ES2320969T3 - Plantas transgenicas que expresan la toxina de photorhabdus. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado de SEQ ID Nº 3.

Description

Plantas transgénicas que expresan la toxina de Photorhabdus.

Antecedentes de la invención

Como se informó en el documento WO98/08932, se ha demostrado que las toxinas proteicas del género Photorhabdus tienen toxicidad oral contra insectos. Se ha demostrado que el complejo de toxina producido por Photorhabdus luminescens (W-14), por ejemplo, contiene de diez a catorce proteínas, y se sabe que éstas se producen mediante la expresión de genes de cuatro regiones genómicas diferentes: tca, tcb, tcc, y tcd. El documento WO98/08932 describe las secuencias nucleotídicas de los genes de la toxina nativa.

De las diferentes toxinas aisladas a partir de Photorhabdus luminescens (W-14), las designadas Toxina A y Toxina B son especialmente potentes contra especies de insectos de interés, por ejemplo el gusano de la raíz del maíz. La Toxina A está compuesta de dos subunidades diferentes. El gen nativo tcdA (SEQ ID Nº:1) codifica la protoxina TcdA (véase la SEQ ID Nº:1). Tal como se determinó mediante espectrometría de masas, TcdA es procesada por una o más proteasas para proporcionar la Toxina A. Más específicamente, TcdA es una proteína de aproximadamente 282,9 kDA (2516 aa) que se procesa para proporcionar TcdAii, una proteína de aproximadamente 208,2 kDA (1849 aa) codificada por los nucleótidos 265-5811 de SEQ ID Nº:1, y TcdAiii, una proteína de aproximadamente 63,5 kDA (579 aa) codificada por los nucleótidos 5812-7551 de SEQ ID Nº:1.

La Toxina B está compuesta de forma similar por dos subunidades diferentes. El gen nativo tcbA (SEQ ID Nº:2) codifica la protoxina TcbA (véase la SEQ ID Nº:2). Tal como se determinó mediante espectrometría de masas, TcbA es procesada por una o más proteasas para proporcionar la Toxina B. Más específicamente, TcbA es una proteína de aproximadamente 280,6 kDA (2504 aa) que se procesa para proporcionar TcbAii, una proteína de aproximadamente 207,7 kDA (1844 aa) codificada por los nucleótidos 262-5793 de SEQ ID Nº:2 y TcbAiii, una proteína de aproximadamente 62,9 kDA (573 aa) codificada por los nucleótidos 5794-7512 de SEQ ID Nº:2. Los genes nativos tcdA y tcbA no son adecuados para una expresión de nivel elevado en plantas. Codifican múltiples secuencias de desestabilización, sitios de corte y empalme del ARNm, sitios de adición de poliA y otros motivos de secuencias posiblemente perjudiciales. Además, las composiciones de los códones no son como las de los genes vegetales. El documento WO98/08932 proporciona consejos generales sobre cómo se podrían modificar los genes de las toxinas para expresarlos de forma más eficaz en el citoplasma de las plantas, y describe cómo se pueden transformar las plantas para que incorporen los genes de las toxinas de Photorhabdus en sus genomas.

El documento WO97/13402 describe secuencias de ADN sintéticas que están optimizadas para la expresión en plantas, en particular maíz, y que codifican una proteína de Bacillus thuringiensis que es tóxica para insectos específicos, junto con métodos para la introducción de cualquier gen insecticida sintético en el maíz.

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Compendio de la invención

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado de SEQ ID Nº 3. En el segundo y tercer aspectos de la presente invención, se proporciona una célula monocotiledónea transgénica y una célula dicotiledónea transgénica que tienen un genoma que comprende la SEQ ID Nº 3. En un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una planta transgénica con un genoma que comprende un ácido nucleico de SEQ ID Nº 3 que confiere resistencia a insectos. Preferiblemente, el genoma de la célula o de la planta comprende además la SEQ ID Nº 4. La planta es preferiblemente arroz, maíz o tabaco.

En una realización preferida, la invención proporciona secuencias polinucleotídicas nuevas que codifican TcdA. La memoria descriptiva también describe secuencias polinucleotídicas que codifican TcbA. Las secuencias nuevas tienen composiciones de bases que difieren sustancialmente de los genes nativos, que las hacen más parecidas a los genes vegetales. Las secuencias nuevas son adecuadas para el uso en una expresión elevada tanto en monocotiledóneas como dicotiledóneas, y esta característica se designa refiriéndose a las secuencias como los criterios "hemicotiledóneos", que se exponen con detalle más adelante. Otras características importantes de las secuencias son que se han eliminado las secuencias potencialmente perjudiciales, y que se han construido sitios de restricción únicos para permitir la adición o el cambio de los elementos de expresión, las señales de transporte a orgánulos, los sitios modificados para proteasas y similares, si se desea.

En una realización particularmente preferida, la invención proporciona secuencias polinucleotídicas que satisfacen los criterios hemicotiledóneos y que comprenden una secuencia que codifica una señal para el transporte al retículo endoplásmico o una secuencia de transporte similar para un orgánulo celular en combinación con una secuencia que codifica TcdA.

La invención también proporciona plantas transgénicas con genomas que comprenden una secuencia nueva de la reivindicación 1 que confiere una actividad funcional contra los insectos.

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Breve descripción de las secuencias

SEQ ID Nº 1 es la secuencia de ADN de tcdA nativa junto con la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente para TcdA.

SEQ ID Nº 2 es la secuencia de ADN de tcbA nativa junto con la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente para TcbA.

SEQ ID Nº 3 es una secuencia artificial que codifica TcdA que es adecuada para la expresión en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

SEQ ID Nº 4 es una secuencia artificial que codifica TcbA que es adecuada para la expresión en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

SEQ ID Nº 5 es una secuencia hemicotiledónea artificial que codifica el péptido señal del RE de 21 aminoácidos de la zeína de 15 kDa del maíz dulce mexicano negro.

SEQ ID Nº 6 es una secuencia hemicotiledónea artificial que codifica la proteína TcdA nativa de tamaño completo (aminoácidos 22-2537) fusionada al péptido señal del retículo endoplásmico de la zeína de 15 kDa (aminoácidos 1-21).

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Descripción detallada

Las toxinas de Photorhabdus nativas son complejos proteicos que se producen y se secretan en las células bacterianas en crecimiento del género Photorhabdus. Son de interés particular las proteínas producidas por la especie Photorhabdus luminescens. Los complejos proteicos tienen un tamaño molecular de aproximadamente 1.000 kDa, y se pueden separar mediante análisis en gel de SDS-PAGE en las numerosas proteínas que los componen. Las toxinas no contienen actividades de hemolisina, lipasa, fosfolipasa de tipo C o nucleasa. Las toxinas exhiben una toxicidad significativa tras la ingestión por parte de varios insectos.

Una característica única de Photorhabdus es su bioluminiscencia. Photorhabdus se puede aislar a partir de una diversidad de fuentes. Una de dichas fuentes son los nematodos, más en particular los nematodos del género Heterorhabditis. Otra de dichas fuentes son las muestras clínicas humanas de heridas, véase Farmer et al. 1989 J. Clin. Microbiol. 27 págs. 1594-1600. Estas cepas saprofitas están depositadas en la American Type Culture Collection (Rockville, MD), ATCC nºs 43948, 43949, 43950, 43951, y 43952, y se incorporan en la presente memoria como referencia. Es posible que otras fuentes pudieran albergar bacterias Photorhabdus que produzcan toxinas insecticidas. Tales fuentes del medio ambiente podrían ser terrestres o acuáticas.

El género Photorhabdus se define taxonómicamente como un miembro de la familia Enterobacteriaceae, aunque tienen ciertos rasgos atípicos para esta familia. Por ejemplo, las cepas de este género son negativas para la reducción de nitrato, producen pigmentos amarillos y rojos y son bioluminiscentes. Este último rasgo es desconocido por otra parte en las Enterobacteriaceae. Photorhabdus se ha descrito recientemente como un género distinto de Xenorhabdus (Boemare et al., 1993 Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 249-255). Esta diferenciación se basa en estudios de hibridación de ADN-ADN, diferencias fenotípicas (p.ej., presencia (Photorhabdus) o ausencia (Xenorhabdus) de catalasa y bioluminiscencia) y la familia del hospedador nematodo (Xenorhabdus; Steinernematidae, Photorhabdus; Heterorhabditidae). Los análisis de ácidos grasos celulares comparativos (Janse et al. 1990, Lett. Appl. Microbiol 10, 131-135; Suzuki et al. 1990, J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 393-401) apoyan la separación de Photorhabdus de
Xenorhabdus.

Actualmente, el género bacteriano Photorhabdus está compuesto de una única especie definida, Photorhabdus luminescens (cepa de la ATCC nº 29999, Poinar et al., 1977, Nematologica 23, 97-102). Se ha descrito una diversidad de cepas relacionadas en la bibliografía (p.ej., Akhurst et al. 1988 J. Gen. Microbiol., 134, 1835-1845; Boemare et al. 1993 Int. J. Syst. Bacteriol., 43, págs. 249-255; Putz et al. 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56, 181-
186).

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Se han depositado las siguientes cepas de Photorhabdus productoras de toxinas:

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Todas las cepas se depositaron de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest. Las cepas que tienen números de acceso precedidos por "ATCC" se depositaron en la fecha indicada en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU. Las cepas precedidas por "NRRL" se depositaron en la fecha indicada en la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), National Center for Agricultural Utilization Research, ARS-USDA, 1815 North University St., Peoria IL 61604, EE.UU.

Varias expresiones que se usan en la presente memoria tienen un significado particular, y se definen como
sigue:

"Actividad funcional" significa en la presente memoria que las toxinas proteicas funcionan como agentes de control de insectos ya que las proteínas son activas de forma oral, o tienen un efecto tóxico, o son capaces de interrumpir o impedir la alimentación, lo cual puede o no provocar la muerte del insecto. Cuando un insecto entra en contacto con una cantidad eficaz de toxina administrada por medio de la expresión en una planta transgénica, composiciones proteicas formuladas, composiciones proteicas pulverizables, una matriz de cebo u otro sistema de administración, los resultados son generalmente la muerte del insecto, o que los insectos no se alimenten de la fuente que produce las toxinas para los insectos.

"Homólogo" significa una secuencia de aminoácidos que se identifica que posee homología respecto de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de toxina de Photorhabdus de referencia.

"Homología" significa una secuencia de aminoácidos que tiene un índice de similitud de al menos el 33% y/o un índice de identidad de al menos el 26% respecto de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de toxina de Photorhabdus de referencia, tal como se calcula mediante el algoritmo GAP con el uso de la matriz de puntuación de proteínas B10sum 62 del Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group GCG, Madison,
WI.

"Identidad" significa una secuencia de aminoácidos que contiene un residuo idéntico en una posición dada, tras la alineación con una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de toxina de Photorhabdus de referencia mediante el algoritmo GAP.

El uso de la expresión "toxina de Photorhabdus" se refiere a cualquier proteína producida por una cepa del microorganismo Photorhabdus que tiene actividad funcional contra insectos, en el que la toxina de Photorhabdus se podría formular como una composición pulverizable, expresar por una planta transgénica, formular como una matriz de cebo, administrar por medio de un baculovirus, o administrar mediante cualquier otro hospedador o sistema de administración aplicable.

