CN106350576A - 一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，属于生物检测及免疫传感器技术领域。该方法包括以下步骤：1)在磁珠表面包被盐酸克伦特罗完全抗原，封闭，得到免疫磁珠探针；2)在胶体金溶液中加入二抗，混匀后加入转化酶，得到酶标二抗；3)在待测溶液中加入免疫磁珠探针和盐酸克伦特罗抗体，免疫反应后磁分，得到磁珠/抗原‑抗体免疫复合物；再加入酶标二抗，反应后磁分，得到磁珠/抗原‑抗体/酶标二抗免疫复合物；4)在磁珠/抗原‑抗体/酶标二抗免疫复合物中加入蔗糖溶液，水解反应后，用血糖仪检测葡萄糖信号值，并根据标准曲线得到待测溶液中盐酸克伦特罗的残留量。具有操作简单，检测快速准确、灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，属于生物检测及免疫传感器技术领域。
背景技术
盐酸克伦特罗(clenbuteerol hydrochloride，CLB)，俗称瘦肉精，是一种强效选择性β兴奋剂，广泛用于防治支气管炎、哮喘性慢性支气管炎等呼吸科疾病和产科的治疗。研究发现，当它高于临床应用剂量5～10倍添加到饲料中，可导致动物体内的脂肪分解代谢增加，蛋白质合成增加，显著提高胴体的廋肉率。但是，人一旦长期食用含有大量CLB残留的肉及其制品会出现头晕、恶心、战栗、肌肉振颤等轻度症状。此外，CLB能使动物肌肉中的糖酵解不足而使机体pH过高，最终影响动物的肉质。从2002年12月起，农业部规定CLB在所有动物性食品中不得检出。因此，有必要发展简单、可靠、灵敏的盐酸克伦特罗残留检测方法来保障我国肉制品市场的安全与稳定。
目前，检测CLB的方法主要有色谱法、色谱-质谱联用法和ELISA法，其中应用最多的是液-质联用法、气-质联用法和化学发光酶免疫法。色谱法和色谱-质谱联用法是盐酸克伦特罗残留痕量分析的首选确证方法，能对残留物进行定性、定量测定，灵敏度较高，但是此类方法需要对样品进行复杂的前处理(如采用气相色谱测定时，需要进行甲酯化衍生化反应)，操作复杂，测试时间长，费用高，并且检测仪器昂贵、移动性差，难以推广普及。
申请号201210145999.X的发明专利公开了一种可用于检测CLB的磁性夹心纳米免疫传感器，其工作原理为：在工作电极表面修饰纳米金再结合被测物一抗，并在溶液中与被测物抗原温育结合，将标记有HRP酶的被测物二抗与工作电极表面的被测物一抗-抗原温育结合，形成“三明治”复合物，在外加磁场作用下，包被有“夹心免疫复合物”的纳米磁珠被吸附到电极表面，加入HRP酶催化底物过氧化脲，通过测定传感器电流输出信号定量分析CLB。但是该方法需要经历复杂的电极修饰过程，对操作人员的要求较高，并且电极作为固相载体属于单一反应界面，包被抗原的量有限，同时电化学工作站的便携性和可操作性不强。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，该方法利用磁性分离技术并结合间接竞争免疫反应，用血糖仪捕获信号，实现盐酸克伦特罗的定量分析，具有操作简单，检测快速准确、灵敏度高等特点。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，包括以下步骤：
1)在磁珠表面包被盐酸克伦特罗完全抗原，封闭，得到免疫磁珠探针；
2)在胶体金溶液中加入二抗，混匀后加入转化酶，得到酶标二抗；
3)在待测溶液中加入免疫磁珠探针和盐酸克伦特罗抗体，免疫反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体免疫复合物；再加入酶标二抗，反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物；
4)在磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物中加入蔗糖溶液，水解反应后，用血糖仪检测葡萄糖信号值，并根据标准曲线得到待测溶液中盐酸克伦特罗的残留量。
步骤1)中磁珠在包被抗原前先进行活化处理，操作可参见专利“一种在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法”(申请号201310226070.4，申请日2013.06.07)。包被、封闭的具体操作也可参见该专利。当采用羧基磁珠时，活化后磁珠上的羧基处于半稳定状态，可与抗原侧链的氨基形成稳定的酰胺键，从而将抗原偶联在磁珠表面。封闭的目的是使磁珠自身未反应的位点得到饱和，以减少非特异性吸附的发生，增加磁珠的通用性。
