CN108530523A - 拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用 - Google Patents

拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种拟南芥Sec14p‑like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用，所述应用为拟南芥Sec14p‑like基因作为植物脂滴标记物在植物细胞内特异性定位脂滴。本发明还提供了该基因在植物细胞内脂滴荧光检测中的应用，所述应用具体为：将该基因的编码蛋白与荧光蛋白连接得到融合蛋白；将所述融合蛋白转化到目标植物中标记植物脂滴。与其他功能相近的脂滴荧光标记相比：本发明提供的Sec14p‑like基因，可根据具体需求连接不同的荧光蛋白基因转化到植物中，表达出带有不同荧光蛋白的融合蛋白，有效避免植物自发荧光的干扰；可稳定转化到植物中，长期稳定的标记植物脂滴，并且不影响植物自身生长发育。

Description

拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用，更具体地，涉及一种拟南芥Sec14p-like基因及其编码蛋白在植物细胞脂滴荧光标记中的应用。
背景技术
细胞是生命体系主要的组织单元，由各种不同的细胞器组成，如：细胞壁、细胞膜、细胞核、叶绿体、高尔基体、线粒体、内质网、核糖体、液泡等。细胞器在酶、细胞和很多组织活动中起到重要指示作用，如细胞增殖、细胞凋亡、抗药性、离子传输、肌肉收缩等等。对细胞器的形态进行监测对于生命细胞行为研究具有重要意义。脂滴是细胞内脂质的主要贮存场所，广泛存在于细菌、酵母，植物以及动物细胞中，并且不同类型的细胞中所包含的脂质性状不同，脂滴的大小差别也很大，直径从4纳米到200微米不等。脂滴由磷脂单分子层及疏水核心构成，并且表面分布多种蛋白。长期以来脂滴一直被认为是一个惰性的细胞内含物，在较长时间内一直没有得到足够的重视。近年来的研究发现，脂滴是一个复杂且活动旺盛的多功能细胞器，在多种生物学过程中发挥重要作用。脂滴中的蛋白参与了多种脂质相关生物学过程，包括细胞信号转导、脂代谢的调控、膜运输、蛋白的合成与分泌等。脂滴的形成和修饰是机体调控自身脂肪细胞新陈代谢的重要组成部分。脂滴不但是甘油三酯贮存和分解、花生四烯酸代谢和前列素合成的主要场所，还具有合成甘油三酯和磷脂的功能。研究还表明，多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病，往往都伴随着脂质贮存的异常。因此，关于脂滴的生物学研究日益受到人们的重视。
根据“相似相容”原理，已经有一些亲脂性的探针被开发出来用于脂滴的成像和追踪。目前，利用荧光探针原位标记的方法来研究脂滴的生物角色和各种生理活动对脂滴的影响文献已经有报道。Nile Red(尼罗红)和BODIPY是两个常用的商业化脂滴探针。NileRed是一个亲脂性探针，不但可以优先聚集在脂滴，在水中也能够发出非常微弱的荧光，因此有一定的背景噪音。为了提高选择性，另一种亲脂性的探针BODIPY以及其他亲脂性的脂滴探针也相继被开发出来。相比Nile Red，它们具有了一定的优势。但是从不同方面来讲，这些探针依然有一些缺点，如有些探针激发光波长和发射光波长确定，当研究样品在相似激发光波长下会发出自发荧光时会限制其使用；有些探针或配制溶液有一定的细胞毒性，不能长时间染色观察。有些探针价格昂贵，耗费巨大，仅仅几毫克即数千元。这些问题阻碍了脂滴研究的开展和进行。因此，迫切的需要一种新的脂滴标记物，能够有效地，长时间地，廉价地标记脂滴。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种特异性标记细胞中脂滴的荧光探针及其应用。本发明的目的是提供一种拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用，具体涉及一种拟南芥Sec14p-like基因及其编码蛋白在植物细胞器脂滴荧光标记中的定位。
本发明提供了一个编码标记植物细胞器脂滴的蛋白的基因及其编码蛋白，具体为拟南芥Sec14p-like(AT1G14820)基因及其编码蛋白。该蛋白有如下特点：(1)融合蛋白Sec14p-like-YFP可以在烟草中瞬时表达，标记烟草细胞中的脂滴结构。(2)Sec14p-like-YFP可以在拟南芥中稳定表达，可以标记拟南芥中的脂滴结构，并且对拟南芥植株没有毒性，不影响拟南芥生长。说明拟南芥Sec14p-like基因及其编码蛋白是一种有效的植物脂滴标记物，具有广泛的应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种拟南芥Sec14p-like基因的应用，所述应用为拟南芥Sec14p-like基因作为植物脂滴标记物在植物细胞内特异性定位脂滴。
