CN110172339B - 一种荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荧光探针及其制备方法，所述荧光探针经过三步反应得到，化合物A、NaH和四氢呋喃经加热回流、冷却后加N,N‑二乙基‑2‑氯乙酰胺回流，萃取、干燥，重结晶得化合物B，加1,4‑二氧六环和NaOH水溶液回流，萃取、干燥，重结晶得化合物C，加1‑羟基苯并三唑、1‑氨基芘和二氯甲烷冰浴滴加二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液反应，再室温反应，柱层层析分离得荧光探针；还提供了应用，识别碘离子。本发明合成方法简单，易于操作，反应步骤少，产率高，荧光探针对碘离子选择性强，不易受其他阴离子干扰，具有实时性，灵敏度高，瞬间检测到待检水溶液中碘离子，对检测生态环境中碘离子含量有实际意义，能够满足较低的碘离子浓度下检测和定量的要求。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针检测技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
近几年，在生物学上重要的阴离子中，碘尤其引人关注，因为它是一种基本的微量营养素，在人类发展的各个阶段都发挥着基本的生理作用。与此同时，碘在控制人体正常生长，维持甲状腺正常机能等方面的重要作用也受到人们越来越多的关注。
碘是人体必需的微量元素，在人体内常以碘化物的形式存在，对于调控细胞代谢、神经性肌肉组织发展与成长、糖类和脂类代谢等方面起着非常重要的作用。此外，碘还广泛用于药物和染料等的化学合成。碘含量的变化对人体的生理功能等方面有非常重要的影响，在甲状腺功能中也起着至关重要的作用。具体来说，碘摄入过多和缺乏会导致甲状腺疾病；例如，机体碘摄入不足,导致甲状腺激素合成不足是碘营养缺乏病的主要发病机理，对机体产生多种损伤,如甲状腺功能减退、克汀病、先天性异常、地方性甲状腺肿、神经障碍和智力迟钝；一次性摄入相当高剂量的碘或长期碘摄入量过高也会对机体造成损伤，导致不良反应的发生，如甲状腺、胃和唾液腺的退行性、坏死和肿瘤病变。因此,碘存在水平的监测对生命科学和环境保护具有重要意义，并为深入研究碘在生理和病理过程发挥的作用提供准确可靠的分析检测手段。
目前传统的碘离子检测方法主要有原子吸收光谱法，毛细管电泳，离子选择性电极，离子色谱法，气相色谱-质谱法(GC-MS)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等。但这些方法大都较为复杂，费时且分析成本较高。近年来，荧光探针技术填补了这些不足，该方法方便、简单、易于操作，且具备选择性好、灵敏度高等优点，受到了广泛的关注,已应用于生命科学、食品科学及环境探测等领域。常见碘离子探针的设计大多是根据氢键或配位键的络合作用，目前由于碘离子的离子半径大、电荷密度低、氢键结合能力低，开发可行的碘离子探针具有挑战性，现有的碘离子探针有的专一性不够，易受其它阴离子的干扰；有的成本较高、合成困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针合成方法简单，易于操作，反应步骤少，产率高的优点，荧光探针对碘离子的选择性强，具有专一下，而且不易受其他阴离子的干扰，并具有实时性，灵敏度高，能够瞬间检测到待检水溶液中碘离子，对检测生态环境中碘离子含量具有很大的实际意义，能够满足较低的碘离子浓度下检测和定量的要求。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种荧光探针，所述荧光探针的的分子式为：C90H81N3O9；所述荧光探针的结构式为：
本发明还提供了上述的荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、在氮气保护下，向50mL的圆底烧瓶中加入化合物A、NaH和干燥的四氢呋喃，在温度为100℃的条件下加热回流1小时，冷却后加入N,N-二乙基-2-氯乙酰胺，继续加热回流20小时，蒸出四氢呋喃，向回流后的产物中加入水，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，然后用乙酸乙酯a萃取3次，合并有机相a，将有机相a水洗3次，再用无水硫酸镁干燥后，在温度为100℃的条件下蒸干，得黄色粘稠物，将黄色粘稠物用甲醇重结晶，得白色固体物质，命名为化合物B；所述化合物A的分子式为：C36H48O6；所述化合物A的结构式为：
所述化合物B的分子式为：C55H83N3O9；所述化合物B的结构式为：
