CN115057889A - 一种生物素修饰钌(ii)配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种生物素修饰钌(ii)配合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，提供了一种生物素修饰钌(II)配合物及其制备方法和应用。本发明将生物素引入钌配合物中，以肿瘤细胞表面的生物素受体作为识别肿瘤细胞的靶点，生物素作为靶向运输药物基团，选择性的将药物输送到生物素受体过量的肿瘤细胞内，从而实现钌配合物的靶向选择性。因此，本发明提供的生物素修饰的钌(II)配合物可有效区分正常细胞和肿瘤细胞，抗肿瘤效果好，对正常细胞的毒性小，在抗肿瘤药物的制备中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种生物素修饰钌(II)配合物及其制备方法和应用。
背景技术
钌配合物因其独特的生物学特性，已成为有前途的潜在抗癌剂之一。目前，钌配合物NAMI-A、KP1019、KP1339和TLD1433已进入临床试验，获得广泛的关注和研究。但是钌(II)配合物仍面临跨膜吸收差、选择性差等问题，进而限制了它的发展和应用。研究发现炔基修饰的钌配合物能够促进药物的分子跨膜吸收能力，增强药物进入细胞的几率，还能够增加药效并降低药物毒副作用。但是大多数化合物仍不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞，在杀死癌细胞的同时，正常细胞也受损害，从而产生一定的毒副作用。因此，开发能够有效识别正常细胞和肿瘤细胞内在差异的肿瘤特异性抗癌药物是癌症化疗的迫切需要，并在近年来受到越来越多的关注。
研究者利用癌细胞和正常细胞的不同特性，将靶向基团与药物结合，以增强其对癌细胞的靶向识别能力。众所周知，所有的活细胞在生命周期中都需要消耗维生素，特别是对于那些快速分裂的癌细胞。所以，参与摄取维生素的受体在癌细胞表面过度表达。因此，这些维生素受体可作为肿瘤细胞成像以及肿瘤靶向药物传递的有用的生物标记物。生物素、叶酸、维生素B12和核黄素是所有细胞分裂所必需的维生素，特别对于癌细胞的生长而言。叶酸受体被认为是靶向药物传递的潜在生物标记物，迄今已有显著进展。相反，生物素受体直到最近才开始研究。生物素(维生素H或B7)是细胞水平的生长促进剂，其在肿瘤组织中的含量明显高于正常组织，癌细胞对其摄取主要与钠依赖的多种维生素转运蛋白(SMVT)有关，而这种受体在多种癌细胞系(如乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和肾癌细胞)中过表达。此外，在许多癌细胞中，生物素受体过表达高于叶酸/维生素B12受体。
目前，以生物素为基础的抗癌药物种类较少，将生物素和钌配合物结合的化合物在抗肿瘤中的应用也少有报道，亟需开发新型的钌配合物，促进钌配合物在抗癌药物中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种生物素修饰钌(II)配合物及其制备方法和应用。本发明提供的生物素修饰钌(II)配合物能够有效区分正常细胞和肿瘤细胞，抗肿瘤效果好，对正常细胞的毒性小，在抗肿瘤药物的制备中具有广阔的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种生物素修饰钌(II)配合物，具有式I所示结构：
式I中：R为-C6H5、-C6H5F、-C6H5Cl、-C6H5Br、-C6H4CF3、-C6H4C≡CC6H5、-CH＝CHC6H5或-C6H4CF3；
优选的，所述生物素修饰钌(II)配合物为以下结构的化合物中的任意一种：
本发明提供了上述方案所述生物素修饰钌(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物、乙酸铵和冰乙酸混合进行缩合反应，得到配体；所述醛类化合物的化学式为RCHO；所述配体的结构如式A所示；
式A和RCHO中，R的种类和式I中一致；
(2)将所述配体、前体化合物和溶剂混合进行配位反应，得到钌(II)配合物；所述前体化合物为[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]、L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，其中bpy表示联吡啶，phen表示邻菲罗啉，py表示吡啶；所述钌(II)配合物的结构如式B所示：
式B中
的种类和式I中一致；
(3)将所述钌(II)配合物、1,4-二溴丁烷、焙烧碳酸钾和溶剂混合进行第一取代反应，得到烷烃链修饰的钌(II)配合物，所述烷烃链修饰的钌(II)配合物的结构式如式C所示：
(4)将所述烷烃链修饰的钌(II)配合物、生物素、焙烧碳酸钾、KI和溶剂混合进行第二取代反应，得到具有式I所示结构的生物素修饰钌(II)配合物。
优选的，所述步骤(1)中1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物和乙酸铵的摩尔比为1:1.5:43～44；
所述缩合反应的温度为100～120℃，时间为4～6h。
优选的，所述步骤(2)中前体化合物和所述配体的摩尔比为1:1.4～1.6；
所述配位反应的温度为110～120℃，时间为6～24h。
