CN114409710B - Nir-ii多吡啶钌配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Nir-ii多吡啶钌配合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了NIR‑II多吡啶钌(II)配合物，所述NIR‑II多吡啶钌(II)配合物结构式如式Ru‑1所示：其经二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇包载后，可用于近红外二区肿瘤成像治疗等；其为具有最大发射波长超过1000nm的全新化合物，具有较好的光稳定性和光热转换效率，无毒，生物相容性好，易被生物体吸收和代谢，对肿瘤细胞有明显细胞毒作用。

Description

NIR-II多吡啶钌配合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明专利涉及生物医学荧光成像应用技术领域，尤其是指NIR-II多吡啶钌(II)配合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类生命健康的重要问题，当前，肿瘤的早期诊断与有效干预是提高患者生存周期的主要方式。目前传统的影像技术存在灵敏度和特异性、时空分辨率低及电离辐射等问题，无法对早期病变组织及时检出和有效干预。而近年来发展的近红外二区(NIR-II:1000-1700nm)荧光成像技术具有更高的时空分辨率、更高的信噪比及组织穿透深度，其中，波长越长，背景干扰越低，成像质量越好，在活体成像与肿瘤治疗等方面显示出巨大的优势。该成像技术强烈依赖性质优良的光学材料，有机小分子染料因其结构清晰稳定、易修饰、易代谢低毒等特点，深受研究者的喜爱。而当前有机小分子的最大发射波长主要集中在1000-1100nm，量子产率较低，穿透深度极其有限，无法应用于NIR-IIa(1300-1400nm)及NIR-IIb(＞1500nm)窗口的生物成像研究。
钌(II)多吡啶配合物具有独特的光物理和光化学特性，在分子传感、肿瘤治疗方面显示出巨大的应用前景。大量的金属钌配合物被用于肿瘤的治疗，对肿瘤细胞显示出良好的治疗效果，其中有NAMI-A、1091、P1339和TLD1433在临床实验中已发展到不同阶段，成为潜在的抗癌药物。有研究报道，可以通过调节辅助配体，修饰配合物的特性以在单个分子内实现诊断和治疗功能。然而，这些钌配合物的发射波长有限，无法实现对深层组织的病变诊断及治疗。
为了获得具有优异性能的近红外二区金属诊疗一体化试剂，研发一种具有高荧光强度、高的组织穿透性、量子产率高、低毒性且具备NIR-IIb成像的小分子近红外二区钌(II)多吡啶配合物显得尤为重要。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种NIR-II多吡啶钌(II)配合物，所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物结构式如式Ru-1所示：
其中，TMS为三甲基硅基。
在本发明的一个或多个实施例中，所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物的荧光发射波长为1100～1600nm。
在本发明的第二方面，本发明提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含权利要求1或2所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物；
优选地，所述纳米颗粒由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物自组装形成。
在本发明的一个或多个实施例中，所述纳米颗粒的直径为13～14nm；优选地，所述纳米颗粒的直径为13.12～13.46nm。
在本发明的第三方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物或在本发明第二方面所述的纳米颗粒在近红外二区1100～1600nm范围内的肿瘤成像中的应用。
在本发明的第四方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物或在本发明第二方面所述的纳米颗粒在制备用于生物体内成像的近红外二区荧光成像探针中的应用。
在本发明的第五方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物或在本发明第二方面所述的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明的第六方面，本发明提供一种本发明第一方面所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物由化合物(8)制备得到，所述化合物(8)制备所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物的反应式如下所示：
化合物(8)制备所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物包括如下步骤：将化合物(8)、化合物(11)置于单口烧瓶中，加入冰醋酸，在100～110℃下回流10～20小时，TLC监测反应，反应完成后，浓缩反应液，浓缩后将所得粗品加中性氧化铝拌样过柱得到黄绿色固体，即为所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物。
优选地，所述化合物(8)与所述化合物(11)的摩尔比为1:1。
在本发明的一个或多个实施例中，所述化合物(11)由化合物(10)制备得到，所述化合物(10)制备化合物(11)的反应式如下所示：
所述化合物(10)制备化合物(11)包括如下步骤：
取化合物(10)、1,10-菲啰啉-5,6-二酮溶于甲醇和水的混合溶剂中，加入到反应容器，在80～100℃加热回流5～10h，TLC点板监测反应，冷却至15～35℃，加入丙酮置于0℃下过夜，析出沉淀，过滤，滤饼用水洗涤，乙醚重结晶，过滤干燥得到黑色固体，即为化合物(11)。
优选地，所述化合物(10)制备化合物(11)的步骤中，化合物(10)与1,10-菲啰啉-5,6-二酮的摩尔比为1:1；所述甲醇、水和丙酮的体积比为1:1:5。
