CN111053904B - 一种基于染料和聚合物构筑的j聚集体光热纳米试剂的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于染料和聚合物构筑的J聚集体光热纳米试剂的制备方法和用途。该纳米光热试剂以氟硼二吡咯染料分子和高分子聚合物为基本构筑单元，在水溶液中共组装，得到了可以在水体系稳定分散的J聚集体纳米溶液。J聚集体的形成使得染料分子的光物理/化学性能发生改变，吸收光谱红移了100多纳米、摩尔消光系数明显增大，表现出良好的光热转化效果。结合进一步的超分子结构重塑，使得J聚集体材料的形貌转化为了纳米颗粒，材料的细胞摄取率增强，更好的实现了材料的生物应用。本发明提出的J聚集体纳米光热材料，具备生物相容性好、光热转化效率高，可耐受光漂白等诸多优点，在光热治疗和光声成像领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料领域，具体涉及一种由氟硼二吡咯(BODIPY)染料分子和高分子聚合物共组装构筑的J聚集体光热纳米材料的制备方法和生物应用。
背景技术
光热治疗(PTT)作为一种重要的肿瘤治疗手段因其具有创伤小、治疗方式简单、恢复快等优点，得到了科学家的广泛关注。在光热治疗中，光热试剂将光能转化为热能，进而实现肿瘤的热消融。就目前报道的光热试剂而言，有机小分子光热试剂由于需要复杂的合成过程，使得想要获得低毒、热转化效率高、近红外吸收的光热试剂存在一定困难，且制备出的有机小分子光热试剂常常不具备光稳定性，在治疗过程中容易发生光漂白；而对于无机光热试剂虽具有近红外吸收和较高的光热转化效率，但其不确定的生物毒性以及难降解等缺点也使得该类材料的应用受到了一定的限制。
对于J聚集体材料而言，很好的利用了分子间的强π-π相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用等非共价相互作用，使得染料分子有序堆叠，并伴随其光物理、光化学性能改变，就能量耗散途径而言，辐射跃迁和隙间穿越会受到极大的抑制，而非辐射跃迁效率则会明显增强，这样就可以在提高材料光热转化效率的同时，增强材料的光热稳定性。
BODIPY分子作为一种常见的荧光染料、光敏剂分子在生物成像、治疗等领域展现出了应用潜能。BODIPY染料J聚集体的形成为染料分子的功能拓展提供了一种简单易行的方案，也使得开发新的生物应用材料成为可能。因此，在本发明中我们积极创新，利用结构简单易于合成的BODIPY染料分子和生物相容性好的高分子共组装，研发出了构筑纳米J聚集体的方法，实现了吸收光谱的红移，得到了光热稳定性好、可耐受光漂白且具有高光热转化效率的光热试剂。该项发明为J聚集体纳米光热试剂的构筑提供了研究思路，同时为该类材料在生物领域的应用扩展提供了借鉴。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于BODIPY染料和高分子共组装构筑的J聚集体纳米光热试剂的制备方法和用途。我们研究出了一整套材料制备方法，得到了J聚集体纳米试剂，该纳米试剂可以在水体系稳定分散、具有光热转化效率高、可耐受光漂泊、生物相容性好等优良特点，可以在活体水平实现肿瘤的高效光热治疗。
本发明提供了以下BODIPY染料分子，其结构式详见附图3。
本发明提供的聚合物为PEG113-b-PCL8，其结构式详见附图2。
本发明所提供的技术方案如下：我们选择易于化学合成且合成产率高的BODIPY分子为聚集材料的核心，与生物相容性好且在水溶液中不易自组装的聚合物PEG113-b-PCL8相结合，通过特定的组装方式结合超分子材料纳米结构重塑等方法制备出J聚集体纳米光热试剂。
通过紫外-可见吸收光谱测试发现：制备得到的J聚集体纳米光热试剂的吸收峰位于780nm左右，与BODIPY染料的单体状态吸收光谱相比红移了100nm左右。将其分散在纯水、生理盐水、PBS、细胞培养基等溶液中，室温环境下放置，每天测试其吸收光谱，无明显变化，说明其具有胶体稳定性，可以在复杂生理环境下稳定而不发生解聚集现象。
J聚集体纳米光热试剂结构重塑的方法：取上述J聚集体纳米溶液，加入到截留分子量为10K、体积大小为15mL的millipore超滤管中，在2000RPM条件下离心4-6次，每次1个小时。每次离心结束后弃去下层水溶液，重新向上层离心管中补加超纯水至15mL再分散后，继续离心。即可得到结构重塑后的J聚集体纳米光热试剂的浓溶液，将其作为母液保存在4℃备用。
通过紫外-可见吸收光谱测试发现：结构重塑后的J聚集体纳米光热试剂的吸收光谱与上述结构重塑前溶液的吸收光谱无明显差异。通过透射电子显微镜观察其形貌为160纳米左右的纳米颗粒；同样可以在纯水、生理盐水、PBS、细胞培养基等溶液中稳定分散数天。