优选的，所述L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2和D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2的制备方法包括以下步骤：
将[Ru(bpy)2Cl2]、吡啶和水混合进行反应，得到[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，将所述[Ru(bpy)2(py)2Cl2]进行手性拆分，得到L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]和D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]；所述手性拆分用拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠或O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠；当所述拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠时，所得产物为L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，当所述拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠时，所得产物为D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]。
优选的，所述步骤(3)中钌(II)配合物和1,4-二溴丁烷的摩尔比为1:40～1:100；
所述第一取代反应的温度为60～90℃，时间为6～24h。
优选的，所述步骤(4)中烷烃链修饰的钌(II)配合物和生物素的摩尔比为1:1.1～1.2；
所述第二取代反应的温度为55～60℃，时间为24～48h。
本发明还提供了上述方案所述的生物素修饰钌(II)配合物或上述方案所述生物素修饰钌(II)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用以及作为靶向肿瘤的荧光探针的应用。
优选的，所述肿瘤包括肺癌、肝癌或脑胶质瘤。
本发明提供了一种生物素修饰钌(II)配合物，具有式I所示结构。本发明将生物素引入钌配合物中，以肿瘤细胞表面的生物素受体作为识别肿瘤细胞的靶点，生物素作为靶向运输药物基团，选择性的将药物输送到生物素受体过量的肿瘤细胞内，从而实现钌配合物的靶向选择性。因此，本发明提供的生物素修饰的钌(II)配合物可有效区分正常细胞和肿瘤细胞，抗肿瘤效果好，对正常细胞的毒性小，在抗肿瘤药物的制备中具有广阔的应用前景。此外，本发明提供的生物素修饰钌(II)配合物还具有荧光性质，可作为靶向肿瘤的荧光探针应用，能够有效区分正常细胞和肿瘤细胞。
此外，本发明提供的生物素修饰钌(II)配合物中，辅助配体可以为外消旋化合物(联吡啶、邻菲罗啉)、左旋化合物或右旋化合物(联吡啶的光学异构体)，本发明对不同构型配体的选择性和所得配合物的性质进行了研究，为生物素修饰钌(II)配合物在抗肿瘤药物中的应用提供重要的理论支持。
本发明还提供了上述方案所述生物素修饰钌(II)配合物的制备方法，本发明提供的制备方法步骤简单，容易操作。
附图说明
图1是生物素修饰手性钌(II)配合物的合成路线；
图2是生物素修饰外消旋钌(II)配合物的合成路线；
图3是目标化合物RBL02-BB的质谱图；
图4是目标化合物RBL043-BB的质谱图；
图5是目标化合物RBL053-BB的质谱图；
图6是目标化合物RBL063-BB的质谱图；
图7是目标化合物RBL0627-BB的质谱图；
图8是目标化合物RBLR31-BB的质谱图；
图9是目标化合物RPL0627-BB的质谱图；
图10是目标化合物RPLR31-BB的质谱图；
图11是目标化合物L-RBL0627-BB的质谱图；
图12是目标化合物D-RPL0627-BB的质谱图；
图13是目标化合物L-RBLR31-BB的质谱图；
图14是目标化合物D-RBLR31-BB的质谱图；
图15是LRBL0627-BB的HepG2细胞定位荧光成像结果；
图16是RBL0627-BB的HepG2细胞定位荧光成像结果。
具体实施方式
本发明提供了一种生物素修饰钌(II)配合物，具有式I所示结构：
式I中：R为-C6H5、-C6H5F、-C6H5Cl、-C6H5Br、-C6H4CF3、-C6H4C≡CC6H5、-CH＝CHC6H5或-C6H4CF3；
在本发明中，所述联吡啶的光学异构体具体为L构型的联吡啶或D构型的联吡啶；当所述辅助配体为联吡啶或邻菲罗啉时，所述生物素修饰钌(II)配合物为生物素修饰外消旋钌(II)配合物，当所述辅助配体为联吡啶的光学异构体时，所述生物素修饰钌(II)配合物为生物素修饰手性钌(II)配合物。
在本发明中，所述生物素修饰钌(II)配合物为以下结构的化合物中的任意一种：
其中，L-RBL0627-BB、D-RBL0627-BB、L-RBLR31-BB、D-RBLR31-BB为生物素修饰手性钌(II)配合物，其余为生物素修饰外消旋钌(II)配合物；在本发明的具体实施例中，生物素修饰手性钌(II)配合物的构型用前缀L(左旋)、D(右旋)表示，没有前缀则表示生物素修饰外消旋钌(II)配合物。
本发明还提供了上述方案所述生物素修饰钌(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物、乙酸铵和冰乙酸混合进行缩合反应，得到配体；所述醛类化合物的化学式为RCHO；所述配体的结构如式A所示；
