Patienten in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen, die für die Referenzdaten unter Verwendung der multivariaten Diskriminanzanalyse entwickelt wurden, berechnet. Um die Detektionseffizienz weiter zu erhöhen, wird der Logarithmus der quantitativen Level an freiem beta-hCG und AFP der Patientin zusammen mit dem Schwangerschaftsstadium der Patientin in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, die unter Verwendung der multivariaten Diskriminanzanalyse für die Referenzdaten entwickelt wurde, einbezogen. Die multivariate Diskriminanzanalyse kann mit dem kommerziell erhältlichen statistischen Computerprogrammpaket „Statistical Analysis System" (hergestellt und verkauft durch SAS Institut Inc.) oder mit weiteren multivariaten statistischen Analyseverfahren oder weiteren im Stand der Technik bekannten statistischen Softwarepaketen durchgeführt werden.
Für den Zweck der Diskriminanzanalyse wird bezüglich der Ausgangswahrscheinlichkeit für das Down-Syndrom aus der allgemeinen unselektionierten Bevölkerung eine Annahme gemacht. Die Ausgangswahrscheinlichkeit beträgt im allgemeinen ungefähr 1 in 800. Bei der multivariaten Diskriminanzanalyse wird eine Entscheidung getroffen, welcher Risikogrenzwert ein positives Testergebnis darstellt. Falls es beispielsweise wünschenswert erscheint, bei einer schwangeren Frau, die mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 in 400 oder höher einen Fetus mit Down-Syndrom trägt, weitere diagnostische Tests durchzuführen, dann, soll, falls das Ergebnis der Diskriminanzanalyse zeigt, dass eine schwangere Frau, die mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 in 400 oder höher einen Fetus mit Down-Syndrom trägt, das Testergebnis der schwangeren Frau als positiv betrachtet werden. Fall ein positives Testergebnis angezeigt ist, soll die Patientin bezüglich weiterer diagnostischer Tests beraten werden, um das Down-Syndrom zu bestätigen.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, könnte in einer der oben genannten Ausführungsformen die Veränderung des Risikogrenzwertes für ein positives Ergebnis oder die Verwendung verschiedener a priori-Risiken, die für verschiedene Untergruppen der Bevölkerung gelten könnten, die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse einer jeden Patientin verändern.
Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf die obengenannten Ausführungsformen, sondern umfasst alle möglichen Ausführungsformen und Markerkombinationen, die in den folgenden Beispielen offenbart werden.
Beispiel 1
Mehr als 400 Proben von Patientinnen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen fetalem Down-Syndrom und den Leveln an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut im Zusammenhang mit AFP (MSAFP), UE und intaktem hCG in mütterlichem Serum zu untersuchen. Diese Proben schlossen 25 Proben mütterlichen Bluts von schwangeren Frauen, von denen bekannt war, dass sie einen Fetus mit Down-Syndrom tragen, und Kontrollproben, die zu den betroffenen Fällen passten, ein.
Für jede Blutprobe wurden die quantitativen Level für AFP, für intaktes hCG-Molekül, für freies beta-hCG und für UE (auch „Marker") durch das folgende Versuchsverfahren bestimmt:
Der Level eines jeden Markers wurde zu einer Variablen in dem stufenweisen Diskriminanzverfahren und der linearen Diskriminanzanalyse des kommerziell erhältlichen statistischen Computersoftwarepaketes „Statistical Analysis System" (SAS Institute Inc.), um einen Referenzdatensatz zu generieren. Das Verhältnis an freiem beta-hCG zu intaktem hCG-Molekül und das Schwangerschaftsstadium der Patientin wurden ebenfalls als Variablen einbezogen. Das stufenweise Diskriminanzverfahren bestimmte, dass alle Variablen in das lineare Diskriminanzverfahren miteinbezogen werden konnten. Das lineare Diskriminanzverfahren wurde dann für jede einzelne Variable separat und für verschiedene Kombinationen der Variablen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Diskriminanzanalysen sind in dem Diagramm unten zusammengefasst. „Sensitivität" bezeichnet den Prozentsatz an fetalen Down-Syndrom Fällen, die ein positives Testergebnis zeigen. „Falsch-positive" bezeichnet den Prozentsatz an normalen Feten, die ein positives Testergebnis zeigen.
