CN106946869A - 一种特异性标记细胞中脂滴的荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性标记细胞中脂滴的荧光探针,该探针化学名称为1‑(3’‑(7’‑硝基苯并呋咱‑4’‑)氨丙基)‑4‑甲基吡啶溴盐,其化学通式如式(I)所示。本发明还公开了所述探针在专一性地标记或显示活细胞中的脂滴形态和分布中的应用。实验证实本发明的探针是一种具有超高的选择性、无背景噪音成像、双光子性能、极好的光稳定性、快速染色能力、免洗涤、细胞毒性低等特点的脂滴荧光探针,应用前景巨大。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂滴荧光探针及其应用,尤其涉及一种特异性标记细胞中脂滴的荧光探针及其应用。
背景技术
脂滴,长期以来一直被认为是细胞中存储中性脂质(甘油三酯和胆固醇酯)的简单的惰性的球体。但是最近的研究表明脂滴并不是静态的,而是细胞内高度动态的细胞器,广泛地存在于真核细胞和原核细胞中。它们在细胞中扮演着重要的角色,参与细胞中的多种活动,比如调节细胞内脂质的代谢,维持细胞内平衡,并与细胞内多种细胞器相互作用。而且脂滴的异常可导致多种疾病,如肥胖症,糖尿病,动脉粥硬化等。
脂滴有一个大的无水的中性核,所以根据“相似相容”原理,一些亲脂性的探针已经被开发并用来成像脂滴。目前,利用荧光脂滴探针实时原位地可视化脂滴的方法研究脂滴的生物角色和各种生理活动对脂滴的影响文献已有报道。Nile Red和BODIPY即为两个商业化的脂滴探针。Nile Red是一个亲脂性的探针,尽管它能够优先地聚集在脂滴,但是它也对细胞内绝大多数结构染色,而且在水中也有微弱的荧光发出,因此造成了极大的背景噪音,导致选择性很差。为了提高选择性,另一种亲脂性的探针BODIPY以及其它亲脂性的脂滴探针也相继被用来成像脂滴。相比Nile Red,它们的选择性有所改善,但是仍然不能满足研究需求,阻碍了脂滴的进一步研究。由此可见,单纯地依赖于脂滴的亲脂性来设计亲脂性的脂滴探针很难实现高选择性地成像脂滴的目的。因此,迫切地需要一种新的设计方法以获得高选择性的脂滴探针,能够专一性地靶向脂滴,实现无背景噪音地成像。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明要解决的问题是提供一种特异性标记细胞中脂滴的荧光探针及其应用
本发明所述特异性标记细胞中脂滴的荧光探针,其特征在于:所述探针化学名称为1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-4-甲基吡啶溴盐,简称NPI;其化学通式如式(I)所示:
本发明所述特异性标记细胞中脂滴的荧光探针(NPI)的制备方法概述如下:
先合成4-(3’-溴丙氨基)-7-苯并呋咱(化合物1),再将其与4-甲基吡啶混合,以乙醇为溶剂,加热回流,冷却至室温,沉淀物用乙醚、水冲洗,制得1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-4–甲基吡啶溴盐(NPI)。
上述特异性标记细胞中脂滴的荧光探针(NPI)制备的反应式如下:
据报道脂滴内部的中性核是被一个两亲性的磷脂单分子层所包被,为了有效地存储脂滴同时维持脂滴结构的稳定性,脂滴内部的水被排出,因此实际上脂滴形成了一个独特的两亲性的结构,它包含一个极性的头部和无水的内部。基于此,本发明预测两亲性的分子能够超高选择性地靶向脂滴,故筛选出了一个基于两亲性的有机小分子探针。这个两亲性的探针分别由一个强亲脂性的荧光团NBD和一个阳离子部分(吡啶盐)组成。选择一个遵循ICT(分子内电荷转移)机制的NBD作为荧光母体,一方面它具有强的亲脂性,能够和脂滴的中性核有强的结合力,同时结合阳离子部分和脂滴的极性头部之间的强的静电作用力,可以实现专一性地靶向脂滴,从而有利于无背景噪音地成像。另一方面,该荧光团的发光性质受环境的极性影响,即在低极性环境中它的荧光强度明显地高于其在高极性环境中,这样当该亲脂性的荧光团靶向脂滴低极性的内部后,能发出强烈的荧光,实现荧光开关的效果,进而也有利于无背景噪音地成像。鉴于此,两亲性探针的双靶标策略能够专一性地靶向脂滴,实现无背景噪音的成像。