式A和RCHO中，R的种类和式I中一致；
(2)将所述配体、前体化合物和溶剂混合进行配位反应，得到钌(II)配合物；所述前体化合物为[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]或L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2，其中bpy表示联吡啶，phen表示邻菲罗啉，py表示吡啶；所述钌(II)配合物的结构如式B所示：
式B中
的种类和式I中一致；
(3)将所述钌(II)配合物、1,4-二溴丁烷、焙烧碳酸钾和溶剂混合进行第一取代反应，得到烷烃链修饰的钌(II)配合物，所述烷烃链修饰的钌(II)配合物的结构式如式C所示：
(4)将所述烷烃链修饰的钌(II)配合物、生物素、焙烧碳酸钾、KI和溶剂混合进行第二取代反应，得到具有式I所示结构的生物素修饰钌(II)配合物。
本发明将1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物、乙酸铵和冰乙酸混合进行缩合反应，得到配体；所述醛类化合物的化学式为RCHO；所述配体的结构如式A所示。在本发明中，所述醛类化合物优选为苯甲醛、对氟苯甲醛、对氯苯甲醛、对溴苯甲醛、4-苯基乙炔基苯甲醛或肉桂醛；所述1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物和乙酸铵的摩尔比优选为1:1.5:43～44；所述缩合反应的温度优选为100～120℃，时间为4～6h；所述缩合反应优选在回流条件下进行。
缩合反应完成后，本发明优选将所得反应液用水稀释，然后调节pH值至7进行沉淀析出，过滤得到粗品，将所述粗品进行硅胶柱纯化，得到具有式A所示结构的配体；在本发明中，所述调节pH值用试剂优选为氨水，所述硅胶柱纯化用洗脱剂优选为乙醇，洗脱时收集第一带，旋干即得到目标产物。
得到配体后，本发明将所述配体、前体化合物和溶剂混合进行配位反应，得到钌配合物；所述前体化合物为[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]、L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2，其中bpy表示联吡啶，phen表示邻菲罗啉，py表示吡啶；所述钌(II)配合物的结构如式B所示。在本发明中，所述[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]、L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2优选为带有结晶水的化合物，具体为[Ru(bpy)2Cl2]·nH2O、[Ru(phen)2Cl2]·nH2O、L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]·mH2O或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]·mH2O，其中n和m表示结晶水的数量，均为正整数，本发明对所述m和n的具体数值没有特殊要求。
在本发明中，所述前体化合物[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]的制备方法优选包括以下步骤：
将辅助配体、氯化锂、三氯化钌和溶剂混合进行配位反应，得到前体化合物；当所述辅助配体为联吡啶时，所得前体化合物为[Ru(bpy)2Cl2]，当所述前体化合物为邻菲罗啉时，所得前体化合物为[Ru(phen)2Cl2]。
在本发明中，所述辅助配体和三氯化钌的摩尔比优选为2:1；所述氯化锂和三氯化钌的摩尔比优选为9.6:1；所述配位反应用有机溶剂优选为N,N'-二甲基甲酰胺和水的混合溶剂，所述混合溶剂中N,N'-二甲基甲酰胺和水的体积比优选为15:1；所述配位反应的温度优选为140℃，时间优选为8h；所述配位反应优选在氩气保护条件下进行。反应完成后，本发明将所得反应液冷却至室温后加入丙酮，然后冷冻过夜，之后依次进行抽滤、洗涤和真空干燥，得到前体化合物。
在本发明中，所述前体化合物L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]的制备方法包括以下步骤：
将[Ru(bpy)2Cl2]、吡啶和水混合进行反应，得到[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，将所述[Ru(bpy)2(py)2Cl2]进行手性拆分，得到L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2和D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2；所述手性拆分用拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠或O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠；当所述拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠时，所得产物为L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，当所述拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠时，所得产物为D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]。