Gemisch = MSAFP + freies beta-hCG + intaktes hCG + UE + Verhältnis Schwangerschaftsstadium ist zusammen mit dem Risikogrenzwert = 1 in 400 außer bei (*), bei dem er 1 in 365 beträgt jeder Variablen einbezogen.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist wird die Veränderung des Risikogrenzwertes für ein positives Ergebnis oder die Verwendung verschiedener a priori-Risiken, die für verschiedene Untergruppen in der Bevölkerung gelten könnten, die Ergebnisse des Diskriminanzverfahrens für jede Patientin verändern.
Beispiel 2
Mehr als 550 Proben von Patientinnen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen fetalem Down-Syndrom und den Leveln an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut zu untersuchen. Ursprünglich wurden 29 Proben von schwangerern Frauen, von denen bekannt war, dass sie einen Fetus mit Down-Syndrom tragen und 520 nicht betroffene Proben mit passendem Schwangerschaftsstadium (gleiche Woche), Alter der Mutter (innerhalb 3 Jahre) und Aufbewahrungszeit in der Kühltruhe (innerhalb 1 Monat) analysiert. Alle Proben stammten von einfach-schwangeren (singleton), nicht diabetischen, weißen schwangeren Frauen.
Um bei der Abschätzung der Screeningeffizienz eine systematische Abweichung des Trainingsatzes zu vermeiden, wurde das Konzept eines Validierungssatzes verwendet. Ein Validierungssatz ist ein Datensatz, der unabhängig vom Referenzdatensatz ist. Die Ergebnisse der Patientinnen im Validierungssatz werden nicht zur Bildung der Referenzdaten verwendet. Im Gegenteil, die Ergebnisse der Patientinnen im Validierungssatz werden mit dem Referenzdatensatz verglichen, um die Screeningeffizienz zu bestimmen. Dieser zweite Validierungssatz bestand aus 26 zusätzlichen, bestätigten Fällen von Trisomie 21 (insgesamt 25 Fälle) und einer zufällig ausgewählten Gruppe von 159 Kontrollproben. Die Kontrollproben wurden in ähnlicher Weise von einfach-schwangeren (singleton), nicht diabetischen, weißen, schwangeren Frauen entnommen.
Die gesamte Studie bestand aus 4388 Bestimmungen der Markerlevel in mütterlichem Blut in 7 verschiedenen Versuchen wie unter dargestellt:
Der Level eines jeden Markers wurde zur einer Variablen in dem stufenweisen Diskriminanzverfahren und dem linearen Diskriminanzverfahren des kommerziell erhältlichen statistischen Computersoftwarepaketes „Statistical Analysis System" (SAS Institut Inc.), um einen Referenzdatensatz zu generieren. Das Schwangerschaftsstadium wurde ebenfalls als Variable miteinbezogen. Das lineare Diskriminanzverfahren wurde dann für jede Variable separat und für verschiedene Kombinationen der Variablen durchgeführt. Die Patientinnen wurden basierend auf einem Down-Syndrom Risikogrenzwert von 1 in 365 als betroffen oder nicht betroffen eingeteilt. Nicht betroffene Fälle, die als betroffen eingeteilt wurden, wurden als falsch-positiv betrachtet. Das Risiko einer jeden Patientin für Down-Syndrom wurde unter Verwendung der Bayes-Regel, der multivariaten normalen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion für betroffene und nicht betroffene Fälle und einem allgemeinen a priori-Risiko von 1 in 800, berechnet. Eine zusammengefasste Kovarianzmatrix wurde für jede Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion verwendet.
Die Ergebnisse der Tabellen 1–3, wie in den 1–3 dargestellt, beziehen sich auf den Ausgangsversuchssatz. Die Ergebnisse in den Tabellen 5–7, 5–7, basieren auf der Einteilung der Patientinnen in dem Validierungssatz. Die Tabelle 4, gezeigt in 4, und die 8 und 9 basieren auf dem Ausgangsversuchssatz und allen betroffenen Fällen.