优选地，所述拟南芥Sec14p-like基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述拟南芥Sec14p-like基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述拟南芥Sec14p-like基因的获得方法包括如下步骤：从拟南芥cDNA中克隆Sec14p-like基因的编码区域并转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行DNA测序，即得；
克隆所述拟南芥Sec14p-like基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示。
第二方面，本发明提供一种拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞内脂滴荧光检测中的应用，所述应用具体为：将拟南芥Sec14p-like基因的编码蛋白与荧光蛋白连接得到融合蛋白；将所述融合蛋白转化到目标植物中标记植物脂滴。
优选地，所述荧光蛋白包括YFP、GFP中的一种。
优选地，所述目标植物包括拟南芥、烟草中的一种。
第三方面，本发明提供一种植物细胞内脂滴荧光检测方法，包括以下步骤：
A、将拟南芥Sec14p-like基因连入表达载体，得重组载体(得到含有拟南芥Sec14p-like
基因的编码蛋白与荧光蛋白连接的重组载体)；
B、将所述重组载体转化宿主，得转化体；
C、将所述转化体转化目标植物，即可实现对植物脂滴的标记。
优选地，连接所述拟南芥Sec14p-like基因的表达载体包括pMD19-T克隆载体、pEarleyGate101、pEarleyGate103中的一种。
优选地，所述宿主为大肠杆菌或农杆菌。
本发明中，将核苷酸Sec14p-like及其编码蛋白用于植物脂滴标记包括如下步骤：
步骤一，将核苷酸Sec14p-like连入表达载体，得重组载体；
步骤二，将所述重组载体转化农杆菌，得农杆菌工程菌；
步骤三，将所述农杆菌工程菌以瞬时或者稳定的形式转化目标植物，即可实现核苷酸Sec14p-like及其编码蛋白对植物脂滴的标记。
本发明所述的植物脂滴荧光标记基因Sec14p-like及其编码蛋白不但可以在短时间内瞬时转化植物并标记植物脂滴，且可以长时间稳定转化植物，长久标记植物脂滴，并且对植物没有毒性，不影响植物正常生长，可以如实反映植物脂滴的状态。
本发明所述的植物脂滴荧光标记基因Sec14p-like及其编码蛋白可以连接不同的荧光蛋白，在不同波长的激发光下发出不同波长的发射光。可以根据所研究植物样本的自发荧光，选择合适的荧光蛋白基因在植物中表达，有效避开植物自发荧光带来的干扰。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明的植物脂滴标记是一种全新的标记物。与其他功能相近的脂滴荧光标记相比：本发明提供的基因Sec14p-like，可以根据具体需求连接不同的荧光蛋白基因转化到植物中，表达出带有不同荧光蛋白的融合蛋白，有效避免植物自发荧光的干扰。可以稳定转化到植物中，长期稳定的标记植物脂滴，并且不影响植物自身生长发育。鉴于以上这些优点，本发明的植物脂滴标记物适用范围广，应用前景非常广阔。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为Sec14p-like基因克隆的PCR产物电泳图；
图2为在烟草中瞬时表达Sec14p-like-FP蛋白用于标记烟草中脂滴；其中，图A、B、C、D为同一个视野下观察的结果，图A为Sec14p-like-YFP在烟草叶片中的分布；图B为脂滴染料尼罗红对烟草叶片中的脂滴染色标记；图C为明场(为不观察荧光显示结果)；图D为合并；图E为Sec14p-like-GFP在烟草叶片中的分布；图F为脂滴染料尼罗红对烟草叶片中的脂滴染色标记；图G为明场；图H为合并；
图3为拟南芥植株在稳定表达Sec14p-like-YFP蛋白之后的生长情况；其中，图A为拟南芥野生型Col-0；图B为稳定表达Sec14p-like-YFP蛋白的拟南芥转基因植株；
图4为拟南芥中稳定表达Sec14p-like-YFP蛋白用于标记拟南芥中脂滴；其中，图A为Sec14p-like-YFP在拟南芥根毛中的分布；图B为脂滴染料尼罗红对拟南芥根毛中的脂滴染色标记；图C为明场；图D为合并。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明涉及的农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开；质粒载体pEarleyGate101、pEarleyGate103、pDONR可通过公开市售的商业渠道取得。
实施例1 Sec14p-like基因的克隆及载体构建
(1)PCR扩增Sec14p-like基因
以GATEWAY方式构建载体，根据已经公布的拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因AT1G14820序列设计引物，扩增产物大小为817bp，其中基因编码区756bp，为了表达融合蛋白编码区末端的终止密码子已经去除。
Sec14p-like-F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGAGGAAAGCCAAG
Sec14p-like-R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAACATTATTGTTTGTTAGAG
提取拟南芥RNA,反转为cDNA，利用上述引物进行PCR扩增。引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
(2)目的片段的回收和构建中间载体
通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段(图1)，采用康为世纪公司的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作步骤见试剂盒说明书。
如图1所示，Marker：DL2000DNA Marker；1：拟南芥Sec14p-like基因启动子克隆的PCR扩增产物。
将回收的目的DNA片段与pDONR载体连接，具体操作步骤见试剂盒说明书。将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布到含有博莱霉素的LB培养基平板上，37℃倒置培养16-20小时。挑取平板上的菌落，摇菌培养，取菌液做模板进行PCR阳性鉴定。
(3)测序验证和构建表达载体
选取多个经过鉴定的阳性克隆，使用康为世纪公司的快速质粒小提试剂盒抽提阳性菌液质粒DNA，送交上海博尚生物技术有限公司进行DNA测序，将测序结果与公开的Sec14p-like基因比对(http://www.arabidopsis.org/)，挑出没有提前出现终止密码子，也没有序列的插入缺失的克隆，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为Sec14p-like。
将测序符合要求的序列分别连接载体pEarleyGate101和pEarleyGate103，具体操作步骤见试剂盒说明书，pEarlygate101载体包含YFP蛋白，pEarlygate103载体包含GFP蛋白。将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布到含有卡那霉素的LB培养基平板上，37℃倒置培养16-20小时。挑取平板上的菌落，摇菌培养，取菌液做模板进行PCR阳性鉴定。
实施例2：重组载体pEarleygate101-Sec14p-like-YFP和pEarleygate103- Sec14p-like-GFP的烟草瞬时转化和脂滴标记分析
(1)将重组载体转化农杆菌
用冻融法将重组载体pEarleygate101-Sec14p-like-YFP转化到农杆菌EHA105中，挑取平板上的农杆菌单克隆，接种到1ml液体抗性LB培养基中(链霉素+利福平+卡那霉素)，在28℃摇床中培养24小时。
(2)瞬时转化烟草
将菌液转接到10ml液体培养基中(含有10mM的MES和40uM的AS)，在28℃摇床中培养16小时。离心菌液收集菌体，用10mM的MgCl2溶液重悬菌体至OD600＝1，最后加入AS至终浓度为200uM并静置3小时。取三周龄烟草，用除去针头的注射器紧贴烟草叶背将上述菌液注射到叶肉中。
(3)脂滴染色
上述烟草暗培养两天后，在叶片上侵染农杆菌的同样位置注射尼罗红溶液，浓度为0.01mg/ml。
(4)脂滴标记分析
注射尼罗红溶液三小时之后，剪取小块叶片，在激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达定位和脂滴染色情况。如图2所示，图A、E中白色明亮处显示融合蛋白荧光(图A中显色黄色荧光，图E中显色绿色荧光)，图B、F中白色明亮处显示脂滴染色荧光(图B、F中显色均显红色荧光)，图C、G为明场图，图D、H为重合后结果。融合蛋白Sec14p-like-YFP和Sec14p-like-GFP在烟草中定位于细胞质膜附近，并且聚集在细胞内形成大小不一的点状结构(A,E)。细胞经过尼罗红染色之后，在激光共聚焦显微镜下，脂滴发出明亮的红色荧光，并且细胞质膜主要由脂质构成，也发出红色荧光(B,F)。A与B，E与F分别合并之后，可以明显看到荧光完全重叠，说明融合蛋白Sec14p-like-YFP和Sec14p-like-GFP有效地标记了细胞内脂滴，并且Sec14p-like可以和不同的荧光蛋白形成融合蛋白，有效的避免了样本自发荧光的影响。
实施例3：重组载体pEarleygate101-Sec14p-like-YFP稳定转化拟南芥和脂滴标 记分析
(1)拟南芥种植和转化
在培养土中播种拟南芥Col-0种子，七天后移苗到大盆中，在温室中正常管理培养，温度20-22℃，相对湿度50-70％，光强100-120μmol/(m2.s)，16h光照8h黑暗。
取实施例2中转化了重组载体pEarleygate101-Sec14p-like-YFP的农杆菌EHA105，接种到液体LB培养基中，过夜培养，28℃，200rpm。将菌液离心收集菌体，4000rpm，10min。用转化液重悬农杆菌至OD600约等于1.0。将菌液倒入培养皿中，准备浸花侵染。将拟南芥花序全部浸入菌液中30s，并轻柔摇动。浸花后在遮光处放置24h。放回原处正常培养管理。拟南芥成熟，角果变黄之后，收集T0代种子，使用稀释5000倍Basta溶液喷洒播种7天的T1幼苗，阴性植株会萎蔫停止生长，阳性植株正常生长。在T1代植株中挑选抗性分离比为3：1的T-DNA单插入株系若干，继续繁殖。如果某一个T1单株的T2代植株全都是抗性植株，那么这一个T1单株及其后代全都是纯合株系。