El uso del término "tóxico" o "toxicidad", como se usa en la presente memoria, se refiere a que las toxinas producidas por Photorhabdus tienen "actividad funcional" como se define en la presente memoria.

"Homología sustancial de secuencias" significa: un fragmento de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos suficientemente similar a otro fragmento de ADN para producir una proteína que tiene propiedades bioquímicas similares; o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a otro polipéptido para exhibir propiedades bioquímicas similares.

Como ocurre con otras toxinas bacterianas, la tasa de mutación de las bacterias en una población provoca que existan muchas toxinas relacionadas ligeramente diferentes en su secuencia. Las toxinas de interés en la presente memoria son aquellas que producen complejos proteicos tóxicos para una diversidad de insectos tras la exposición, como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, las toxinas son activas contra Lepidoptera, Coleoptera, Homopotera, Diptera, Hymenoptera, Dictyoptera y Acarina. La invención de la presente memoria pretende abarcar las toxinas proteicas homólogas a las toxinas proteicas producidas por las cepas de la presente memoria y cualquier cepa derivada de las mismas, así como cualquier toxina proteica producida por Photorhabdus. Estas proteínas homólogas pueden diferir en la secuencia, pero no difieren en la función de las toxinas descritas en la presente memoria. Las toxinas homólogas pretenden incluir los complejos proteicos de entre 300 kDa y 2.000 kDa, y están compuestas de al menos dos subunidades, en las que una subunidad es un péptido que puede o no ser igual que la otra subunidad. Se han identificado diversas subunidades proteicas y se enseñan en los Ejemplos de la presente memoria. En general, las subunidades proteicas son de entre alrededor de 18 kDa a alrededor de 230 kDa; entre alrededor de 160 kDa a alrededor de 230 kDa; 100 kDa a 160 kDa; alrededor de 80 kDa a alrededor de 100 kDa; y alrededor de 50 kDa a alrededor de 80 kDa.

Como se discutió anteriormente, algunas cepas de Photorhabdus se pueden aislar de nematodos. Algunos nematodos, gusanos parásitos cilíndricos elongados del filo Nematoda, han desarrollado la capacidad de aprovechar las larvas de insectos como su medio de crecimiento preferido. Las larvas de insectos proporcionan una fuente de alimentos para los nematodos en crecimiento y un medio en el que reproducirse. Un efecto drástico tras la invasión de las larvas por ciertos nematodos es la muerte larval. La muerte larval resulta de la presencia, en ciertos nematodos, de bacterias que producen una toxina insecticida que detiene el crecimiento larval y que inhibe la actividad de alimenta-
ción.

De forma interesante, parece que cada género de nematodo parásito de insecto alberga una especie particular de bacteria, adaptada exclusivamente para el crecimiento simbiótico con ese nematodo. Desde que esta investigación se inició, el nombre del género bacteriano Xenorhabdus se reclasificó en Xenorhabdus y Photorhabdus. Las bacterias del género Photorhabdus se caracterizan por ser simbiontes de los nematodos Heterorhabditus, mientras las especies de Xenorhabdus son simbiontes de la especie Steinernema. Este cambio de nomenclatura se refleja en esta memoria descriptiva, pero el cambio de nomenclatura no debería alterar el alcance de las invenciones descritas en la presente memoria de ninguna manera.

Los péptidos y los genes que se describen en la presente memoria se nombran según las directrices publicadas recientemente en Journal of Bacteriology "Instructions to Authors" p. i-xii, enero de 1996), que se incorpora en la presente memoria como referencia.

Los métodos de transformación útiles para llevar a cabo la invención se conocen bien y se describen, por ejemplo, en el documento WO98/08932.

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tcdA y tcbA hemicotiledóneos

SEQ ID Nº 3 es la secuencia de nucleótidos de un gen tcdA modificado de acuerdo con la invención. SEQ ID Nº 4 es la secuencia de nucleótidos de un gen tcbA modificado.

Las Tablas 1 y 2 siguientes identifican características significativas de los genes tcdA y tcbA modificados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 tcdA

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TABLA 2 tcbA

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Se debería indicar que las proteínas codificadas por tcdA (SEQ ID Nº:3) y tcbA (SEQ ID Nº:4) optimizados para plantas difieren de las proteínas nativas por la adición de un residuo de Ala en la posición nº 2. Esta modificación se hizo para acomodar el sitio NcoI que abarca el codón de inicio ATG.

La Tabla 3 siguiente compara la composición de códones del gen tcdA modificado de SEQ ID Nº:3 y el gen tcbA modificado de SEQ ID Nº:4 con las composiciones de códones de los genes nativos, los genes dicotiledóneos típicos, y los genes de maíz.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

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Ejemplo 1

Diseño de Genes Adaptados a los Códones Vegetales que Codifican los Péptidos de W-14 TcbA y TcdA A. Diseño de genes

Se examinaron las cadenas codificantes de las secuencias de ADN nativas de los genes de Photorhabdus W-14 que codifican los péptidos TcbA y TcdA en busca de la presencia de secuencias perjudiciales tales como el motivo desestabilizante del ARN de Shaw/Kamen ATTTA, sitios de reconocimiento de corte y empalme de intrones, y motivos de adición de poli A. Esto se llevó a cabo mediante el uso del soporte informático de análisis de secuencias MacVector (Oxford Molecular Biology Group, Symantec Corp.), con el uso de un archivo de subsecuencias de ácidos nucleicos personalizado. También se buscaron en la secuencia nativa sucesiones de 4 o más bases iguales.

La búsqueda de motivos en los genes tcbA y tcdA nativos de W-14 reveló la presencia de muchas secuencias potencialmente perjudiciales en las cadenas codificantes de las proteínas, tal como se resume en la Tabla 4. También había presentes, aunque no se muestran, muchas sucesiones de cuatro o más residuos individuales (p.ej., el gen tcbA nativo tiene 81 sucesiones de cuatro As).

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TABLA 4

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Los análisis de los genes eucarióticos y de los genes vegetales en particular han demostrado que los dobletes CG y TA están poco representados, mientras los genes están enriquecidos en dobletes CT y TG. Las secuencias de los genes adaptados a los criterios hemicotiledóneos se han ajustado por lo tanto para que abarquen estas composiciones de bases y para que tengan composiciones de G+C de alrededor del 53%, de forma similar a muchos genes vegetales. Cuando se comparan respecto de los genes tcbA y tcdA nativos de W-14, los genes adaptados a plantas tienen una distribución de G+C mucho más uniforme.

Los cambios de nucleótidos para eliminar las secuencias potencialmente perjudiciales se eligieron para ajustar simultáneamente la composición de códones de la región codificante para reflejar más fielmente la de los genes vegetales. Se proporcionó una estructura básica para estos cambios mediante las tablas de adaptación de códones preparadas para los genes de maíz y de dicotiledóneas mostradas en la Tabla 3.

La comparación de las composiciones de los códones de los genes nativos de W-14 respecto de los genes de maíz y de dicotiledóneas reveló que los genes de W-14 contienen un grupo de códones degenerados con preferencias muy diferentes para los 18 aminoácidos para los que hay elección (Tabla 3). Para cada uno de 8 aminoácidos (Phe, Tyr, Cys, Arg, Asn, Lys, Glu, y Gly) en ambos genes de W-14, el codon más abundante es diferente de los códones preferidos hallados en los genes de maíz o de dicotiledóneas. Sería de esperar que se hallasen dificultades traduccionales en los intentos de producir en plantas proteínas (tales como TcbA y TcdA) que tengan cantidades relativamente elevadas de estos aminoácidos a partir de ARNms que tengan un número elevado de códones no preferidos. Existe una diferencia notable en la distribución de las composiciones de códones que especifican los otros 10 aminoácidos. Para His, Gln, Ile, Val, y Asp, los códones preferidos en dicotiledóneas son los más abundantes en ambos genes de W-14. Para Leu, Thr, Ser, y Ala, los códones preferidos en maíz son las elecciones de códones más abundantes hallados en el gen tcdA. En contraste, el gen tcbA contiene solamente el codon preferido en maíz CCG (Pro) como la elección más abundante.

Al elegir los códones, se consideraron los contenidos de dobletes, de forma que los códones adyacentes preferiblemente no formaron dobletes CG o TA (que están poco representados en los genes eucarióticos; 1, 4), mientras los dobletes CT o TG (que están enriquecidos en los genes eucarióticos ibídem) se crearon cuando fue posible.

También se eligió utilizar una diversidad de códones para Met, Trp, Asn, Asp, Cys, Glu, His, Ile, Lys, Phe, Thr, y Tyr.

La secuencias se diseñaron también para que codificasen sitios de reconocimiento de 6 pb únicos para enzimas de restricción, espaciados aproximadamente cada 1200 pb. Finalmente, se insertó un codón adicional (GCT; Ala) en la segunda posición para codificar un sitio de reconocimiento de Nco I que abarcaba el codon de inicio ATG (Met). Se incluyeron sitios de reconocimiento adicionales tras el codon de parada para facilitar las etapas de clonación posteriores en vectores de expresión. Estas características se exponen anteriormente en las Tablas 1 y 2.

Los genes tcdA y tcbA nuevos de SEQ ID Nº:3 y SEQ ID Nº:4 comparten un 73,5% y un 72,6% de identidad, respectivamente, con sus homólogos nativos de W-14 (Wisconsin Genetics Computer Group, algoritmo GAP).

B. Síntesis de Genes

Se llevó a cabo la síntesis completa de los genes tcbA y tcdA adaptados a los códones vegetales bajo contrato con Operon Technologies, Inc. (OPTI, Alameda, CA). Básicamente, los oligonucleótidos sintetizados químicamente de la secuencia apropiada se ensamblaron en fragmentos de ADN de una longitud aproximada de 500 bases. Estos se unieron entre sí (probablemente por medio de sitios para enzimas de restricción colocados de forma apropiada) en cuatro fragmentos mayores de aproximadamente 2 kilo-pares de bases (kpb) cada uno; por lo tanto, cada uno consistía en aproximadamente 1/4 de la región codificante completa del gen particular. La secuencia de ADN de los fragmentos se confirmó en esta etapa. Si existían errores en la secuencia, se volvían a sintetizar los oligonucleótidos apropiados, y se repetía el proceso de ensamblaje. Una vez que se verificó la secuencia de las partes fraccionarias del gen, se ensamblaron por parejas para producir las mitades del gen, y se verificó la secuencia de nuevo. Finalmente, se unieron las dos mitades, y se verificaron las secuencias de las uniones entre las mitades. Por lo tanto, se verificó la secuencia de cada parte del nuevo gen al menos dos veces.

Se debería indicar que los intentos de expresar los genes tcbA o tcdA nativos en cepas de clonación de Escherichia coli estándar indican que la producción de estas proteínas es letal. Se pueden encontrar problemas de letalidad si se usan vectores de clonación estándar que tienen una expresión residual de promotores lacZ inherentes para ensamblar estos genes.