优选地，所述化合物(10)由化合物(9)反应得到，所述化合物(9)制备化合物(10)的反应式如下所示：
化合物(9)制备化合物(10)包括如下步骤：
取化合物(9)、RuCl3·xH2O和LiCl溶于DMF中，加入到反应容器，在140～160℃下加热反应6～10h。反应结束后，冷却至15～35℃，加入丙酮置于0℃下析出沉淀，过滤得到紫红色固体，用水洗涤将所得紫红色固体，乙醚重结晶，过滤干燥，即得化合物(10)。
优选地，化合物(9)制备化合物(10)的步骤中，控制RuCl3·xH2O、化合物(9)和LiCl的摩尔比为2400:6000:1。
在本发明的一个或多个实施例中，所述化合物(8)由化合物(1)反应得到，所述化合物(1)制备化合物(8)的反应式如下所示：
化合物(1)制备化合物(8)包括如下步骤：
步骤1)：取化合物(1)、乙基(三苯基膦)乙酸酯混匀加入到反应容器中，，加入四氢呋喃溶解，15～35℃在15～35℃下反应18～30小时，反应完后，旋干反应液，纯化，得到亮黄色油状产物，即为化合物(2)；
步骤2)：取步骤1)得到的化合物(2)加入到反应容器中，加入乙酸乙酯溶解，氢气氛围下加入10％Pd/C，置换三次氮气，混合物在氢气氛围下在15～35℃下反应18～30小时15～35℃，反应完后，反应混合物用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，旋干滤液得到浅黄色油状物，即为化合物(3)；
步骤3a)：称取步骤2)得到的化合物(3)加入到反应容器中，加入四氢呋喃溶解，反应瓶置于0-5℃冰水浴中，称取LiOH溶于水缓慢加入至反应体系中，待加入完毕，将冰水浴撤去，在15～35℃下反应18～30小时15～35℃，点板监测，反应完毕，反应液用盐酸调pH至1-3，往其中加入水，用EA萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色油状粗品；
步骤3b)：将步骤3a)得到的粗品溶解于二氯甲烷，加入到反应容器，置于冰水浴中，加入DMAP，EDCI搅拌均匀，接着加入三甲基硅乙醇，在15～35℃下反应18～30小时15～35℃，TLC点板监控反应完全，将反应液倒入水中，DCM萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到粗品，纯化得到黄色油状物，即为化合物(4)；
步骤4)：称取步骤3b)得到的化合物(4)溶于二氯甲烷中，加入到反应容器，在15～35℃下15～35℃，依次加入NH4Ac、NBS，在15～35℃下15～35℃搅拌均匀，加入水淬灭反应，将反应液倒入水中，DCM萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色油状物，即为化合物(5)；
步骤5)：称取步骤4)得到的化合物(5)、联硼酸频那醇酯和乙酸钾，加入到反应容器，溶解于DMF中，置换N2，N2氛围下加入催化剂Pd(PPh)3Cl2，置换N2，反应液置于油浴锅中，N2氛围下反应，TLC监控，反应完全，反应液冷却至15～35℃15～35℃，倒入水中，EA萃取，浓缩有机相，纯化得到无色油状物，即为化合物(6)；
步骤6)：称取步骤5)得到的化合物(6)、4,7-二溴-5,6-二硝基苯并噻二唑和K2CO3溶解于甲苯和水的混合溶剂中，加入到反应容器，置换N2，N2氛围下加入催化剂Pd(PPh3)4，置换N2，反应液置于油浴锅中，N2氛围下反应，TLC监控，反应完全，反应液冷却至15～35℃15～35℃，倒入水中，EA萃取，浓缩有机相，纯化，得到紫红色化合物(7)；
步骤7)：称取步骤6)得到的化合物(7)、锌粉、氯化铵，加入到反应容器，溶解于DCM、甲醇及水的混合溶剂中，15～35℃15～35℃反应1～3h，反应液由紫色变为黄色，通过硅藻土过滤，滤饼用DCM洗涤，滤液旋干得到黄色化合物(8)。
优选地，所述步骤1)中，化合物(1)与乙基(三苯基膦)乙酸酯的摩尔比为0.8:1。
更优选地，所述步骤3a)使用的化合物(3)、所述步骤3a)使用的LiOH、所述步骤3b)使用的DMAP与所述步骤3b)使用的EDCI的摩尔比是1:5：0.2：1.6；所述步骤3a)中，四氢呋喃和水的体积比为5:1。
更优选地，所述步骤4)中，化合物(4)、NH4Ac与NBS的摩尔比是1:0.1:1.1。
更优选地，所述步骤5)中，化合物(5)、联硼酸频那醇酯、乙酸钾和催化剂Pd(PPh)3Cl2的摩尔比为10：12：24：1。
更优选地，所述步骤6)中，化合物(6)、4,7-二溴-5,6-二硝基苯并噻二唑、K2CO3和Pd(PPh3)4的摩尔比为1:1:3.2:0.1。
更优选地，所述步骤7)中，化合物(7)、锌粉、氯化铵的摩尔比为1：119：36；DCM、甲醇和水的体积比为1:1:0.1。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种可在1500nm以上荧光发射的NIR-II多吡啶钌(II)配合物，其经二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇包载后，可用于近红外二区肿瘤成像及治疗；
2、本发明提供一种可在1000nm以上荧光发射的NIR-II多吡啶钌(II)配合物，其为具有最大发射波长超过1000nm的全新化合物，无毒，生物相容性好，易被生物体吸收和代谢；
3、本发明提供一种可调控代谢的有机荧光小分子化合物的制备方法，其合成路线简单，反应效率高，收率高，具有较高的工业应用前景；
4、本发明提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物自组装形成，直径为13.12～13.46nm。
5、本发明提供一种上述NIR-II多吡啶钌(II)配合物或纳米颗粒在近红外二区1100～1600nm范围内的肿瘤成像中的应用、在制备用于生物体内成像的近红外二区荧光成像探针中的应用和在制备抗肿瘤药物中的应用。探针在生物成像的实验中，可实现很好的时间和空间分辨率，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为NIR-II多吡啶钌(II)配合物核磁氢谱表征；
图2为NIR-II多吡啶钌(II)配合物核磁碳谱表征；