在本发明中，所述[Ru(bpy)2Cl2]和吡啶的摩尔比优选为1:2，所述反应的温度优选为100℃，时间优选为4h，所述反应优选在氩气保护条件下进行；反应完成后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，然后减压蒸干，将所得产物溶解于无水甲醇中，然后加入乙醚进行析晶，之后依次进行过滤、洗涤和真空干燥，得到[Ru(bpy)2(py)2Cl2]。
在本发明中，所述手性拆分具体为：将所述[Ru(bpy)2(py)2Cl2]、拆分剂和水混合，室温下搅拌均匀后过滤，将所得滤液在自然蒸发条件下结晶，将所得晶体依次进行洗涤和真空干燥，得到目标产物。在本发明中，所述搅拌的时间优选为25min，所述[Ru(bpy)2(py)2Cl2]和拆分剂的用量比优选为1.95g:0.5mol；所述结晶优选在通风橱中进行，所述结晶的时间优选为10天；所述洗涤用洗涤剂优选为乙醚；在本发明的具体实施例中，拆分后所得产物具体为L-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸]·12H2O和D-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸]·12H2O。
得到上述前体化合物后，本发明将所述配体、前体化合物和溶剂混合进行配位反应，得到钌(II)配合物。在本发明中，所述前体化合物和所述配体的摩尔比优选为1:1.5；所述溶剂优选为乙二醇水溶液，所述乙二醇水溶液的质量分数优选为90％；所述配位反应的温度优选为110～120℃，时间优选为6～24h，更优选为8～12h；所述配位反应优选在回流条件下进行。配位反应结束后，本发明优选将所得反应液冷却至室温后加水稀释，然后通过过滤除去不溶物，得到滤液，将所述滤液和高氯酸钠混合进行沉淀析出，过滤后得到粗品，将所述粗品进行中性氧化铝柱纯化，得到钌(II)配合物。
在本发明中，当所述前体化合物为L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]所得钌(II)配合物的结构具体如式B-1所示，当所述前体化合物为D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]时，所得钌(II)配合物的结构具体如式B-2所示：
得到钌(II)配合物后，本发明将所述钌(II)配合物、1,4-二溴丁烷、焙烧碳酸钾和溶剂混合进行第一取代反应，得到烷烃链修饰的钌(II)配合物，所述烷烃链修饰的钌(II)配合物的结构式如式C所示。在本发明中，所述钌(II)配合物和1,4-二溴丁烷的摩尔比优选为1:40～1:100；所述焙烧碳酸钾和1,4-二溴丁烷的摩尔比优选为1.75:1；所述溶剂优选为N,N'-二甲基甲酰胺；所述第一取代反应的温度优选为60～90℃，时间为6～24h；所述第一取代反应优选在回流条件下进行。在本发明的具体实施例中，优选先将焙烧碳酸钾和钌(II)配合物加入N,N'-二甲基甲酰胺中，在60℃下活化30min后，加入1,4-二溴丁烷，然后升温至回流温度进行反应。第一取代反应完成后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，然后过滤除去碳酸钾固体，得到滤液，将所述滤液用甲基叔丁基醚萃取，得到水相，向所述水相中加入高氯酸钠使产物沉淀析出，然后依次进行过滤和干燥，得到粗品，将所述粗品进行中性氧化铝柱纯化，得到目标产物；所述中性氧化铝柱纯化使用的洗脱剂为乙腈和甲苯的混合溶剂，具体为先使用乙腈和甲苯体积比为1:1的混合溶剂进行洗脱，得到第一带，然后用乙腈和甲苯体积比为2:1的混合溶剂进行洗脱，得到第二带，将第一带和第二带收集的产物减压旋干，得到目标产物。
在本发明中，当所述前体化合物为L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]时，所得烷烃链修饰的钌(II)配合物的结构具体如式C-1所示，当所述前体化合物为D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]时，所得烷烃链修饰的钌(II)配合物的结构具体如式C-2所示：
得到烷烃链修饰的钌(II)配合物后，本发明将所述烷烃链修饰的钌(II)配合物、生物素、焙烧碳酸钾、KI和溶剂混合进行第二取代反应，得到具有式I所示结构的生物素修饰钌(II)配合物。在本发明中，所述烷烃链修饰的钌(II)配合物和生物素的摩尔比优选为1:1.1～1.2；所述KI和生物素的摩尔比优选为1.5～2:1；所述生物素和焙烧碳酸钾的摩尔比优选为42～43mg:1g；在本发明中，所述生物素的结构式如下：
在本发明中，所述第二取代反应用溶剂优选为无水N,N'-二甲基甲酰胺；所述第二取代反应的温度优选为55～60℃，时间优选为6～8h。在本发明的具体实施例中，优选先将烷烃链修饰的钌(II)配合物、KI和部分无水N,N'-二甲基甲酰胺混合，得到第一混合液，将所述第一混合液在55～60℃下活化5h，将生物素和焙烧碳酸钾和剩余部分无水N,N'-二甲基甲酰胺混合，得到第二混合液，将所述第二混合液在55～60℃下活化5h，然后将第一混合液和第二混合液混合进行反应。