C. Adición de un Péptido de Transporte al Retículo Endoplásmico a la Región Codificante de TcdA

Los expertos en el campo de la expresión genética vegetal saben que las proteínas se dirigen específicamente hacia el retículo endoplásmico (RE) por medio de un péptido señal corto que se elimina durante o después del proceso de transporte a través de la membrana del RE. La proteína madura (procesada) se incorpora en la endomembrana del RE o se libera en el interior del RE, en donde la proteína transportada se puede plegar de una manera exclusiva (ayudada por las chaperoninas), modificar mediante glicosilación, acumular en la vacuola, o translocar adicionalmente (mediante secreción). Estos procesos los revisan Gomord y Faye [V. Gomord y L. Faye, (1996) Signals and mechanisms involved in intracellular transport of secreted proteins in plants. Plant Physiol. Biochem. 34:165-181] y Bar-Peled et al. [M. Bar-Peled, D. C. Bassham, y N. V. Raikhel, (1996) Transport of proteins in eukaryotic cells: more questions ahead. Plant Molec. Biology 32:223-249]. También se sabe que los mecanismos de reconocimiento subcelulares para un péptido señal del RE están conservados evolutivamente en cierta medida, ya que la señal del RE para una proteína producida normalmente en células monocotiledóneas (maíz) se reconoce y se procesa normalmente en las células dicotiledóneas (tabaco). Esto se ejemplifica mediante el péptido señal del RE de la zeína de 15 kDa del maíz [L. M. Hoffman, D. D. Donaldson, R. Bookland, K. Rashka, y E. M. Herman, (1987) Synthesis and protein body deposition of maize 15-kd zein in transgenic tobacco seeds. EMBO J. 6:3213-3221, y pat. de EE.UU. nº 5589616]. Además, se sabe que el péptido señal del RE derivado de una proteína puede dirigir la translocación de una proteína diferente si se une de manera apropiada a la segunda proteína mediante métodos de ingeniería genética [D. C. Hunt y M. J. Chrispeels, (1991) The signal peptide of a vacuolar protein is necessary and sufficient for the efficient secretion of a cytosolic protein. Plant Physiol. 96:18-25, y Denecke, J., J. Botterman, y R. Deblaere (1990) Protein secretion in plants can occur via a default pathway. Plant Cell 2:51-59]. Por lo tanto, se puede exponer a una proteína in vivo a diferentes medios bioquímicos dirigiendo su acumulación en el citosol (al no proporcionar una secuencia de péptido señal), o en el RE/vacuola (mediante la provisión de un péptido señal apropiado).

Se sabe que el péptido señal del RE de las proteínas zeína de 15 kDa del maíz comprende los primeros 20 aminoácidos codificados por la región codificante de la zeína. Dos ejemplos de tales péptidos señal son el péptido señal del RE de la zeína de 15 kDa de maíz A5707, nº de acceso del NCBI M72708, y el péptido señal del RE de la zeína de 15 kDa del maíz dulce mexicano negro, nº de acceso del NCBI M13507. Hay una diferencia de únicamente un aminoácido (Ser y Cys en el residuo 17) entre estos péptidos señal.

SEQ ID Nº:5 es una secuencia modificada que codifica el péptido señal del RE de la zeína de 15 kDa del maíz dulce mexicano negro. Las modificaciones realizadas en esta secuencia se hicieron para acomodar los diferentes usos de códones monocotiledóneos/dicotiledóneos y otras consideraciones relacionadas con los motivos de las secuencias discutidas anteriormente en el diseño de la región codificante de tcdA optimizada para plantas. La secuencia incluye un residuo de Ala adicional en la posición nº 2 para acomodar el sitio NcoI que abarca el codón de inicio ATG.

SEQ ID NO:6 proporciona una secuencia que codifica la proteína TcdA nativa de tamaño completo (aminoácidos 22-2537) fusionada al péptido señal del retículo endoplásmico de zeína de 15 kDa modificado (aminoácidos 1-21).

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Ejemplo 2

Transformación de Tabaco con Agrobacterium que Porta el Plásmido pDAB2041 que Codifica Toxinas de Photorhabdus A. Plásmido pDAB2041

La preparación de vectores de transformación de tabaco se llevó a cabo en tres etapas. Primero, se ligó una región codificante de tcdA optimizada para plantas modificada en un plásmido de casete de expresión en plantas de tabaco. En esta etapa, la región codificante se colocó bajo el control transcripcional de un promotor funcional en células vegetales de tabaco. La terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARN estuvieron mediadas por una copia en posición 3' de la región terminadora del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium. Dos plásmidos diseñados para funcionar de esta manera son pDAB1507 y pDAB2006. En la segunda etapa, el gen completo compuesto del promotor, la región codificante, y la región terminadora se ligó entre los extremos del T-ADN de un vector binario de Agrobacterium, pDAB1542. También estaba colocado entre los extremos del T-ADN un gen marcador seleccionable en plantas para permitir la selección de las células vegetales de tabaco transformadas. En la tercera etapa, el plásmido de vector binario modificado se conjugó desde su cepa hospedadora de E. coli en una cepa de Agrobacterium tumefaciens atenuada capaz de transformar las células vegetales de tabaco que se regeneran en plantas transgénicas fértiles.

Una característica del plásmido pDAB1507 es que cualquier región codificante que tenga un sitio NcoI en su extremo 5' y un sitio SacI en 3' respecto de la región codificante, cuando se clona en los únicos sitios NcoI y SacI de pDAB1507, se coloca bajo el control transcripcional de una versión potenciada del promotor de 35S de CaMV. También es una característica de pDAB1507 que la secuencia líder sin traducir (UTR) de 5' que precede al sitio NcoI comprende una versión modificada de la UTR de 5' del gen de la proteína de la envoltura de MSV, en la que se ha clonado una versión delecionada internamente del intrón 1 de Adh1S de maíz. Además, una característica de pDAB1507 es que la terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARNm que contiene la región codificante introducida están mediadas por las secuencias de terminación/adición de poli A derivadas del gen de nopalina sintasa (Nos). Finalmente, una característica de pDAB1507 es que el ensamblaje completo del promotor/región codificante/3'UTR se puede obtener en forma de un único fragmento de ADN mediante escisión en los sitios NotI
flanqueantes.

Una característica del plásmido pDAB2006 es que cualquier región codificante que tenga un sitio NcoI en su extremo 5' y un sitio SacI en 3' respecto de la región codificante, cuando se clona en los únicos sitios NcoI y SacI de pDAB2006, se coloca bajo el control transcripcional del promotor de 35S de CaMV. También es una característica de pDAB2006 que la secuencia líder sin traducir (UTR) de 5' que precede al sitio NcoI comprende un poliligador. Además, una característica de pDAB2006 es que la terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARNm que contiene la región codificante introducida están mediadas por las secuencias de terminación/adición de poli A derivadas del gen de nopalina sintasa (Nos). Finalmente, una característica de pDAB2006 es que el ensamblaje completo del promotor/región codificante/3'UTR se puede obtener en forma de un único fragmento de ADN mediante escisión en los sitios NotI flanqueantes.

Una característica del plásmido pDAB1542 es que cualquier fragmento de ADN flanqueado por sitios NotI se puede clonar en el único sitio NotI de pDAB1542, por lo que se coloca así el fragmento introducido entre los extremos del T-ADN, y adyacente al gen de neomicina fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina). Para preparar un gen expresable en plantas para producir la proteína TcdA sin señalización en células vegetales de tabaco, se escindió el ADN de un plásmido (pAOH_4-OPTI) que contenía la región codificante de tcdA optimizada para plantas, (SEQ ID Nº:3) con las enzimas de restricción NcoI y SacI, y se ligó el fragmento grande de 7550 pb con el ADN cortado de manera similar del plásmido pDAB1507 para producir el plásmido pDAB2040. El ADN de pDAB2040 se digirió después con NotI, y el fragmento de 8884 pb se ligó con ADN digerido con NotI de pDAB1542 para producir el plásmido pDAB2041. Este plásmido se conjugó después mediante conjugación triparental [Firoozabady, E., D. L. DeBoer, D. J. Merlo, E. L. Halk, L. N. Amerson, K. E. Rashka, y E. E. Murray (1987) Transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants. Plant Molec. Biol. 10:105-116] desde la cepa hospedadora de Escherichia coli (XL1-Blue, Stratagene, La Jolla, CA), en la cepa no oncógena de Agrobacterium tumefaciens EHA101S, que es un mutante resistente a estreptomicina espontáneo de la cepa EHA101 (Hood, E. E., G. L. Helmer, R. T. Fraley, y M.-D. Chilton (1986) The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA. J. Bacteriol. 168:1291-1301). Después se usó la cepa EHA101S (pDAB2041) para producir plantas de tabaco transgénicas que expresaban la proteína TcdA.

B. Plásmido pRK2013

Para preparar un gen expresable en plantas para producir la proteína TcdA dirigida al retículo endoplásmico en células vegetales de tabaco, se escindió el ADN de un plásmido (pA0H_4-ER) que contenía la región codificante de tcdA optimizada para plantas, dirigida al RE, (SEQ ID Nº:6) con las enzimas de restricción NcoI y SacI, y el fragmento grande de 7610 pb se ligó a ADN cortado de manera similar del plásmido pDAB2006 para producir el plásmido pDAB1833. El ADN de pDAB1833 se digirió después con NotI, y el fragmento de 8822 pb se ligó a ADN de pDAB1542 digerido con NotI para producir el plásmido pDAB2052. Este plásmido se conjugó después mediante conjugación triparental desde la cepa hospedadora de Escherichia coli (XL1-Blue), en la cepa no oncógena de Agrobacterium tumefaciens EHA101S. La cepa EHA101S (pDAB2052) se usó después para producir plantas de tabaco transgénicas que expresaban la proteína TcdA que contenía un péptido de transporte al retículo endoplásmico en el extremo aminoterminal.

C. Transferencia del Plásmido pDAB2041 a la Cepa de Agrobacterium EHA101S

Se cultivaron durante la noche cultivos de E. coli que portaba el plásmido Ti modificado pDAB2041 (plásmido que contiene el gen de la Toxina A reconstruido, tcdA), E. coli que portaba el plásmido pRK2013, y la cepa de Agrobacterium EHA101S, después se mezclaron 1:1:1 en medio LB simple solidificado con agar y se cultivaron en la oscuridad a 28ºC. Dos días después, el cultivo de bacterias se retiró con un asa, se suspendió en medio LB simple, se mezcló vorticialmente, y después se diluyó 1:10^{4}, 1:10^{5}, y 1:10^{6} veces en medio líquido LB simple. Se extendieron alícuotas de estas diluciones en placas selectivas que contenían medio YEP más eritromicina (100 mg/L) y estreptomicina (250 mg/L), y se cultivaron a 28ºC. Dos días más tarde, se recogieron colonias individuales y se sembraron en estrías en el mismo medio, y después se extendieron para proporcionar colonias individuales. Se recogieron colonias individuales de nuevo y se sembraron en estrías, y después se extendieron por colonias individuales. Se recogieron las colonias individuales por tercera vez, se cultivaron en forma de estrías, y después se sometieron a un análisis cualitativo que implicaba el cultivo en medio de lactosa y el ensayo cromogénico con reactivo de Benedict. De diez cepas reveladas de esta manera, se eligió la colonia de coloración más rápida para el trabajo posterior.