Die Ergebnisse der Versuchsverfahren wurden zur. Bestimmung, ob ein signifikanter Unterschied in den Leveln eines jeden Markers zwischen betroffenen und anbetroffenen Fällen bestand, analysiert. Tabelle 1 (1) zeigt, dass sich, außer bei UE, die Betroffenen in allen signifikant von den nicht Betroffenen unterscheiden. Die falsch-positive Rate und die Detektionseffizienz eines jeden Markers wurden außerdem, wie in Tabelle 2 (2) gezeigt, bestimmt. Die höchste Detektionseffizienz wurde mit einem hCG Versuch erreicht, der sowohl das intakte Molekül und die freie Beta-Untereinheit misst. Eine weitere Erhöhung in der Detektionseffizienz wurde durch die Kombination einzelner Marker in Gemischen beobachtet. Das Gemisch, welches den hCG-Versuch enthält, der sowohl das intakte hCG-Molekül und die freie beta-Untereinheit des hCG misst, erzeugte die höchste Detektionseffizienz unter den Gemischen, wie in Tabelle 3 (3) gezeigt.
Die Auswertung der beta- und alpha- Untereinheit des hCGs alleine zeigte, dass für die alpha-Untereinheit keine signifikanten Unterschiede zwischen betroffenen und nicht betroffenen Fällen existierte (p = 0,23), während ein signifikanter Anstieg für die beta-Untereinheit bei betroffenen beobachtet wurde (p = 0,001). Wie im allgemeinen im Stand der Technik bekannt, misst die Beweisstärke in wissenschaftlichen Untersuchungen, indem die Wahrscheinlichkeit angezeigt wird, dass ein Ergebnis, das mindestens so hoch ist, wie das beobachtete, zufällig entsteht. Je geringer der p-Wert, umso stärker der Beweis, dass das Ergebnis kein Zufallsergebnis ist.
8 zeigt das 10., 50. und 90. Percentil für freies beta-hCG bezogen auf das Schwangerschaftsstadium. Bei nicht betroffenen Schwangerschaften wird ein kontinuierlicher Abwärtstrend bezogen auf das Schwangerschaftsstadium beobachtet. Wie in Tabelle 4 (4) gezeigt, offenbart die Analyse der freien beta-hCG Level in den Fällen von fetalem Down-Syndrom, dass 86% oberhalb des Mittelwerts der nicht Betroffenen liegen.
Die Level an freiem beta-hCG in sowohl betroffenen und nicht betroffenen Fällen passen in eine logarithmische Gaußverteilung (p = 0,78 und 0,86). 9 illustriert diese Verteilungen. Die Tabelle 5 (5) liefert die Detektionseffizienzdaten für die freie beta-hCG Untereinheit und die freie alpha-hCG Untereinheit alleine. Die hohe Detektionseffizienz für freies beta-hCG ist in Tabelle 5 gezeigt.
Eine noch höhere Detektionseffizienz wurde mit einem Gemisch aus AFP und freiem beta-hCG erreicht. Wie in Tabelle 6 (6) gezeigt, wurde durch die Einbeziehung des Logarithmus des Level an freiem beta-hCG und des Logarithmus des Level an MSAFP in das lineare Diskriminanzverfahren des kommerziell erhältlichen statistischen Computersoftwarepakets „Statistical Analysis System" (SAS Institut Inc.), wie oben beschrieben eine bessere Detektionseffizienz erreicht.
Eine höhere Detektionseffizienz würde ebenfalls durch die Verwendung des Level an freiem beta-hCG und dem Level an AFP erreicht werden, im Gegensatz zu deren Logarithmen.
Durch eine weitere Analyse der Daten wurde beobachtet, dass sowohl AFP und freies beta-hCG unabhängig vom Alter der Mutter sind (p = 0,8394 und 0,5214 unter Verwendung des Kruskal-Wallis Tests für 4 verschiedene Altersgruppen der Mütter für AFP bzw. freies beta-hCG, (Alter = 30, 31–35, 36–40 und 40)). Die Korrelation (r) der Level der freien beta-Untereinheit des hCGs und des AFPs heben sich außerdem nicht signifikant von 0 ab (r = 0,04, p = 0,39 und r = –0,06, p = 0,81 für nicht betroffene bzw. betroffene Fälle).