对于本发明中提出的J聚集体纳米光热试剂，具有以下突出优势：(1)光谱红移进入近红外光区，摩尔消光系数增强，具有较高的光热转化效率；(2)具有突出的光热稳定性，在高强度激光照射下，仍可保持吸收光谱稳定、光热转化效果恒定。
综上，本发明中提出的J聚集体纳米光热试剂的制备以及应用具备以下有益效果：具有光热性能好、稳定性强等多方面优势；在生物治疗中展现出了良好的治疗效果，具备光声成像的应用潜能；利用易于合成、结构简单的BODIPY染料构筑J聚集体纳米光热材料的方法为新型光热治疗试剂的开发提供了思路借鉴；提出了超分子纳米结构重塑的方法，结构重塑前后其细胞摄取明显增强，但光热转化能力保持不变。
附图说明
图1为本发明中所设计的染料分子的合成路线。
图2为本发明中所设计的聚合物分子式。
图3为本发明中所设计的染料分子的结构式。
图4为本发明中制备的J聚集体光热试剂J1的吸收光谱。
图5a为本发明中制备的J聚集体光热试剂J2和J3以及单体Ph-BDBr的吸收光谱；图5b为J3的透射电子显微镜照片；图5c为J3的粒径统计图。
图6为本发明中制备的J聚集体光热试剂J4和J5的吸收光谱。
图7为本发明中制备的J聚集体光热试剂J4和J5在六次光热循环过程中温度的变化情况。
图8为本发明中制备的J聚集体光热试剂J3与ICG对比测试光稳定性循环实验中样品的温度变化情况。
图9为4T1细胞对J聚集体光热试剂J2和J3摄取量的对比图。
图10为乳腺癌肿瘤荷瘤小鼠在不同对照组中，瘤内给药治疗一次后，在治疗周期里肿瘤体积的变化情况。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的深入说明，实施例是为了对本发明做详细描述，但本发明的保护范围不仅仅限于以下实施例。
实施例1：四种疏水性BODIPY染料分子的合成，分子结构式见附图3，合成路线见附图1。化合物2的合成：将化合物1(1.83g,5.0mmol)和N-氯代丁二酰亚胺(NCS)(2.0g,15.0mmol)溶解在100mL甲醇中，再向其中加入少量硫脲(0.1g)，30℃反应约3h。期间点板监控，当化合物1消耗完时，停止反应，旋蒸除去溶剂后，经柱层析PE/DCM(1/1,v/v)纯化后即可得到红色固体产物2(1.83g)产率为84.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.98(s,2H),2.58(s,6H),2.36(s,3H),2.08(s,6H),1.37(s,6H)。
化合物MePh-BDCl的合成。将3,4-二甲氧基苯甲醛(498.5mg,3.0mmol)溶解于50mL干燥的乙腈溶液中并加入少量分子筛作为除水剂，在氩气保护下向其中加入0.5mL哌啶和0.5mL冰乙酸，室温条件下搅拌10min后，再向其中加入化合物2(435.1mg,1.0mmol)，85℃回流反应6h。直到化合物2消耗完，停止反应，旋蒸除去溶剂，将所得粗产物溶解于EA并用饱和氯化铵、饱和食盐水分别洗涤三次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩，经柱层析PE/二氯甲烷(DCM)(1/8,v/v)纯化后得到深红金属色固体产物MePh-BDCl(0.52g)产率为70.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.99(d,J＝16.6Hz,2H),7.62(d,J＝16.6Hz,2H),7.26-7.21(m,2H),7.16(d,J＝2.0Hz,2H),7.00(s,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),3.96(d,J＝13.8Hz,12H),2.38(s,3H),2.11(s,6H),1.42(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)150.42,149.17,147.14,139.27,139.08,138.68,137.66,135.38,135.34,130.73,130.59,130.23,129.21,121.64,116.17,111.17,109.78,56.03,55.96,21.29,19.71,10.68.HRMS(MALDI):m/z[M]calcd for C40H39BCl2F2N2O4 730.2348；found 730.2351。
化合物4的合成。将化合物1(1.62g,5.0mmol)和N-氯代丁二酰亚胺(NCS)(2.0g,15.0mmol)溶解在100mL甲醇中，再向其中加入少量硫脲(0.1g)，30℃反应约3h。期间点板监控，当化合物1消耗完时，停止反应，旋蒸除去溶剂后，经柱层析PE/DCM(1/1,v/v)纯化后即可得到红色固体产物2(1.58g)产率为80.6％。