步骤2)中胶体金可采用柠檬酸三钠还原法制备，参见专利“一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用”，也可采用专利“大气压空气等离子体液相下合成胶体金纳米颗粒的方法”(申请号201610069073.5，申请日2016.02.01)中公开的方法。
步骤2)中二抗与转化酶的质量比为1:8～12，根据紫外全波长扫描标记前后的抗体金溶液优选为1:10，这是因为紫外扫描标记后的胶体金溶液与标记前相比可以看到峰值发生偏移4～5nm。二抗可选择兔抗羊抗体，具体随一抗的变化而变化。
步骤3)中免疫磁珠探针上的完全抗原与待测溶液中的盐酸克伦特罗竞争结合抗体，形成磁珠/抗原-抗体免疫复合物和盐酸克伦特罗-抗体免疫复合物，磁分，弃去上清液中未结合的抗体、盐酸克伦特罗-抗体免疫复合物等，再加入酶标二抗进行第二次免疫反应，在磁珠上形成抗原-抗体/酶标二抗夹心免疫复合物，磁分，弃去上清液中未结合的酶标二抗。
步骤3)中免疫磁珠探针的加量为20～30mg，盐酸克伦特罗抗体的加入浓度为1:1000～1:700，酶标二抗的加入浓度为1:800～1:400。以上参数均由单因素试验优化得出。
步骤4)中蔗糖为反应底物，在转化酶的作用下能水解生成葡萄糖，再通过血糖仪测定葡萄糖信号即可。
步骤4)中水解反应的时间为20～40min，反应温度40～60℃。
步骤4)中标准曲线的制作方法为：分别在系列浓度的盐酸克伦特罗标准品溶液(例如：0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL)中加入免疫磁珠探针、盐酸克伦特罗抗体，免疫反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体免疫复合物，再加入酶标二抗，反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物；在上述免疫复合物中加入蔗糖溶液，水解反应后用血糖仪检测葡萄糖信号值，以标准品溶液浓度为横坐标，以添加标准品的血糖仪各信号值(S)与无标准品添加的血糖仪信号值(S0)的比值为纵坐标，绘制标准曲线。进一步作回归分析，得到线性回归方程。
本发明的有益效果：
血糖仪是一种检测血清中血糖含量的小型医疗设备，便携、定量成本低，近年来受到科研工作者的研究和关注。Yu Li等人发现便携式血糖仪可用于检测非糖物质，如药物(可卡因)、生物因子(腺嘌呤)、疾病标志物(结核干扰素)、有毒金属离子(铀)等。
本发明结合分散固相萃取的高效性、免疫亲和反应的特异性和磁回收的简便性，可有效简化现有方法的前处理流程，缩短前处理时间，提高目标物富集效率和杂质净化效率，并利用便携式血糖仪快速、准确地定量CLB残留，具有操作简单、灵敏度高、检测成本低等优点，可用于肉类及肉制品中CLB的定量分析。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程示意图；
图2为盐酸克伦特罗的标准曲线；
图3为检测方法特异性验证结果。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，流程示意图见图1，具体步骤如下：
1)免疫磁珠探针的制备
a.在2mg羧基磁珠中加入200μL含有5mg/mL EDC的MES溶液(15mM，pH6.0)，室温下活化30min后磁分弃上清；
b.加入500μL含0.1mg CLB-BSA的MES溶液，室温反应过夜，磁分弃上清；
c.加入含有2％OVA的PBS(0.01M，pH6.0)溶液，37℃封闭2h，磁分弃上清，得到免疫磁珠；
d.加入含0.1％OVA的PBS溶液重悬磁珠(磁珠浓度1mg/mL)，保存于4℃冰箱中待用。
2)胶体金/转化酶/二抗复合物(即酶标二抗)的制备
a.胶体金的制备
参照柠檬酸三钠还原法，取1mL浓度1％的氯金酸溶液，用超纯水定容至100mL，倒入250mL圆底烧瓶中，在恒温加热磁力搅拌条件下冷凝回流加热，沸腾后立即加入5mL浓度1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热，观察到溶液颜色渐渐由淡黄色变为蓝色，最后当溶液变为酒红色并保持颜色不再变化时，继续加热10min后停止加热和搅拌，回流冷却，得到胶体金溶液，4℃避光保存备用；
b.取上述胶体金溶液，加入K2CO3溶液调节pH至8.5，加入1mg二抗，4℃反应1h，10000rpm高速离心25min，弃上清，加入10mg转化酶，4℃反应4h，同样条件离心，弃上清，加入2％聚乙二醇2000重悬，即得酶标二抗，4℃冰箱保存备用。
3)标准曲线的绘制