Die grundlegende Beobachtung aus unseren Daten bestätigt die Tatsache, dass die freie beta-hCG Untereinheit zur höchsten Detektionseffizienz für das Down-Syndrom beiträgt. In der Tat erzeugte die Verwendung eines Versuchs, der lediglich das freie beta-hCG misst, eine Detektionseffizienz und eine falsch-positive Rate von 65,4% bzw. 5,2%. Diese Raten sind vergleichbar mit denen, die aus einer Kombination von 3 Versuchen berichtet wurden. Wie früher dargelegt, besteht daher ein Vorteil der vorliegenden Erfindung in der Reduzierung der Anzahl der Versuche.
Unser Ergebnis, der Beitrag des freien beta-hCG, basiert auf Folgendem: (a) der alleinige beste Beitrag zur Detektionseffizienz für das Down-Syndrom bestand in einem Versuch für freies beta-hCG, (b) ein Versuch mit dem intakten hCG-Molekül führte zu substantiell geringeren Detektionsraten, (c) ein Versuch, der eine Kombination aus intaktem hCG-Molekül und freiem beta-hCG misst, führt zu einer höheren Detektionseffizienz als ein Versuch, der das intakte hCG-Molekül alleine misst.
Es steht fest, dass das Risiko für das fetale Down-Syndrom mit dem Alter der Mutter zunimmt. Um, wie oben beschrieben, die spezifische Patientinnenrisiken der vorliegenden Erfindung für die klinische Verwendung zu erzeugen, ist ein spezifisches a priori-Risiko bezogen auf das Alter der Mutter in das multivariate Diskriminanzanalyseverfahren einbezogen. Da sowohl AFP und freies beta-hCG Level unabhängig vom Alter der Mutter sind, haben wir unsere Daten analysiert, um zu sehen wie viele nicht betroffene und betroffene Frauen ein positives Ergebnis bei einem bestimmten a priori-Risiko für jedes einzelne Alter haben würden. Die vorhergehende Information wurde verwendet, um, basierend auf der Altersverteilung der Mütter bei Lebendgeburten in den Vereinigten Staaten, die falsch-positive und Sensitivitätsrate für ein zusammenhängendes landesweites Screening innerhalb der Vereinigten Staaten zu projizieren. Wie in Tabelle 7 (7) gezeigt, zeigen die Projektionen, dass es möglich ist, eine Detektionsrate von 80%, mit 5 falsch-positiven, zu erreichen. Die Proben, die in Beispiel 2 beschrieben wurden, wurden weiterhin analysiert, um die Detektionseffizienz anderer Kombinationen der Marker zu entdecken. Im speziellen wurde das lineare Diskriminanzverfahren des Beispiels 2 mit demselben Risikogrenzwert und a priori- Risikowert für verschiedene Markerkombinationen, Vielfache der Mittelwerte (MOM) für die Marker und die Logarithmen der Marker, mit und ohne die Einbeziehung des Schwangerschaftsstadiums, durchgeführt. Das lineare Diskriminanzverfahren wurde unter Verwendung sowohl der Referenzdaten als auch der Validierungsdaten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8, in 10, zusammengefasst.
Beispiel 3
Das folgende Beispiel stellt die Etablierung eines einstufigen Versuchs für freies beta-hCG und eines zweistufigen Versuch für freies beta-hCG und deren Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung dar.
Etablierung eines einstufigen Versuchs für freies beta-hCG

1. Eine 96-Loch Mikrotiterplatte wird mit einem „Fang"-Antikörper, der spezifisch für die freie beta-Untereinheit des humanen chorionalen Gonadotropins (hCG) Moleküls ist, beschichtet. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Die Konzentration des Beschichtungsantikörper beträgt 0,8 Mikrogamm pro Loch, kann aber, falls erwünscht, anders sein. Die Platte wird bei 4°C mindestens 16 Stunden lang inkubiert.
2. Die Platte wird mit einer phosphatgepufferten Salzlösung mit pH 7,2, die 0,05% Tween-20 enthält, gewaschen. Weitere geeignete Waschpuffer können angewendet werden. Die Platte wird dann mit einer Lösung, die 3% hydrolisiertes Tierprotein und 0,05% Tween-20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung mit einem pH von 7,2 enthält, „blockiert". Weitere Lösungen, die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise eine 1% bovine Serumalbuminlösung, können verwendet werden. Dreihundert Mikroliter der Blockierlösung werden jedem Loch zugegeben und die Platte wird eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Weitere Blockierverfahren sind ebenfalls praktikabel, z. B. „Lasierung" („glazing").
3. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen und 100 Mikroliter des Versuchspuffers, der einen biotinylierten Antikörper, der spezifisch für die freie beta-Untereinheit des hCGs ist, enthält, werden zu jedem Loch zugegeben. Der verwendete Versuchspuffer besteht aus 3% hydrolisiertem Tierprotein und 0,05% Tween-20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung mit einem pH von 7,2, kann aber jegliche geeignete, im Stand der Technik bekannte, Lösung sein. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal und, in Abhängigkeit von den Preferenzen des Versuchsdurchführenden, mit einer anderen Substanz als Biotin, beispielsweise Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase, konjugiert sein. Die Konzentration des Antikörpers im Versuchspuffer kann angepaßt werden, um optimale Absoprtionswerte zu erhalten.
4. Zwanzig Mikroliter der Probe werden dann zu jedem Loch hinzugegeben. Die Probe kann bestehen aus: Versuchspuffer, der als Kontrolle für die Versuchsdurchführung mitläuft; eine Lösung aus freiem beta-hCG, die zur Standardisierung der Werte der unbekannten Proben verwendet wird, oder der Serumprobe einer Frau im zweiten Schwangerschaftsdrittel. Die Platte wird 30 Sekunden „gevortext" und dann auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute platziert, auf dem sie 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert.
5. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Einhundert Mikroliter des Versuchspuffers, der Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase enthält, wird dann jedem Loch zugefügt. Dieser Schritt wird nicht benötigt, falls der zweite verwendete Antikörper an eine andere Substanz als Biotin konjugiert ist. Die Konzentration der Streptavidinperoxidase im Versuchspuffer ist 2,0 Mikrogramm pro Milliliter. Die Platte wird für 5 Minuten auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Umgebungstemperatur platziert.
6. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Einhundert Mikroliter eine o-Phenylendiaminsubstratlösung wird jedem Loch zugefügt. Diese Substratlösung kann alternativ jeder geeignete, im Stand der Technik bekannte Farbstoff sein, und ist abhängig von der Substanz, die mit dem zweiten Antikörper konjugiert ist. Die Platte wird dann auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute platziert und bei Umgebungstemperatur im Dunkeln 8 Minuten lang inkubiert.
7. Einhundert Mikroliter einer verdünnten (1,0 N) Schwefelsäure wird dann jedem Loch zugefügt, um die Substratreaktion zu stoppen.
8. Die Absorption eines jeden Lochs wird spektrophotometrisch bei 492 nm bestimmt.

Etablierung eines zweistufigen Versuchs für freies beta-hCG

1. Eine 96-Loch Mikrotiterplatte wird mit einem „Fang"-Antikörper, der spezifisch für die freie beta-Untereinheit des humane chorionalen Gonadotropins (hCG) Moleküls ist, beschichtet. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Die Konzentration des Beschichtungsantikörpers beträgt 0,8 Mikrogamm pro Loch, kann aber, falls erwünscht, anders sein. Die Platte wird bei 4°C mindestens 16 Stunden lang inkubiert.
2. Die Platte wird mit einer phosphatgepufferten Salzlösung mit pH 7,2, die 0,05% Tween-20 enthält, gewaschen. Weitere geeignete Waschpuffer können angewendet werden. Die Platte wird dann mit einer Lösung, die 3% hydrolisiertes Tierprotein und 0,05% Tween-20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung mit einem pH von 7,2 enthält, „blockiert". Weitere Lösungen, die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise eine 1% bovine Serumalbuminlösung, können verwendet werden. Dreihundert Mikroliter der Blockierlösung werden jedem Loch zugegeben und die Platte wird eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Weitere Blockierverfahren sind ebenfalls praktikabel, z. B. „Lasierung" („glazing").
3. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen und 100 Mikroliter des Versuchspuffers werden zu jedem Loch zugegeben. Der verwendete Versuchspuffer besteht aus 3% hydrolysiertem Tierprotein und 0,05% Tween-20 in einer phosphatgepufferten Salzlösung mit einem pH von 7,2, kann aber jegliche geeignete, im Stand der Technik bekannte Lösung sein.