化合物Ph-BDCl的合成。依据化合物MePh-BDCl的制备方法合成化合物Ph-BDCl，产率为67.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.99(d,J＝16.6Hz,2H),7.62(d,J＝16.6Hz,2H),7.58-7.49(m,3H),7.33-7.27(m,2H),7.23(dd,J＝8.3,1.9Hz,2H),7.16(d,J＝1.9Hz,2H),6.90(d,J＝8.3Hz,2H),3.95(d,J＝13.4Hz,12H),1.40(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)150.50,149.19,147.30,138.89,138.80,138.37,134.69,131.39,130.18,129.48,129.34,128.39,121.95,121.76,116.11,111.18,109.75,56.02,55.93,11.78。HRMS(ESI):m/z[M+NH4]+calcd for C40H43BCl2F2N3O4 706.2216；found 706.2209。
化合物5的合成。将化合物1(1.62g,5.0mmol)溶解在100mL DCM，之后向其中缓慢加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(2.22g,12.5mmol)，室温反应约1h。期间点板监控，当化合物1消耗完时，停止反应，旋蒸除去溶剂后，经柱层析PE/DCM(1/1,v/v)纯化后即可得到红色固体产物2(2.3g)产率为89.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.98(s,2H),2.61(s,6H),2.36(s,3H),2.07(s,6H),1.38(s,6H)。
化合物MePh-BDBr的合成。将3,4-二甲氧基苯甲醛(498.5mg,3.0mmol)溶解于50mL干燥的乙腈溶液中并加入少量分子筛作为除水剂，在氩气保护下向其中加入0.5mL哌啶和0.5mL冰乙酸，室温条件下搅拌10min后，再向其中加入化合物5(524.1mg,1.0mmol)，室温反应6h。直到化合物5消耗完，停止反应，旋蒸除去溶剂，将所得粗产物溶解于EA并用饱和氯化铵、饱和食盐水分别洗涤三次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩，经柱层析PE/二氯甲烷(DCM)(1/9,v/v)纯化后得到深红金属色固体产物MePh-BDBr(0.57g)产率为68.9％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.08(d,J＝16.6Hz,2H),7.61(d,J＝16.5Hz,2H),7.26-7.20(m,2H),7.16(d,J＝2.0Hz,2H),7.00(s,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),3.96(d,J＝13.2Hz,12H),2.38(s,3H),2.11(s,6H),1.44(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)150.42,149.18,148.19,140.30,139.31,139.07,138.88,135.31,131.28,130.92,130.15,129.26,121.64,116.42,111.17,110.00,109.79,56.03,55.97,21.29,19.72,12.57.HRMS(MALDI):m/z[M]calcd for C40H39BBr2F2N2O4 820.1317；found 820.1327。
化合物6的合成。依据化合物5的制备方法合成化合物6，产率为85.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.52(q,J＝3.0Hz,3H),7.25(d,J＝7.3Hz,2H),2.61(s,6H),1.36(s,6H)。
化合物Ph-BDBr的合成。依据化合物MePh-BDBr的制备方法合成化合物Ph-BDBr，产率为61.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.08(d,J＝16.5Hz,2H),7.69-7.47(m,5H),7.38-7.24(m,4H),7.16(s,2H),6.90(dd,J＝8.5,2.6Hz,2H),3.95(dd,J＝12.8,2.6Hz,12H),1.42(d,J＝2.6Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)150.49,149.20,148.35,141.00,138.99,138.82,134.88,132.09,130.11,129.51,129.38,128.38,121.76,116.36,111.18,110.30,109.78,56.02,55.95,13.73.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C37H34BBr2F2N2O4779.0921；found 779.0896。