转化液(按照顺序配制)：
加水补齐至1L
(2)稳定转化载体pEarleygate101-Sec14p-like-YFP的表型分析
取拟南芥纯合转化株系和Col-0种子，经表面消毒后铺在MS培养基上，在温室中正常管理培养，温度20-22℃，相对湿度50-70％，光强100-120μmol/(m2.s)，16h光照8h黑暗。七天后观察表型拍照。如图3所示，转基因拟南芥和野生型拟南芥生长状态基本一致，说明拟南芥表达融合蛋白Sec14p-like-YFP之后，对拟南芥的生长发育没有影响。
(3)脂滴染色
取上述拍照后的拟南芥幼苗，在浓度为0.01mg/ml的尼罗红溶液中浸泡1分钟，取出，清水冲洗三遍。
(4)脂滴标记分析
拟南芥幼苗经尼罗红染色之后，在激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达定位和脂滴染色情况。如图4所示，图A中白色明亮处显示融合蛋白荧光(呈黄色荧光)，图B中白色明亮处显示脂滴染色荧光(呈红色荧光)，图C中显示明场结果，图D为重合后结果。融合蛋白Sec14p-like-YFP在拟南芥根毛细胞中有表达，并且聚集形成大小不一的球状结构(A)。细胞经过尼罗红染色之后，脂滴发出明亮的红色荧光，并且同样聚集形成大小不一的球状结构(B)。A与B合并之后，可以明显看到荧光完全重叠，说明融合蛋白Sec14p-like-YFP能有效地标记细胞内脂滴。
本发明公开了一个拟南芥Sec14p-like基因及其编码蛋白的应用，用于在植物细胞内特异定位脂质体。利用激光共聚焦显微镜，本发明所公布的Sec14p-like基因编码蛋白与不同的荧光蛋白融合之后可以检测脂滴在细胞中的定位。特别是对于具有自发荧光特性的组织，将合适的荧光蛋白与Sec14p-like基因编码蛋白融合表达之后，能够有效检测脂滴在细胞中的定位分布情况，避免组织自发荧光的干扰，具有广泛的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用
<130> DAG35494
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>

Claims (10)

1.一种拟南芥Sec14p-like基因的应用，其特征在于，所述应用为拟南芥Sec14p-like基因作为植物脂滴标记物在植物细胞内特异性定位脂滴。
2.根据权利要求1所述的拟南芥Sec14p-like基因的应用，其特征在于，所述拟南芥Sec14p-like基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的拟南芥Sec14p-like基因的应用，其特征在于，所述拟南芥Sec14p-like基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的拟南芥Sec14p-like基因的应用，其特征在于，所述拟南芥Sec14p-like基因的获得方法包括如下步骤：从拟南芥cDNA中克隆Sec14p-like基因的编码区域并转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行DNA测序，即得；
克隆所述拟南芥Sec14p-like基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
5.一种拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞内脂滴荧光检测中的应用，其特征在于，所述应用具体为：将拟南芥Sec14p-like基因的编码蛋白与荧光蛋白连接得到融合蛋白；将所述融合蛋白转化到目标植物中标记植物脂滴。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荧光蛋白包括YFP、GFP中的一种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目标植物包括拟南芥、烟草中的一种。
8.一种植物细胞内脂滴荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将拟南芥Sec14p-like基因连入表达载体，得重组载体；
B、将所述重组载体转化宿主，得转化体；
C、将所述转化体转化目标植物，即可实现对植物脂滴的标记。
9.根据权利要求8所述的拟南芥Sec14p-like基因及其编码蛋白的应用，其特征在于，连接所述拟南芥Sec14p-like基因的表达载体包括pMD19-T克隆载体、pEarleyGate101、pEarleyGate103中的一种。
10.根据权利要求8所述的拟南芥Sec14p-like基因及其编码蛋白的应用，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌或农杆菌。
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