图3为NIR-II多吡啶钌(II)配合物的吸收发射光谱；
图4为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒与ICG在不同介质下的光稳定性比较结果图；
图5为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒的透射电镜和动态光散射结果；
图6为不同孵育时间下4T1细胞悬液的NIR-II成像图及不同孵育时间下4T1细胞样品的平均荧光强度；
图7为不同条件下顺铂、NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒及激光处理下NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒对4T1细胞的细胞毒性；
图8为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒的光热转换效率图；
图9为不同处理方式下的4T1细胞活死细胞显微成像图；
图10为不同处理方式下4T1细胞的FITC-AnnexV/PI凋亡流式图；
图11为不同时间点下，4T1皮下肿瘤模型的近红外二区成像及肿瘤区荧光强度随时间变化的散点图；
图12为给药组和空白组小鼠体内光热效果；
图13为：(a)不同治疗组的小鼠肿瘤体积变化曲线；(b)治疗过程中各组小鼠的体重变化曲线；(c)治疗结束后各组小鼠肿瘤离体图片；(d)治疗结束后各组离体肿瘤质量；(e)治疗结束后4T1肿瘤小鼠的照片；
图14为：(a)为不同实验组中ICR小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色；(b)不同实验组小鼠血液生化指标(AST、ALT、ALP、T-Bill、BUN、Creatinine)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供一种近红外二区多吡啶钌(II)配合物，所述近红外二区多吡啶钌(II)配合物结构式如式Ru-1所示：
以下实施例1～4具体说明Ru-1的合成方法：
实施例1：化合物(8)的合成
制备化合物(8)的反应式如下所示：
化合物(8)的制备方法包括如下步骤：
各称取化合物(1)(5g,18.3mmol)，乙基(三苯基膦)乙酸酯(7.65g,22mmol)充分混匀置于100mL单口圆底烧瓶中，加入四氢呋喃50mL溶解，15～35℃反应24小时，反应完后，反应液通过旋转蒸发仪旋干，混合物通过柱层析分离纯化，得到亮黄色油状产物(2)(6.0g,收率95.5％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(d,J＝15.9Hz,1H),7.40(d,J＝8.7Hz,2H),7.35–7.29(m,4H),7.19–7.09(m,6H),7.04(d,J＝8.7Hz,2H),6.33(d,J＝15.9Hz,1H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.5,149.8,147.0,144.2,129.5,129.2,127.6,125.4,124.0,121.8,115.5,60.3,14.4.
称取化合物(2)(6g,17.4mmol)置于250mL单口圆底烧瓶中，加入100mL乙酸乙酯溶解，氢气(40atm)氛围下加入10％Pd/C(0.6g)，置换三次氮气，混合物在H2(40atm)氛围下15～35℃反应24小时。反应完后，反应混合物用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤(30mL×3)，滤液直接旋干得到浅黄色油状化合物(3)(5.6g,收率93.3％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.23-7.17(m,4H),7.09-7.03(m,6H),7.02-6.94(m,4H),4.13(q,J＝7.3Hz,2H),2.90(t,J＝7.8Hz,2H),2.60(t,J＝7.8Hz,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.2,148.1,146.3,135.3,129.4,129.4,124.8,124.1,122.7,60.7,36.3,30.6,14.5.
称取化合物(3)(2.5g,7.25mmol)置于250mL单口瓶中，加入100mL四氢呋喃溶解，反应瓶置于0-5℃冰水浴中，称取LiOH(0.434g,36.25mmol)溶于20mL水缓慢加入至反应体系中，待加入完毕，将冰水浴撤去，15～35℃反应24小时。点板监测，反应完毕，反应液用1M盐酸调pH至1-3，往其中加入100mL水，用EA(50mL×3)萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，通过旋转蒸发仪浓缩得到黄色油状粗品(4g)直接投入下一步。
将上一步得到的黄色油状粗品(4g)溶解于80mL二氯甲烷置于冰水浴中，加入DMAP(178mg,1.45mmol)，EDCI(2.1g,11.6mmol)搅拌30min，接着加入三甲基硅乙醇(1.37g,11.6mmol)，15～35℃搅拌24小时，TLC点板监控反应完全，将反应液倒入150mL水中，DCM(50mL×3)萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到粗品，通过柱层析纯化得到黄色油状物，即为化合物(4)(2g，66％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.31(t,J＝7.9Hz,4H),7.17(t,J＝7.4Hz,6H),7.13–7.04(m,4H),4.35–4.22(m,2H),3.00(t,J＝7.8Hz,2H),2.70(t,J＝7.8Hz,2H),1.14–1.03(m,2H),0.15(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.4,148.2,146.3,135.4,129.4,129.4,124.8,124.2,122.8,62.9,36.4,30.7,17.6,-1.2.