步骤二、向100mL的圆底烧瓶中依次加入步骤一中得到的化合物B、1,4-二氧六环和浓度为1mol/L的NaOH水溶液，在温度为100℃的条件下加热回流72h，自然冷却减压，蒸出有机溶剂，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，然后用乙酸乙酯b萃取3次，合并有机相b，将有机相b水洗3次，再用无水硫酸镁干燥后，得淡黄色粘稠物，将淡黄色粘稠物用甲醇重结晶，得白色固体物质，命名为化合物C；
所述化合物C的分子式为：C43H56O12；所述化合物C的结构式为：
步骤三、在200mL的圆底烧瓶中加入步骤二中得到的化合物C、1-羟基苯并三唑、1-氨基芘和干燥的二氯甲烷，在冰浴中搅拌滴加二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后在冰浴中反应1h，然后在室温的条件下反应24h，蒸出有机溶剂c，得到初产物，以等体积的二氯己烷和正己烷溶剂为洗脱剂，进行柱层层析分离，得到荧光探针。
优选地，步骤一中所述四氢呋喃与化合物A、NaH、N,N-二乙基-2-氯乙酰胺和水和乙酸乙酯a的体积和质量比为：25mL:500mg:210mg:780mg：20mL：20mL。
优选地，步骤二中所述化合物B与1,4-二氧六环、NaOH水溶液和乙酸乙酯b的质量和体积比为：1g:20mL:20mL:30mL。
优选地，步骤三中所述二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液中二环己基碳二亚胺的摩尔浓度为0.12mmoL/mL。
优选地，步骤三中所述化合物C与1-羟基苯并三唑、1-氨基芘、二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液的质量和体积比为：500mg:270mg:869mg:50mL。
本发明还提供了上述的荧光探针的应用，所述荧光探针用于识别碘离子，识别碘离子的方法为：
将荧光探针溶解于空白储备液中，得到荧光试剂，向荧光试剂中滴加待检水溶液，得到混合液，进行荧光激发，荧光探针具有实时性，荧光探针能瞬间识别待检水溶液中的碘离子；所述空白储备液由四氢呋喃和2×10-3mol/L的pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液按体积比为7:3制成。
优选地，所述混合液中荧光探针浓度为5μmol/L。
优选地，荧光激发的波长为346nm，荧光探针识别到碘离子时的波长为482nm。
优选地，所述荧光探针识别碘离子的最低检测限为2.3×10-7mol/L，碘离子的定量分析的线性浓度最低值为4.0×10-5mol/L。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的荧光探针合成方法简单，易于操作，反应步骤少，产率高的优点，荧光探针对碘离子的选择性强，具有专一下，而且不易受其他阴离子的干扰，并具有实时性，灵敏度高，能够瞬间检测到待检水溶液中碘离子，对检测生态环境中碘离子含量具有很大的实际意义，碘离子的最低检测限为2.3×10-7mol/L，并且定量分析的线性浓度最低值为4.0×10-5mol/L，能够满足较低的碘离子浓度下检测和定量的要求。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的荧光探针的核磁共振氢谱图。
图2是本发明的荧光探针在不同含水量的四氢呋喃中的荧光强度变化曲线。
图3是本发明的荧光探针在不同pH值的空白储备液中的荧光强度图。
图4是本发明的荧光探针检测待检水溶液中的碘离子的荧光强度图。
图5是本发明荧光探针在识别碘离子时的抗干扰性图。
图6本发明荧光探针对碘离子的不同响应时间的荧光强度图。
具体实施方式
实施例1
一种荧光探针，所述荧光探针的的分子式为：C90H81N3O9；所述荧光探针的结构式为：
本实施例还提供了上述的荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、在氮气保护下，向50mL的圆底烧瓶中加入500mg化合物A、210mgNaH和25mL干燥的四氢呋喃，在温度为100℃的条件下加热回流1小时，冷却后加入780mgN,N-二乙基-2-氯乙酰胺，继续加热回流20小时，蒸出四氢呋喃，向回流后的产物中加入20mL水，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，然后用20mL乙酸乙酯a萃取3次，合并有机相a，将有机相a水洗3次，再用无水硫酸镁干燥后，在温度为100℃的条件下蒸干，得黄色粘稠物，将黄色粘稠物用甲醇重结晶，得540mg白色固体物质，命名为化合物B，产率为68％；所述化合物A的分子式为：C36H48O6；所述化合物A的结构式为：