实施例2。染料Ph-BDCl制备J聚集体光热试剂J1的方法：将Ph-BDCl溶于干燥的丙酮，得到其饱和溶液。称取高分子聚合物PEG113-b-PCL8 10mg加入200μL丙酮，在37℃下搅拌使其充分溶解，之后向其中加入10mL超纯水，在37℃900RPM条件下搅拌3min，之后向其中快速滴加Ph-BDCl染料分子的丙酮饱和溶液1mL，在此条件下继续搅拌24小时，过0.45μm水系滤膜，即可得到Ph-BDCl染料的J聚集体光热试剂J1，浓度约为60μM。其吸收光谱变化如附图4所示。
实施例3。Ph-BDBr染料与聚合物构筑的J聚集体光热试剂J3的制备方法：将Ph-BDBr分子溶于丙酮，得到其饱和溶液。称取10mg聚合物PEG113-b-PCL8，加入少量丙酮，在37℃下搅拌使其充分溶解，之后向其中加入10mL超纯水，在37℃900RPM条件下搅拌3min，之后向其中快速滴加BODIPY染料分子的饱和溶液3mL，在此条件下继续搅拌24小时。即可得到Ph-BDBr染料结构重塑前的J聚集体溶液J2。之后将该溶液，加入到滤膜截留分子量为10K、体积大小为15mL的millipore超滤管中，在2000RPM条件下离心6次，每次1个小时。每次离心结束后弃去下层水溶液，重新向上层离心管中补加超纯水至15mL，继续离心。最终可以得到浓度为1.5mM左右的结构重塑后的J聚集体光热试剂J3 0.6mL。其吸收光谱如附图5a所示，其形貌为160纳米左右的颗粒如附图5b所示，粒径统计结果如附图5c所示。
实施例4。染料MePh-BDCl构筑的J聚集体光热试剂J4的制备方法：首先将染料分子MePh-BDCl溶解在有机溶剂丙酮中，得到该染料的饱和溶液。之后取0.5mL溶解有染料的有机溶液，向其中加入10毫克聚合物PEG113-b-PCL8固体粉末，37℃下搅拌使其充分溶解并混合均匀。最后在900RPM搅拌37℃水浴加热环境下，向其中缓慢滴加10毫升去离子水，滴加完成后，维持该条件继续搅拌24h，即可得到MePh-BDCl染料的J聚集体溶液，浓度约为30μM。测试样品的吸收光谱光谱，如附图6所示。
实施例5。染料MePh-BDBr构筑的J聚集体光热试剂J5的制备方法：将MePh-BDBr染料分子溶解在有机溶剂四氢呋喃中，得到该染料的饱和溶液。之后取0.5mL溶解有该染料的有机溶液，向其中加入10毫克聚合物PEG113-b-PCL8固体粉末，37℃下搅拌使其充分溶解并混合均匀。最后在900RPM搅拌37℃水浴加热环境下，向其中缓慢滴加10毫升去离子水，滴加完成后，维持该条件继续搅拌24h，即可得到MePh-BDBr染料的J聚集体溶液，浓度约为30μM。测试样品的吸收光谱，如附图6所示。
实施例6。对BODIPY染料J聚集体溶液光热转化性能的进行评估：取上诉染料MePh-BDCl和MePh-BDBr制备得到的J聚集体光热试剂J4和J5各10μM，用808nm激光器高强度3W/cm2照射样品3min，使其自然降温冷却，以此为一个循环，照射样品六次，评估样品的光热稳定性。如附图7所示，两种J聚集体光热试剂的光热转化效果恒定，具有很好的耐受光漂泊的能力。
实施例7。Ph-BDBr J聚集体纳米光热试剂J3的光热稳定性评估：与FDA批准的临床使用的光热试剂吲哚菁绿(ICG)相比，等吸收条件下使用785nm激光器1.5W/cm2照射ICG样品10min，其温度上升仅有8℃，且照射过程中光漂白明显；而同样条件下照射J聚集体纳米光热试剂J3的溶液温度可上升24℃，且经历五次光热循环后，其光谱没有发生明显变化，光热转化能力稳定，表现出良好的耐受光漂白能力，如附图8所示。
实施例8。对4T1细胞分别给药本发明中制备的结构重塑前后的Ph-BDBr J聚集体纳米光热材料J2和J3 20μM，给药不同时间后，收集细胞，并将细胞裂解，提取其中的染料分子Ph-BDBr，测试得到细胞对两种材料的摄取量差异，如附图9所示。
实施例9。Ph-BDBr J聚集体纳米纳米光热试剂J3应用于活体抗肿瘤研究：选用本发明中研发的光热试剂J3进行进一步的活体肿瘤抑制实验，瘤内注射光热试剂后，经过一次光热治疗即可很好的实现肿瘤的热消融、抑制肿瘤生长的效果，实验结果如附图10所示。