本发明所述特异性标记细胞中脂滴的荧光探针在专一性地标记或显示活细胞中的脂滴形态和分布中的应用。
其中:所述活细胞优选是HeLa细胞、PC-3细胞或是MSC细胞。
本发明提供的特异性标记细胞中脂滴的荧光探针是具有超高选择性的可用于无背景噪音地成像脂滴的两亲性的荧光探针,且可同时具有双光子成像能力。
实验结果证实,本发明所述的探针具有超高的选择性,能够专一性地靶向细胞中的脂滴,其成像效果远远强于商业化的脂滴探针Nile red。同时,由于在NBD基础上非共轭地引入了阳离子盐部分并不会影响NBD的发光性质,这使得本发明的探针(NPI)保持了NBD的荧光性质,即ICT性质,荧光受环境极性的影响,随环境极性的增加,荧光强度降低,同时荧光峰位有所红移。因此当NPI靶向具有低极性的脂滴内部时,荧光强度将远远大于其在水中的荧光强度,从而可以实现了荧光开关效果。同时,这样的高信噪比和低的背景噪音也使得探针进行染色后,可无需进一步洗涤,即可在显微镜下直接观察。同时NPI具有合适的双光子性能,可用于双光子成像。在双光子显微镜下,细胞中的脂滴可被清楚地观察到。此外,NPI探针的光稳定性极好,明显强于Nile Red.同时它的染色速度极快(小于2分钟),细胞毒性很低,并且可和其他探针兼容。因此NPI探针能有望为研究脂滴及其相关活动的一个强有力的工具,更重要的是利用两亲性分子的双靶向的设计思路能够为未来膜性细胞器包括脂滴在内的探针的设计提供一个通用的指导。
总之,本发明的探针是一种全新的探针,与其功能相近的其他亲脂性的脂滴荧光探针相比,本发明所述探针具有超高的选择性、无背景噪音成像、双光子性能、极好的光稳定性、快速染色能力、免洗涤、细胞毒性低等特点。鉴于其具有适用范围广,单、双光子光稳定性好,染色速度快,细胞毒性低,以及能在活性细胞中专一地成像脂滴的特点,其应用前景极其广阔。
附图说明
图1:用Hoechst 33342和NPI(A)或Nile red(B)共同染色HeLa细胞的共聚焦荧光照片。
其中:(1)图为明场激光扫描的微分干涉照片;(2)图为Hoechst 33342在405nm激光辐照下得到的荧光照片;(3)图为NPI或Nile red在473nm激光辐照下得到的荧光照片;(4)图为(1)、(2)、(3)的叠加图。
图2:用Hoechst 33342和NPI(A)或Nile red(B)共同染色经过不同处理的HeLa细胞的共聚焦荧光照片。
不同处理:(1-4)为固定细胞,(5-8)为固定后的细胞再通过二甲苯去除细胞内脂滴。
其中:1、5图为明场激光扫描的微分干涉照片;2、6图为Hoechst 33342在405nm激光辐照下得到的荧光照片;3、7图为NPI、Nile red在473nm激光辐照下得到的荧光照片;4、8图为2、3的叠加图。标尺=20μm。
图3:用NPI染色经过油酸处理不同时间的HeLa细胞的共聚焦荧光照片。
(A):2h;(B):4h;(C):6h。
其中:1图为NPI在473nm激光辐照下得到的荧光照片;2图为明场激光扫描的微分干涉照片;3图为1、2的叠加图。标尺=20μm。
图4:NPI的单/双光子光稳定性及Nile red的单光子光稳定性的量化图;
图5:用NPI处理HeLa细胞不同时间(2h,10h,24h)后细胞的存活率。
具体实施方式
实施例1:
4-(3’-溴丙氨基)-7-苯并呋咱(1)的合成
在烧瓶中,将4-氯-7-硝基苯呋咱(2g,10mmol)溶解在甲醇中,搅拌15分钟,然后加入3-溴丙胺(2.19g,10mmol),于室温下反应8小时。反应结束后用二氯甲烷萃取,水洗。用无水硫酸钠进行干燥。最后用石油醚和乙酸乙酯的混合物进行柱层分析获得最终产物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.54(t,J=5.40Hz,1H),8.54(d,J=9.00Hz,1H),6.45(d,J=8.70Hz,1H),3.64(m,4H),2.23(m,2H)。
