CN101585876B - 一种苏丹红ⅱ完全抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种苏丹红II完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以苏丹红II为原料，在吡啶条件下与琥珀酸酐发生缩合反应，生成苏丹红II-半琥珀酸酯；利用活化酯法使苏丹红II-半琥珀酸酯上的羧基与牛血清蛋白BSA结合，制备苏丹红II完全抗原。用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了苏丹红II的完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对苏丹红II研究的需要。
Description
技术领域
一种苏丹红II完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
苏丹红主要包括苏丹红I、II、III和IV，其中苏丹红II在体内代谢可产生二甲基苯胺(2，4-xylidine)和1-氨基-2-萘酚，ARC将苏丹红II和其代谢产物2，4-二甲基苯胺(2，4-xylidine)均列为三类致癌物。经毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性。油溶性的苏丹红染料一旦被摄入人体，极易溶解在肌体组织中，由于不具水溶性，因而不会在消化和循环过程中随尿液排出体外。如果长期较大剂量地摄入，就会在体内积累而对肌体造成损伤或基因突变而致癌。因苏丹红可能致癌的特性，包括我国在内的许多国家都禁止将苏丹红作为食用色素添加在食品当中。
目前，食品中苏丹红的检测方法主要有采用高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-质谱法(LC-MS)。另外，气相色谱-质谱法(GC-MS)、薄层层析法、极谱法、毛细管电泳、分光光度法等也可对苏丹红样品进行检测，实验准度高重复性好，可是这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，以酶联免疫吸附法为代表的免疫学方法，因其灵敏、特异、快速、操作简单等优点在食品安全快速检测中地位越来越重要。所以有必要制备苏丹红II完全抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种苏丹红II完全抗原的制备方法，所制备的产品可用于苏丹红II免疫分析方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案：一种苏丹红II完全抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测，以苏丹红II为原料，在吡啶条件下与琥珀酸酐发生缩合反应，生成苏丹红II-半琥珀酸酯；第二步为完全抗原的制备及检测，利用活化酯法使苏丹红II-半琥珀酸酯上的羧基与牛血清蛋白(BSA)结合，制备苏丹红II完全抗原。工艺步骤为：
(1)苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原的合成：
称取苏丹红II于50mL的圆底烧瓶中，加入吡啶，搅拌溶解，加入琥珀酸酐，苏丹红II与琥珀酸酐等摩尔投料，在90℃条件下搅拌反应24h，反应完成后，旋转蒸发除去吡啶，将反应液预先冷却至4℃，然后移入含有质量浓度10％盐酸的冰蒸馏水中静置过夜，沉淀以蒸馏水洗至pH6.0，真空干燥，得苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原粗制品；
(2)苏丹红II完全抗原的合成：
制备A液：称取0.1mmol半抗原于20mL烧杯中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解后，加入0.1mmoL的N，N′-二环己基碳酰亚胺，0.1mmoL的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应60min，4℃保存，此液为A液。
制备B液：称取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氢钠缓冲液，4℃保存，此液为B液。
在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并边加边摇，于4℃下孵育3h，即得苏丹红II完全抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
透析：将苏丹红II完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得苏丹红II完全抗原：苏丹红II-半琥珀酸酯-牛血清蛋白；
(3)苏丹红II完全抗原的鉴定：苏丹红II完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定苏丹红II完全抗原的偶联比。
偶联比测定：偶联比是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制苏丹红II浓度为0，10，20，30μg·mL-1的20％乙腈溶液，通过紫外扫描可知苏丹红II的最大吸收波长为474nm，在474nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。
偶联比测定：配制150μg·mL-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL-1，在474nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：γ＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/66200)。
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL-1)。
本发明的有益效果：本发明合成了苏丹红II的完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1苏丹红II完全抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
实施例1
(1)苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原的合成：
称取0.1mol的苏丹红II于50mL的圆底烧瓶中，溶于5mL吡啶中，搅拌溶解，加入0.1mol的琥珀酸酐，在90℃条件下搅拌反应24h，反应完成后，旋转蒸发除去吡啶。将反应液预先冷却至4℃，然后移入添加有2mL浓盐酸的20mL冰蒸馏水中静置过夜，沉淀以蒸馏水洗至pH6.0，真空干燥，得苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原粗制品。
(2)苏丹红II完全抗原的制备：
制备A液：称取0.1mmol半抗原于20mL烧杯中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解后，加入0.1mmoL的N，N′-二环己基碳酰亚胺，0.1mmoL的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应60min，4℃保存，此液为A液。
制备B液：称取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氢钠缓冲液，4℃保存，此液为B液。
在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并边加边摇，于4℃下孵育3h，即得苏丹红II完全抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
透析：将完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到苏丹红II完全抗原：苏丹红II-半琥珀酸酯牛血清蛋白。
(3)苏丹红II完全抗原的鉴定
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制苏丹红II浓度为0，10，20，30μg·mL-1的20％乙腈溶液，通过紫外扫描可知苏丹红II的最大吸收波长为474nm，在474nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：ε＝吸光值/摩尔浓度。本实验摩尔吸收系数ε＝11118.9。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，10，20，40，60，80，100μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。
偶联比测定：配制150μg·mL-1牛血清蛋白的20％乙醇溶液，将偶联产物用20％乙醇稀释到150μg·mL-1，在474nm处测吸光值，以20％乙醇为空白，测出牛血清蛋白溶液的吸光值为A1，偶联产物的吸光值为A2，则偶联比率r为：γ＝[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/66200)，本实验r＝19。
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，66200为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL-1)。
Claims (1)
1.一种苏丹红II完全抗原的合成方法，其特征是第一步为半抗原的制备，以苏丹红II为原料，在吡啶条件下与琥珀酸酐发生缩合反应，生成苏丹红II-半琥珀酸酯；第二步为完全抗原的制备及检测，利用活化酯法使苏丹红II-半琥珀酸酯上的羧基与牛血清蛋白结合，制备苏丹红II完全抗原；工艺步骤为：
(1)苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原的合成：
称取苏丹红II于50mL的圆底烧瓶中，加入吡啶，搅拌溶解，加入琥珀酸酐，苏丹红II与琥珀酸酐等摩尔投料，在90℃条件下搅拌反应24h，反应完成后，旋转蒸发除去吡啶，将反应液预先冷却至4℃，然后移入含有质量浓度10％盐酸的冰蒸馏水中静置过夜，沉淀以蒸馏水洗至pH6.0，真空干燥，得苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原粗制品；
(2)苏丹红II完全抗原的合成：
制备A液：称取0.1mmol半抗原于20mL烧杯中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解后，加入0.1mmol的N，N′-二环己基碳酰亚胺，0.1mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应60min，4℃保存，此液为A液；
制备B液：称取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氢钠缓冲液中，4℃保存，此液为B液；
在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并边加边摇，于4℃下孵育3h，即得苏丹红II完全抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
透析：将苏丹红II完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到苏丹红II完全抗原：苏丹红II-半琥珀酸酯-牛血清蛋白；
(3)苏丹红II完全抗原的鉴定：苏丹红II完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定苏丹红II完全抗原的偶联比。
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