称取化合物(4)(1g,2.4mmol)溶于30mL二氯甲烷中，15～35℃条件下，依次加入NH4Ac(18.5mg,0.24mmol)，NBS(470mg,2.64mmol)，15～35℃搅拌30min，加入20mL水淬灭反应，将反应液倒入100mL水中，DCM(50mL×3)萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，旋转蒸发仪浓缩得到黄色油状物，即为化合物(5)(2g)，粗品直接投入下一步。
称取化合物(5)(1.173g,1.754mmol)、化合物联硼酸频那醇酯(535mg,2.11mmol)、乙酸钾(413mg,4.21mmol)溶解于20mL DMF中，置换三次N2，N2氛围下加入催化剂Pd(PPh)3Cl2(129mg,0.175mmol)，再次置换N2。反应液置于80℃油浴锅中N2氛围下反应，TLC监控，反应完全，反应液冷却至15～35℃，倒入300mL水中，EA(100mL×3)萃取，有机相通过旋转蒸发仪浓缩，柱层析纯化得到无色油状物，即为化合物(6)(892mg,收率71％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(t,J＝7.6Hz,2H),7.28(dd,J＝9.6,6.2Hz,2H),7.17–7.10(m,4H),7.09–7.01(m,5H),4.26–4.18(m,2H),2.95(t,J＝7.8Hz,2H),2.64(t,J＝7.8Hz,2H),1.38(d,J＝7.6Hz,12H),1.08–0.98(m,2H),0.11–0.05(m,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.1,150.7,147.4,145.5,135.9,135.8,129.3,129.2,125.2,124.9,123.3,121.5,83.6,62.7,36.1,30.4,24.9,17.3,1.1,-1.4.
称取化合物(6)(420mg,0.77mmol)，4,7-二溴-5,6-二硝基苯并噻二唑(296.7mg,0.77mmol)，K2CO3(342mg,2.5mmol)溶解于12mL甲苯及4mL水的混合溶剂中，置换三次N2，N2氛围下加入催化剂Pd(PPh3)4(89.3mg,0.077mmol)，再次置换N2。反应液置于115℃油浴锅中N2氛围下反应，TLC监控，反应完全，反应液冷却至15～35℃，倒入100mL水中，EA(50mL×3)萃取，有机相通过旋转蒸发仪浓缩，柱层析纯化得到紫红色化合物(7)(160mg,收率20％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.39(m,4H),7.33(dd,J＝20.2,12.8Hz,5H),7.25–7.09(m,17H),4.24–4.18(m,4H),2.97(t,J＝7.8Hz,4H),2.65(t,J＝7.8Hz,4H),1.06–0.96(m,4H),0.07(s,18H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.1,153.2,149.8,146.7,144.8,142.3,137.0,130.2,129.6,129.5,127.8,126.2,125.8,124.3,122.1,120.4,62.8,36.0,30.4,17.3,1.4.
称取化合物(7)(80mg,0.076mmol)、锌粉(594mg,9.08mmol)、氯化铵(146mg,2.73mmol)溶解于5mL DCM、5mL甲醇及0.5mL水的混合溶剂中，15～35℃反应2h，反应液由紫色变为黄色，通过硅藻土过滤，滤饼用20mL DCM洗涤，滤液旋干得到黄色化合物(8)(80mg)。
实施例2：化合物(10)的合成
化合物(10)的反应式如下所示：
化合物(10)的制备方法包括如下步骤：
称取RuCl3·xH2O(1g,3.82mmol)，2,2’-联吡啶(1.5g,9.6mmol)，LiCl(6.8mg,1.62μmol)溶于3mL DMF中。150℃加热反应8h。反应结束后，冷却至15～35℃，加入100mL丙酮置于0℃下过夜析出沉淀，第二天过滤紫红色固体，滤饼用水洗涤3次，接着加入乙醚重结晶，过滤干燥得到黑色固体(100mg,收率16.7％)，即为化合物(10)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.65(d,J＝8.1Hz,2H),8.50(d,J＝8.2Hz,2H),8.08(t,J＝7.8Hz,2H),7.84-7.73(m,2H),7.66(t,J＝7.4Hz,2H),7.12(t,J＝6.0Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ157.0,151.6,138.4,128.4,125.1.
实施例3：化合物(11)的合成
化合物(11)的反应式如下所示：
化合物(11)的制备方法包括如下步骤：
称取化合物(10)(61mg,0.125mmol)和1,10-菲啰啉-5,6-二酮(26.47mg,0.125mmol)溶于2mL甲醇和2mL水中，90℃加热回流8h，TLC点板监测反应，冷却至15～35℃，加入10mL丙酮置于0℃下过夜析出沉淀，第二天过滤固体，滤饼用水洗涤3次，接着乙醚重结晶，过滤干燥得到黑色固体(50mg,收率54％)，即为化合物(11)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.95(d,J＝7.0Hz,4H),8.53(d,J＝7.5Hz,2H),8.21(d,J＝3.2H z,4H),7.9 6(d,J＝4.7Hz,2H),7.8 1(d,J＝5.0H z,2H),7.73(dd,J＝12.7,6.2Hz,4H),7.59(d,J＝5.7Hz,4H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ174.0,157.1,157.0,156.2,154.8,152.2,151.8,138.7,138.6,135.1,123.5,129.0,128.4,128.2,125.2,125.1.
