CN110746437A - 基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了基于吡喃‑香豆素的一氧化碳(CO)荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：本发明提供了以3‑乙酰基‑7‑二乙基氨基香豆素、2‑(2,4‑二羟基苯甲酰基)苯甲酸、烯丙基氯甲酸酯等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种近红外一氧化碳荧光探针；首先，该荧光探针对CO表现出很高的灵敏度，探针与CO反应之后荧光显著增强；其次，该荧光探针对CO表现出很高的选择性，不受其他活性氧、活性氮、活性硫以及生物硫醇的干扰；并且，该荧光探针与CO作用迅速，响应时间在50s以内；此外，该荧光探针应用于活细胞内一氧化碳含量的检测。

Description

基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于吡喃-香豆素染料的一氧化碳近红外荧光探针的制备和应用。

背景技术

一氧化碳(CO)是由体内多种细胞中的血红素氧合酶催化合成的一种信号分子(L.K.Weaver,N.Engl.J.Med.,2009,360,1217-1225)。近年来研究表明,CO作为气体传递物质，在各种生理和病理过程中起着重要作用(F.Wattel,R.Favory,S.Lancel,R.Neviere,D.Mathieu,Bull.Acad.Natl.Med.,2006,190,1961-1975；L.Y.Wu,R.Wang,Pharmacol.Rev.,2005,57,585-630)。CO参与多种生理过程，如血管扩张、抗凋亡、抗炎症和神经传递(D.R.Premkumar,M.A.Smith,P.L.Richey,R.B.petersen,R.Castellani,R.K.Kutty,J.Neurochem.,1995,65,1399-1402；R.A.Schroeder,C.A.Ewing,J.V.Sitzmann,P.C.Kuo,Dig.Dis.Sci.,2000,45,2405-2410)。此外，CO的不正常代谢与许多疾病密切相关，如阿尔茨海默病、高血压、炎症、心力衰竭等(I.-T.Lee,S.-F.Luo,C.-W.Lee,S.-W.Wang,C.-C.Lin,C.-C.Chang,Am.J.Pathol.,2009,175,519-532；V.S.Raju,N.Imai,C.S.Liang,J.Mol.Cell.Cardiol.,1999,31,1581-1589)。鉴于一氧化碳重要的生理及临床意义，迫切需要设计有效的方法去精确检测它的含量。

目前有许多检测CO的方法，比如：比色法(D.Benito-Garagorri,M.Puchberger,K.Mereiter,K.Kirchner,Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,9142-9145；S.Heylen,J.A.Martens,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,7629-7630；J.Esteban,J.V.Ros-Lis,R.Martinez-Manez,M.D.Marcos,M.Moragues,J.Soto,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,4934-4937；M.E.Moragues,J.Esteban,J.V.Ros-Lis,R.Martínez-Mánz,M.D.Marcos,M.Martínez,J.Am.Chem.Soc.,2011,133,15762-15772)，电化学法(S.S.Park,J.Kim,Y.Lee,Anal.Chem.,2012,84,1792-1796)，气相色谱分析法(G.S.Marks,H.J.Vreman,B.E.Mclaughlin,J.F.Brien,K.Nakatsu,Antioxid.Redox Signal.,2002,4,271-277.)。相比于这些传统的方法，荧光分析方法具有高灵敏度，实时监测和高分辨率成像生物样本等优势。到目前为止，有许多检测CO的荧光探针被报道，分别基于香豆素，萘酰亚胺，荧光素等染料(W.Feng,D.Liu,Q.Zhai,G.Feng,Sens.Actuators B,2017,240,625-630；W.Feng,J.Hong,G.Feng,Sens.Actuators B,2017,251,389-395；W.Feng,D.Liu,S.Feng,G.Feng,Anal.Chem.,2016,88,10648-10653；S.Feng,D.Liu,W.Feng,G.Feng,Anal.Chem.,2017,89,3754-3760)。但是，这些探针存在一些问题：(1)这些荧光探针具有较短的分析波长，因此容易被活体内生物分子产生的自发荧光信号干扰，从而降低了探针的灵敏度；(2)这些荧光探针具有相对较长的响应时间，反应时间在10分钟以上。因此，设计和合成具有长波长和快速响应的荧光探针是非常有意义的。

