CN111560454A

CN111560454A - 植物细胞高尔基体特异标记及应用

Info

Publication number: CN111560454A
Application number: CN202010276759.8A
Authority: CN
Inventors: 卢江; 蓝霞; 傅佩宁; 宋士任; 高宇; 吴伟
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111560454B

Abstract

本发明公开了一种植物细胞高尔基体特异标记，植物细胞高尔基体特异标记为RxLR132^aa21‑158基因；还公开了该特异标记编码的蛋白以及该特异标记在植物高尔基体荧光检测中的应用。本发明的RxLR132^aa21‑158基因与荧光报告基因融合后表达的融合蛋白的荧光能够与高尔基体标记蛋白融合蛋白的荧光叠加，可以特异标记高尔基体，且其特异性定位不受荧光报告基因的影响。本发明的植物细胞高尔基体特异标记丰富了高尔基体标记库，可以给不同植物蛋白高尔基体定位研究提供多种候选标记选择，具有重要意义。

Description

植物细胞高尔基体特异标记及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种植物细胞高尔基体特异标记及应用。

背景技术

细胞是生物体基本的结构和功能单位。在真核细胞中，生物膜将真核细胞分隔成不同的亚细胞结构，包括线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、溶酶体、内质网、细胞核、高尔基体、液泡、囊泡等，使得细胞内能够同时进行多种化学反应，而不会相互干扰。各种蛋白质按其功能有序地分布在细胞的每个区室中发挥功能。研究蛋白质的亚细胞定位对于探索和分析蛋白质功能至关重要，也是系统地理解植物生长发育、形态建成、对抗各种生物非生物胁迫等必不可少的环节。

融合报告基因定位法是亚细胞定位常用手段，通过将目的蛋白基因与易于检测的报告基因进行融合，构建融合基因表达载体，表达融合蛋白，然后借助于报告基因表达产物的特征来定位目的蛋白质。报告基因就其表达产物而言，主要有荧光蛋白和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)，而荧光报告基因法应用最为广泛。

荧光报告基因法是将目的基因与易于检测的荧光报告基因融合，再将融合基因导入表达载体，通过愈伤组织转化、基因枪、农杆菌介导的瞬时转化等方法转化合适的细胞，表达融合蛋白，通过在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下检测荧光蛋白的荧光即可直观的测定目的蛋白在细胞中的准确定位。荧光报告基因通常包括绿色荧光蛋白(GFP)基因及其荧光突变体(黄色荧光蛋白(YFP)基因、蓝色荧光蛋白(BFP)基因、青色荧光蛋白(CFP))和红色荧光蛋白(RFP)基因及其突变体(mCherry，mStrawberry，mTangerine，mBanana，mOrange)等。荧光报告基因法具有灵敏性高、适用性强、容易操作、试验周期相对较短、能使蛋白质保持其天然特性、对活细胞不产生毒害、能够在活体中观察蛋白质的动态变化等优点，避免了提纯蛋白、标记异硫氰酸荧光素等荧光染料、经显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而使研究蛋白的活细胞的准确定位变得简单易行，是目前蛋白质亚细胞定位研究中应用最为广泛的方法。

荧光报告基因法标记细胞器对于研究细胞器的动态变化及功能具有重要意义。首先，荧光蛋白基因与细胞器定位序列融合表达可将荧光蛋白定位到特定的细胞器和膜系统中，可以直观地对细胞器的形态特征、数目、分布规律、动态变化、功能以及内膜系统等进行活体观察。如将GFP和内质网定位信号KDEL构建成融合蛋白，在转化细胞的内质网中可观察到膜皮层样的网状结构，此内质网标记物促进了内膜系统结构、功能和囊泡运输的研究。将GFP与肌动蛋白、微管蛋白以及其他细胞骨架作用蛋白融合，可用于研究植物细胞骨架组分间的相互作用以及细胞骨架力学。其次，由于细胞中的细胞器种类较多、部分细胞器结构大小相似，难以区分，当观察到未知蛋白的荧光可能定位于某个特定的细胞器时，必须进行未知蛋白荧光和细胞器标记荧光的共定位分析，才能最终确定未知蛋白的定位。