实施例4：Ru-1的合成
Ru-1的反应式如下所示：
Ru-1的制备方法包括如下步骤：
称取化合物(8)(35mg,0.033mmol)，化合物(11)(23mg,0.033mmol)置于50mL单口烧瓶中，加入3mL冰醋酸，105℃回流15小时，TLC监测反应，反应完后，反应液通过旋蒸浓缩，粗品加中性氧化铝拌样过柱得到黄绿色固体，即为化合物Ru-1(15mg,收率33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.31(d,J＝8.0Hz,2H),8.96(t,J＝9.0Hz,4H),8.31(d,J＝4.9Hz,2H),8.17(t,J＝7.7Hz,2H),8.09(t,J＝7.7Hz,2H),7.98(dd,J＝16.3,6.8Hz,10H),7.67-7.60(m,2H),7.53-7.46(m,2H),7.38-7.28(m,11H),7.22(dd,J＝21.5,8.3Hz,8H),7.12(t,J＝6.8Hz,3H),4.28-4.11(m,4H),2.96(t,J＝7.7Hz,4H),2.64(t,J＝7.7Hz,4H),1.13-0.90(m,4H),0.05(s,18H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.1,156.8,154.0,153.5,151.8,151.6,151.0,148.7,147.2,145.3,139.9,138.7,138.6,137.2,136.4,134.3,134.1,131.1,130.0,129.5,129.4,128.4,127.4,125.8,125.5,123.9,120.7,62.7,36.1,30.4,17.3,1.4.MALDI-TOF-MS m/z:[M-2Cl]+calcd for C90H82N12O4RuSSi22+,1584.49；found,1584.78.
实施例5：NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)的制备
用实施例4制备得到的化合物Ru-1制备NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)，具体步骤如下所示：
称取1mg Ru-1和10mg双亲大分子DSPE-PEG5K溶于1mL四氢呋喃中，超声下至完全溶解，接着在超声破碎仪强烈超声状态下逐滴加入至10mL一级水中，至完全溶解成淡蓝色透明溶液，接着35℃搅拌过夜除去里面的有机溶剂，然后再将上述溶液用50mL超滤离心管(30KDa)超滤浓缩至1mL。即得到NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)。
图5为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒的透射电镜和动态光散射结果；由结果可知，NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒的平均粒径为13.12～13.46nm，平均水合粒径为19.84～22.06nm。
图3为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒在水中的吸收/发射光谱图；测得其最大发射波长为～1000nm，并拖尾至1600nm，最大吸收波长为～780nm，峰形与Ru-1在DCM中的峰形类似，最大吸收和最大发射较Ru-1在DCM中的吸收发射有明显的蓝移，主要是由于溶剂化效应及分子之间聚集态下的相互作用影响。从侧面证明了上述纳米颗粒具有二区发射特性，可以用于近红外二区的成像研究。
图4为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒与ICG(吲哚菁绿)在不同介质中的光稳定性比较结果图；808nm激光持续照射不同介质中的Ru-1dots纳米颗粒及ICG一小时，激光功率密度为0.1W/cm2，ICG在PBS、水及胎牛血清中的荧光信号发生明显的衰减，而Ru-1dots纳米颗粒的荧光信号保持良好。上述结果表明所制备的Ru-1dots较ICG具有优越的光稳定性。
由以上结果可知，所制备的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒具有近红外二区发射波长，且光学性质稳定，可用于进一步成像实验。
实施例6
以下实验为4T1细胞对实施例5得到的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒的摄取实验。
4T1细胞对实施例5得到的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)的摄取实验。
具体步骤如下：
取对数期的4T1细胞置于6孔板中，当细胞密度达到70～80％，将含Ru-1dots(10μM)的DMEM培养基2mL加入至每个复孔，其中一个孔加入空白培养基做对照，然后置于孵育箱中培育1h、3h、6h、12h，接着细胞消化，离心，细胞沉淀用PBS洗涤三次，最后加入200μL PBS，混合均匀，置于近红外二区小动物成像仪下进行成像分析。图6为不同孵育时间下4T1细胞悬液的NIR-II成像图及不同孵育时间下4T1细胞样品的平均荧光强度。由图可知，随着孵育时间的增长，4T1细胞悬浮液的荧光强度明显增加，呈现出对Ru-1dots良好的摄取能力。
实施例7
以下实验为实施例5得到的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒对4T1细胞的毒性。
实施例5得到的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)对4T1细胞的毒性具体步骤如下：
