CN116930485A - 一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫检测和光谱分析技术领域，尤其涉及一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统。该方法利用竞争性免疫反应原理，利用转化酶催化蔗糖底物以生成具有强烈红外信号的反应次级产物葡萄糖，然后利用红外光谱仪检测次级产物的红外光谱信号值，进而用于待测污染物样品中的含量检测。本发明相对传统的光谱检测方法检测灵敏度高。并且与常规实验室检测方法相比，不仅具有反应快速的优点，同时还能实现污染物在痕量状态下的原位快速定量分析检测，且具有量程范围广、可重复性好、便携性强、可高通量检测等优势。

Description

一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快 速检测方法及检测系统

技术领域

本发明涉及免疫检测和光谱分析技术领域，尤其涉及一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统。

背景技术

随着人类与环境交互日益频繁，许多污染物进入了自然界。这些污染物经自然循环，会再次富集于人体，给人体造成伤害。目前用于污染物检测的检测技术多集中在实验室仪器分析（GC-MS, ICP）、化学试剂法、电化学法、原子吸收光谱法等。这些检测技术需要复杂的前处理、耗时长，对操作者不友好；且存在检测仪器体积过大等不可避免的客观因素，不能用于原位快速检测。对于有些污染物而言，在送检的过程中已经开始对环境或人体造成伤害。因此，原位快速检测环境中的污染物对即时调整应对措施减少对人体及环境进一步的伤害具有十分重要的意义。

专利CN106350576B公开了一种基于血糖仪检测盐酸克伦特罗残留的方法，利用免疫磁珠探针与样品竞争结合盐酸克伦特罗抗体，再加入酶标二抗，磁分后利用转化酶水解蔗糖，检测信号。

专利CN113138271A公开了一种基于血糖仪信号读出的多种毒品快速检测方法，利用96孔免疫基板固定抗原，与样品竞争结合生物素化的抗体，再利用联袂亲和素引入转化酶催化产生葡萄糖，检测信号。

上述专利技术均是使用血糖仪检测待测物关联信号。

然而，本发明发现：使用血糖仪检测时，不同批次的血糖试纸之间的结果存在较大差异，数据重复性差。这就导致了之前批次血糖试纸建立的标准曲线不能用于之后批次血糖试纸，每次检测都需要重新划定标准曲线，进而无法利用统一的标准曲线计算待测物浓度。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及检测方法，提高了现有光谱技术在环境中痕量目标物检测方面的灵敏度，有助于实现污染物在痕量状态下的原位快速定量分析检测，且具有量程范围广、可重复性好的优势。

具体的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，包括如下步骤：S1、以待测污染物的抗原Ag或抗体Ab为特征蛋白；将所述特征蛋白和转化酶Inv同时修饰在金纳米颗粒上，得到AuNPs-Inv-特征蛋白；S2、以待测污染物的抗原Ag或抗体Ab为结合蛋白，所述结合蛋白能特异性结合所述特征蛋白；将所述AuNPs-Inv-特征蛋白、所述结合蛋白和待测样品混合反应后，分离AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白；所述待测样品选自待测污染物标准品和待测污染物样品；S3、将所述AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白与蔗糖溶液混合反应后，用红外光谱仪检测反应液的红外光谱信号值；S4、基于待测污染物标准品及其对应二级产物的红外光谱信号值，间接绘制待测污染物含量和红外光谱信号值的标准曲线；通过标准曲线及待测污染物样品的二级产物的红外光谱信号值从而计算待测污染物样品中的污染物含量。

本发明提供的检测方法基于免疫学原理和竞争反应原理实现。步骤S2将AuNPs-Inv-特征蛋白、结合蛋白和待测样品混合反应，当待测样品中污染物浓度提高时，基于竞争反应原理，步骤S2分离得到的AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白会随之减少。

进一步的，在本发明中，步骤S3将AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白与蔗糖溶液混合反应，AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白中的转化酶Inv会催化蔗糖并产生葡萄糖，利用红外光谱技术能检测到葡萄糖较强的光学信号，从而间接实现目标物信号放大。红外激光具有能量高，单色性好，方向性强和相干性强的特点，其光谱功率密度高，可以抑制检测器的噪声干扰。本发明以红外激光为光源进行光谱分析，与普通红外光源相比，具有更好的灵敏度和分辨率，同时具有原位检测的能力。