所述化合物B的分子式为：C55H83N3O9；所述化合物B的结构式为：
步骤二、向100mL的圆底烧瓶中依次加入1g步骤一中得到的化合物B、20mL1,4-二氧六环和20mL的浓度为1mol/L的NaOH水溶液，在温度为100℃的条件下加热回流72h，自然冷却减压，蒸出有机溶剂，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，然后用30mL乙酸乙酯b萃取3次，合并有机相b，将有机相b水洗3次，再用无水硫酸镁干燥后，得淡黄色粘稠物，将淡黄色粘稠物用甲醇重结晶，得605mg白色固体物质，命名为化合物C，产率为74％；
所述化合物C的分子式为：C43H56O12；所述化合物C的结构式为：
步骤三、在200mL的圆底烧瓶中加入500mg的步骤二中得到的化合物C、270mg1-羟基苯并三唑、869mg1-氨基芘和干燥的二氯甲烷，在冰浴中搅拌滴加50mL二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后在冰浴中反应1h，然后在室温的条件下反应24h，蒸出有机溶剂c，得到初产物，以等体积的二氯己烷和正己烷溶剂为洗脱剂，进行柱层层析分离，得到荧光探针，产率为65％；所述二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液中二环己基碳二亚胺的摩尔浓度为0.12mmoL/mL。
对制备的荧光探针进行结构检测，采用核磁共振仪对其进行表征，其核磁共振氢谱图如图1所示，从荧光探针的核磁共振氢谱图可知：1HNMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.24(s,27H,tBu),4.57(d,6H,ArCH2(eq)O,J＝9.2Hz),4.60(s,6H,ArOCH2),5.21(d,6H,ArCH2(ax)O,J＝12.0Hz),6.89(d,3H,pyrene-H,J＝8.4Hz),7.12(s,6H,ArH),7.23(d,3H,pyrene-H,J＝9.2Hz),7.33(d,3H,pyrene-H,J＝9.2Hz),7.44-7.56(m,12H,pyrene-H),7.67(d,3H,pyrene-H,J＝6.8Hz),7.75(d,3H,pyrene-H,J＝9.2Hz),9.54(s,3H,NH)，得知目标产物中氢的种类有12种，峰面积表示各个种类的氢的数目。结果表明：制备的荧光探针的结构与设计的结构相符。
实施例2
本实施例提供了实施例1制备的荧光探针的应用，所述荧光探针用于识别碘离子，识别碘离子的方法为：
将实施例1制备的荧光探针溶解于空白储备液中，配置成荧光探针浓度为50μmol/L的荧光试剂，用移液枪移取2.4mL的空白储备液于石英比色皿中，再加入300μL的荧光试剂和300μL的浓度为10mmol/L的待检水溶液，得到荧光探针浓度为5μmol/L的混合液，在波长为346nm的条件下进行荧光激发，识别待检水溶液中的碘离子；
所述空白储备液由四氢呋喃和2×10-3mol/L的pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液(摩尔浓度比为1:1的三羟甲基氨基甲烷和盐酸混合物)按体积比为7:3制成；
所述Tris-HCl缓冲液的配置方法为：称取三羟甲基氨基甲烷121.2mg溶于超纯水中，用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节其pH为7.0，得到浓度为2×10-3mol/L的pH为7.0的Tris-HCl缓冲液。
图2是本发明的荧光探针在不同含水量的四氢呋喃中的荧光强度变化曲线，由图可知，在四氢呋喃中加入水溶液(2×10-3mol/L的pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液)后，荧光探针的荧光受水的影响很大，并随着水量的增加荧光强度不断增加，含水量在30％～40％之间时，荧光强度基本保持稳定；含水量达到60％时，含有荧光探针的四氢呋喃水溶液变浑浊，且荧光强度降低；含水量达到70％时，含有荧光探针的四氢呋喃水溶液变浑浊且有少量白色沉淀生成，其荧光强度急剧下降，考虑到水对荧光探针的荧光强度的影响，所以不再进行含水量达80％～100％对荧光探针荧光强度影响实验，最后选择体积比为7:3的四氢呋喃和水溶液(2×10-3mol/L的pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液)作为空白储备液。