取对数期生长的4T1小鼠乳腺癌细胞培养于96孔板中，待细胞贴壁生长至70％～80％，接着向每孔加入含不同浓度的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)及阳性药物顺铂的培养基100μL，药物浓度分别为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM，继续在孵育箱中培养孵育24h。期间一组Ru-1dots药物组，每孔给予激光(808nm,1W/cm2)照射5分钟。接着小心吸走每孔的培养基，每孔加入100μL含MTT(5mg/mL)的无血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2孵育4h，小心吸走培养基，加入150μL DMSO振荡混匀，使用Tecan InfiniteM1000多功能酶标仪测量在490nm波长的吸光度，计算细胞存活率。每个浓度均设置5个复孔。图7为不同条件下(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM)顺铂、NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒及激光处理下NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒对4T1细胞的细胞毒性。由图可知，随着Ru-1dots及顺铂的浓度增加，4T1细胞的成活率明显降低，且808nm激光联合作用下，Ru-1dots对4T1的细胞毒性明显增强。当浓度大于60μM时，联合作用后的对4T1细胞的细胞毒性明显优于顺铂阳性对照组，而4T1细胞对顺铂药物表现出明显的耐药性。以上结果表明Ru-1dots纳米颗粒对4T1肿瘤细胞具有一定的药物毒性及光活化毒性。
实施例8
以下实验为实施例5得到的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)的光热转换效率
NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)的光热转换效率研究。具体步骤如下：
取Ru-1dots样品300μL置于EP管中，用808nm激光对其进行持续照射，待其温度达到恒温时，撤去激光光源，此过程同时用光热相机记录样品的温度，每隔30s记录一次，并绘制升温冷却曲线。同时测试该样品的紫外吸收发射曲线，记录808nm下的吸光度A808。光热转换效率(η)通过下列方程计算得到：
其中，hs可以通过hs＝mc/τ公式计算得到，m指测试样品的质量，c指水的比热容，τ是冷却系数，可以通过冷却曲线与温度的关系拟合得到，ΔTmax是指最高温度与环境温度的差值，Qs为纯水的散热量，因纯水样品升温不明显，此处可以忽略不计。A808为该样品在808nm处的吸光度。将上述结果代入公式即可得到Ru-1dots纳米颗粒的光热转换效率。图8为NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒的光热转换效率图。如图8(左)所示，避光条件下，不同时间点的DPBF的荧光发射波谱对比无明显的衰减，如图8(右)所示，在808nm的激光持续照射下，分别测定不同照射时间后DPBF的荧光发射光谱，其荧光衰减同样不是很明显，12min后其荧光衰减不到10％，表明该钌(II)多吡啶化合物Ru-1光动力效果不佳，侧面说明了Ru-1dots纳米颗粒无明显的光动力效果。出现上述现象可能是因为808nm的激光能量不足以使Ru-1上的Ru(bpy)2Cl2配体脱落，从而激活周围的O2，产生ROS。
实施例9
以下实验为实施例5得到的NIR-II多吡啶钌(II)配合物纳米颗粒(Ru-1dots)处理4T1细胞后的活死细胞染色实验
实施例5得到的Ru-1dots处理4T1细胞后的活死细胞染色实验。具体步骤如下：
取对数期生长的4T1小鼠乳腺癌细胞培养于12孔板中，每孔加入含有细胞数约1×105的DMEM培养基1mL。在37℃，含5％CO2的细胞孵育箱中培养过夜使细胞贴壁，第二天移走旧的培养基，并分别向孔中加入空白培养基、含Ru-1dots(20μM)培养基各1mL，接着培养24小时，因12孔板面积较大，光源聚焦面积较小，期间给予空白组和药物组激光照射20min，激光选择808nm光纤耦合激光器，功率密度为1W/cm2。24h后，移去旧的培养基，小心的用4℃的PBS洗涤细胞(300μL×2)，避免用力吹打，接着避光条件下向每个孔中加入配好的活死细胞染色工作液100μL，将12孔板置于孵育箱中培养15min。接下来，继续小心的用4℃的PBS洗涤细胞(300μL×2)，避免用力吹打，最后每孔加入100μL PBS，置于倒置荧光显微镜下分别对空白组、单独药物组、单独激光组、药物激光组细胞进行活死细胞成像。图9为不同处理方式下的4T1细胞活死细胞显微成像图。由图可知，Ru-1dots能够对4T1引起细胞死亡，并且在808nm激光照射下能够增强Ru-1dots作用效果。
实施例10
以下实验为实施例5得到的Ru-1dots处理4T1细胞后的细胞凋亡实验
实施例5得到的Ru-1dots处理4T1细胞后的细胞凋亡实验。具体步骤如下：
取对数期生长的4T1小鼠乳腺癌细胞培养于12孔板中，每孔加入含有细胞数约1×105的DMEM培养基1mL。在37℃，含5％CO2的细胞孵育箱中培养过夜使细胞贴壁，第二天移去旧的培养基，并分别向孔中加入空白培养基、含Ru-1dots(20μM)的DMEM培养基各1mL，接着培养24小时，期间给予空白组和药物组激光照射20min,诱导细胞凋亡。24h后，收集每孔上层培养基，下层细胞沉淀用0.25％胰酶(500μL)消化2min,加入培养基(500μL)，小心吹打均匀，使细胞沉淀悬浮，然后与每孔上层培养基收集一起，1000g离心5min，移去上层清液，下层细胞沉淀用PBS洗涤3次，1000g离心5min,移去上层清液，加入细胞凋亡Annexin V-FITC/PI工作液(索莱宝生物试剂)，轻轻混匀，避光染色15min,接着对空白组、单独药物组、单独激光组、药物激光组细胞进行流式细胞凋亡分析。图10为不同处理方式下4T1细胞的FITC-AnnexV/PI凋亡流式图。由图可知，Ru-1dots能够对4T1引起细胞凋亡，并且在808nm激光照射下能够增强Ru-1dots诱导4T1细胞凋亡的作用。
实施例11
以下实验为实施例5得到的Ru-1dots对乳腺癌荧光成像的研究
Ru-1dots对乳腺癌荧光成像的研究。具体步骤如下：
接种前，对小鼠右后肢进行脱毛处理，取对数期4T1小鼠乳腺癌细胞溶于1.5mL无血清的DMEM培养基配成细胞悬浮液，浓度约为1×107个细胞/毫升。将上述细胞悬液接种至15只小白鼠右后肢，每只100μL的体积，约3-4周后，肿瘤体积长至100～200mm3，即可分组用于小鼠肿瘤成像及治疗实验。