在本发明中，步骤S1所述金纳米颗粒的粒径优选为25-35nm，更优选为30nm；步骤S1所述修饰的pH值优选为7.5-8.5，更优选为8。本发明修饰得到的AuNPs-Inv-特征蛋白结构稳定，转化酶Inv能最大程度地修饰在金纳米颗粒上，不仅有助于提高酶催化底物后产生的红外光谱检测信号，也进一步地起到封闭金纳米颗粒的效果。

本发明利用转化酶Inv催化蔗糖产生葡萄糖。转化酶催化蔗糖产生的葡萄糖具有明显的红外指纹吸收信号，在后续红外吸收光谱分析中具有更好的检测表现。

本发明在红外光谱检测时优选使用EC-QCL（外腔式量子级联激光器，Externalcavity quantum cascade laser）和红外探测器。EC-QCL不仅检测灵敏度高、具有指纹特性，还具有检测灵活性高、测量速度快、低成本的优点。另外，EC-QCL的峰值发射波长处于中红外波段，且可在较宽的谱带区间快速调谐。相较其他红外光谱仪，EC-QCL在小型化原位检测中的表现更佳。

另外，本发明使用红外光谱仪检测反应液的红外光谱信号值，然后绘制待测污染物含量和红外光谱信号值的标准曲线，进而用于待测污染物样品中的污染物含量检测。该方法在不同批次的样品检测中获得的样品关联信号的数值差异不显著，说明该方法重复性强，绘制的标准曲线可重复应用于不同批次的样品检测。

在本发明中，所述污染物优选包括氟喹诺酮类、环丙沙星、氯霉素和喹诺酮类中的一种或者多种。这些污染物常见于食品和环境领域，通常具有浓度极低的特点。现有常规方法难以实现针对此类污染物的快速原位检测，或者检测结果不准确。而本发明提供的基于免疫生物反应的红外信号增强与检测方法适用于上述污染物的检测，可原位实时获取检测结果。

本发明提供的基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法利用竞争性免疫反应原理，使待测样品中的污染物含量与反应产物之间形成特定的线性关系。同时，所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法还在反应过程中引入了转化酶Inv，并在反应产物中添加蔗糖溶液，利用转化酶催化蔗糖底物以生成具有明显红外光谱信号的反应次级产物葡萄糖，利用红外光谱仪获取葡萄糖的特征红外信号间接建立与目标物的线性关系，以此实现目标物的红外信号间接增强。本发明将红外光谱分析技术与免疫学信号放大技术相结合，利用了红外光谱学技术的实时快速分析的优点，再借助免疫学技术的高特异性性能，实现了对痕量污染物的高灵敏度的快速检测，能够在食品安全和环境检测等领域发挥较大的应用价值，对其它领域的痕量待测物检测也具有一定的指导价值。

第二方面，本发明提供了一种优选的基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法：所述特征蛋白为待测污染物的抗体Ab；将所述特征蛋白和转化酶Inv同时修饰在金纳米颗粒上，得到AuNPs-Inv-Ab；所述结合蛋白为待测污染物的抗原Ag；将所述抗原Ag、AuNPs-Inv-Ab和待测污染物混合反应后，分离得到AuNPs-Inv-Ab-Ag。

在本发明中，步骤S2所述混合反应优选基于免疫层析试纸条实现；所述免疫层析试纸条的结构包括样品垫、结合垫和NC膜；所述结合垫中包含AuNPs-Inv-Ab；所述NC膜在测试线包被有抗原Ag；

检测时，将待测样品滴在样品垫上，待测样品和结合垫释放的AuNPs-Inv-Ab向检测线方向迁移；未与待测样品发生反应的AuNPs-Inv-Ab与检测线处的抗原Ag结合，从而在检测线处得到AuNPs-Inv-Ab-Ag。