第二取代反应完成后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，然后过去除去碳酸钾固体,得到滤液；向所述滤液加入高氯酸钠进行沉淀析出，之后依次进行过滤和真空干燥，得到粗品；将所述粗品进行中性氧化铝柱纯化，得到目标产物；所述中性氧化铝柱纯化具体为先用甲苯-乙腈混合溶剂进行洗脱，分带后用乙腈洗脱至无色，再用乙腈-乙醇混合溶剂洗脱；所述甲苯-乙腈混合溶剂中甲苯和乙腈的体积比优选为1:3。
在本发明的具体实施例中，当所述前体化合物为[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]时，最终所得产物为生物素修饰外消旋钌(II)配合物，具体的合成路线如图2所示；当所述前体化合物为L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]时，最终所得产物为生物素修饰手性钌(II)配合物，具体的合成路线如图1所示。
本发明还提供了上述方案所述的生物素修饰钌(II)配合物或上述方案所述生物素修饰钌(II)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用以及作为靶向肿瘤的荧光探针的应用；在本发明中，所述肿瘤优选包括肺癌、肝癌或脑胶质瘤；本发明对所述应用的具体方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法应用即可，上述应用具体为非治疗目的的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，实施例1～8为生物素修饰外消旋钌(II)配合物的合成和纯化，实施例10～13为生物素修饰手性钌(II)配合物的合成和纯化。
实施例1RBL02-BB的合成
1)[Ru(bpy)2Cl2]·2H2O的合成：向烧瓶中加入联吡啶(1.87g，12mmol),氯化锂(2.43g，57.6mmol)，三氯化钌(1.57g，6mmol)，再加上15mL DMF和1mL水，在氩气保护下于140℃加热回流反应8h。冷却至室温，加入50mL丙酮，摇匀，置冰箱放冷过夜。抽滤，得紫黑色微晶，以冰水、丙酮洗涤滤饼数次，真空干燥器干燥，得紫黑色晶体。
2)配体L02的合成：向圆底烧瓶中加入1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮(315mg，1.5mmol)，苯甲醛(238.5mg，2.25mmol)，乙酸铵(5g，64.9mmol)，用30mL冰乙酸溶解，搅拌至溶解，在110℃加热回流4h。反应后，用100mL水稀释，用氨水调至pH＝7，抽滤得到黄色，粗品过硅胶柱纯化，乙醇洗脱，收集第一带，旋干得到目标产物，即为配体L02。
3)RBL02的合成：向50mL三口瓶中加入[Ru(bpy)2Cl2].2H2O(103.8mg，0.2mmol)，L02(88.9mg,0.3mmol)，乙二醇9mL和水1mL混合溶剂，常规加热回流120℃，6h。反应完毕冷却至室温加水稀释，并过滤以除去固体杂质。然后取滤液加入适量高氯酸钠至产生大量红色沉淀，抽滤，干燥滤饼得到粗品。将干燥好的粗产物用少量乙腈溶解，过中性氧化铝柱纯化，乙腈、甲苯洗脱，收集主要红色组分，旋蒸，干燥后得目标产物(钌(II)配合物，记为RBL02)。
4)RBL02-BBr的合成：向三口瓶中加入新焙烧过的K2CO3(2.036g，14.7mmol)，RBL02(200mg)，以10mL DMF为溶剂，在60℃活化30min，后加入1,4-二溴丁烷(1.8g，8.4mmol)，常规加热24h。冷却至室温后，抽滤除去碳酸钾固体，并用200mL甲基叔丁基醚分萃取，合并水相。向水相中加入适量的高氯酸钠至产生大量橙红色沉淀，抽滤，干燥滤饼得到橙红色粗品。粗品过中性氧化铝柱纯化，乙腈和甲苯混合溶剂洗脱，首先采用甲苯：乙腈＝1：1(v/v)的混合溶剂进行洗脱，洗脱下来的为第一带(主要目标带)，后用乙腈：甲苯＝2：1(v/v)的混合溶剂洗脱，此为第二带，减压旋干得目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RBL02-BBr)。
5)RBL02-BB的合成：向烧瓶中加入RBL02-BBr(150.35mg，0.144mmol)，KI(47.8mg，0.28mmol)，无水DMF 5mL，在60℃油浴加热搅拌5h；与此同时，向另一个烧瓶中加入生物素(42.16mg，0.172mmol)，炒过的无水K2CO31g，无水DMF 5mL，同样在60℃油浴加热搅拌5h。活化后，将两者混合，于60℃油浴加热搅拌24h，反应结束后，冷却至室温。抽滤除去碳酸钾固体，向滤液加入高氯酸钠至产生大量橙红色沉淀，抽滤得滤饼，真空干燥后即为粗品。粗品过中性氧化铝柱纯化，采用甲苯：乙腈＝1:3(v/v)的混合溶剂洗脱，分带后用乙腈洗脱至无色，再用乙腈和乙醇混合溶剂洗脱，得到目标产物(RBL02-BB)；产率65％。ESI-MS(inCH3CN,m/z):1206.07(Cal.)，504.05(Found for[M-2ClO4 -]2+/2)，产物的质谱图如图3所示。
实施例2RBL043-BB的合成
1)配体L043的合成：参考实施例1中2)的实验方法，用对氟苯甲醛(279mg，2.25mmol)替换苯甲醛(238.5mg，2.25mmol)，得到目标产物(配体L043)。
2)RBL043的合成：参考实施例1中3)的实验方法，用L043(94.23mg，0.3mmol)替换L02，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RBL043)。