待上述4T1模型鼠右后肢肿瘤体积长至100～200mm3，将肿瘤模型鼠通过腹腔注射125μL戊巴比妥钠(1mg/mL)麻醉，待小鼠麻醉后，立马通过尾静脉注射200μL Ru-1dots纳米颗粒水溶液(1mg/mL)，将小鼠置于近红外二区成像系统采集不同时间点的荧光图像，研究其肿瘤部位对Ru-1dots的摄取规律。小动物活体成像仪所用相机为InGaAs检测器。激发光源为808nm波长光纤耦合激光器，成像激光功率密度约为0.1W/cm2，滤光片选择1000nm长通滤光片。肿瘤体积按如下公式计算：
图11为不同时间点下，4T1皮下肿瘤模型的近红外二区成像及肿瘤区荧光强度随时间变化的散点图。由图可知，形成的Ru-1dots能够有效富集在肿瘤部位并且延长化合物在血液以及肿瘤组织的滞留时间。
实施例12
以下实验为乳腺癌皮下肿瘤模型化疗及光热治疗研究
乳腺癌皮下肿瘤模型化疗及光热治疗研究。具体步骤如下：
待肿瘤长至100～200mm3时，将上述25只雌性BLAB/c的小白鼠随机分为5组，每组5只，分别设定为空白组、单独808nm激光组、Ru-1dots药物组、Ru-1dots加激光照射组以及阳性顺铂药物组。药物浓度按金属质量浓度计算分别为Ru-1dots(Ru:1mg/kg)、顺铂(Pt：1mg/kg)，空白组和单独激光组给予每只小鼠尾静脉注射200μL PBS。激光组和给药激光组分别在注射药物24h后激光照射肿瘤区域10min，并用红外相机监测不同时间点的温度变化，激光采用功率密度为1W/cm2的808nm激光。治疗过程中隔天监测记录小鼠体重及肿瘤体积变化。
图12为给药组和空白组小鼠体内光热效果。
图13为(a)不同治疗组的小鼠肿瘤体积变化曲线；(b)治疗过程中各组小鼠的体重变化曲线；(c)治疗结束后各组小鼠肿瘤离体图片；(d)治疗结束后各组离体肿瘤质量；(e)治疗结束后4T1肿瘤小鼠的照片。
实施例13
以下实验为组织切片及生化指标分析
组织切片及生化指标分析。具体步骤如下：
取9只ICR雌性小白鼠随机分为5组，分别尾静脉注射200μL Ru-1dots、PBS、顺铂，浓度与治疗浓度一致，72小时后，通过眼眶取外周血，静置30min，离心取上层血清，用于生化指标(ALT、AST、ALP、T-Bill、Creatinine、BUN)的分析，同时每只小鼠进行离体取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，并用组织固定液固定，用于组织切片及免疫组化分析。
图14：(a)为不同实验组中ICR小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色；(b)不同实验组小鼠血液生化指标(AST、ALT、ALP、T-Bill、BUN、Creatinine)。以上结果说明Ru-1dots具有良好的生物相容性，不会引起类似顺铂的肾损伤作用。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种NIR-II多吡啶钌(II)配合物，其特征在于，所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物结构式如式Ru-1所示：
2.根据权利要求1所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物，其特征在于，所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物的荧光发射波长为1100～1600nm。
3.一种纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒包含权利要求1或2所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物自组装形成。
5.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的直径为13～14nm。
6.权利要求1或2所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物或权利要求3-5任一项所述的纳米颗粒在制备用于生物体内成像的近红外二区荧光成像探针中的应用。
7.权利要求1或2所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物或权利要求3-5任一项所述的纳米颗粒在制备抗乳腺癌皮下肿瘤药物中的应用。
8.一种权利要求1或2所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物由化合物(8)制备得到，所述化合物(8)制备所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物的反应式如下所示：
化合物(8)制备所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物包括如下步骤：将化合物(8)、化合物(11)置于单口烧瓶中，加入冰醋酸，在100～110℃下回流10～20小时，TLC监测反应，反应完成后，浓缩反应液，浓缩后将所得粗品加中性氧化铝拌样过柱得到黄绿色固体，即为所述NIR-II多吡啶钌(II)配合物。
9.根据权利要求8所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述化合物(8)与所述化合物(11)的摩尔比为1:1。
10.根据权利要求8所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述化合物(11)由化合物(10)制备得到，所述化合物(10)制备化合物(11)的反应式如下所示：
所述化合物(10)制备化合物(11)包括如下步骤：
取化合物(10)、1,10-菲啰啉-5,6-二酮溶于甲醇和水的混合溶剂中，加入到反应容器，在80～100℃加热回流5～10h，TLC点板监测反应，冷却至15～35℃，加入丙酮置于0℃下过夜，析出沉淀，过滤，滤饼用水洗涤，乙醚重结晶，过滤干燥得到黑色固体，即为化合物(11)。