图3是本发明的荧光探针在不同pH值的空白储备液中的荧光强度图，由图可知，在体积比为7:3的四氢呋喃和水溶液(2×10-3mol/L的pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液)中，调节空白储备液的pH变化范围从3到11，荧光探针的荧光强度基本保持不变，表明说明该荧光探针在一定的酸碱度范围内能保持稳定的结构，有着很好的稳定性，为探针在不同酸碱度的实际样品中的检测提供了前提。
本实施例的所述待检水溶液中含有的阴离子包括：F-、Cl-、Br-、I-、AcO-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、NO2 -和CO3 2-；
对照溶液：将实施例1制备的荧光探针溶解于空白储备液中，配置成荧光探针浓度为5μmol/L的荧光试剂，作为对照溶液，不加待检水溶液。
将对照溶液和混合液均在在波长为346nm的条件下进行荧光激发，如图4所示，图中曲线a为荧光探针检测碘离子，其他曲线分别代表：为荧光探针(对照)、荧光探针检测F-、荧光探针检测Cl-、荧光探针检测Br-、荧光探针检测AcO-、荧光探针检测SO3 2-、荧光探针检测SO4 2-、荧光探针检测HSO3 -、荧光探针检测NO2 -和荧光探针检测CO3 2-，为荧光探针在482nm处发射荧光，由图可知，I-导致了探针在482nm处的荧光强度显著降低，而其它阴离子均对探针的荧光光谱影响很小，说明探针对碘离子具有很好的选择性，能用于识别碘离子。
实施例3
本实施例为实施例1制备的荧光探针的用于识别碘离子时的抗干扰性试验：
将实施例1制备的荧光探针溶解于空白储备液中，配置成荧光探针浓度为50μmol/L的荧光试剂，用移液枪移取2.1mL的空白储备液于石英比色皿中，再加入300μL的荧光试剂和300μL的浓度10mmol/L的碘离子水溶液，得到试验A号液，然后再向试验A号液中分别加入均为300μL的浓度10mmol/L的F-水溶液、Cl-水溶液、Br-水溶液、Aco-水溶液、SO3 2-水溶液、SO4 2-水溶液、HSO3 -水溶液、NO2 -水溶液和CO3 2-水溶液，分别得到试验B号液、试验C号液、试验D号液、试验E号液、试验F号液、试验G号液、试验H号液、试验I号液、试验J号液，试验A号液～试验J号液中的荧光探针的浓度均为5μmol/L，将试验A号液～试验J号液(对应图5中的A～J)在波长为346nm的条件下进行荧光激发，测试荧光探针识别碘离子时的抗干扰性；所述空白储备液同实施例2；
测试结果如图5所示，只有碘离子使探针分子在482nm处荧光下降，荧光探针只检测碘离子，不受其他阴离子(F-、Cl-、Br-、I-、Aco-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、NO2 -和CO3 2-)的影响，具有抗干扰性。
实施例4
本实施例为实施例1制备的荧光探针的用于识别碘离子时的的碘离子浓度对荧光强度的影响：
将实施例1制备的荧光探针溶解于空白储备液中，配置成荧光探针浓度为50μmol/L的荧光试剂，分别向荧光探针浓度为50μmol/L的荧光试剂中加入浓度2×10-4mol/Lmol/L～1.4×10-2mol/L的共24个碘离子水溶液，得到24个混合溶液，所述24个混合溶液中的荧光探针浓度均为5μmol/L，碘离子浓度为2×10-5mol/Lmol/L～1.4×10-3mol/L，将各混合溶液在波长为346nm的条件下进行荧光激发，得出荧光探针识别碘离子的最低检测限为2.3×10-7mol/L，随着碘离子浓度的增加，荧光探针在482nm处的荧光强度逐渐降低。
将上述24个混合溶液分别测定荧光探针在482nm处的荧光强度，以混合溶液中的碘离子浓度为横坐标，荧光探针在482nm处的荧光强度为纵坐标，建立线性回归方程，混合溶液中的碘离子浓度在4.0×10-5mol/L～1.6×10-4mol/L范围内，荧光强度与碘离子浓度呈线性相关，y＝554.12178-11.37797x，相关系数R2＝0.9996，故碘离子的定量分析的线性浓度最低值为4.0×10-5mol/L。
实施例5
本实施例为实施例1制备的荧光探针的用于识别碘离子的时间稳定性试验：
将实施例1制备的荧光探针溶解于空白储备液中，配置成荧光探针浓度为50μmol/L的荧光试剂，向荧光探针浓度为50μmol/L的荧光试剂中加入300μL的浓度10mmol/L的碘离子水溶液，得到混合溶液，所述混合溶液中荧光探针浓度为5μmol/L，在加入碘离子水溶液后立即开始检测混合溶液在482nm处荧光强度的变化，然后每隔十秒测定荧光强度的变化，同时以不加碘离子水溶液的荧光探针浓度为5μmol/L的荧光试剂作为对照b，如图6所示，图中b曲线表示不同响应时间的对照b在482nm处荧光强度的变化，c曲线表示不同响应时间的混合溶液在482nm处荧光强度的变化，由图6可知，荧光探针对碘离子的响应很快，几乎是瞬间的，具有较好的灵敏度和实时性，故对检测生态环境中碘离子含量具有很大的实际意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (7)