在本发明提供的更优选实施方式中，所述检测方法结合了EC-QCL和免疫层析放大信号技术，具体包括如下步骤：

在30nm的金纳米颗粒AuNPs上同时修饰待测物的特异性抗体Ab和转化酶Inv，得到金标抗体-酶结合物AuNPs-Inv-Ab，在免疫层析试纸条上进行待测物的检测时，基于小分子竞争法原理，当滴加样本后，AuNPs-Inv-Ab结合物被释放出来并在层析过程中毛细管的作用下向吸水纸方向移动，当目标物为阴性时，AuNPs-Inv-Ab则会被包被在NC膜上测试线（Test line, T line）处的抗原Ag捕获并生成AuNPs-Inv-Ab-Ag复合物，并生成一条很深的红色条带，在该处滴加蔗糖溶液20μL，该金颗粒上的转化酶会催化蔗糖并产生葡萄糖，同时用红外光谱技术可以检测到生成的葡萄糖的较强的光学信号；当待测物为阳性时，AuNPs-Inv-Ab会和样本中的目标物结合，使得没有更多的AuNPs-Inv-Ab和T线处的抗原结合，从而使得在T线处形成一条较淡的红色条带，相应的检测该处酶催化底物产生的葡糖糖的红外信号也就减弱。因此根据竞争法原理，随着待测物浓度的提高，试纸条T线处的红色条带会减弱，相应产生的葡萄糖的红外信号也会随之降低。进一步的，在肉眼无法识别条带深浅的情况下，本发明使用EC-QCL和红外光谱探测仪可以通过检测反应次级产物的葡萄糖的红外信号值实现对待测污染物的间接检测。本发明基于待测污染物标准品及其对应的红外光谱信号值，绘制待测污染物含量和红外光谱信号值的标准曲线；通过标准曲线及待测污染物样品的反应次级产物的红外光谱信号值计算待测污染物样品中的污染物含量，可实现对痕量污染物的有效准确检测，在可视化的基础上进一步的提高检测待测物的灵敏度和可重复性。

第三方面，本发明提供了另一种优选的基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法：所述特征蛋白为待测污染物的抗原Ag；将所述特征蛋白和转化酶Inv同时修饰在金纳米颗粒上，得到AuNPs-Inv-Ag；所述结合蛋白为待测污染物的抗体Ab；将所述抗体Ab、AuNPs-Inv-Ag和待测污染物混合反应后，分离得到AuNPs-Inv-Ag-Ab。

在本发明中，步骤S2所述混合反应优选基于免疫磁珠体系实现；所述免疫磁珠体系中包含修饰有抗体Ab的磁珠IMB-Ab；

检测时，将AuNPs-Inv-Ag、IMB-Ab和待测样品混合反应，AuNPs-Inv-Ag与待测样品竞争性地与IMB-Ab结合，磁分离得到AuNPs-Inv-Ag-Ab-IMB。

在本发明提供的更优选实施方式中，所述检测方法结合了EC-QCL和免疫磁珠信号放大技术，具体包括如下步骤：

在免疫磁珠IMB上修饰待测物特异性抗体，得到磁珠抗体结合物IMB-Ab。在30nm的金纳米颗粒上同时修饰待测物的抗原Ag和转化酶Inv，得到金标抗原和酶的结合物AuNPs-Inv-Ag。利用竞争法的检测原理，当样本中没有待测物时，溶液中IMB-Ab上的Ab会和AuNPs-Inv-Ag的Ag发生特异性反应生成AuNPs-Inv-Ag-Ab-IMB复合物。通过磁分离处理，AuNPs-Inv-Ag-Ab-IMB复合物与溶液中未被结合的AuNPs-Inv-Ag分离。在分离后的AuNPs-Inv-Ag-Ab-IMB复合物中加入蔗糖溶液，该复合物上的酶会进一步催化蔗糖产生葡萄糖，进而利用红外光谱进行葡萄糖的信号采集。当样本中存在待测物时，待测物会和AuNPs-Inv-Ag结合物中的Ag形成竞争关系，结合IMB-Ab结合物上Ab。由于会生成IMB-Ab-待测物，因此，没有过多的IMB-Ab去和AuNPs-Inv-Ag结合。当磁分离结束后，液体中残留更多的AuNPs-Inv-Ag结合物，使得在磁珠中加入蔗糖后，酶催化蔗糖后产生的葡萄糖的红外光谱信号相应减弱。在本发明提供的优选实施方式中，随着目标物浓度的提高，葡萄糖的红外光谱信号会随之降低。本发明利用上述规律，使用EC-QCL和红外光谱探测仪检测葡萄糖的红外信号值，并基于葡萄糖红外信号值间接建立待测物含量和光谱信号的关系，通过标准曲线及待测污染物样品的反应次级产物的红外光谱信号值计算待测污染物样品中的污染物含量，从而实现痕量污染物的高效快速检测，在可视化的基础上进一步的提高检测待测物的灵敏度和可重复性。