D. Transformación de Tabaco con Agrobacterium que Porta el Plásmido pDAB2041

La transformación de tabaco con Agrobacterium tumefaciens se llevó a cabo mediante un método similar, pero no idéntico, a los métodos publicados (R Horsch et al, 1988. Plant Molecular Biology Manual, S. Gelvin et al, eds., Kluwer Academic Publishers, Boston). Para proporcionar el tejido inicial para la transformación, las semillas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Kentucky 160) se esterilizaron superficialmente y se plantaron en la superficie de TOB-, que es un medio de Murashige y Skoog sin hormonas (T. Murashige y F. Skoog, 1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Plant Physiol. 75: 473-497) solidificado con agar. Las plantas se cultivaron durante 6-8 semanas en una sala incubadora iluminada a 28-30ºC y las hojas se recogieron de forma estéril para el uso en el protocolo de transformación. Se cortaron de forma estéril fragmentos de aproximadamente un cm^{2} de estas hojas, excluyendo el nervio central. Los cultivos de las cepas de Agrobacterium (EHA101S que contenía pDAB2041), que se habían cultivado durante la noche en un agitador rotatorio a 28ºC, se centrifugaron y se resuspendieron en medio con sales de Murashige y Skoog, ajustado a una densidad óptica final de 0,7 a 600 nm. Los fragmentos de hojas se sumergieron en esta suspensión bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, después se secaron con paños de papel estériles y se colocaron boca arriba en medio TOB+ (medio de Murashige y Skoog que contenía 1 mg/L de ácido indolacético y 2,5 mg/L de benciladenina) y se incubaron en la oscuridad a 28ºC. Dos días más tarde los fragmentos de hojas se cambiaron a medio TOB+ que contenía 250 mg/L de cefotaxima (Agri-Bio, North Miami, Florida) y 100 mg/L de sulfato de kanamicina (AgriBio) y se incubaron a 28-30ºC con luz. Los fragmentos de hojas se cambiaron a TOB+ nuevo con cefotaxima y kanamicina dos veces por semana durante las primeras dos semanas y una vez por semana posteriormente. Los fragmentos de hojas que mostraron un recrecimiento de la cepa de Agrobacterium se cambiaron a medio TOB+ con cefotaxima y kanamicina, más 100 mg/l de carbenicilina (Sigma). De cuatro a seis semanas después de tratar los fragmentos de hojas con las bacterias, las plantas pequeñas que surgían de los focos transformados se extrajeron de esta preparación de tejido y se plantaron en un medio TOB- que contenía 250 mg/L de cefotaxima y 100 mg/L de kanamicina en cajas GA7 de Magenta (Magenta Corp., Chicago). Estas plántulas se cultivaron en una sala incubadora iluminada. Después de 3-4 semanas las plantas transgénicas primarias habían arraigado y crecido hasta un tamaño suficiente para poder analizar la expresión de la proteína del transgén en las muestras de hojas. Se recuperaron veinticinco eventos transgénicos independientes en forma de plantas individuales de la transformación con pDAB2041.

Se propagaron in vitro a partir de fragmentos de hojas ocho líneas independientes que expresaban diversos niveles de proteína transgénica del T-ADN de pDAB2041 como sigue. Se cortaron de forma estéril de doce a dieciséis fragmentos de aproximadamente un cm^{2} de las hojas de cada planta transgénica primaria, excluyendo el nervio central y todos los bordes naturales. Estos fragmentos de hojas se colocaron en medio TOB+ que contenía 250 mg/L de cefotaxima y 100 mg/L de kanamicina, se cultivaron en el incubador iluminado a 28-30ºC durante 3-4 semanas, en cuyo momento se pudo cortar plantas pequeñas de la masa de tejido que se encontraba en proliferación. Varias plántulas pequeñas de cada línea transgénica se pasaron a cajas Magenta que contenían medio TOB- más cefotaxima y kanamicina, y se dejaron arraigar y crecer. La masa de tejido que se encontraba en proliferación se cultivó después en medio TOB+ con cefotaxima y kanamicina, y se pudo cortar plantas adicionales y cultivarlas según fue necesario.

Las plantas se trasladaron al invernadero lavando el agar de las raíces, trasplantándolas en tierra en macetas de 35,5 cm^{2}, colocando la maceta en una bolsa Ziploc (DowBrands), colocando agua corriente en el fondo de la bolsa, y colocándola con una luz indirecta en un invernadero a 30ºC durante una semana. Se pudo abrir la bolsa después de una semana; las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer más, hasta que se aclimataron y se eliminó la bolsa. Las plantas se cultivaron en condiciones habituales de invernadero cálido (30ºC, 16 h de luz). Las plantas fueron adecuadas para la toma de muestras cuatro semanas tras el transplante.

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Ejemplo 3

Caracterización de las Plantas de Tabaco Transgénicas que Expresan la Toxina de Photorhabdus que Confiere Control de Insectos A. Producción de Anticuerpos Policlonales

La proteína TcdA recombinante producida por E. coli se purificó mediante una serie de purificaciones en columna. La proteína se envió a la Berkley Antibody Company (Richmond, CA) para la producción de antisuero en un conejo. Las inoculaciones con el antígeno se iniciaron con 0,5 mg de proteína, seguido de cuatro inyecciones de refuerzo de 0,25 mg cada una a intervalos de aproximadamente tres semanas. El suero de conejo se analizó mediante un análisis de Western estándar con el uso de la proteína TcdA recombinante como el antígeno y quimioluminiscencia amplificada, método ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). Los anticuerpos (PAb-EA_{0}) se purificaron mediante el uso de un equipo de purificación de anticuerpos PURE I (Sigma, St. Luis, MO). Los anticuerpos PAb-EA_{0} reconocen la TcdA de tamaño completo y sus componentes procesados.

B. Expresión de la Proteína TcdA en Tabaco

La proteína se extrajo del tejido foliar de las plantas de tabaco transformadas y sin trasformar siguiendo el procedimiento descrito inmediatamente a continuación.

Se recogieron dos discos foliares de 1,4 cm de diámetro de la parte media de una hoja completamente extendida. Los discos se colocaron en un fragmento de 1,6 x 4 cm de papel 3M Whatman. El papel se plegó a lo largo y se insertó en una paja flexible. Se pipetearon en el papel cuatrocientos microlitros de tampón de extracción (9,5 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M, 15,5 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M, 2 ml de Na_{2}EDTA 0,5 M, 100 ml de Triton X100, 1 ml de Sarcosil al 10%, 78 ml de beta-mercaptoetanol, H_{2}O para proporcionar un volumen total de 100 ml). La paja que contenía la muestra se pasó después a través de un dispositivo de rodillos usado para sacar el extracto. Se colocó un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en el otro extremo de la paja para recoger el extracto. El extracto se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 rpm en una microcentrífuga refrigerada Eppendorf. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Se llevó a cabo el análisis de cuantificación de proteínas mediante el uso del protocolo de análisis de proteínas de Bio-Rad estándar (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El extracto se diluyó hasta 2 mg/ml de proteína total mediante el uso del tampón de extracción.

Para la detección de la proteína transgénica, se llevó a cabo un análisis de transferencia de Western. Tras un procedimiento estándar para la separación de proteínas (Laemmli, 1970), se cargaron 40 \mug de proteína en cada pocillo de un gel de poliacrilamida en gradiente del 4-20% (Owl Scientific Co., MA) para la electroforesis. Posteriormente, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa mediante el uso de un aparato de electrotransferencia en modo semiseco (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). La membrana se incubó durante una hora en Blotto (disolución de un 5% de leche en TBST; Tris HCl 25 mM de pH 7,4, NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Tween 20). A continuación, se sustituyó el Blotto por la disolución de anticuerpo primario (en Blotto). Después de una hora en el anticuerpo primario, la membrana se lavó tres veces con TBST durante cinco minutos. Después se añadió el anticuerpo secundario en Blotto (dilución 1:2000 de IgG anti-conejo de cabra conjugado a peroxidasa de rábano; Bio-Rad Laboratories) a la membrana. Después de una hora de incubación, la membrana se lavó cuatro veces con una cantidad en exceso de TBST durante 10 minutos. La proteína se visualizó mediante el uso de quimioluminiscencia amplificada, método ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). La intensidad diferencial de las bandas de proteínas se midió mediante el uso de un densitómetro (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).

Para determinar la expresión de la proteína TcdA en tabaco transformado con pDAB2041, se usaron anticuerpos PAb-EA_{0} como los anticuerpos primarios. Los niveles de expresión de la proteína TcdA variaron entre los eventos de transformación independientes. La planta primaria generada a partir del evento nº 2041-13 mostró el nivel más elevado de expresión de pre-pro TcdA de proteína extraíble. Cuando se usaron los fragmentos de hojas de esta planta (nº 2041-13) en la propagación in vitro, se obtuvieron varias plantas. Se analizó la expresión de la proteína TcdA en siete de estas plantas. Todas las plantas excepto una produjeron la proteína TcdA de tamaño completo, así como algunos componentes peptídicos procesados. Mediante el uso de anticuerpos específicos hacia neomicina fosfotransferasa, NPT (5 prime-3 prime, Boulder, Co), se detectó la expresión del gen marcador seleccionable (npt II). Se obtuvieron resultados similares para el nº 2041-29.

TABLA 5 Análisis de Western de las plantas derivadas del evento nº 2041-13

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C. Análisis de Ácidos Nucleicos de las Líneas de Tabaco Transgénico

Se preparó del ADN genómico de un grupo de eventos transgénicos 2041. Las líneas incluyeron la 2041-13 de la etapa de caja Magenta, y las plantas de la etapa de invernadero 2041-13-1, 2041-13-2, 2041-13-5, 2041-9, 2041-20A y 2041-20B. Se incluyó una línea GUS transgénica (2023) como control negativo. Se llevó a cabo el análisis de Southern de estas líneas. El ADN genómico de tabaco se digirió con la enzima SstI, lo que debería dar como resultado un producto de hibridación de 8,9 kb cuando se hibrida con una sonda específica del gen tcdA. El producto de hibridación de 8,9 kb debería consistir en el promotor 35T y en la región codificante de tcdA. Todas las plantas 2041 contuvieron una banda del tamaño esperado. Los eventos 2041-9 y -20 parecen ser la misma línea con 5 bandas de hibridación idénticas. El evento 2041-13 produjo 6 seis fragmentos de hibridación con la sonda de la región codificante de tcdA. La planta de la caja Magenta y las diversas plantas de invernadero de 2041-13 produjeron todas el mismo perfil de hibridación. Este patrón de hibridación fue diferente del de los eventos 2041-9 y -20.

El análisis del ARN mediante el uso de la sonda de la región codificante de tcdA se llevó a cabo en el mismo grupo de plantas 2041 de invernadero. Los análisis de inmunotransferencia revelaron que las plantas 2041-9, 2041-20A, 2041-20B, y 2041-13-1 no produjeron proteína TcdA detectable; mientras 2041-13-2 y 2041-13-5 produjeron cantidades sustanciales de TcdA de tamaño completo. El análisis de Northern coincidió con el resultado de la inmunotransferencia. Se detectó una señal de ARN débil para las plantas 2041-9, 2041-20A, 2041-20B, y 2041-13-1. Una banda que correspondía al transcrito de tcdA de tamaño completo fue débilmente visible en la planta 2041-13.1. En contraste, para las plantas 2041-13-2 y 2041-13-5 se detectó una señal intensa de ARN, con una cantidad sustancial de transcrito de tcdA de tamaño completo (\sim8,0 kb). Estos datos apoyan la actividad observada en el bioensayo para este grupo de plantas.

Se preparó ADN genómico a partir un segundo evento transgénico 2041 funcionalmente activo, 2041-29. Se llevó a cabo el análisis de Southern de esta línea. Se incluyó una línea GUS transgénica (2023) como control negativo, y se incluyó el ADN de la línea 2041-9 como control positivo.