3)RBL043-BBr的合成：参考实施例1中4)的实验方法，用RBL043(200mg)替换RBL02，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RBL043-BBr)。
4)RBL043-BB的合成：参考实施例1中5)的实验方法，用RBL043-B Br(152.94mg，0.144mmol)替换RBL02-BBr，得到目标产物(RBL043-BB)。ESI-MS(in CH3CN,m/z):1226.2(Cal.),513.3(Found for[M-2ClO4 -]2+/2)，产物的质谱图如图4所示。
实施例3RBL053-BB的合成
1)配体L053的合成：参考实施例1中2)的实验方法，用对氯苯甲醛(315mg，2.25mmol)替换苯甲醛(238.5mg，2.25mmol)，得到目标产物(配体L053)。
2)RBL053的合成：参考实施例1中3)的实验方法，用L053(99mg，0.3mmol)替换L02，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RBL053)
3)RBL053-BBr的合成：参考实施例1中4)的实验方法，用RBL053(200mg)替换RBL02，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RBL053-BBr)。
4)RBL053-BB的合成：参考实施例1中5)的实验方法，用RBL053-B Br(155.24mg，0.144mmol)替换RBL02-BBr，得到目标产物(RBL053-BB)，产率65％。ESI-MS(in CH3CN,m/z):1078.1(Cal.),440.3(Found for[M-2ClO4 -]2+/2)。产物的质谱图如图5所示。
实施例4RBL063-BB的合成
1)配体L063的合成：参考实施例1中2)的实验方法，用对溴苯甲醛(413.88mg，2.25mmol)替换苯甲醛(238.5mg，2.25mmol)，得到目标产物(配体L063)。
2)RBL063的合成：参考实施例1中3)的实验方法，用L063(112.2mg,0.3mmol)替换L02，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RBL063)
3)RBL063-BBr的合成：参考实施例1中4)的实验方法，用RBL063(200mg)替换RBL02，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RBL063-BBr)。
4)RBL063-BB的合成：参考实施例1中5)的实验方法，用RBL063-BBr(161.56mg，0.144mmol)替换RBL02-BBr，得到目标产物(RBL063-BB)，产率65％。ESI-MS(in CH3CN,m/z):1286.1(Cal.)，543.5(Found for[M-2ClO4 -]2+/2)。产物的质谱图如图6所示。
实施例5RBL0627-BB的合成
1)配体L0627的合成：参考实施例1中2)的实验方法，用4-苯基乙炔基苯甲醛(463.95mg，2.25mmol)替换苯甲醛(238.5mg，2.25mmol)，得到目标产物(配体L0627)。
2)RBL0627的合成：参考实施例1中3)的实验方法，用L0627(118.8mg，0.3mmol)替换L02，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RBL0627)
3)RBL0627-BBr的合成：参考实施例1中4)的实验方法，用RBL0627(200mg)替换RBL02，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RBL0627-BBr)。
4)RBL0627-BB的合成：参考实施例1中5)的实验方法，用RBL0627-BBr 165mg(0.144mmol)替换RBL02-BBr，得到目标产物(RBL0627-BB)，产率65％。ESI-MS(in CH3CN,m/z):554.157([M-2ClO4 -]2+/2,612.180[M-ClO4 -+NH4 +]2+/2)。产物的质谱图如图7所示。
实施例6RBLR31-BB的合成
1)配体LR31的合成：参考实施例1中2)的实验方法，用肉桂醛(297mg，2.25mmol)替换苯甲醛(238.5mg，2.25mmol)，得到目标产物(配体LR31)。
2)RBLR31的合成：参考实施例1中3)的实验方法，用LR31(96.63mg，0.3mmol)替换L02，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RBLR31)
3)RBLR31-BBr的合成：参考实施例1中4)的实验方法，用RBLR31(200mg)替换RBL02，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RBLR31-BBr)。