4. Zwanzig Mikroliter der Probe werden dann zu jedem Loch hinzugegeben. Die Probe kann bestehen aus: Versuchspuffer, der als Kontrolle für die Versuchsdurchführung mitläuft; einer Lösung aus freiem beta-hCG, die zur Standardisierung der Werte der unbekannten Proben verwendet wird, oder der Serumprobe einer Frau im zweiten Schwangerschaftsdrittel. Die Platte wird 30 Sekunden „gevortext" und dann auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute platziert, auf dem sie 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert.
5. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Einhundert Mikroliter des Versuchspuffers, der einen biotinylierten Antikörper enthält, der spezifisch für die freie Beta Untereinheit des hCG ist, wird dann jedem Loch zugefügt. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und, in Abhängigkeit von den Preferenzen des Versuchsdurchführenden, mit einer anderen Substanz als Biotin, beispielsweise Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase, konjugiert sein. Die Konzentration des Antikörpers im Versuchspuffer kann angepaßt werden, um optimale Absoprtionswerte zu erhalten. Die Platte wird 30 Sekunden „gevortext" und dann auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute platziert, auf dem sie 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert wird.
6. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Einhundert Mikroliter des Versuchspuffers, der Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase enthält, wird dann jedem Loch zugefügt. Dieser Schritt wird nicht benötigt, wenn der zweite verwendete Antikörper an eine andere Substanz als Biotin konjugiert ist. Die Konzentration der Streptavidin-Peroxidase im Versuchspuffer ist 2,0 Mikrogramm pro Milliliter. Die Platte wird für 5 Minuten auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Umgebungstemperatur platziert.
7. Die Platte wird dann, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Einhundert Mikroliter einer o-Phenylendiaminsubstratlösung wird jedem Loch zugefügt. Dies Substratlösung kann alternativ jeder geeignete, im Stand der Technik bekannte Farbstoff sein und ist abhängig von der Substanz mit der der zweite Antikörper konjugiert ist. Die Platte wird dann auf einem Rotator bei 200 Umdrehungen pro Minute platziert und bei Umgebungstemperatur im Dunkeln 8 Minuten lang inkubiert.
8. Einhundert Mikroliter einer verdünnten (1,0 N) Schwefelsäure wird dann jedem Loch zugefügt, um die Substratreaktion zu stoppen.
9. Die Absorption eines jeden Lochs wird spektrophotometrisch bei 492 nm bestimmt.

Diese beiden Versuche wurden zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet. Einhundertachtundsiebzig (178) Patientinnenproben wurden verwendet, um die Beziehung zwischen fetalem Down-Syndrom und den Leveln an freiem beta-hCG in mütterlichem Blut zu untersuchen. Sechsundzwanzig (26) Proben von schwangeren Frauen, von denen bekannt war, dass sie einen Fetus mit Down-Syndrom tragen, und 152 unbekannte, nicht betroffene Proben wurden analyisiert. Alle Proben stammten von einfach-schwangeren (singleton), nicht diabetischen, weißen, schwangeren Frauen.
Die Patientenproben wurden dann mit Hilfe eines ELISA Versuchs auf die quantitativen Level an MSAFP, und, mit Hilfe des ein- und zweistufigen Versuchs, die Level an freiem beta-hCG unabhängig voneinander analysiert. Der Level an MSAFP und der Level an freiem beta-hCG aus jedem Versuch wurde dann zu einer Variablen in dem linearen Diskriminanzverfahren des kommerziell erhältlichen statitischen Computersoftwarepaketes „Statisitical Analysis System", um den Referenzdatensatz zu generieren. Das Schwangerschaftsstadium der Patientin wurde ebenfalls als Variable in das Diskriminanzverfahren einbezogen. Die Ergebnisse dieser Diskriminanzanalysen für alle Schwangerschaftsstadien und für Schwangerschaftsstadien zwischen der 14. und 16. Woche sind unten zusammengefasst.

Claims

Apparat umfassend: ein Mittel, welches für den Empfang von Messdaten betreffend den Level an freiem Beta (hCG) im mütterlichen Blut einer schwangeren Frau geeignet ist und ein Auswertungsmittel zum Vergleich der Messdaten betreffend den Level an freiem Beta (hCG) mit einem Referenzdatensatz zur Bestimmung von fötalen chromosomalen Trisomien.