高尔基体是由单位膜构成的扁平囊叠加在一起组成。扁平囊为圆形，边缘膨大且具穿孔。高尔基体的主要功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、分类与包装，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。与动物细胞高尔基体相比，植物细胞的高尔基体相对来说体积比较小，遍布在整个细胞质当中，这种分布方式可以缩短内质网和高尔基体以及它同后高尔基体细胞器之间的距离。高尔基体标记蛋白包括多种膜结合蛋白，如木糖基转移酶(β-1,2xylosyltransferase)、甘露糖苷酶[α-1,2mannosidase 1(ManI)]和半乳糖醛酸转移酶14(galacturonosyltransferase 14,GAUT 14)等，但是数量依然不是很多，发掘新的高尔基体标记可以丰富标记库，可以给不同植物高尔基体亚细胞定位研究提供多种选择，具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种植物细胞高尔基体特异标记及应用，丰富了标记库，可以给不同植物高尔基体亚细胞定位研究提供多种选择。

植物细胞高尔基体特异标记，所述植物细胞高尔基体特异标记为RxLR132^aa21-158基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，上述植物细胞高尔基体特异标记通过以下方法得到：从葡萄霜霉菌cDNA中克隆RxLR132^aa21-158基因的编码区域，并转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行DNA测序。

进一步地，克隆所述RxLR132^aa21-158基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:3、SEQID NO:4所示。

本发明还公开了上述植物细胞高尔基体特异标记编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还公开了上述植物细胞高尔基体特异标记在植物高尔基体荧光检测中的应用。

进一步地，上述应用的具体方法为：将所述的RxLR132^aa21-158基因与荧光报告基因融合，得到融合基因；将所述融合基因导入表达载体，得到重组载体；将所述重组载体转化到宿主中，得到转化体；所述转化体转化到目标植物中，用于标记高尔基体。

进一步地，所述的荧光报告基因包括GFP、YFP、BFP、CFP、RFP、mCherry、mStrawberry、mTangerine、mBanana、或mOrange。

进一步地，所述的表达载体包括pBI121。

进一步地，所述的宿主包括大肠杆菌或农杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果具体体现在：

1、本发明的植物细胞高尔基体特异标记丰富了高尔基体标记库，可以给不同植物蛋白高尔基体定位研究提供多种候选标记选择，具有重要意义。

2、本发明的RxLR132^aa21-158基因与荧光报告基因融合后表达的融合蛋白的荧光能够与高尔基体标记蛋白融合蛋白的荧光叠加，可以特异标记高尔基体，且其特异性定位不受荧光报告基因的影响。

3、本发明的RxLR132^aa21-158基因可以稳定转化到植物中，长期稳定的标记植物细胞高尔基体，并且不影响植物正常生长。

附图说明

图1为葡萄霜霉病病状示意图。

图2为RNA电泳图。

图3为PCR电泳图。

图4为蛋白的激光共聚焦显微镜图。

图5为蛋白Western blotting分析图。

图6为RxLR132^aa21-158-GFP与高尔基体标记蛋白融合蛋白GmMan1_1-49-mCherry共定位分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，有必要指出的是，本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，并不能理解为对本发明保护范围的界定。

实施例1

一、植物细胞高尔基体特异标记的获得

1、葡萄霜霉菌样本采集

葡萄霜霉病一般6-7月开始发病，8-9月为发病盛期，此时为采样的最佳时间。如图1所示，葡萄霜霉病主要危害葡萄叶片，产生黄色至褐色多角形病斑，叶斑背面产生白色霉层。病样采集后保存在自封袋中。

2、葡萄霜霉菌RNA的提取

(1)取含葡萄霜霉菌的病组织(约100mg)于1.5mL离心管中，液氮速冻后研磨成粉末。

(2)加入600μL 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB，2％PVP-40，2M NaCl，20mM EDTA，0.1M Tris-HCl，1％β-mercaptoethanol，0.5g/L Spermidine，pH 8.0)，涡旋震荡混均，65℃水浴30min，期间颠倒两次，其中M为mol/L。

(3)加入600μL水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液，剧烈震荡10s后离心(室温，13000rpm，10min)。

(4)取上清，加入等体积氯仿，剧烈震荡10s后离心(室温，13000rpm，2min)。

(5)取上清，加入等体积5M LiCl，4℃过夜沉淀。

(6)离心(4℃，13000rpm，20min)，去上清，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗一次，晾干后加入500μL SSTE(1M NaCl，0.5％SDS，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)溶解沉淀。

(7)加入500μL氯仿，剧烈震荡10s后离心(室温，13000rpm，2min)。

(8)取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀RNA 1h。

(9)离心(4℃，13000rpm，10min)后去上清。用70％乙醇洗涤沉淀一次，晾干后加入适量DEPC水溶解RNA，经过电泳检测，如图2所示，28S和18S条带完整，表明RNA质量很高，满足后续实验要求。

以上所用耗材均为无RNase材质或事先经过DEPC水处理并高温灭菌。

3、RNA反转录成cDNA

参照北京全式金(TransGen Biotech)公司的TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis Super Mix试剂盒。