吡喃-香豆素染料是目前荧光探针领域中应用比较广泛的一类染料，它具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优势。最重要的是具有近红外发射性能。近红外发射能够穿透更深的组织，不易受到生物自体荧光的干扰，对生物成像更有利。据报道，利用吡喃-香豆素荧光探针已经成功检测了许多目标物，如：Cys、HClO、H₂O₂和Hg²⁺等(H.Lv,X.-F.Yang,Y.Zhong,Y.Guo,Z.Li,H.Li,Anal.Chem.,2014,86,1800-1807；S.Ding,Q.Zhang,S.Xue,G.Feng,Analyst,2015,140,4687-4693；J.Liu,Y.-Q.Sun,P.Wang,J.Zhang,W.Guo,Analyst,2013,138,2654-2660；B.Dong,X.Song,X.Kong,C.Wang,Y.Tang,Y.Liu,W.Lin,Adv.Mater.,2016,28,8755-8759)。但是，还没有基于吡喃-香豆素类染料的探针被用于检测CO，因此设计和合成一个吡喃-香豆素类探针来检测CO是非常必要的。

发明内容

根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于吡喃-香豆素的近红外一氧化碳荧光探针。

本发明的技术方案是，一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针，其结构式如下：

一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的制备方法。步骤如下：

1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的3-乙酰基-7-二乙基氨基香豆素和1～1.5当量的2-(2,4-二羟基苯甲酰基)苯甲酸溶解到6～10mL甲磺酸中，反应混合物在80～100℃下搅拌10～14h，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，倒入盛有40～60g冰水的烧杯中，随即加入0.5～1mL 70％高氯酸，立即析出蓝绿色固体，静止1～3h，过滤，用5～10mL的冰水洗涤固体，干燥，粗产品用体积比为30:1～10:1的CH₂Cl₂/CH₃OH洗脱剂进行柱层析，得到蓝绿色固体化合物(CP-OH)(产率60％)。2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的化合物CP-OH，3～5当量的烯丙基氯甲酸酯和3～5当量的三乙胺溶解到15～25mL二氯甲烷中，反应混合物室温下搅拌1～5h，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到橘黄色固体产物(产率80％)，即为所述的荧光探针。

本发明的有益效果是，一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。荧光探针本身或加入Pd²⁺之后，在670nm处没有明显的近红外发射峰；同时加入Pd²⁺和CO之后，在670nm处出现了明显的近红外发射峰。并且随着CO浓度的增大，探针的近红外荧光强度不断增强。该探针的检测范围从1.0μM到20μM，检测限为0.33μM，这说明该探针可以高灵敏的检测CO。接着，研究探针的紫外吸收光谱。探针本身在440nm处有吸收带；加入Pd²⁺之后，吸收峰没有明显的改变；同时加入Pd²⁺和CO之后，440nm处的吸收峰逐渐减小，在600nm附近出现新的强吸收峰。然后，研究探针的选择性。考察了探针与活性氧(H₂O₂,ONOO^-,·OH,ClO^-,ROO·,O₂ ^-)，活性氮(NO,NO₂ ^-,NO₃ ^-)，活性硫(H₂S,SO₃ ^2-,HSO₃ ^-,SO₄ ^2-)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)的荧光响应情况。结果发现，只有CO能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。最后，研究了pH值对荧光探针测定CO的影响，当pH值在7.0到10.0之间时，不影响荧光探针对CO的测定。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在50s以内。

一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的应用。在细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光。在细胞中同时加入荧光探针和Pd²⁺，红色通道依然没有明显的而荧光变化，这说明细胞中的CO含量较低。细胞用血红素(Heme)处理，刺激细胞内CO的产生，然后加入Pd²⁺同时用探针染色，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。这些结果说明荧光探针能监控细胞内CO含量的变化，这为监控人体内和一氧化碳相关病变提供一种可靠的手段。

附图说明

图1为荧光探针的合成路线。

图2为荧光探针与不同浓度的CO作用后的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针和Pd²⁺的浓度均为10μM，CO浓度分别为：0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10,12,15,20μM。荧光激发波长为600nm。