Der Apparat nach Anspruch 1, wobei es sich bei der fötalen chromosomalen Trisomie um das Downsyndrom handelt.
Apparat zur Bestimmung, ob eine schwangere Frau signifikant gefährdet ist, einen Fötus mit Down Syndrom auszutragen, umfassend: ein Mittel, welches für den Empfang von Messdaten betreffend den Level an freiem Beta (hCG) im mütterlichen Blut einer schwangeren Frau geeignet ist, und ein Mittel, welches für den Empfang von Messdaten betreffend den Level an alpha Fetoprotein im mütterlichen Blut einer schwangeren Frau geeignet ist, und ein Auswertungsmittel zur Berechnung eines normativen Datensatzes aus einem Referenzdatensatz enthaltend Referenzwerte des Levels an freiem Beta (hCG) und des Levels an alpha Fetoprotein zu verschiedenen Schwangerschaftsstadien einer (1) schwangeren Frau, die einen Fötus mit Down Syndrom austrägt und (2) einer schwangeren Frau, die einen normalen Fötus austrägt, und zur Aufnahme der Messdaten betreffend der Level an freiem Beta (hCG) und alpha Fetoprotein und der Schwangerschaftsstadien der schwangeren Frau in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, dabei wird zur Bestimmung des Risikos der schwangeren Frau, einen Fötus mit Downsyndrom auszutragen, der Level und das Schwangerschaftsstadium der schwangeren Frau mit dem normativen Datensatz verglichen.
Apparat zur Bestimmung, ob eine schwangere Frau signifikant gefährdet ist, einen Fötus mit Down Syndrom auszutragen umfassend: ein Mittel, welches für den Empfang von Messdaten betreffend den Level an freiem Beta (hCG) im mütterlichen Blut einer schwangeren Frau geeignet ist, und ein Auswertungsmittel zur Berechnung eines Referenzdatensatzes und zur Aufnahme der Messdaten betreffend den Level an freiem Beta (hCG) und des Schwangerschaftsstadiums der schwangeren Frau in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, dabei wird zur Bestimmung des Risikos der schwangeren Frau, einen Fötus mit Down Syndrom auszutragen, der Level an freiem Beta (hCG) und das Schwangerschaftsstadium der schwangeren Frau mit dem normativen Datensatz verglichen.
Der Apparat nach Anspruch 3 oder 4 weiterhin umfassend: ein Mittel, welches für den Empfang von Messdaten betreffend den Level an alpha Fetoprotein im mütterlichen Blut einer schwangeren Frau geeignet ist, und wobei das Auswertungsmittel auch die Messdaten des alpha Fetoprotein in die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion aufnimmt und dabei auch den Level an alpha Fetoprotein der schwangeren Frau mit einem Referenzdatensatz vergleicht.
Der Apparat nach Anspruch 3, 4, oder 5, wobei der Referenzdatensatz aus den log(s) der Messdaten betreffend den/die Level berechnet wird, und die log(s) der Messdaten dazu dienen, den/die Level der schwangeren Frau mit dem normativen Datensatz zu vergleichen.
Apparat zur Bestimmung, ob eine schwangere Frau signifikant gefährdet ist, einen Fötus mit Down Syndrom auszutragen, umfassend: ein Mittel, welches für den Empfang von Messdaten betreffend den Level des zu bestimmenden Stoffes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Beta (hCG), einer Variante (Varianten) des freien Beta (hCG), oder einer aberrierenden Form (aberrierenden Formen) des freien Beta (hCG) im mütterlichen Blut einer schwangeren Frau geeignet ist, und ein Auswertungsmittel zur Berechnung eines eferenzdatensatzes und zur Aufnahme der Messdaten betreffend den Level des zu bestimmenden Stoffes und des Schwangerschaftsstadiums der schwangeren Frau in eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, dabei wird zur Bestimmung des Risikos der schwangeren Frau, einen Fötus mit Down Syndrom auszutragen, der Level des zu bestimmenden Stoffes und das Schwangerschaftsstadium mit dem normativen Datensatz verglichen.