(1)取一个1.5mL无RNase离心管，加入以下组分：

(2)样品置于25℃孵育10min后，产物用于qPCR：42℃孵育15min；产物用于PCR：42℃孵育30min。

(3)样品置于85℃加热5s，失活TransScript RT/RI与gDNA Remover，样品保存于-80℃，得到cDNA。

4、克隆RxLR132基因片段RxLR132^aa21-158(417bp)

以上述cDNA为模板，以RxLR132基因全长引物(见表1中的P1和P2)进行PCR扩增RxLR132基因全长。

表1 RxLR132基因引物信息

注：P3中的“CTAGA”以及P4中的“GGTACC”为添加的酶切位点。

PCR反应体系为：

反应程序为：

PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳分离，于紫外灯下分辨目的条带并切下对应胶条，胶条经小片段胶回收试剂盒进行纯化回收，具体步骤参照说明书。再以纯化回收后的RxLR132为模板，以带XbaI和KpnI酶切位点的引物(P3和P4)进行PCR扩增RxLR132基因片段RxLR132^aa21-158，PCR电泳图(图3)显示PCR产物在400bp左右，符合RxLR132^aa21-158大小。随后将PCR产物采用纯化回收试剂盒进行回收，得到纯化回收的基因片段。

二、构建载体和测序验证

1、构建载体

(1)将亚细胞定位载体pBI121-GFP和pBI121-mCherry以及上述纯化回收的基因片段分别同时用XbaI和KpnI进行双酶切。酶切体系为：

将酶切组分混匀，37℃酶切2h。

(2)pBI121载体酶切产物经PCR产物回收试剂盒进行纯化回收，RxLR132^aa21-158酶切产物经小片段纯化回收试剂盒进行纯化回收。

(3)将载体和目的基因片段连接，连接体系为：

将连接组分混匀，16℃过夜连接。

2、转化大肠杆菌

每个连接体系分别加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，混匀后冰上静置30min。接着42℃热击90s，冰上静置2-3min。加入500μL SOC液体培养基(2％Tryptone,0.5％Yeastextract,0.05％NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl₂,20mM glucose)，复苏培养(37℃，200rpm，30min)。取200μL菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(1％Tryptone,0.5％Yeastextract,1％NaCl,1.5％Agar)平板，置于37℃培养箱培养36h。

3、阳性转化子鉴定及保存

利用PCR技术对重组载体pBI121-gene-GFP和pBI121-gene-mCherry是否导入大肠杆菌进行检测。用牙签从LB板上挑取单菌落的少量菌体作为PCR反应的模板，用相应的引物进行菌落PCR验证。菌落PCR体系为：

反应程序为：

PCR产物经电泳检测，根据电泳结果，扩增片段与目的片段相符合的克隆即为阳性克隆。阳性克隆接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基扩大培养。经测序验证正确的质粒保存于-80℃备用。

RxLR132^aa21-158基因片段经测序验证，具体序列信息如下：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

三、重组质粒的转化

1、农杆菌电击感受态的制备及转化

(1)取保存的农杆菌菌株GV3101，于含50μg/mL利福平的LB培养基平板上划线活化(30℃培养2d)。

(2)挑取单菌落，接种于含50μg/mL利福平的LB液体培养基培养(30℃，250rpm)，摇至OD₆₀₀＝0.5。

(3)菌液冰浴15min，分装于无菌的50mL离心管，随后离心收集菌体(4℃，4000rpm，15min)。

(4)弃上清，加入30mL超纯水(4℃预冷)重悬洗涤菌体，离心(4℃，4000rpm，15min)。

(5)重复(4)两次。

(6)弃上清，加入5mL 10％甘油(4℃预冷)重悬菌体，按80μL每份分装于1.5mL离心管中，得到农杆菌感受态，液氮速冻后-80℃保存备用。

2、重组质粒转化农杆菌

(1)取出保存于-80℃冰箱的农杆菌感受态，于冰上解冻。

(2)每管感受态分别加入1μL待转质粒(pBI121重组载体)，混匀，将混合物缓缓加入电击杯中，防止产生气泡。

(3)电击杯放入电穿孔仪中，以2500V(模式P2)电压进行电击转化。

(4)电击结束，向电击杯中加入1mL预冷的LB液体培养基，吸取100μL菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的LB培养基平板。

(5)平板置于30℃培养箱培养2d后，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定(参照上述“阳性转化子鉴定及保存”中的PCR体系和反应程序)，阳性克隆扩大培养后，加入等体积50％甘油，于-80℃保存。