Los ADNs genómicos de tabaco se digirieron con la enzima SstI, lo que debería dar como resultado un producto de hibridación de 8,9 kb cuando se hibrida con una sonda específica del gen tcdA. El producto de hibridación de 8,9 kb debería consistir en el promotor de 35T y en la región codificante de tcdA. Para la planta 2041-29-5, se detectaron tres productos de hibridación mayores de 8,9 kb con la sonda específica del gen tcdA. El análisis de inmunotransferencia ha demostrado que esta planta produce la proteína pre-pro TcdA, y por lo tanto es probable que se perdiera un sitio de restricción durante la transformación o la regeneración, o el ADN genómico de 2041-29 no se digirió por
completo.

D. Ensayos de Discos Foliares de Tabaco con Gusano del Tabaco que Exhiben Control de Insectos

Se tomaron muestras de las hojas de plantas de tabaco, Nicotiana tabaco, trasplantadas previamente al invernadero. Se tomó una muestra de una única hoja de cada planta en cada fecha de ensayo. Las hojas se seleccionaron de la zona en la que las hojas alargadas más jóvenes pasan a ser hojas aovadas más viejas. Las hojas cortadas se colocaron en recipientes con una capacidad de 340 g con el peciolo sumergido en agua para mantener la turgencia, y se transportaron al laboratorio.

Se cortaron ocho discos de 1,4 cm de la parte central de un lado de cada hoja (lado adaxial derecho hacia arriba, con la parte distal alejada del observador). Cada disco se colocó individualmente en un pocillo de una bandeja de 128 pocillos C-D International (Pitman, NJ.) en el que se habían pipeteado previamente 0,5 ml de una disolución de agar acuoso del 1,6%. El agar solidificado evitó que los discos foliares se secasen. La superficie adaxial del disco se orientó siempre hacia arriba.

Se colocó un único gusano del tabaco, Manduca sexta, neonato en cada disco, y los pocillos se sellaron con tapas de plástico perforadas. El ensayo se mantuvo a 27ºC y un 40% de HR. La mortalidad larval y los datos de peso en vivo se recogieron después de 3 días. Los datos se sometieron a análisis de la varianza y a la prueba de rangos múltiples de Duncan (\alpha = 0,05) (Proc GLM, SAS Institute Inc., Cary, NC.). Los datos se transformaron mediante el uso de una función logarítmica para corregir la correlación entre la magnitud de la media y la varianza.

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TABLA 6 Resultados de los ensayos de discos foliares de plantas de tabaco cultivadas en invernadero con el evento 2041-13

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TABLA 7 Resultados de los Ensayos de Discos Foliares de Plantas de Tabaco Cultivadas en Invernadero con el Evento 2041-29

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Todas las plantas del evento 2041-29 redujeron significativamente el aumento de peso larval de THW en comparación con las plantas de control. La reducción media del peso fue de un 49%. Se produjo una mortalidad estadísticamente significativa en las larvas de THW expuestas a las hojas de las plantas 2041-29. La mortalidad promediada fue de un 37,5% en comparación con el 5,2% en los controles.

E. Aislamiento y Caracterización de la Proteína Toxina de Photorhabdus Funcional a Partir de Plantas Transgénicas

Se homogeneizaron siete gramos de plantas de tabaco transgénicas (2041-13) que expresaban el gen TcdA (Toxina A) con 10 ml de tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,0 mediante el uso de un Bead Beater (Biospec Products, Bartlesville, OK) según las instrucciones del fabricante. El homogeneizado se filtró a través de cuatro capas de gasa y después se centrifugó a 35.000 g durante 15 min. El sobrenadante se recogió y se filtró a través de una membrana Millipore Express^{TM} de 0,22 \mum. Después se aplicó a una columna Superdex 200 (2,6 \times 40 cm) que se había equilibrado con tampón Tris 20 mM, pH 8,0 (Tampón A). La proteína se eluyó con Tampón A a un caudal de 3 ml/min. Se recogieron fracciones de 3 ml cada una y se sometieron al bioensayo con gusano de la raíz del maíz del sur (SCR). Se descubrió que las fracciones que correspondían a un peso molecular nativo de alrededor de 860 kDa tuvieron la actividad insecticida más elevada. El análisis de Western de la fracción activa mediante el uso de un anticuerpo policlonal específico para la Toxina A indicó la presencia de un péptido TcdA de tamaño completo. Las fracciones activas se combinaron posteriormente y se aplicaron a una columna Mono Q 10/10 que se había equilibrado con Tampón A. Las proteínas unidas a la columna se eluyeron después mediante un gradiente lineal de NaCl 0 a 1 M en Tampón A. Se recogieron fracciones de 2 ml cada una y se analizaron mediante el bioensayo de SCR y Western con el uso de un anticuerpo específico hacia la Toxina A. Los resultados demostraron de nuevo la correlación entre la actividad insecticida y la presencia del péptido TcdA de tamaño completo.

F. Caracterización de la Progenie de Plantas Transgénicas

Se determinó la heredabilidad de las plantas modificadas genéticamente que contenían el gen de la toxina de Photorhabdus generando la progenie F1. La progenie se generó a partir del evento 2041-13 mediante la auto-polinización de las plantas con expresión positiva. Las plantas 2041-13 del invernadero se dejaron auto-polinizar. Las cápsulas de semillas se recogieron cuando estuvieron maduras y se dejaron secar y post-madurar adicionalmente en una mesa de laboratorio durante dos semanas. Las semillas de la planta designada 2041-13A se esterilizaron superficialmente y se distribuyeron sobre la superficie de medio TOB- sin selección, para permitir la recuperación de la progenie sin expresión o no transgénica, así como los hermanos transgénicos con expresión y segregación. Las semillas germinaron en una sala incubadora iluminada C (16 h de luz, 28ºC). Después de 1 mes, cincuenta y una plántulas, designadas 2041-13A-S1 a S51, se distribuyeron en cajas Magenta que contenían medio TOB- para que siguieran creciendo. Tres semanas más tarde, se enviaron muestras de hojas de estas plántulas cultivadas en cajas Magenta para la determinación del nivel de expresión de la toxina TcdA.

Se analizó la respuesta a kanamicina en las muestras de hojas colocando a la luz segmentos de hojas estériles en medio TOB+ que contenía 100 mg/L de kanamicina y puntuando el crecimiento del tejido y el color después de dos semanas. Todos los fragmentos de hojas mostraron cierta respuesta positiva, lo que indica la segregación del complejo.

Este grupo de plántulas de la progenie del evento 2041-13 cultivadas in vitro se trasplantaron al invernadero aproximadamente dos meses después de la siembra en el medio, mediante el uso del siguiente método. Después de lavar el agar de las raíces, las plantas se trasplantaron a macetas de 35,5 centímetros cuadrados con una mezcla de tierra que contenía un 75% de MetroMix y un 25% de tierra mineral. Se introdujeron en una bolsa con cierre de cremallera y se añadió agua corriente para dejar 2,5-5 centímetros de agua en el fondo de la bolsa tras la absorción en la tierra. Estas bolsas se cerraron y se colocaron bajo una carretilla en el invernadero para protegerlas de la luz directa del sol. Las bolsas se abrieron después de 5-6 días, y se retiraron después de 7 días, cuando las plantas se adaptaron a la tierra y se movieron a lo alto de la carretilla para el cultivo en invernadero normal. Las plantas estuvieron preparadas para someterlas a los bioensayos con insectos a las cuatro semanas tras el transplante.

La progenie F1 se analizó en busca de la expresión de toxina proteica mediante un cribado inmunológico y en busca de actividad biológica mediante bioensayos vegetales, como se describió previamente, mediante el uso del gusano del tabaco. Existió una correlación positiva entre los niveles de expresión de toxina proteica y el grado de inhibición del crecimiento, y a niveles de expresión mayores se observó mortalidad. Se observó que la actividad biológica tenía significación estadística con niveles de confianza elevados entre las poblaciones sin transformar y las transformadas que expresaban la toxina proteica.

La siguiente tabla resume los resultados de los bioensayos con insectos (gusano del tabaco) llevados a cabo con la progenie F1 de plantas 2041-13 auto-fertilizadas modificadas genéticamente para producir la toxina A "204". Los ensayos incluyeron 6 plantas de la progenie sin expresión (controles negativos para la proteína), 45 plantas que expresaban la toxina A, y 4 controles sin transformar (KY-160). Los resultados son de tres ensayos de discos foliares (método previamente resumido), en los que se usaron ocho discos por ensayo. Los datos se analizaron mediante el uso del análisis de la varianza, y se agruparon por ensayo.

El efecto del tratamiento para cada uno de estos análisis indicó que el Pr > F fue menor de 0,0001. Las plantas que expresaban la Toxina A produjeron un control significativo del gusano del tabaco en comparación con cada uno de los grupos de control, basándose en cada una de las tres medidas de la eficacia. Los dos grupos de control se comportaron de manera similar. El análisis estadístico mediante el uso de ANOVA y una prueba de LSD con alfa igual a 0,01 (o 1%) mostró diferencias entre los 3 grupos. La prueba de LSD indicó que las plantas sin expresión y sin transformar fueron similares en cuanto a los pesos de las larvas, pero las plantas con expresión proporcionaron pesos significativamente menores que cualquiera de los otros dos grupos de plantas. Estos datos demostraron que la base genética para el control de insectos fue heredable, y correspondió a la presencia del gen de la toxina expresada.

TABLA 8 Resultados con los gusanos del tabaco de la progenie F1 de plantas de tabaco 2041-13 auto-fertilizadas

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Ejemplo 4

Transformación de Maíz con un Vector que Porta el Plásmido pDAB1834 que Codifica Toxinas de Photorhabdus A. Preparación de Vectores de Transformación de Maíz que Contienen Regiones Codificantes de TcdA Optimizadas para Plantas Modificadas: Plásmido Pdab1834

La preparación de vectores de transformación de maíz se llevó a cabo en dos etapas. Primero, se ligó una región codificante de tcdA optimizada para plantas modificada en un plásmido de casete de expresión en plantas. En esta etapa, la región codificante se colocó bajo el control transcripcional de un promotor funcional en células vegetales de maíz. La terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARN estuvieron mediadas por una copia en posición 3' de la región terminadora del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium. Un plásmido diseñado para funcionar de esta manera es pDAB1538. En la segunda etapa, el gen completo compuesto del promotor, la región codificante, y la región terminadora de UTR de 3' se ligó en un vector de transformación de plantas que contenía un gen marcador seleccionable expresable en plantas que permitió la selección de células vegetales de maíz transformadas entre un contexto de células sin transformar. Un ejemplo de tal vector es pDAB367.

Una característica del plásmido pDAB1538 es que cualquier región codificante que tenga un sitio NcoI en su extremo 5' y un sitio SacI en 3' respecto de la región codificante, cuando se clona en los únicos sitios NcoI y SacI de pDAB1538, se coloca bajo el control transcripcional del promotor de ubiquitina1 (ubi1) de maíz. También es una característica de pDAB1538 que la secuencia líder sin traducir (UTR) de 5' que precede al sitio NcoI comprende un poliligador. Además, una característica de pDAB1538 es que la terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARNm que contiene la región codificante introducida están mediadas por las secuencias de terminación/adición de poli A derivadas del gen de nopalina sintasa (Nos). Finalmente, una característica de pDAB1538 es que el ensamblaje completo del promotor/región codificante/3'UTR se puede obtener en forma de un único fragmento de ADN mediante escisión en los sitios NotI flanqueantes.