图3为荧光探针对不同CO浓度的荧光线性响应图。

图4为荧光探针与Pd²⁺，CO作用后的紫外可见吸收光谱图。

图5为荧光探针的选择性图。

荧光探针和Pd²⁺的浓度均为10μM，CO浓度为20μM，其它分析物浓度均为200μM。

图6为pH对荧光探针的影响图。

图7为荧光探针与CO作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。

图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图9荧光探针与CO作用的细胞成像图。(a)细胞用探针染色0.5h。(b)细胞同时用探针和Pd²⁺染色0.5h。(c)细胞用Heme处理4h，然后同时用探针和Pd²⁺染色0.5h。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

荧光探针的合成

合成路线如图1。化合物CP-OH的合成：在100mL的圆底烧瓶中，将3-乙酰基-7-二乙基氨基香豆素(0.39g,1.5mmol)和2-(2,4-二羟基苯甲酰基)苯甲酸(0.39g,1.5mmol)溶解到8mL甲磺酸中，反应混合物在90℃下搅拌12h，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，倒入盛有50g冰水的烧杯中，随即加入0.8mL 70％高氯酸，立即析出蓝绿色固体，静止2h，过滤，用10mL的冰水洗涤固体，干燥，粗产品用体积比为20:1的CH₂Cl₂/CH₃OH洗脱剂进行柱层析，得到蓝绿色固体化合物(0.52g，产率60％)，即为化合物CP-OH。

CO荧光探针(CP-CO)的合成：在100mL的圆底烧瓶中，将化合物CP-OH(0.58g,1.0mmol)，烯丙基氯甲酸酯(0.48g,4.0mmol)和三乙胺(0.40g,4.0mmol)溶解到20mL二氯甲烷中，反应混合物室温下搅拌3h，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到橘黄色固体产物(0.33g，产率80％)，即为荧光探针。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm):δ8.33(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(s,1H),7.98(t,J＝8.0Hz,1H),7.69-7.57(m,3H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),6.89(d,J＝8.0Hz,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.67(s,1H),6.49(s,1H),6.04-5.96(m,1H),5.47-5.34(m,3H),4.76(d,J＝8.0Hz,2H),3.45(q,J＝8.0Hz,4H),1.23(t,J＝8.0Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,ppm):δ169.3,159.1,156.4,153.5,152.9,151.9,151.7,151.6,151.3,148.9,148.8,146.9,140.6,134.8,130.9,130.1,129.8,129.0,125.1,124.0,119.9,117.3,109.6,108.1,100.3,96.7,81.8,69.5,45.0,12.5.MS(TOF):565.2.

实施例2：

荧光探针和CO溶液配制

探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成1×10^-4M的探针溶液。同时称取一定量PdCl₂溶解在二次蒸馏水中，配成1×10^-4M的储备液。CO溶液的配制：将一定量的CORM-3溶解在二次蒸馏水中，转移到500mL的容量瓶中，加水至刻度线，得到浓度为1.0×10^-3mol·L^-1的CORM-3。将1.0×10^-3mol·L^-1的CORM-3溶液逐渐稀释，得到2.0×10^-4-1.0×10^-5mol·L^-1的CORM-3水溶液。将1.0mL探针的备用溶液，1.0mL的PdCl₂备用溶液和1.0mL的CORM-3水溶液加入到10mL的容量瓶中，用缓冲溶液定容后，得到浓度为1.0×10^{- 5}mol·L^-1的荧光探针和PdCl₂，2.0×10^-5-1.0×10^-6mol·L^-1的CO混合待测溶液。