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的分子式为：C90H81N3O9；所述荧光探针的结构式为：
2.一种制备如权利要求1所述的荧光探针的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、在氮气保护下，向50mL的圆底烧瓶中加入化合物A、NaH和干燥的四氢呋喃，在温度为100℃的条件下加热回流1小时，冷却后加入N,N-二乙基-2-氯乙酰胺，继续加热回流20小时，蒸出四氢呋喃，向回流后的产物中加入水，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，然后用乙酸乙酯a萃取3次，合并有机相a，将有机相a水洗3次，再用无水硫酸镁干燥后，在温度为100℃的条件下蒸干，得黄色粘稠物，将黄色粘稠物用甲醇重结晶，得白色固体物质，命名为化合物B；所述化合物A的分子式为：C36H48O6；所述化合物A的结构式为：
所述化合物B的分子式为：C54 H81 N3O9；所述化合物B的结构式为：
步骤二、向100mL的圆底烧瓶中依次加入步骤一中得到的化合物B、1,4-二氧六环和浓度为1mol/L的NaOH水溶液，在温度为100℃的条件下加热回流72h，自然冷却减压，蒸出有机溶剂，再用浓度为1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，然后用乙酸乙酯b萃取3次，合并有机相b，将有机相b水洗3次，再用无水硫酸镁干燥后，得淡黄色粘稠物，将淡黄色粘稠物用甲醇重结晶，得白色固体物质，命名为化合物C；
所述化合物C的分子式为：C42 H54 O12；所述化合物C的结构式为：
步骤三、在200mL的圆底烧瓶中加入步骤二中得到的化合物C、1-羟基苯并三唑、1-氨基芘和干燥的二氯甲烷，在冰浴中搅拌滴加二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后在冰浴中反应1h，然后在室温的条件下反应24h，蒸出有机溶剂c，得到初产物，以等体积的二氯己烷和正己烷溶剂为洗脱剂，进行柱层层析分离，得到荧光探针。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述四氢呋喃与化合物A、NaH、N,N-二乙基-2-氯乙酰胺和水和乙酸乙酯a的体积和质量比为：25mL:500mg:210mg:780mg：20mL：20mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中所述化合物B与1,4-二氧六环、NaOH水溶液和乙酸乙酯b的质量和体积比为：1g:20mL:20mL:30mL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液中二环己基碳二亚胺的摩尔浓度为0.12mmoL/mL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述化合物C与1-羟基苯并三唑、1-氨基芘、二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液的质量和体积比为：500mg:270mg:869mg:50mL。
7.一种如权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针用于识别碘离子，识别碘离子的方法为：
将荧光探针溶解于空白储备液中，得到荧光试剂，向荧光试剂中滴加待检水溶液，得到混合液，进行荧光激发，荧光探针具有实时性，荧光探针能瞬间识别待检水溶液中的碘离子；所述空白储备液由四氢呋喃和2×10-3mol/L的pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液按体积比为7:3制成；所述混合液中荧光探针浓度为5μmol/L；所述荧光激发的波长为346nm，荧光探针识别到碘离子时的波长为482nm；所述荧光探针识别碘离子的最低检测限为2.3×10-7mol/L，碘离子的定量分析的线性浓度最低值为4.0×10-5mol/L。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20200630 |