4)RBLR31-BB的合成：参考实施例1中5)的实验方法，用RBLR31-BBr154.1mg(0.144mmol)替换RBL02-BBr，得到目标产物(RBLR31-BB)，ESI-MS(in CH3CN,m/z):345.1017[[M-2ClO- 4+H+]3+/3],383.7841[[M-ClO- 4+NH4 ++H+]3+/3],517.1492([M-2ClO4 -]2+/2,575.1727[M-ClO4 -+NH4 +]2+/2,633.1962[M+NH4 +]2+/2)。产物的质谱图如图8所示。
实施例7RPL0627-BB的合成
1)[Ru(phen)2Cl2].2H2O的合成：在三颈瓶中加入邻菲啰啉(1.35g，7.5mmol)，三氯化钌(0.735g，3.5mmol)，无水氯化锂(0.74g，17.5mmol)。再加入15mL DMF和1mL蒸馏水搅拌均匀，于160℃条件下加热回流反应8h，反应毕。冷却至室温，加入50mL丙酮，搅拌均匀，冰箱冷藏静置过夜。抽滤，滤饼用冰水、冰丙酮洗涤数次，直至滤液滴下呈紫色状停止。滤饼置于真空干燥箱中干燥，得黑绿色晶体。
2)配体L0627的合成：同实施例5步骤1)。
3)RPL0627的合成：参考实施例1中3)的实验方法，用L0627(118.8mg，0.3mmol)替换L02，用[Ru(phen)2Cl2].2H2O(113mg，0.2mmol)替换[Ru(bpy)2Cl2].2H2O，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RPL0627)
4)RPL0627-BBr的合成：参考实施例1中4)的实验方法，用RPL0627(190mg)替换RBL02，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RPL0627-BBr)。
5)RPL0627-BB的合成：参考实施例1中5)的实验方法，用RPL0627-BBr 171mg(0.144mmol)替换RBL02-BBr，得到目标产物(RPL0627-BB)，产物的质谱图如图9所示。
实施例8RPLR31-BB的合成
1)配体LR31的合成：同实施例6步骤1)。
2)RPLR31的合成：参考实施例7中3)的实验方法，用LR31(96.63mg，0.3mmol)替换RPL0627，得到目标产物(钌(II)配合物，记为RPLR31)
3)RPLR31-BBr的合成：参考实施例7中4)的实验方法，用RPLR31(190mg)替换RPL0627，得到目标产物(烷烃链修饰的钌(II)配合物，记为RPLR31-BBr)。
4)RPLR31-BB的合成：参考实施例7中5)的实验方法，用RPLR31-BBr(161mg，0.144mmol)替换RPL0627-BBr，得到目标产物(RPLR31-BB)，产物的质谱图如图10所示。
实施例9手性拆分
1)[Ru(bpy)2Cl2].2H2O的合成：同实施例1步骤1)。
2)[Ru(bpy)2(py)2].2H2O的合成
向烧瓶中加入[Ru(bpy)2Cl2].2H2O(2.01g,3.85mmol)，23mL吡啶和46mL水，在氩气保护下于100℃加热回流反应4h，冷却至室温，减压蒸去全部溶剂，46mL无水甲醇得到红色溶液，加入300mL乙醚，室温放冷置几个小时后，析出大量的红色晶体，抽滤，乙醚洗涤滤饼数次，真空干燥器干燥，得到红色晶体。
3)L-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-dibenzoyl-L-tarate].12H2O的合成
将1.95g[Ru(bpy)2(py)2].2H2O溶于30mL水中，室温下加入0.5M的O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠溶液19mL后搅拌，室温下搅拌25min，过滤，所得滤液放入烧杯中，置于通风橱中结晶，约10天左右析出大量红色晶体，晶体用乙醚洗涤数次，真空干燥器干燥，得到红色针状晶体。
4)D-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-dibenzoyl-D-tarate].12H2O的合成
将1.95g[Ru(bpy)2(py)2].Cl2溶于30mL水中，室温下加入0.5M的O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠溶液19mL后搅拌，室温下搅拌25分钟，过滤，所得滤液放入烧杯中，置于通风橱中结晶，约10天左右析出大量红色晶体，晶体用乙醚洗涤数次，真空干燥器干燥，得到红色针状晶体。
实施例10L-RBL0627-BB的合成
1)配体L0627的合成：同实施例5步骤1)。
2)L-RBL0627的合成：按照实施例5步骤2)的方法，将其中的[Ru(bpy)2Cl2].2H2O替换为L-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-dibenzoyl-L-tarate]·12H2O(260mg，0.2mmol)，得到目标产物(手性钌(II)配合物，记为L-RBL0627)。
3)L-RBL0627-BBr的合成：按照实施例5步骤3)的方法，将其中的RBL0627替换为L-RBL0627，得目标产物(烷烃链修饰的手性钌(II)配合物，记为L-RBL0627-BBr)。
4)L-RBL0627-BB的合成：按照实施例5中步骤4)的方法，将其中的RBL0627-BBr替换为L-RBL0627-BBr，得目标化合物(L-RBL0627-BB)，产率65％。ESI-MS(in CH3CN,m/z):554.157([M-2ClO4 -]2+,612.180[M-ClO4 -+NH4 +]2+/2)。产物的质谱图如图11所示。