本发明在前述两种免疫分析技术的基础上对纳米金颗粒进行了特定的催化酶修饰，配合特定的待催化底物实现了信号放大。同时，本发明还结合了光谱学技术快速分析的优势，通过分析酶催化后产生的具有光学特性的次级底物，间接建立与目标的线性关系，实现痕量污染物的快速测定分析。

第四方面，本发明还提供了一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测系统，包括前述AuNPs-Inv-特征蛋白和结合蛋白；还包括蔗糖溶液和红外光谱仪。

优选的，所述红外光谱仪包括EC-QCL和红外探测器。

本发明提供的基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测系统将光谱学技术和免疫学信号放大原理相结合，利用了光谱学实时获取检测结果及免疫学高特异性等优点，能够弥补现有检测技术对痕量污染物的检测不准确、检测时间过长等问题，对食品和环境领域中痕量污染物的检测具有重要意义。

有益效果

本发明提供了一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统。所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法利用竞争性免疫反应原理，使待测样品中的污染物含量与具有强烈红外信号的次级产物之间形成特定的线性关系。同时，所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法还在反应过程中引入转化酶Inv，将最终的免疫反应产物添加到蔗糖溶液，利用转化酶催化蔗糖底物以生成具有强烈红外信号的反应次级产物葡萄糖，依靠目标物与次级产物葡萄糖的线性关系，实现目标物红外信号强度间接增强。

本发明利用转化酶催化蔗糖底物以生成具有强烈红外信号的反应次级产物葡萄糖，然后利用红外光谱仪检测红外光谱信号值，绘制待测污染物含量和红外光谱信号值的标准曲线，进而用于待测污染物样品中的污染物含量检测。本发明相对传统的光谱检测方法检测灵敏度高。并且与常规实验室检测方法相比，不仅具有反应快速的优点，同时还能实现污染物在痕量状态下的原位快速定量分析检测，且具有量程范围广、可重复性好、便携性强、可高通量检测等优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。

图1是本发明实施例1所述基于红外光谱技术和免疫层析信号放大技术的痕量污染物检测方法的技术原理示意图。

图2是本发明实施例1所述基于红外光谱技术和免疫层析信号放大技术的痕量污染物检测方法的技术流程示意图。

图3是本发明实施例2所述基于红外光谱技术和免疫磁珠信号放大技术的痕量污染物检测方法的技术原理示意图。

图4是本发明实施例2所述基于红外光谱技术和免疫磁珠信号放大技术的痕量污染物检测方法的技术流程示意图。

图5是本发明实验例1所述蔗糖信号检测量程范围测定结果。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所涉及的试剂包括：免疫磁珠，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），四氯金酸，柠檬酸三钠，吐温20（T20），氯化钠，碳酸钾，磷酸盐缓冲液片剂（PBS, pH7.2, 索莱宝），牛血清蛋白（BSA），酪蛋白钠，蔗糖，目标物抗体（山东绿都），目标物抗原(山东绿都)，二抗（羊抗鼠IgG, 索莱宝）。

本发明所涉及的耗材包括：PVC底板（80mm*300mm，上海捷宁），玻璃纤维（8mm*300mm，上海捷宁），样品垫（17 mm*300mm，上海捷宁），硝酸纤维素膜（NC膜，CN140，2.5cm，赛多利斯），吸水纸（CF-7，27 mm*300mm，上海捷宁）。