四、亚细胞定位及共定位分析

将pBI121-RxLR132^aa21-158-GFP、pBI121-RxLR132^aa21-158-mCherry和pSuper1300-GmMan1_1-49-mCherry(pSuper1300-GmMan1_1-49-mCherry的制备同pBI121-RxLR132^aa21-158-GFP和pBI121-RxLR132^aa21-158-mCherry，此处不再赘述)采用农杆菌介导的本氏烟草瞬时表达系统进行表达，具体步骤如下：

(1)取存于-80℃的农杆菌(含pBI121重组载体)，于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平LB培养基平板活化(30℃培养2d)。

(2)挑取单菌落于10mL含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的LB液体培养基中，30℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝0.5～1.0。

(3)离心收集菌体(24℃，4000rpm，5min)。

(4)弃上清，加入30mL重悬液(10mM MgCl₂)重悬洗涤菌体，离心(24℃，4000rpm，5min)。

(5)弃上清，加入重悬液(10mM MgCl₂)重悬菌体调至OD₆₀₀＝0.4(共表达时，将含不同质粒的农杆菌菌体浓度调至OD₆₀₀＝0.8，再以等体积混合)，30℃静置3h。

(6)取长至5周的烟草盆栽苗，用去掉针头的注射器将农杆菌重悬液注射至烟草叶片。其中，烟草的种植方法为：

营养土和蛭石按照1:2的比例混合，分装于口径为10cm的塑料花盆中，将烟草种子播于盆中，10天后将烟草苗移栽至新盆，每盆1棵。置于光周期为12h光照/12h黑暗，温度为22℃的植物房培养，定期浇水施肥。

(7)2天后取下烟草叶片在激光共聚焦显微镜下观察荧光分布情况。GFP的激发波长为488nm，发射波长为525nm；mCherry的激发波长为580nm，发射波长为610nm。

在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的亚细胞定位，如图4所示，GFP蛋白定位于烟草细胞的细胞核和细胞质。RxLR132^aa21-158-GFP标记了数个环状结构，环状结构悬浮于细胞质中，偶尔会在胞质中流动，其形态、大小与已经报道的裂解液泡相似。当把荧光报告基因换成mCheery时，RxLR132^aa21-158基因与荧光报告基因融合后表达的融合蛋白的红色荧光分布与绿色荧光分布基本一致，这说明RxLR132^aa21-158的特异性定位不受荧光蛋白的影响。

五、蛋白免疫印记(Western blot)确定瞬时表达蛋白的大小

采用如下步骤进行Western blot检验瞬时表达蛋白大小是否符合预期。

(1)采集植物组织，用液氮速冻后，磨成粉末。

(2)取适量粉末于2mL离心管中，加入适量含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液(50mMTris-HCl[pH 7.5],150mM NaCl,1mM EDTA,0.5％NP-40,1×cocktail,1mM PMSF,5μMMG132)，震荡混匀后，冰水浴10min。

(3)4℃，13000rpm离心10min，上清转至新的2mL离心管，Bradford定量后，用于Western blotting分析。

(4)SDS-PAGE电泳凝胶配制：参照《分子克隆》，根据蛋白分子量大小配制相应浓度的分离胶，用异丙醇压平，待分离胶凝固后，将异丙醇倒掉，于分离胶上灌注5％的浓缩胶，待其凝固后使用。

(5)蛋白样品处理：取适量待测蛋白样品，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴10min。

(6)电泳：取适量蛋白样品上样进行电泳。电泳参数设置为低电压60V运行30min跑过浓缩胶，随后将电泳槽放置在冰水中以高电压180V运行60-90min。

(7)转膜：转膜滤纸、醋酸纤维膜和凝胶于转膜缓冲液中浸泡，按照(正极)转膜滤纸-硝酸纤维膜(NC)-凝胶-转膜滤纸(负极)顺序置于半干转转膜仪，转膜参数为：23V30min。

(8)封闭：用TBST配制5％的脱脂奶粉溶液，将NC膜置于适量5％奶粉中，常温封闭1h。

(9)一抗孵育：将封闭的膜转移至加了一抗anti-GFP的TBST溶液中(1：10000稀释)，常温孵育2h，用TBST溶液洗3次，每次5min。

(10)二抗孵育：将膜转至加了羊抗鼠二抗的TBST溶液中(1：10000稀释)，孵育1h。用TBST溶液洗3次，每次5min。

(11)显影：将膜置于X线暗盒中，于膜上滴加ECL显色液，盖上透明膜，避光静置2min。用滤纸擦掉多余反应液，用透明胶带将膜固定好。在暗室中，将X光胶片置于膜正上方，曝光3-5min。随后将胶片放入显影仪器中进行显影。