Una característica de pDAB367 es que la proteína fosfinotricin-acetil transferasa, cuyo sustrato es fosfinotricina y los compuestos relacionados, se produce en las células vegetales por medio de la transcripción de su región codificante mediada por el promotor de 35S del virus del mosaico de la coliflor, y que la terminación de la transcripción más la poliadenilación están mediadas por la región terminadora de la nopalina sintasa. Una característica adicional de pDAB367 es que cualquier fragmento de ADN que contenga sitios NotI flanqueantes se puede clonar en el único sitio NotI de pDAB367, por lo que se une físicamente el fragmento de ADN introducido con el gen marcador seleccionable anteriormente mencionado.

Para preparar un gen expresable en plantas de maíz para producir la proteína TcdA dirigida al retículo endoplásmico en células vegetales, se escindió el ADN de un plásmido (pAOH_4-ER) que contenía la región codificante de tcdA optimizada para plantas, dirigida al RE (SEQ ID Nº:6) con las enzimas de restricción NcoI y SacI, y el fragmento grande de 7610 pb se ligó a ADN cortado de manera similar del plásmido pDAB1538 para producir el plásmido pDAB1832. El ADN de pDAB1832 se digirió con NotI, y el fragmento de NotI de 9984 pb se ligó en el único sitio NotI de pDAB367 para producir el plásmido pDAB1834.

Una característica de los plásmidos pDAB1834 es que los promotores de ubi1 y 35S están codificados en la misma cadena de ADN.

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B. Transformación y Regeneración de Aislamientos de Maíz Transgénicos

Se iniciaron cultivos de callos de tipo II a partir de embriones cigóticos inmaduros del genotipo "Hi-II." (Armstrong et al, (1991) Maize Genet. Coop. Newslett., 65: 92-93). Los embriones fueron aislados de espigas cultivadas en invernadero a partir de cruces entre padre Hi-II A y padre Hi-II B, ó embriones F_{2} derivados de una auto- o sib-polinización de una planta Hi-II. Se cultivaron los embriones inmaduros (de 1,5 a 3,5 mm) en medio de iniciación que consistía en sales N6 y vitaminas (Chu et al, (1978) The N6 medium and its application to another culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1,0 mg/L de 2,4-D, L-prolina 25 mM, 100 mg/L de hidrolizado de caseína, 10 mg/L de AgNO_{3}, 2,5 g/L de GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ), y 20 g/L de sacarosa, con un pH de 5,8. Después de cuatro a seis semanas, el callo fue subcultivado en medio de mantenimiento (medio de iniciación en el que se omitió el AgNO_{3} y la L-prolina se redujo a 6 mM). La selección del callo de tipo II tuvo lugar durante aprox. 12-16 semanas.

El plásmido pDAB1834 se transformó en el callo embriógeno. Para la detonación, se precipitaron 140 \mug de ADN plasmídico sobre 60 mg de partículas de oro esféricas empapadas con alcohol (1,5 - 3,0 \mum de diámetro, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) añadiendo 74 \muL de CaCl_{2} H_{2}O 2,5 M y 30 \muL de espermidina 0,1 M (base libre) a 300 \muL de ADN plasmídico y H_{2}O. Inmediatamente, se mezcló vorticialmente la disolución y se dejaron reposar las partículas de oro recubiertas de ADN. Se retiró el sobrenadante transparente resultante y se volvieron a suspender las partículas de oro en 1 ml de etanol absoluto. Esta suspensión se diluyó con etanol absoluto para obtener 15 mg de oro revestido de ADN/mL.

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Se extendieron aproximadamente 600 mg de tejido de callo embriógeno sobre la superficie de un medio de mantenimiento de callo de tipo II, tal y como se describe en la presente memoria, que carece de hidrolizado de caseína y de L-prolina, pero que está complementado con sorbitol 0,2 M y manitol 0,2 M como agente osmótico. Tras un pre-tratamiento de 4 h, el tejido se transfirió a placas de cultivo que contenían medio de detonación (medios osmóticos solidificados con 20 g/L de agar TC (PhytoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee Mission, KS) en vez de 7 g/L de GELRITE. La detonación con helio aceleró las partículas de oro en suspensión recubiertas de ADN hacia y dentro de las dianas de tejido preparadas. El dispositivo utilizado fue un prototipo anterior al descrito en la patente de EE.UU. nº 5.141.131, que se incorpora en la presente memoria como referencia. Se cubrieron los tejidos con una rejilla de acero inoxidable (aberturas de 104 \mum) y se colocaron en un vacío parcial de 635 mm de Hg en la cámara del dispositivo. Las partículas de oro recubiertas de ADN se diluyeron adicionalmente 1:1 con etanol absoluto antes de la detonación y se aceleraron en las dianas de callos cuatro veces mediante el uso de una presión de helio de 10,3x10^{6} Pa, dispensándose con cada detonación 20 \muL de la suspensión de ADN/oro. Inmediatamente después de la detonación, se transfirió el tejido a medio osmótico durante un periodo de recuperación de 16 a 24 horas. Después, el tejido se dividió en fragmentos pequeños y se transfirió a medio de selección (medio de mantenimiento que carece de hidrolizado de caseína y L-prolina pero que contiene 30 mg/L de BASTA® (AgrEvo, Berlín, Alemania)). Cada 4 semanas durante 3 meses, las piezas de tejido se transfirieron de manera no selectiva a un medio de selección nuevo. Después de 7 semanas y hasta las 22 semanas, se retiraron y se aislaron los sectores del callo que se encontraban en proliferación frente a un contexto de tejido con el crecimiento inhibido. El tejido resistente a BASTA®resultante se subcultivó bisemanalmente en medio de selección nuevo. Tras el análisis de Western, las líneas transgénicas positivas se identificaron y se transfirieron a medios de regeneración. Las líneas negativas en el análisis de Western se sometieron a un análisis posterior de transferencia en mancha de ARN para identificar los controles negativos para la
regeneración.

Se inició la regeneración transfiriendo tejido de callo a un medio de inducción a base de citocinas, que consistió en sales de Murashige y Skoog, de aquí en adelante, sales de MS, y vitaminas (Murashige y Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497), 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de manitol, 5 mg/L de 6-bencilaminopurina, de aquí en adelante BAP, 0,025 mg/L de 2,4-D, 30 mg/L de BASTA®, y 2,5 g/L de GELRITE a pH 5,7. Se colocaron los cultivos con poca luz (125 ft-candelas) durante una semana y después otra semana con mucha luz (325 ft-candelas). Después de un periodo de inducción de dos semanas, se transfirió el tejido de manera no selectiva a un medio de regeneración sin hormonas, que era idéntico al medio de inducción, salvo que carecía de 2,4-D y de BAP, y se mantuvo con mucha luz. Se retiraron plántulas pequeñas (1,5 a 3 cm) y se colocaron en tubos de cultivo de 150x25 mm que contenían un medio SH (sales de SH y vitaminas (Schenk y Hildebrandt, (1972) Can. J. Bot. 50:199-204), 10 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mio-inositol, 5 mL/L de FeEDTA, y 2,5 g/L de GELRITE, pH 5,8). Se transfirieron las plántulas a macetas de 12 cm que contenían aproximadamente 0,25 kg de METRO-MIX 360 (The Scotts Co. Marysville, OH) en el invernadero en cuanto mostraron crecimiento y desarrollaron un sistema de raíces suficiente. Se cultivaron con un fotoperiodo de 16 h complementado mediante una combinación de lámparas de sodio y de haluros metálicos a gran presión, y se mojaron según se necesitara con una combinación de tres formulaciones de fertilizantes de Peters Excel independientes (Grace-Sierra Horticultural Products Company, Milpitas, CA). En la etapa de 6-8 hojas, las plantas se trasplantaron a macetas de diecinueve litros que contenían aproximadamente 4 kg de METRO-MIX 360, y se cultivaron hasta la madurez.

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Ejemplo 5

Caracterización de Plantas de Maíz Transgénicas que Expresan la Toxina de Photorhabdus que Confiere Control de Insectos A. Bioensayos con insectos

Se tomó una muestra de una única hoja de cada planta en cada ensayo. Se cortaron ocho discos de 1,4 cm de la parte externa de cada hoja (de una longitud de aproximadamente 30 cm) evitando la vena central. Cada disco se colocó individualmente en un pocillo de una bandeja de 128 pocillos C-D International (Pitman, NJ.) en los que se habían pipeteado previamente 0,5 ml de una disolución de agar acuoso del 1,6%. El agar solidificado evitó que los discos foliares se secasen. La superficie adaxial del disco se orientó siempre hacia arriba.

Se colocaron cinco gusanos de la raíz del maíz del sur neonatos, Diabrotica undecimpunctata howardi, en cada disco y los pocillos se sellaron con tapas de plástico perforadas. El ensayo se mantuvo a 27ºC y un 40% de HR. La mortalidad larval y los datos de peso en vivo se recogieron después de 3 días. Los datos se sometieron a análisis de la varianza y a la prueba de rangos múltiples de Duncan (\alpha = 0,05) (Proc GLM, SAS Institute Inc., Cary, NC.). Los datos de peso se transformaron mediante el uso de una función logarítmica para corregir la correlación entre la magnitud de la media y la varianza.

TABLA 9 Resultados del ensayo de discos foliares de maíz frente a SCR

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15

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Nota: Las medias seguidas por la misma letra no son significativamente diferentes basándose en la prueba de rangos múltiples de Duncan (alfa=0,05). Los grupos de insectos que pesaban menos de 0,1 mg se ajustaron a 0,03 mg en vez de cero para llevar a cabo un análisis más conservador. Los datos de mortalidad (arcsin(sqrt)) y de peso (log10) se transformaron para los análisis.

Los resultados mostrados en la Tabla 9 demostraron que dos eventos que expresan proteína TcdA fueron estadísticamente diferentes de las líneas de control bioensayadas mediante el uso de neonatos de SCR según los criterios de mortalidad y peso de supervivencia. Estos resultados demostraron que los gusanos de la raíz del maíz del sur se vieron afectados por la alimentación en plantas de maíz que contienen y expresan el gen tcdA. Las plantas de 1834-11 se usaron para generar una progenie para analizar la heredabilidad del transgén.

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B. Producción y análisis de la progenie de maíz transgénico para tcdA

Origen y cultivo de las plantas de la progenie: Las plantas hermanas 1834-11-07 y 1834-11-08, derivadas clonalmente mediante regeneración del callo del evento de maíz transgénico 1834-11, se trasplantaron al invernadero y se polinizaron con OQ414 endogámico. Las semillas obtenidas de estos cruces, que comprendían los lotes de semillas 1834-11-07A y 1834-11-08A, se plantaron en Rootrainers (3,8 cm x 5 cm x 20 cm de profundidad, producto nº 647, C. Hummert Intl., Earth City, Mo.) rellenos con mezcla sin tierra Metro-Mix 360 (Scotts Terra-Lite, disponible de Hummert Intl.) y se irrigaron por la parte superior con una solución nutritiva de Hoagland. (La solución de Hoagland contiene 229 ppm de nitrógeno en forma de nitrato, 24,6 ppm de nitrógeno en forma de amonio, 26 ppm de P, 157 ppm de K, 187 ppm de Ca, 49 ppm de Mg y 30 ppm de Na).