实施例1

本实施例以氯霉素作为待检测污染物，提供了一种基于免疫层析技术的痕量污染物氯霉素快速定量检测试纸条。试纸条的制备方法包括如下步骤：

（1）金纳米颗粒（AuNPs）的制备：采用化学还原法用柠檬酸三钠作为还原剂制备约30nm的金纳米颗粒（AuNPs）。所有的玻璃器皿都预先用新鲜王水浸泡并清洗，最后用超纯水冲洗三次。将2mL 1% HAuCl₄溶液与95.8mL超纯水在圆烧瓶中混合，加热并回流，煮沸后立即加入2.2mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续搅拌15min。在此过程中该溶液颜色逐渐变为鲜亮的酒红色，证明金纳米颗粒的形成。最后，冷却至室温后，收集金纳米颗粒，放置4℃保存备用。

（2）金纳米颗粒-待测物抗体-转化酶的制备：首先向5mL金纳米颗粒（1μM）的溶液中加入约60μL碳酸钾溶液(0.25M)混合均匀后，调节金纳米颗粒pH为8左右；然后加入75μg待测物氯霉素的抗体，室温震荡反应20min后，加入0.5mL转化酶溶液（3%），继续室温震荡反应30min。然后，再一次加入相同量的转化酶溶液，继续反应1小时，使得转化酶能够尽最大程度的修饰在金纳米颗粒上，不仅能够提高酶催化底物后产生的红外光谱检测信号，也进步一地起到了封闭金纳米颗粒的效果。最后，9000转离心并洗涤两次，并加入2mL金标展开剂（10mM PBS, 0.5% BSA, 0.5% 酪蛋白钠, 0.05% T20, pH7.2），最终得到AuNPs-Inv-Ab结合物。

（3）金标抗体酶结合物垫的制备

利用XYZ-三维平面划膜仪器将步骤（2）制备好的AuNPs-Inv-Ab结合物喷涂在玻璃纤维上，喷涂参数为20μL/cm。37℃烘干后得到金标抗体酶结合物垫，室温、避光、干燥保存。

（4）试纸条的包被与切割

配制测试线T（待测物氯霉素的抗原,1mg/mL）和控制线C（羊抗鼠IgG, 1mg/mL）所需试剂，用XYZ-三维平面划膜仪器在NC膜上进行包被（NC膜须预先黏贴在PVC底板相应的位置，方便包被操作，仪器包被参数为1μL/cm），然后置于烘箱，37℃烘干2小时。按照层析试纸条黏贴顺序依次黏贴吸水纸，金标抗体酶结合物垫，样品垫。最后使用切条机切成4cm宽的试纸条，放置干燥、避光、室温环境下备用。

本实施例还提供了一种基于红外光谱技术和免疫层析信号放大技术的痕量污染物检测方法，利用上述制备得到的试纸条，对痕量污染物氯霉素进行检测。该检测方法的技术原理参见图1，技术流程参见图2。

本实施例中，该检测方法的具体操作包括如下步骤：

配制一系列不同浓度梯度的氯霉素溶液（1000ppb、 500ppb、200ppb、100ppb、50ppb、10ppb、1ppb、0.1ppb、0ppb），分别滴加在试纸条的样品垫上进行反应，每个浓度的氯霉素溶液在试纸条样品垫上的滴加量为150μL。由于层析作用，原先涂敷在金标结合物垫上的结合物（AuNPs-Inv-Ab）被释放出来。若是空白样本（无氯霉素），则释放出来的AuNPs-Inv-Ab和包被在NC膜处的T线的完全抗原（氯霉素-Antigen）会直接发生免疫反应并在该T线处形成一条红色条带；若样本为阳性（含有氯霉素），氯霉素首先会和结合物垫处的AuNPs-Inv-Ab发生特异性反应并生成AuNPs-Inv-Ab-氯霉素复合物，然后在毛细管层析作用下继续向吸水纸方向移动，由于氯霉素占据了一部分AuNPs-Inv-Ab上抗体的位点，即样本中的待测物氯霉素和T线处的氯霉素抗原存在竞争关系，使得没有更多的AuNPs-Inv-Ab去和T线处的氯霉素抗原进行反应，使得该T线处颜色变淡；当氯霉素浓度达到较高浓度是时，由于AuNPs-Inv-Ab的位点全部被占据，则没有空余的位点和T线处的抗原反应，T线完全被抑制而不会不显色，因此随着待测物氯霉素浓度的提高，T线显色程度降低，金纳米颗粒也减少，随之酶的含量也相应的减少，最终酶催化蔗糖后产生底物的红外光谱信号也会随之减弱。最终待测物氯霉素的浓度与T线处的显色程度及红外光谱信号成反比关系。