实施例3：

荧光探针与CO作用的荧光光谱的测定

图2为荧光探针与CO作用的荧光光谱，荧光探针和Pd²⁺的浓度均为10μM，CO浓度分别为：0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10,12,15,20μM。激发波长固定为600nm，发射波长范围为620～780nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，由于烯丙基甲酸酯的淬灭作用，荧光探针加入Pd²⁺之后，在近红外(670nm)处没有明显的近红外发射峰；同时加入Pd²⁺和CO之后，在670nm处出现了明显的近红外发射峰。这是因为Pd²⁺首先被CO还原为Pd⁰，随后介导Tsuji-Trost反应，导致烯丙基甲酸酯的断裂，释放出吡喃-香豆素荧光团，从而产生近红外荧光。并且随着CO浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。图3为探针对不同CO浓度的线性响应图。荧光强度跟CO的浓度呈现线性关系，线性范围是1.0×10^-6～2.0×10^-5M，检测限是0.33μM。这说明该探针可以高灵敏的检测CO。

实施例4：

荧光探针与CO作用的紫外可见吸收光谱的测定

图4为荧光探针与CO作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，CO的加入量为20μM。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，探针本身在440nm处有吸收带；加入Pd²⁺之后，吸收峰没有明显的改变；同时加入Pd²⁺和CO之后，440nm处的吸收峰逐渐减小，在600nm附近出现新的强吸收峰。

实施例5：

荧光探针对CO测定的选择性

图5为荧光探针对CO测定的选择性图。考察在浓度为10μM的荧光探针和Pd²⁺溶液中加入CO(20μM)及其活性氧(H₂O₂,ONOO^-,·OH,ClO^-,ROO·,O₂ ^-)，活性氮(NO,NO₂ ^-,NO₃ ^-)，活性硫(H₂S,SO₃ ^2-,HSO₃ ^-,SO₄ ^2-)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)(200μM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有CO能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对CO有较好的选择性。

实施例6：

溶液pH值对荧光探针测定CO的荧光性质的影响

考察pH值对荧光探针测定CO的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为2.0～10.0，荧光探针和Pd²⁺的浓度均为10μM，CO的浓度为20μM。从图中可以看出，荧光探针随着pH的变化，荧光强度基本不变，说明pH对探针本身没有很大的影响。然而，加入CO之后，在pH在7.0～10.0范围内，荧光强度比值显著增强。综上所述，当pH值在7.0到10.0之间时，不影响荧光探针对CO的测定，是比较合适的pH值范围，这非常有利于该探针用于实际样品中CO的测定。

实施例7：

荧光探针与CO作用的响应时间的测定

我们研究了荧光探针对CO的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对CO的响应时间为50s，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。

实施例8：

荧光探针在活细胞中的应用

首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～30μM CO探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的CO。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择肝癌细胞HepG2进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在细胞中只加入荧光探针，红色通道几乎没有荧光(图9a)；在细胞中同时加入荧光探针和Pd²⁺,红色通道依然没有明显的而荧光变化(图9b)，这说明细胞中的CO含量较低。文献报道血红素(Heme)可以刺激细胞内CO的产生。细胞用血红素(Heme)预先处理4h，刺激细胞内CO的产生，然后加入Pd²⁺同时用探针染色0.5h，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号(图9c)。这些结果说明荧光探针能监控细胞内CO含量的变化，这为监控人体内和一氧化碳相关病变提供一种可靠的手段。

Claims (3)

1.一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针，其结构如下：

2.根据权利要求1所述的一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：

1)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的3-乙酰基-7-二乙基氨基香豆素和1～1.5当量的2-(2,4-二羟基苯甲酰基)苯甲酸溶解到6～10mL甲磺酸中，反应混合物在80～100℃下搅拌10～14h，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，倒入盛有40～60g冰水的烧杯中，随即加入0.5～1mL 70％高氯酸，立即析出蓝绿色固体，静止1～3h，过滤，用5～10mL的冰水洗涤固体，干燥，粗产品用体积比为30:1～10:1的CH₂Cl₂/CH₃OH洗脱剂进行柱层析，得到蓝绿色固体化合物，即化合物CP-OH，其结构如下：

2)在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的化合物CP-OH，3～5当量的烯丙基氯甲酸酯和3～5当量的三乙胺溶解到15～25mL二氯甲烷中，反应混合物室温下搅拌1～5h，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到橘黄色固体产物，即为所述的荧光探针。

3.根据权利要求1所述的一种基于吡喃-香豆素的一氧化碳荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞内一氧化碳含量的检测。

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