CN108148572B - 一种脂滴荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脂滴荧光探针，采用9,10‑菲醌与N,N‑二乙基‑4‑氨基苯甲醛在醋酸中，以醋酸铵催化下保护气体中回流反应，分离获得。本发明的脂滴荧光探针在细胞或组织成像中可以采用单光子或双光子荧光检测脂滴。

Description

一种脂滴荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种脂滴荧光探针，特别涉及一种具有双光子性质的菲醌类化合物荧光探针。
背景技术
脂滴是细胞内中性脂的主要贮存场所，广泛存在于细菌、酵母、植物、昆虫以及动物细胞中。脂滴是一种呈球状的细胞器，它的主要功能是动态调节细胞的能量平衡。在白色脂肪组织，脂滴主要是储存甘油三酯，储存能量；在棕色脂肪组织，脂滴和线粒体紧密联系，分解甘油三酯，提供细胞和生物有机体能量。脂滴的大小差别很大，直径从40nm至100μm不等。脂滴由磷脂单分子层及中性脂构成的疏水核心构成，并且表面分布有很多蛋白。
长期以来，脂滴一直被认为是一种类似于糖原的颗粒，只是用来贮存能量，当细胞需要能量时，用来供给能量，是一个“惰性”的细胞内含物，因而脂滴在很长一段时间内并未受到人们的重视。最新的研究表明，脂滴并非细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，可能在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解，以及信号传导过程中起着重要的作用。
另外，研究还表明，多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和Niemann Pick C疾病，往往都伴随着脂质贮存的异常。因此，通过定位脂滴来判断脂滴是否异常有着重要的研究价值。但目前定位脂滴的荧光探针少，而且合成步骤繁琐、成本高；而且普遍都是处于可见光区域的，往往容易受到背景干扰。因此，开发新型的具有近红外激发的双光子荧光探针，使得背景干扰少，具有更好的应用价值。
发明内容
针对现有技术中定位脂滴的荧光探针少、合成步骤繁琐、成本高等问题，本发明提供一种合成简便、定位准确的具有双光子性质的脂滴荧光探针。
本发明的另一目的是提供一种上述脂滴荧光探针的合成方法，原材料易得、成本低。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种脂滴荧光探针，简称：PIA，其结构式如式（I）所示：
式（I）。
一种上述脂滴荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）9,10-菲醌与N,N-二乙基-4-氨基苯甲醛在醋酸中，以醋酸铵催化下保护气体中回流反应：
；
（2）反应结束后，调pH至中性，然后抽滤、干燥得到脂滴荧光探针。
所述9,10-菲醌与N,N-二乙基-4-氨基苯甲醛的摩尔比为1:1-1.5。
所述保护气体为氮气或惰性气体。
所述回流反应的温度为95-120℃，回流时间为12-16h。
一种上述脂滴荧光探针在细胞或组织成像中检测脂滴的应用。
上述应用中，以二甲亚砜（DMSO）为脂滴荧光探针溶剂，单光子荧光成像中激发波长为405nm，发射波段为425-475nm；双光子荧光成像中激发波长为760nm，发射波段为425-475nm。
本发明具有以下优点：
本发明所述的脂滴荧光探针是一类新型的高选择性识别脂滴的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。该探针具有双光子性质，在水相中的荧光强度远远弱于有机相中的荧光强度，实现定位脂滴的作用。本发明提供的具有脂滴荧光探针能实现脂滴检测，并且实现细胞内成像，在荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为脂滴荧光探针的核磁共振氢谱图；
图2为脂滴荧光探针在不同溶剂中的相对荧光强度；
图3为脂滴荧光探针与BODIPY493/503探针的细胞共定位图像；
图4为脂滴荧光探针与BODIPY493/503的强度相关图；
图5为脂滴荧光探针的单光子与双光子荧光成像图片；
图6为脂滴荧光探针的组织成像图片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 PIA的合成。
将0.25g（1.2mmol）9,10-菲醌和0.18g（1mmol）N,N-二乙基-4-氨基苯甲醛，溶于20mL醋酸中，加入0.38g（5mmol）醋酸铵做催化剂，在氮气保护下100℃回流反应12 h。反应结束后，冷却到室温，倒入冰水中搅拌，调pH至中性后抽滤，用真空干燥箱干燥得探针化合物，产率：80%。探针化合物的氢核磁谱图如图1所示。
实施例2 PIA的溶剂化效应。
将实施例1中的探针溶解于二甲亚砜中，配制成浓度为10-3 M的母液。分别取50μL上述母液加入九个相同的5mL容量瓶中，分别用DMF、DMSO、THF、MeCN、PBS、MeOH、DCM、H2O、Dioxane稀释到5mL，然后进行荧光检测，结果见图2：由图2可知，探针在有机溶液中的荧光强度远远大于水相中。这说明当检测环境是水相时，在水中探针的荧光强度明显较弱，使得探针能更好的用于人体环境的检测，大大降低了探针对人体的危害性，同时也消除了自身的干扰性。
实施例3 PIA的细胞共定位。
将实施例1中探针用DMSO配成1 mM母液，染色时取5μL母液用1mL培养基稀释，配制为终浓度为5μM的染色液。将接种好的细胞在染色液中37 ºC孵育30 min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行荧光成像，激发波长为405nm，发射波段为425-475nm。同时用商用脂滴探针(BODIPY493/503)进行共定位实验，激发波长为488nm，发射波段为500-550nm。由共聚焦荧光显微镜下图像如图3所示，其中由左至右依次为明场成像，PIA探针成像，BODIPY493/503探针成像，明场、PIA探针和BODIPY493/503探针叠加图像，可知探针能很好的定位于脂滴，其图像呈蓝色。以PIA探针的相对荧光强度为横坐标，以BODIPY493/503的相对荧光强度为纵坐标作脂滴探针PIA与BODIPY493/503的强度相关性图，如图4所示，计算可得脂滴探针的共定位系数高达0.83，说明探针成功定位于脂滴中。
实施例4 双光子荧光成像。
将实施例1中探针用DMSO配成1 mM母液，染色时取5μL母液用1mL培养基稀释，配制为终浓度为5μM的染色液。将接种好的细胞在染色液中37 ºC孵育30 min，用PBS洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行荧光成像。单光子激发波长为405nm，双光子激发波长为760nm，发射波段为425-475nm，荧光相位图像如图5所示，其中，由左至右依次为明场成像、单光子成像、双光子成像。由图5可知，探针具有良好的双光子性质，在双光子成像中脂滴图像更清晰。
实施例5 组织荧光成像。
将实施例1中探针用DMSO配成1 mM母液，染色时取40μL母液用2mL PBS缓冲液稀释，配制为终浓度为20μM的染色液。将小鼠的肝组织切片在染色液中37 ºC孵育120 min，用PBS洗3次，然后用荧光显微镜进行双光子荧光成像，激发波长为760nm，发射波段为425-475nm，荧光相位图像如图6所示，其中，由左至右依次为明场成像、单光子成像、双光子成像。由图6可知，探针可进行组织成像，其穿透力达到40 μm左右。

Claims (1)

1.一种结构式如式（I）所示的荧光探针在细胞或组织成像中检测脂滴的应用：
式（I）。
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