当滴加样本反应15min后，用红外光谱仪器检测测试线T处酶催化特定底物产生次级产物的光谱信号，建立红外光谱信号与氯霉素之间的线性关系，实现快速定量检测痕量污染物的目的。

实施例2

本实施例以环丙沙星作为待检测污染物，提供了一种基于免疫磁珠技术的痕量污染物环丙沙星快速定量检测试剂盒。试剂盒中包括免疫磁珠-待测物抗体结合物和纳米-待测物抗原-转化酶结合物。

（1）免疫磁珠-待测物抗体结合物的制备：首先，将1mg的免疫磁珠（IMB，直径600nm）用MES缓冲液清洗两遍后，加入1mL的MES活化缓冲液，然后再分别加入EDC（10mg/mL,50μL）和NHS（10mg/mL,100μL）活化剂，室温震荡30min，磁分离，洗涤2遍以除去活化剂等杂质。然后，加入1mL PBS缓冲溶液，再加入0.2mg环丙沙星的特异性抗体，继续反应1小时，加入BSA溶液（5%，0.2mL）震荡30min。最后，磁分离，用PBS缓冲液洗涤3次后，得到IMB-Ab结合物并转到1mL的PBS缓冲液中待用。

（2）金纳米-待测物抗原-转化酶的制备：首先，取实施例1中制备得到的金纳米颗粒，向5mL金纳米颗粒（1μM）的溶液中加入约60μL碳酸钾溶液(0.25M)混合均匀后，调节金纳米颗粒pH为8左右；然后加入75μg待测物环丙沙星的抗原，室温震荡反应20min后，加入0.5mL转化酶溶液（3%），继续室温震荡反应30min。然后，再一次加入相同量的转化酶溶液，继续反应1小时，使得转化酶能够尽最大程度的修饰在金纳米颗粒上，不仅能够提高检测信号，也起到了封闭金纳米颗粒的效果。最后，9000转离心并洗涤两次，并加入2mL PBS缓冲液，最终得到AuNPs-Inv-Ag结合物，4℃保存备用。

本实施例还提供了一种基于红外光谱技术和免疫磁珠信号放大技术的痕量污染物检测方法，利用上述试剂盒，对痕量污染物环丙沙星进行检测。该检测方法的技术原理参见图3；技术流程参见图4。本实施例中，具体操作包括如下步骤：

分别取20μL所制备的IMB-Ab结合物，置于9个离心管中，然后分别加入100μL不同浓度的待测物环丙沙星（1000ppb、 500ppb、200ppb、100ppb、50ppb、10ppb、1ppb、0.1ppb、0ppb），最后分别加入20μL的AuNPs-Inv-Ag结合物，置于振荡器上反应。