11.根据权利要求10所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述化合物(10)制备化合物(11)的步骤中，化合物(10)与1,10-菲啰啉-5,6-二酮的摩尔比为1:1；所述甲醇、水和丙酮的体积比为1:1:5。
12.根据权利要求10所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述化合物(10)由化合物(9)反应得到，所述化合物(9)制备化合物(10)的反应式如下所示：
化合物(9)制备化合物(10)包括如下步骤：
取化合物(9)、RuCl3·xH2O和LiCl溶于DMF中，加入到反应容器，在140～160℃下加热反应6～10h，反应结束后，冷却至15～35℃，加入丙酮置于0℃下析出沉淀，过滤得到紫红色固体，用水洗涤将所得紫红色固体，乙醚重结晶，过滤干燥，即得化合物(10)。
13.根据权利要求12所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，化合物(9)制备化合物(10)的步骤中，控制RuCl3·xH2O、化合物(9)和LiCl的摩尔比为2400:6000:1。
14.根据权利要求8所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述化合物(8)由化合物(1)反应得到，所述化合物(1)制备化合物(8)的反应式如下所示：
化合物(1)制备化合物(8)包括如下步骤：
步骤1)：取化合物(1)、乙基(三苯基膦)乙酸酯混匀加入到反应容器中，加入四氢呋喃溶解，15～35℃在15～35℃下反应18～30小时，反应完后，旋干反应液，纯化，得到亮黄色油状产物，即为化合物(2)；
步骤2)：取步骤1)得到的化合物(2)加入到反应容器中，加入乙酸乙酯溶解，氢气氛围下加入10％Pd/C，置换三次氮气，混合物在氢气氛围下在15～35℃下反应18～30小时15～35℃，反应完后，反应混合物用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，旋干滤液得到浅黄色油状物，即为化合物(3)；
步骤3a)：称取步骤2)得到的化合物(3)加入到反应容器中，加入四氢呋喃溶解，反应瓶置于0～5℃冰水浴中，称取LiOH溶于水缓慢加入至反应体系中，待加入完毕，将冰水浴撤去，在15～35℃下反应18～30小时15～35℃，点板监测，反应完毕，反应液用盐酸调pH至1-3，往其中加入水，用EA萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色油状粗品；
步骤3b)：将步骤3a)得到的粗品溶解于二氯甲烷，加入到反应容器，置于冰水浴中，加入DMAP，EDCI搅拌均匀，接着加入三甲基硅乙醇，在15～35℃下反应18～30小时15～35℃，TLC点板监控反应完全，将反应液倒入水中，DCM萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到粗品，纯化得到黄色油状物，即为化合物(4)；
步骤4)：称取步骤3b)得到的化合物(4)溶于二氯甲烷中，加入到反应容器，在15～35℃下15～35℃，依次加入NH4Ac、NBS，在15～35℃下15～35℃搅拌均匀，加入水淬灭反应，将反应液倒入水中，DCM萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色油状物，即为化合物(5)；
步骤5)：称取步骤4)得到的化合物(5)、联硼酸频那醇酯和乙酸钾，加入到反应容器，溶解于DMF中，置换N2，N2氛围下加入催化剂Pd(PPh)3Cl2，置换N2，反应液置于油浴锅中，N2氛围下反应，TLC监控，反应完全，反应液冷却至15～35℃15～35℃，倒入水中，EA萃取，浓缩有机相，纯化得到无色油状物，即为化合物(6)；
步骤6)：称取步骤5)得到的化合物(6)、4,7-二溴-5,6-二硝基苯并噻二唑和K2CO3溶解于甲苯和水的混合溶剂中，加入到反应容器，置换N2，N2氛围下加入催化剂Pd(PPh3)4，置换N2，反应液置于油浴锅中，N2氛围下反应，TLC监控，反应完全，反应液冷却至15～35℃15～35℃，倒入水中，EA萃取，浓缩有机相，纯化，得到紫红色化合物(7)；
步骤7)：称取步骤6)得到的化合物(7)、锌粉、氯化铵，加入到反应容器，溶解于DCM、甲醇及水的混合溶剂中，15～35℃15～35℃反应1～3h，反应液由紫色变为黄色，通过硅藻土过滤，滤饼用DCM洗涤，滤液旋干得到黄色化合物(8)。
15.根据权利要求14所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，化合物(1)与乙基(三苯基膦)乙酸酯的摩尔比为0.8:1。
16.根据权利要求14所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3a)使用的化合物(3)、所述步骤3a)使用的LiOH、所述步骤3b)使用的DMAP与所述步骤3b)使用的EDCI的摩尔比是1:5：0.2：1.6；所述步骤3a)中，四氢呋喃和水的体积比为5:1。
17.根据权利要求14所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，化合物(4)、NH4Ac与NBS的摩尔比是1:0.1:1.1。
18.根据权利要求14所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，化合物(5)、联硼酸频那醇酯、乙酸钾和催化剂Pd(PPh)3Cl2的摩尔比为10：12：24：1。
19.根据权利要求14所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中，化合物(6)、4,7-二溴-5,6-二硝基苯并噻二唑、K2CO3和Pd(PPh3)4的摩尔比为1:1:3.2:0.1。
20.根据权利要求14所述的NIR-II多吡啶钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中，化合物(7)、锌粉、氯化铵的摩尔比为1：119：36；DCM、甲醇和水的体积比为1:1:0.1。
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