分别在0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL系列浓度的盐酸克伦特罗标准品溶液中加入25mg免疫磁珠探针、1:800稀释倍数盐酸克伦特罗抗体以及1:500的酶标二抗，反应后磁分弃上清，得到磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物；在上述免疫复合物中加入500μL浓度0.1g/mL的蔗糖溶液，55℃温度下水解30min后，用便携式血糖仪检测产生的葡萄糖信号值，制作标准曲线(见图2)。
4)待测溶液的检测
取25mg免疫磁珠，加入100μL待测溶液(含猪肉均质样品)、100μL 1:800的CLB抗体和100μL1:500的酶标二抗，反应后磁分弃上清，得到磁珠/抗原-抗体-酶标二抗免疫复合物；在上述免疫复合物中加入500μL浓度0.1g/mL的蔗糖溶液，55℃水解30min后，用便携式血糖仪检测产生的葡萄糖信号值为7.8mM；对照标准曲线得到待测溶液中盐酸克伦特罗的残留量为10ng/mL。
试验例
1)检测方法的准确度验证
取适量正常猪肉充分搅碎，每份称取2.00g均质样品，制备9份样品，分3组，每组各添加1、5、10ng/mL的盐酸克伦特罗标准品。在猪肉均质样品中加入3mL 0.1mol/L的高氯酸溶液，匀浆振荡提取10min，再加入3mL PBS，于样品混合仪上匀浆5min，4℃、10000rpm离心30min，取全部上清二次离心，上清液用2M NaOH调节pH值为7.4，再用实施例1中方法检测，计算加标样品的回收率、相对标准偏差和变异系数，结果见下表1。
表1加标回收试验结果
2)检测方法的特异性验证
为验证检测方法的特异性，设计盐酸克伦特罗结构类似物与抗体的交叉反应试验，两种类似物为莱克多巴胺(ractopamine，RAC)和沙丁胺醇(salbutamol，SAL)。盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的添加方式见图3，浓度均为5ng/mL。结果表明：本发明中检测方法具有较高的特异性，抗体与盐酸克伦特罗各类似物无交叉反应。
Claims (7)
1.一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)在磁珠表面包被盐酸克伦特罗完全抗原，封闭，得到免疫磁珠探针；
2)在胶体金溶液中加入二抗，混匀后加入转化酶，得到酶标二抗；
3)在待测溶液中加入免疫磁珠探针、盐酸克伦特罗抗体，免疫反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体免疫复合物；再加入酶标二抗，反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物；
4)在磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物中加入蔗糖溶液，水解反应后，用血糖仪检测葡萄糖信号值，并根据标准曲线得到待测溶液中盐酸克伦特罗的残留量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中磁珠在包被抗原前先进行活化处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中二抗与转化酶的质量比为1:8～12。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中免疫磁珠探针的加量为20～30mg，盐酸克伦特罗抗体的浓度为1:1000～1:700，酶标二抗的浓度为1:800～1:400。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中水解反应的时间为20～40min，反应温度40～60℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中标准曲线的制作方法为：分别在系列浓度的盐酸克伦特罗标准品溶液中加入免疫磁珠探针、盐酸克伦特罗抗体，免疫反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体免疫复合物，再加入酶标二抗，反应后磁分，得到磁珠/抗原-抗体/酶标二抗免疫复合物；在上述免疫复合物中加入蔗糖溶液，水解反应后用血糖仪检测葡萄糖信号值，以标准品溶液浓度为横坐标，以添加标准品的血糖仪各信号值与无标准品添加的血糖仪信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。
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