Las condiciones del invernadero para este ensayo fueron: Días de 16 horas, luz complementada mediante lámparas de haluro metálico según fue necesario para alcanzar un mínimo de 600 ?Einsteins/cm^{2} de PAR, y una temperatura ambiente de 30ºC durante el día, 22ºC durante la noche.

Se tomaron muestras de las hojas para la determinación de proteínas aproximadamente una semana después de la plantación. Los bioensayos con hojas se llevaron a cabo 2-3 semanas después de la plantación; los bioensayos con raíces se iniciaron aproximadamente 3 semanas tras la plantación.

Análisis de proteínas de las plantas de la progenie: Se extrajeron las proteínas de las muestras de hojas y raíces recogidas de las plantas transgénicas, progenies de la línea 1834-11, y de plantas sin transformar. Cada muestra se colocó en un fragmento de 1,6 x 4 cm de papel 3M Whatman^{TM}. El papel se plegó a lo largo y se insertó en una paja flexible. Se pipeteó en el papel un volumen de 350 \mul de un tampón de extracción (9,5 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M, 15,5 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M, 2 ml de Na_{2}EDTA 0,5 M, 100 ml de Triton X-100, 1 ml de Sarcosil al 10%, 78 ml de beta-mercaptoetanol, H_{2}O para proporcionar un volumen total de 100 ml, 50 \mug/ml de Antipaína, 50 \mug/ml de Leupeptina, Quimostatina 0,1 mM, 5 \mug/ml de Pepstatina). La paja que contenía la muestra se pasó después a través de un dispositivo de rodillos usado para sacar el extracto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El extracto se centrifugó durante 10 minutos a 14.000 rpm en una microcentrífuga refrigerada Eppendorf. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. La cantidad de la proteína extraíble total se determinó mediante el uso de un protocolo de análisis de proteínas de BioRad estándar (BioRad Laboratories, Hercules,
CA).

La presencia de la proteína TcdA se visualizó mediante análisis de transferencia de Western siguiendo un procedimiento estándar para la separación de proteínas (Laemmli, 1970). Se cargó un volumen de veinte \mul de extracto en cada pocillo de un gel de poliacrilamida en gradiente del 4-20% (Owl Scientific Co., MA) para la electroforesis. Posteriormente, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa mediante el uso de un aparato de electrotransferencia en modo semiseco (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). La membrana se incubó durante una hora en una disolución TBST-M (10% de leche en disolución TBST; Tris HCl 25 mM de pH 7,4, NaCl 136 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Tween 20). Después, se añadió el anticuerpo primario (Anti-TcdA en TBST-M). Después de una hora, se lavó 3 veces la membrana con TBST durante cinco minutos. Después se añadió la disolución de anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rábano; Bio-Rad Laboratories, en TBST-M) a la membrana. Después de una hora de incubación, la membrana se lavó cuatro veces con una cantidad en exceso de TBST durante 10 minutos. La proteína se visualizó mediante el uso del método de quimioluminiscencia Super Signal® West Pico (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). La transferencia de proteínas se expuso a Hyper-film (Amersham, Arlington Heights, IL) y se reveló en 3 minutos. La intensidad de la banda de proteínas se midió mediante el uso de un densitómetro (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA) y se comparó con los
patrones.

Tres de seis plantas del lote de semillas 1834-11-07A y tres de seis plantas del lote de semillas 1834-11-08A produjeron niveles detectables de proteína TcdA (Tabla 1). Se detectaron aproximadamente de 3,8 a 13,3 ppm de TcdA en los limbos de las hojas, y de 4,1 a 8,4 ppm en las puntas de las hojas de las plantas positivas para la proteína. Las cantidades de proteína TcdA detectadas en las raíces fueron ligeramente menores que las halladas en las
hojas.

Bioensayos con insectos con las plantas de la progenie: Las plantas se seleccionaron para el bioensayo basándose en los resultados del análisis de transferencia de Western. Se cortaron doce (12) discos foliares de 6,4 mm de diámetro de la hoja más joven de cada plántula de 2 semanas de edad. Cada disco se colocó en un pocillo de una bandeja de 128 pocillos (CD International) que contenían aproximadamente 0,5 mL de un agar del 2% solidificado en disolución acuosa. Se colocaron dos gusanos de la raíz del maíz del sur neonatos, Diabrotica undecimpunctata howardi (Barber) (SCR); en cada pocillo con un disco foliar. Las bandejas se cubrieron con tapas perforadas y se mantuvieron en un medio controlado durante 3 días (28ºC; 16 horas de luz:8 horas de oscuridad; aprox. 60% de humedad relativa). Las larvas vivas de 4 discos foliares se agruparon y se pesaron para producir 3 determinaciones del peso por planta. Los pesos medios se calcularon dividiendo la suma de pesos por el número de supervivientes. Las diferencias de pesos medios de los SCR alimentados con discos foliares de plantas positivas y negativas para la proteína se determinaron mediante el uso del análisis de la varianza en los pesos medios transformados mediante el logaritmo natural (Minitab, v. 12.2, Minitab Inc., State College, PA).

Los bioensayos con raíces se iniciaron aproximadamente 1 semana después del inicio de los bioensayos con discos foliares. Aproximadamente 24 h antes de la eclosión, los huevos de SCR se suspendieron en una disolución de agar del 0,15% en agua a una concentración de 100 huevos/ml. Se inocularon los huevos de SCR a las plantas pipeteando 2,0 ml de la suspensión de huevos (es decir, aproximadamente 200 huevos) justo por debajo de la superficie de la tierra en la base de cada planta. Dos semanas después de la inoculación, las plantas se extrajeron de sus macetas Rootrainer, sus raíces se lavaron de la mezcla de maceta, y se puntuaron los daños en los gusanos basándose en un sistema de puntuación del 1 (resistente) al 9 (sensible) (Welch, 1977). Los resultados de las puntuaciones de las raíces se examinaron mediante el uso de pruebas no paramétricas para determinar si la distribución de puntuaciones de las raíces de las plantas positivas para la proteína fue la misma que la distribución de puntuaciones para las plantas negativas para las proteínas. La prueba se realizó en el nivel de significación del 5%. (StatXact v.3, CYTEL Software Corporation, Cambridge MA).

Los resultados de los bioensayos con hojas y raíces de las plantas de la progenie positivas y negativas para la proteína tcdA se resumen en la Tabla 10. Los pesos medios de las larvas de SCR alimentadas con discos foliares de las plantas positivas para la proteína fueron significativamente menores que los de las larvas alimentadas con discos foliares de las plantas negativas para la proteína (F = 4.6; d.f. = 1, 34; P \leq 0,001). La prueba de 2 muestras de Kolmogorov-Smirnov (p=0,04) y la prueba de rachas de Wald Wolfowitz (p=0,001) indicaron que las distribuciones de puntuaciones de las raíces positivas y negativas para la proteína no fueron similares. La prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney (p=0,0206) y la prueba de puntuaciones normales (p=0,206) indicaron que la puntuación media para las plantas positivas para la proteína fue menor que la puntuación media de las raíces de las plantas negativas para la proteína.

TABLA 10 Resultados de los análisis de proteínas y de los bioensayos con insectos con la progenie de maíz transgénico para TcdA

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Análisis del ADN de las plantas de la progenie: Se introdujeron muestras de hojas de las plantas de la progenie 1834-11.7A y 1834-11.8A en tubos de polipropileno cónicos de 50 ml, y se secaron en un Freeze Dry Lyophilizer de Labconco (Kansas City, MO) durante 1-2 días. Las hojas liofilizadas se trituraron después en un molino de muestras Tecator Cyclotec 1093 (Hoganas, Suecia) y se almacenaron a -20ºC. Se extrajo el ADN genómico mediante el siguiente procedimiento: (1) a un tubo cónico de 25 ml que contenía 300-500 mg de tejido triturado, se le añadieron 9 ml de CTAB (disolución de bromuro de cetil-trimetilamonio), y se incubó a 65ºC durante 1 hora; (2) se añadieron 4,5 ml de cloroformo: octanol (24:1) y se mezcló suavemente durante 5 minutos; (3) las muestras se centrifugaron a 2000 rpm y se precipitó el ADN del sobrenadante con un volumen igual de isopropanol; (4) el ADN se recogió con un gancho de vidrio, se lavó en etanol, y se disolvió en TE (Tris.HCl 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH 8,0).

El ADN genómico se digirió a 37ºC durante 2 horas en un tubo Eppendorf que contenía la siguiente mezcla: 8 \mul de 800 ug/ml de ADN, 2 \mul de 1 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino), 2 \mul de tampón 10x, 1 \mul de SacI, 1 \mul de EcoRI, y 6 \mul de H_{2}O. Las muestras de ADN digerido se sometieron a electroforesis durante la noche a 40 mA en un gel de agarosa SeaKem LE del 0,85% (FMC, Rockland, Maine). El gel se transfirió a una membrana Immobilon-Ny+ de Millipore (Bedford, MA) durante la noche en SSC 20X (175,2 g/l de NaCl, 88 g/l de citrato-Na). La sonda de ADN se cortó con BamHI/SacI (NEB, Beverly, MA) del plásmido pDAH1551, lo que liberó un fragmento de 7356 pb que contenía el marco de lectura abierto del gen tcdA reconstruido. Este fragmento de 7356 pb se marcó con P32 mediante el uso de un equipo Prime-it RmT dCTP-Labeling Reactions de Stratagene (La Jolla, CA) y se usó para la hibridación de Southern. La hibridación se llevó a cabo en tampón de hibridación (10% de polietilenglicol, 7% de SDS [dodecilsulfato sódico], SSC 0,6X, NaPO_{4} 10 mM, EDTA 5 mM, 10 \mug/ml de esperma de salmón desnaturalizado) a 60ºC durante la noche. Tras la hibridación, la membrana se lavó con SSC 10X más un 0,1% de SDS a 60ºC durante 30 min, y se expuso con una película de rayos X (Hyperfilm® MP, Amershan Life Sciences, Piscataway, NJ) durante 1-2 días.

Los resultados resumidos indican que un patrón de 8 bandas de hibridación (del tamaño del fragmento esperado y mayores) cosegregó con la expresión de la proteína en el 50% de toda la progenie analizada. Estos resultados son característicos de una inserción del complejo en un único sitio. Todas las plántulas que contenían el inserto expresaban también la proteína tóxica.

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Ejemplo 6

Transformación de Arroz con un Vector que Porta el Plásmido pDAB1553 que Codifica Toxinas de Photorhabdus A. Plásmido pDAB1553

Se usó para la transformación el plásmido pDAB1553 que contiene tcdA controlado por el promotor de ubiquitina1 de maíz y hpt (higromicina fosfotransferasa que proporciona resistencia al antibiótico higromicina) bajo el control de 35T (un promotor de 35S modificado).

La preparación de vectores de transformación de arroz se llevó a cabo en dos etapas. Primero, se ligó una región codificante de tcdA optimizada para plantas modificada en un plásmido de casete de expresión en plantas de arroz. En esta etapa, la región codificante se colocó bajo el control transcripcional de un promotor funcional en células vegetales. La terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARN estuvieron mediadas por una copia en posición 3' de la región terminadora del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium. Un plásmido diseñado para funcionar de esta manera es el plásmido pDAB1538 (descrito en la sección de vectores de transformación de maíz). En la segunda etapa, el gen completo compuesto del promotor, la región codificante y la región terminadora se ligó en un vector de transformación de plantas de arroz que contenía un gen marcador seleccionable expresable en plantas que permitió la selección de células vegetales de arroz transformadas entre un contexto de células sin transformar. Un ejemplo de tal vector es pDAB354-Not1.