(12)取出NC膜，置于丽春红染液中染色10s以确认转印效果。

蛋白的表达情况通过western blotting分析，如图5所示，所有蛋白均可检测到相应大小的条带(GFP 27kD；RxLR132^aa21-158-GFP 41kD)，说明所有蛋白均可在烟草中正常表达。

六、共定位分析验证蛋白表达位置

为了确定RxLR132^aa21-158-GFP在细胞中的确切定位，将上述融合蛋白与高尔基体标记蛋白融合蛋白GmMan1_1-49-mCherry进行共定位分析。结果如图6所示，RxLR132^aa21-158-GFP定位于胞质中的圆球形细胞器，荧光呈点状分布于整个细胞质中，且点状荧光在胞质中具有较快的移动速度，其形态与动态跟已报道的高尔基体标记的荧光模式相似，并且能够与高尔基体标记蛋白融合蛋白GmMan1_1-49-mCherry的红色荧光叠加，这说明RxLR132^aa21-158-GFP特异性定位于高尔基体，也即，本发明提供的RxLR132^aa21-158基因可以作为植物细胞高尔基体特异标记。

上述是结合实施例对本发明作详细说明，但是本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何在本发明专利核心指导思想下所作的改变、替换、组合简化等都包含在本发明专利的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 植物细胞高尔基体特异标记及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgctaataa gcgtgaccaa cgctgcagtg ggtgccaagc cggggcctca tgcaggtcgg 60

gacttagacg gaagcaccac atcaatgagc gtcaacgtgg acgacgaaga aagagggctt 120

tcagatatgc taaaaaggtt gcgttcaatg cttttcgatg cgaactctgc caccaaaggc 180

caggcgttga aaaaggacgc caaatccacc aaaagtgtta aagctgctgg tgctgcttca 240

aacgccaaga aggttggtca gctccgacac atgtggaatc agatcaaaaa tgttgagtac 300

aaaggcaatg tcaagtattt ggccatcatt tacgtgattt gtatcctaag tgtacttgga 360

attctcggga ctgtattcgc gattaatcgc aatatctcga atcagtatat tcacgag 417

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Ile Ser Val Thr Asn Ala Ala Val Gly Ala Lys Pro Gly Pro

1 5 10 15

His Ala Gly Arg Asp Leu Asp Gly Ser Thr Thr Ser Met Ser Val Asn

20 25 30

Val Asp Asp Glu Glu Arg Gly Leu Ser Asp Met Leu Lys Arg Leu Arg

35 40 45

Ser Met Leu Phe Asp Ala Asn Ser Ala Thr Lys Gly Gln Ala Leu Lys

50 55 60

Lys Asp Ala Lys Ser Thr Lys Ser Val Lys Ala Ala Gly Ala Ala Ser

65 70 75 80

Asn Ala Lys Lys Val Gly Gln Leu Arg His Met Trp Asn Gln Ile Lys

85 90 95

Asn Val Glu Tyr Lys Gly Asn Val Lys Tyr Leu Ala Ile Ile Tyr Val

100 105 110

Ile Cys Ile Leu Ser Val Leu Gly Ile Leu Gly Thr Val Phe Ala Ile

115 120 125

Asn Arg Asn Ile Ser Asn Gln Tyr Ile His Glu

130 135

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagaat gctaataagc gtgaccaacg c 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtacccc ctcgtgaata tactgattcg 30

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcgtcaaa ttcctcttgt cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgtgaata tactgattcg 20

Claims

1.植物细胞高尔基体特异标记，其特征在于：所述植物细胞高尔基体特异标记为RxLR132^aa21-158基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的植物细胞高尔基体特异标记，其特征在于，通过以下方法得到：从葡萄霜霉菌cDNA中克隆RxLR132^aa21-158基因的编码区域，并转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行DNA测序。

3.根据权利要求2所述的植物细胞高尔基体特异标记，其特征在于，克隆所述RxLR132^aa21-158基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的植物细胞高尔基体特异标记编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.权利要求1-3任一项所述的植物细胞高尔基体特异标记在植物高尔基体荧光检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，具体应用为：将所述的RxLR132^aa21-158基因与荧光报告基因融合，得到融合基因；将所述融合基因导入表达载体，得到重组载体；将所述重组载体转化到宿主中，得到转化体；所述转化体转化到目标植物中，用于标记高尔基体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的荧光报告基因包括GFP、YFP、BFP、CFP、RFP、mCherry、mStrawberry、mTangerine、mBanana或mOrange。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的表达载体包括pBI121。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的宿主包括大肠杆菌或农杆菌。