上述J聚集体纳米光热试剂的制备方法，适用于大部分疏水性的BODIPY染料，具有一定的通用性。通过与亲疏水特定比例的聚合物共组装，很好的光热试剂实现了100纳米左右的光谱红移，使得材料的吸收光谱进入到近红外光区且摩尔消光系数增大，更利于光热材料实现高效的光热转化，且具有突出的抗光漂白能力。
值得提出的是，在本发明中聚合物的引入不仅稳定了J聚集体纳米材料使其不易发生聚沉，赋予了其良好的水分散性，在一定程度上提高了材料的生物相容性，使其在生物体系使用更安全，而且赋予了超分子材料一定的可修饰性，更利于材料纳米结构重塑。进而充分展现了本发明制备得到的光热材料在生物医药领域的应用潜能。
本发明中提出的整套材料制备方法，为新型纳米光热试剂的研发开辟了新的路径。
Claims (9)
1.一种J聚集体光热纳米试剂的制备方法，其特征在于J聚集体光热纳米试剂是通过疏水性的BODIPY染料分子和两亲性的嵌段聚合物PEG113-b-PCL8共组装构筑的，具体包括以下步骤：
1)两种BODIPY染料分子Ph-BDCl或Ph-BDBr的纳米J聚集体溶液的制备方法一：
将BODIPY染料分子Ph-BDCl或Ph-BDBr溶于其良溶剂中，得到其饱和溶液；称取10mg嵌段聚合物加入少量体积丙酮，在37℃下搅拌使其充分溶解，之后向其中加入10mL超纯水，在37℃900RPM条件下搅拌3min，之后向其中快速滴加BODIPY染料分子的饱和溶液1-3mL，在此条件下继续搅拌24小时，过0.45μm水系滤膜，即得到Ph-BDCl或Ph-BDBr的纳米J聚集体溶液；
两种BODIPY染料分子MePh-BDCl或MePh-BDBr的纳米J聚集体溶液的制备方法二：
称取一定质量的BODIPY染料分子MePh-BDCl或MePh-BDBr和10mg嵌段聚合物混溶于少量良溶剂中，在37℃下搅拌使其充分溶解，之后向其中加入10mL超纯水，在37℃900RPM条件下搅拌24小时，过0.45μm水系滤膜，即得到MePh-BDCl或MePh-BDBr的纳米J聚集体溶液；
2)四种BODIPY染料分子MePh-BDCl、Ph-BDCl、MePh-BDBr、Ph-BDBr的纳米J聚集体的结构重塑：
分别取上述四种BODIPY染料分子MePh-BDCl、Ph-BDCl、MePh-BDBr、Ph-BDBr的纳米J聚集体溶液，加入到截留分子量为10K、体积为15mL的millipore超滤管中，在2000RPM条件下离心6次，每次1小时，每次离心结束后弃去下层溶液，重新向上层离心管中补加超纯水至15mL，继续离心，最终得到0.6mL的纳米J聚集体浓溶液，将其作为母液保存在4℃条件下备用，得到J聚集体光热纳米试剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于疏水性的BODIPY染料分子溶于的良溶剂为：二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、丙酮。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于J聚集体的制备过程是先将嵌段聚合物PEG113-b-PCL8溶解分散在水中，之后再向其中加入BODIPY染料分子的饱和溶液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于J聚集体的制备过程中向水中加入BODIPY染料分子饱和溶液的体积有要求，根据BODIPY染料分子溶解性差异，饱和溶液体积有所不同，对于Ph-BDCl分子所需的体积为1mL，对于Ph-BDBr所需的体积为3mL。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于初期制备得到的纳米J聚集体，经过进一步的超滤过程使其形貌转化为纳米颗粒，从而提高其细胞摄取率，以实现其在生命体系中的应用。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于超滤过程选择转速2000RPM，离心时间6小时，使其形貌得到充分转化。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的J聚集体光热纳米试剂，其特征在于该J聚集体光热纳米试剂具有良好的光热转化能力以及耐光漂白效果。
8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的J聚集体光热纳米试剂在制备抗肿瘤光热试剂以及光声成像试剂方面的应用。
9.疏水性BODIPY染料分子化合物MePh-BDCl、Ph-BDCl、MePh-BDBr、Ph-BDBr的制备方法，其特征在于
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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