Una característica de pDAB354-Not1 es que la proteína higromicina fosfotransferasa, cuyo sustrato es higromicina B y los compuestos relacionados, se produce en las células vegetales por medio de la transcripción de su región codificante mediada por el promotor de 35S del virus del mosaico de la coliflor, y que la terminación de la transcripción más la poliadenilación están mediadas por la región terminadora de la nopalina sintasa. Una característica adicional de pDAB354-Not1 es que cualquier fragmento de ADN que contiene sitios NotI flanqueantes se puede clonar en el único sitio NotI de pDAB354-Not1, por lo que se une físicamente el fragmento de ADN introducido con el gen marcador seleccionable anteriormente mencionado.

Para preparar un gen expresable en plantas para producir la proteína TcdA sin señalización en células vegetales de arroz, se escindió el ADN de un plásmido (pA0H_4-OPTI) que contenía la región codificante de tcdA optimizada para plantas, (SEQ ID Nº:3) con las enzimas de restricción NcoI y SacI, y se ligó el fragmento grande de 7550 pb con el ADN cortado de manera similar del plásmido pDAB1538 para producir el plásmido pDAB1551. El ADN de pDAB1551 se digirió después con NotI, y el fragmento grande de 9933 pb se ligó con ADN digerido con NotI de pDAB354-Not1 para producir el plásmido pDAB1553.

Una característica del plásmido pDAB1553 es que los promotores de ubi1 y 35S están codificados en la misma cadena de ADN.

B. Producción de Plantas Transgénicas de Arroz

Para la iniciación del callo embriógeno, las semillas maduras de la variedad Japonica, Taipei 309 se descascarillaron y se esterilizaron superficialmente en etanol al 70% durante 2-5 min, y después se remojaron durante 30-45 min en lejía comercial al 50% (2,6% de hipoclorito sódico) con unas cuantas gotas de jabón "Liquinox". Las semillas se aclararon después 3 veces con agua destilada estéril y se colocaron en un papel de filtro antes de transferirlas al medio de "inducción de callo" (es decir, NB). El medio NB consistió en macroelementos N6 (Chu, 1978, The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, págs. 43-56), microelementos B5 y vitaminas (Gamborg et al., 1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158), 300 mg/L de hidrolizado de caseína, 500 mg/L de L-prolina, 500 mg/L de L-glutamina, 30 g/L de sacarosa, 2 mg/L de ácido 2,4-dicloro-fenoxiacético (2,4-D), y 2,5 g/L de Gelrite (Schweizerhall, NJ) con el pH ajustado a 5,8. Las semillas maduras cultivadas en medios de "inducción" se incubaron en la oscuridad a 28ºC. Después de 3 semanas de cultivo, el callo primario emergente inducido desde la región escutelar del embrión maduro se transfirió a medio NB nuevo para su mantenimiento posterior.

Se precipitó alrededor de 140 \mug de ADN de plásmido pDAB1553 sobre 60 mg de partículas de oro de 1,0 micrómetros (Bio-Rad) como se describe en la presente memoria.

Para la detonación con helio, los cultivos de callos embriógenos que se encontraban en proliferación activa, de un tamaño de 2-4 mm, se sometieron a un tratamiento hiperosmótico. Este tratamiento incluyó la colocación del callo en medio NB con manitol 0,2 M y sorbitol 0,2 M (Vain et al., 1993, Osmoticum treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize. Plant Cell Rep. 12: 84-88) durante 4 h antes de la detonación con helio. Después del tratamiento osmótico, los cultivos de callos se transfirieron a medio de "detonación" (NB + agar al 2%) y se cubrieron con una rejilla de acero inoxidable (230 micrómetros). Los cultivos de callos se detonaron a presiones de helio de 13,8x10^{6} Pa dos veces por diana. Tras la detonación, el callo se transfirió de nuevo al medio hiperosmótico durante la noche antes de colocarlo en el medio de selección, que consistió en medio NB con 30 mg/L de higromicina. Después de 2 semanas, los cultivos se transfirieron a medio de selección nuevo con una concentración más elevada de agente de selección, es decir, NB+50 mg/L de higromicina (Li et al., 1993, An improved rice transformation system using the biolistic method. Plant Cell Rep. 12: 250-255).

Los cultivos de callo embriógeno, de color blanco amarillento, y compactos, recuperados en NB+50 mg/L de higromicina, se regeneraron transfiriéndolos a medio de "pre-regeneración" (PR) + 50 mg/L de higromicina. El medio PR consistió en medio NB con 2 mg/L de bencil-aminopurina (BAP), 1 mg/L de ácido naftalenacético (NAA), y 5 mg/L de ácido abscísico (ABA). Después de 2 semanas de cultivo en la oscuridad, se transfirieron a medio de "regeneración" (RN). La composición del medio RN es medio NB con 3 mg/L de BAP, y 0,5 mg/L de NAA. Los cultivos en medio RN se incubaron durante 2 semanas a 28ºC con luz fluorescente intensa (325 ft-candelas). Las plántulas con brotes de 2 cm se transfirieron a medio 1/2 MS (Murashige y Skoog, 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497) con vitaminas 1/2 B5, 10 g/L de sacarosa, 0,05 mg/L de NAA, 50 mg/L de higromicina y 2,5 g/L de Gelrite ajustado a pH 5,8 en cajas Magenta. Cuando las plántulas se establecieron con sistemas de raíces bien desarrollados, se transfirieron a tierra (1 metromix: 1 tierra superficial) y se cultivaron en el invernadero (ciclo día/noche a 29/24ºC, 50-60% de humedad, fotoperiodo de 12 h) hasta la madurez.

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Ejemplo 7

Caracterización de las Plantas de Arroz Transgénicas que Expresan la Toxina de Photorhabdus que Confiere Control de Insectos A. Bioensayos con insectos

Los bioensayos con insectos se llevaron a cabo mediante el uso de discos foliares, y se demostró que eran muy eficaces en el control del gusano de la raíz del maíz del sur. Se obtienen huevos de Diabrotica undecimpunctata howardi de French Ag Research y se hacen eclosionar en placas Petri mantenidas a 28,5ºC y un 40% de HR. Se toman muestras de las partes aéreas de las plantas transgénicas y se colocan por separado en placas Petri invertidas (100x15 mm) que contienen 15 ml de agar acuoso del 1,6% en el fondo para proporcionar humedad, y papel de filtro en la parte superior para absorber la condensación. Estas preparaciones se infestan con cinco larvas neonatales por placa y se mantienen a 28,5ºC y un 40% de HR durante 3 días. Se registra la mortalidad y los pesos de las larvas. Los datos de peso se transformaron mediante el uso de una función logarítmica para corregir la correlación entre la magnitud de la media y la varianza.

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TABLA 11

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17

Nota: Las medias seguidas por la misma letra no son significativamente diferentes basándose en la prueba de rangos múltiples de Duncan (alfa=0,05).

Los grupos de insectos que pesaban menos de 0,1 mg se ajustaron a 0,03 mg en vez de cero para llevar a cabo un análisis más conservador. Los datos de pesos se transformaron (Log10) para los análisis. Se usó una única muestra en cada una de las tres fechas de ensayo. Se tomaron muestras de las plantas de las cajas Magenta.

Los resultados demuestran que en los bioensayos con discos foliares, varios eventos del arroz derivados de la transformación con el gen tcdA tuvieron estadísticamente un efecto funcional sobre el gusano de la raíz del maíz neonato.

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<110> Petell, Jim

{}\hskip1cm Merlo, Donald

{}\hskip1cm Herman, Rod

{}\hskip1cm Roberts, Jean

{}\hskip1cm Guo, Lining

{}\hskip1cm Schafer, Barry

{}\hskip1cm Sukhapinda, Kitisri

{}\hskip1cm Owens Merlo, Ann

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<120> Plantas Transgénicas que Expresan la Toxina de Photorhabdus

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<130> 50698

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<140>

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<141>

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<150> US 60/148,356

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<151> 11-08-1999-08-11

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 7551

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<212> ADN

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<213> Photorhabdus luminescens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(7598)

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<400> 1

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\hskip0,8cm

18

\hskip0,8cm

19

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20

\hskip0,8cm

21

\hskip0,8cm

22

\hskip0,8cm

23

\hskip0,8cm

24

\hskip0,8cm

25

\hskip0,8cm

26

\hskip0,8cm

27

\hskip0,8cm

28

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<210> 2

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<211> 7515

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<212> ADN

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<213> Photorhabdus luminescens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(7512)

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<400> 2

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\hskip0,8cm

29

\hskip0,8cm

30

\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

32

\hskip0,8cm

33

\hskip0,8cm

34

\hskip0,8cm

35

\hskip0,8cm

36

\hskip0,8cm

37

\hskip0,8cm

38

\hskip0,8cm

39

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<210> 3

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<211> 7577

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)..(7553)

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: tcdA hemicotiledónea

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<400> 3

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\hskip0,8cm

40

\hskip0,8cm

41

\hskip0,8cm

42

\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\hskip0,8cm

45

\hskip0,8cm

46

\hskip0,8cm

47

\hskip0,8cm

48

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

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<210> 4

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<211> 7541

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)..(7517)

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: tcbA hemicotiledónea

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<400> 4

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\hskip0,8cm

51

\hskip0,8cm

52

\hskip0,8cm

53

\hskip0,8cm

54

\hskip0,8cm

55

\hskip0,8cm

56

\hskip0,8cm

57

\hskip0,8cm

58

\hskip0,8cm

59

\hskip0,8cm

60

\hskip0,8cm

61

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<210> 5

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia hemicotiledónea que codifica la señal del RE de la zeína de 15 kDa del maíz dulce mexicano negro.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1) .. (63)

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<400> 5

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\hskip0,8cm

62

\newpage

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<210> 6

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<211> 7621

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: tcdA hemicotiledónea fusionada al péptido señal del retículo endoplásmico de la zeína de 15 kDa modificada

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<220>

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<221> CDS

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<222> (4)..(7614)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\hskip0,8cm

64

\hskip0,8cm

65

\hskip0,8cm

66

\hskip0,8cm

67

\hskip0,8cm

68

\hskip0,8cm

69

\hskip0,8cm

70

\hskip0,8cm

71

\hskip0,8cm

72

Claims (8)

1. Un ácido nucleico aislado de SEQ ID Nº 3.

2. Una célula monocotiledónea transgénica que tiene un genoma que comprende SEQ ID Nº 3.

3. Una célula dicotiledónea transgénica que tiene un genoma que comprende SEQ ID Nº 3.

4. Una planta transgénica con un genoma que comprende un ácido nucleico de SEQ ID Nº 3 que confiere resistencia a insectos.

5. Una planta o célula transgénica según cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 4, en la que dicho genoma comprende además SEQ ID Nº 4.

6. Una planta transgénica de las Reivindicaciones 4 ó 5, en la que la planta es arroz.

7. Una planta transgénica de las Reivindicaciones 4 ó 5, en la que la planta es maíz.

8. Una planta transgénica de las Reivindicaciones 4 a 5, en la que la planta es tabaco.