1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-4–甲基吡啶溴盐(NPI)的合成
将合成的化合物(1)(0.3g,1mmol)与4-甲基吡啶(240Μl,1.5mmol)混合,以乙醇为溶剂,加热回流。24小时后反应结束,冷却至室温,沉淀物用乙醚冲洗三次,然后再用冲洗三遍,得到最终产物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.48(s,1H),8.94(d,J=6.40Hz,2H),8.54(d,J=8.80Hz,1H),7.98(d,J=6.00Hz,2H),6.44(d,J=8.80Hz,1H),4.65(t,J=7.20Hz,2H),3.57(s,2H),2.58(s,3H),2.34(t,J=7.00Hz,2H).13C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm)=159.36,145.38,144.93,144.37,138.30,128.82,121.60,100.04,58.20,29.51,21.81.HRMS(m/z):[M]+calculated for C15H16N5O3,314.32;found,314.12。
实施例2:HeLa细胞的培养
HeLa细胞株均是在37℃,5%CO2的CO2培养箱中进行培养。HeLa细胞株在内含10%胎牛血清和1%双抗的H-DMEM培养液中贴壁培养。
等细胞生长到对数期,接片培养:①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min,酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中;②将100mL细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍,用1mL0.25%胰酶消化3-5分钟,小心地倒出培养基,加入少量新鲜培养基吹打均匀,细胞计数后,留下合适密度的细胞,将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1×105),接种至内含盖玻片的培养皿中,放入CO2培养箱中培养,使细胞爬片生长。
实施例3:NPI和Nile red染色HeLa细胞内脂滴的共聚焦荧光显微实验
将接好的细胞爬片先用细胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗涤2遍,然后在室温下用4μM NPI染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。将细胞爬片取出,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在共聚焦荧光显微镜下进行观察,发现细胞内的脂滴被NPI清晰地着色,呈圆球状,主要分布在细胞质中(未被Hoechst着色的区域)。然而,Nile red除了染色圆点之外,也染色了细胞内大多数结构。因此,本发明所述两亲性探针NPI是具有超高选择性的脂滴探针,能够给出脂滴的无背景噪音的荧光照片。
结果见图1。用Hoechst 33342和NPI(A)或Nile red(B)共同染色HeLa细胞的共聚焦荧光照片。其中(1)图为明场激光扫描的微分干涉照片;(2)图为Hoechst 33342在405nm激光辐照下得到的荧光照片;(3)图为NPI或Nile red在473nm激光辐照下得到的荧光照片;(4)图为(1)、(2)、(3)的叠加图。
实施例4:通过去除脂滴法证明探针NPI的超高选择性的证明实验