反应1小时后，进行磁分离。用PBST缓冲液清洗3遍后，在分离后的磁珠中加入20μL蔗糖溶液。最后用红外光谱检测生成产物葡萄糖的信号，并与待测物的浓度建立关系。

实验例1

现有技术中已知利用血糖仪检测蔗糖信号的方法，由于血糖仪是基于电化学原理，其电极在制作过程中存在误差，导致不同批次的血糖试纸之间的结果存在差异。

为了更清楚的体现上述差异，本实验例对不同批次的血糖试纸测量稳定性进行了对比：通过配制不同浓度的蔗糖溶液，使用血糖仪对蔗糖信号进行检测，结果如表1所示。

表1不同批次血糖试纸测量稳定性对比

注： Low=表示所测结果低于血糖仪量程；High=表示所测结果高于血糖仪量程。

由表1可以看出：利用血糖仪检测蔗糖信号时，不同批次的血糖试纸之间的结果存在差异，数据重复性差。第一批次血糖试纸建立的标准曲线不能用于第二批次血糖试纸。

因此，利用血糖仪检测蔗糖信号时，基于一个批次的血糖试纸建立得到的标准曲线不能直接用于下个批次的血糖试纸（会导致标准曲线失效，无法准确计算待测物浓度）。

实验例2

本实验例分别对血糖仪和红外光谱仪的蔗糖信号检测量程范围进行了测定，结果如图5所示。

由图5可以看出：血糖仪的蔗糖溶液检测范围仅为200-4000ppm，本发明利用红外光谱仪检测待测样品，可以获取更大范围的检测结果。

综上，由于环境中的污染物大多为小分子且含量较少，难以直接使用红外光谱仪进行测量。本发明基于免疫生物反应原理，使待测样品中的污染物含量与次级产物（蔗糖）的红外信号之间形成特定线性关系。进而能够直接以红外光谱仪实现对环境污染物的原位检测。与常规实验室检测方法相比，本发明提供的方案不仅具有反应快速的优点，同时还能实现污染物在痕量状态下的原位快速定量分析检测，且具有量程范围广、可重复性好、便携性强、可高通量检测等优势。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、以待测污染物的抗原Ag或抗体Ab为特征蛋白；

将所述特征蛋白和转化酶Inv同时修饰在金纳米颗粒上，得到AuNPs-Inv-特征蛋白；

S2、以待测污染物的抗原Ag或抗体Ab为结合蛋白，所述结合蛋白能特异性结合所述特征蛋白；

将所述AuNPs-Inv-特征蛋白、所述结合蛋白和待测样品混合反应后，分离AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白；

所述待测样品选自待测污染物标准品和待测污染物样品；

S3、将所述AuNPs-Inv-特征蛋白-结合蛋白与蔗糖溶液混合反应后，用红外光谱仪检测反应液的红外光谱信号值；

S4、基于待测污染物标准品及其对应的红外光谱信号值，绘制待测污染物含量和红外光谱信号值的标准曲线；

通过标准曲线及待测污染物样品的红外光谱信号值计算待测污染物样品中的污染物含量。

2.根据权利要求1所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，步骤S1所述金纳米颗粒的粒径范围为25-35nm。

3.根据权利要求1所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，步骤S1所述修饰的pH值范围为7.5-8.5。

4.根据权利要求1所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，所述特征蛋白为待测污染物的抗体Ab；将所述特征蛋白和转化酶Inv同时修饰在金纳米颗粒上，得到AuNPs-Inv-Ab；所述结合蛋白为待测污染物的抗原Ag；将所述抗原Ag、AuNPs-Inv-Ab和待测污染物混合反应后，分离得到AuNPs-Inv-Ab-Ag。

5.根据权利要求4所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，步骤S2所述混合反应基于免疫层析试纸条实现；所述免疫层析试纸条的结构包括样品垫、结合垫和NC膜；所述结合垫中包含AuNPs-Inv-Ab；所述NC膜在测试线包被有抗原Ag；

检测时，将待测样品滴在样品垫上，待测样品和结合垫释放的AuNPs-Inv-Ab向检测线方向迁移；未与待测样品发生反应的AuNPs-Inv-Ab与检测线处的抗原Ag结合，从而在检测线处得到AuNPs-Inv-Ab-Ag。

6.根据权利要求1所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，所述特征蛋白为待测污染物的抗原Ag；将所述特征蛋白和转化酶Inv同时修饰在金纳米颗粒上，得到AuNPs-Inv-Ag；所述结合蛋白为待测污染物的抗体Ab；将所述抗体Ab、AuNPs-Inv-Ag和待测污染物混合反应后，分离得到AuNPs-Inv-Ag-Ab。

7.根据权利要求6所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，步骤S2所述混合反应基于免疫磁珠体系实现；所述免疫磁珠体系中包含修饰有抗体Ab的磁珠IMB-Ab；

检测时，将AuNPs-Inv-Ag、IMB-Ab和待测样品混合反应，AuNPs-Inv-Ag与待测样品竞争性地与IMB-Ab结合，磁分离得到AuNPs-Inv-Ag-Ab-IMB。

8.根据权利要求1-7任意一项所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法，其特征在于，所述污染物包括氟喹诺酮类、环丙沙星、氯霉素和喹诺酮类中的一种或者多种。

9.基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测系统，其特征在于，包括权利要求1-8任意一项中的AuNPs-Inv-特征蛋白和结合蛋白；还包括蔗糖溶液和红外光谱仪。

10.根据权利要求9所述基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测系统，其特征在于，所述红外光谱仪包括EC-QCL和红外探测器。