二甲苯可用来去除固定细胞中的脂滴,因此可用来进一步证明NPI对脂滴的超高选择性。对照组:细胞先用多聚甲醛固定,30分钟后细胞已被固定,然后吸去多聚甲醛,加入1ML的PBS,再用细胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗涤2遍,然后用4μM NPI染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。实验组:细胞先用多聚甲醛固定,30分钟后细胞已被固定,然后吸去多聚甲醛,之后用不同浓度梯度的酒精(70%,80%,90%,95%和100%)依次处理细胞各5分钟,然后用二甲苯处理细胞两次,各5分钟,之后再用反浓度梯度的酒精依次处理各5分钟。最后用PBS洗涤细胞两次,此时细胞内的脂滴被完全去除。然后用细胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗涤2遍,最后用4μM NPI染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。将两组实验中的细胞爬片取出,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在共聚焦显微镜分别收集NPI,Nile red和Hoechst 33342的信号。
观察发现,去除脂滴前,细胞内的脂滴能够被NPI清晰地着色,但是脂滴被去除之后,没有检测到来自NPI的荧光。相比之下,去除脂滴后,细胞内的其他环境仍会被Nile red着色。因此该实验证明了两亲性探针NPI只能够专一地染色脂滴,而不能染色细胞内的其他环境。
结果如图2。用Hoechst 33342和NPI(A)或Nile red(B)共同染色经过不同处理的HeLa细胞的共聚焦荧光照片。不同处理:(1-4)为固定细胞,(5-8)为固定后的细胞再通过二甲苯去除细胞内脂滴。其中1、5图为明场激光扫描的微分干涉照片;2、6图为Hoechst 33342在405nm激光辐照下得到的荧光照片;3、7图为NPI、Nile red在473nm激光辐照下得到的荧光照片;4、8图为2、3的叠加图。标尺=20μm。
实施例5:通过用油酸处理HeLa细胞证明探针NPI的超高选择性
因为油酸能够作为一种中性磷脂聚集在脂滴内,从而能诱导脂滴的形成,使脂滴增多。因此我们用油酸处理HeLa细胞来进一步证明两亲性脂滴探针NPI的超高选择性。将接好的细胞爬片分别用油酸处理不同的时间(2h,4h,6h),然后吸出,用PBS洗涤2遍,之后用4μM NPI染色孵育2min。取出细胞爬片,将细胞生长面朝下盖在载玻片上,在共聚焦荧光显微镜进行观察,发现随着处理时间的增长,细胞内的脂滴增大,来自NPI的绿色荧光也显著增强。这表明NPI也能很好地染色细胞内新产生的脂滴。
结果见图3。用NPI染色经过油酸处理不同时间的HeLa细胞的共聚焦荧光照片。(A):2h;(B):4h;(C):6h.其中1图为NPI在473nm激光辐照下得到的荧光照片;2图为为明场激光扫描的微分干涉照片;3图为1、2的叠加图。标尺=20μm。
实施例6:NPI染色HeLa细胞的双光子照片,单/双光子光稳定性及其细胞毒性试验
将接种好的细胞爬片用4μM的NPI进行染色,室温下孵育2min。然后将细胞爬片取出,细胞生长面朝下盖在载玻片上,直接在双光子显微镜(激发波长:840nm,平均飞秒脉冲功率为3mW)下观察细胞。
结果表明NPI具有双光子成像能力,能够在双光子激发下清晰地成像细胞中的脂滴。同时,测定其单/双光子光稳定性及Nile red的单光子光稳定性,结果表明NPI有极好的光稳定性,明显高于Nile red。用CCK8测定NPI的细胞毒性,结果表明NPI对细胞的毒性极小。
结果见图4、图5。
Claims (3)
1.一种特异性标记细胞中脂滴的荧光探针,其特征在于:所述探针化学名称为1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-4-甲基吡啶溴盐,简称NPI;其化学通式如式(I)所示:
2.权利要求1所述特异性标记细胞中脂滴的荧光探针在专一性地标记或显示活细胞中的脂滴形态和分布中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于:所述活细胞是HeLa细胞、PC-3细胞或是MSC细胞。
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