实施例11D-RBL0627-BB的合成
1)配体L0627的合成：同实施例5步骤1)。
2)D-RBL0627的合成：按照实施例5步骤2)的方法，将其中的[Ru(bpy)2Cl2].2H2O替换为D-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-dibenzoyl-D-tarate].12H2O(260mg，0.2mmol)，得到目标产物(手性钌(II)配合物，记为D-RBL0627)。
3)D-RBL0627-BBr的合成：按照实施例5步骤3)的方法，将其中的RBL0627替换为D-RBL0627，得目标产物(烷烃链修饰的手性钌(II)配合物，记为D-RBL0627-BBr)。
4)D-RBL0627-BB的合成：按照实施例5中步骤4)的方法，将其中的RBL0627-BBr替换为D-RBL0627-BBr，得目标化合物(D-RBL0627-BB)，产率65％。ESI-MS(in CH3CN,m/z):554.157([M-2ClO4 -]2+,612.180[M-ClO4 -+NH4 +]2+).产物的质谱图如图12所示。
实施例12L-RBLR31-BB的合成
1)配体LR31的合成：同实施例6步骤1)。
2)L-RBLR31的合成：按照实施例6步骤2)的方法，将其中的[Ru(bpy)2Cl2].2H2O替换为L-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-dibenzoyl-D-tarate].12H2O(103.8mg，0.2mmol)，得到目标产物(手性钌(II)配合物，记为L-RBLR31)。
3)L-RBLR31-BBr的合成：按照实施例6步骤3)的方法，将其中的RBLR31替换为L-RBLR31(200mg)，得目标产物(烷烃链修饰的手性钌(II)配合物，L-RBLR31-BBr)，产率50％。
4)L-RBLR31-BB的合成：按照实施例6中步骤4)的方法，将其中的RBLR31-BBr替换为L-RBLR31-BBr，得到目标化合物(L-RBLR31-BB)，产率65％。产物的质谱图如图13所示。
实施例13D-RBLR31-BB的合成
1)配体LR31的合成：同实施例6步骤1)。
2)D-RBLR31的合成：按照实施例6步骤2)的方法，将其中的[Ru(bpy)2Cl2].2H2O替换为D-[Ru(bpy)2(py)2][O,O′-dibenzoyl-D-tarate].12H2O(103.8mg，0.2mmol)，得到目标产物(手性钌(II)配合物，D-RBLR31)。
3)D-RBLR31-BBr的合成：按照实施例6步骤3)的方法，将其中的RBLR31替换为D-RBLR31(200mg)，得目标产物(烷烃链修饰的手性钌(II)配合物，D-RBLR31-BBr)，产率50％。
4)D-RBLR31-BB的合成：按照实施例6中步骤4)的方法，将其中的RBLR31-BBr替换为D-RBLR31-BBr，得到目标化合物(D-RBLR31-BB)，产率65％。产物的质谱图如图14所示。
实施例14抗肿瘤活性测试
对上述实施例制备的生物素修饰钌(II)配合物的抗肿瘤活性进行测试，具体步骤如下：
1、种板：处理细胞，传代后培养基重悬细胞，取10μL，计数为n；每块96孔板需要细胞悬液1×105/n；加样槽加入细胞悬液和10mL培养基，混匀；排枪量程调至100μL，种板；放入CO2培养箱，培养24h。
2、加药：1.5mL EP管，培养基配制设置最高浓度2倍浓度样品700μL；对半稀释，配制梯度浓度样品；将配制好的药物从低浓度至高浓度顺序加药，每孔100μL；最后一排为空白对照组；放入CO2培养箱，培养72h。
3、加MTT：取出96孔板，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)；放入CO2培养箱，培养4h。
4、收板：取出96孔板，使用真空泵将孔中液体吸出；每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)；酶标仪在570nm激发波长下，测试溶液吸光值，并计算IC50值。
其中，实验所用肿瘤细胞为SPC-A-1(人肺腺癌细胞)，A549(人非小细胞肺癌细胞)、H446(人小细胞肺癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、U87(人脑胶质瘤细胞)，实验结果见表1。
表1生物素修饰钌(II)配合物对不同肿瘤细胞的抑制作用
根据表1中的数据可以看出，RBL0627-BB、RPL0627-BB、L-RBL0627-BB、D-RBL0627-BB对多种不同的肿瘤细胞均体现出较好的抑制作用，RBL02-BB对H466和HepG2的抑制作用较好，RBL043-BB、RPLR31-BB和L-LRBLR31-BB对HepG2的抑制作用较好，并且其中D-LRBLR31-BB对HepG2的抑制作用最强。以上结果表明，本发明提供的生物素修饰钌(II)配合物在抗肿瘤药物开发上有巨大的潜在应用前景。
实施例15
细胞定位实验：
取在对数期生长良好的HepG2细胞种共聚焦小皿，每个小皿约5×104个细胞，于培养箱中培养24h贴壁。培养24h之后将药物母液稀释成对应浓度，取出已贴壁的细胞，按照对应浓度加药物处理，盖上盖子十字晃动混匀之后做好标记放进培养箱继续培养72h。通过采用Hoechst 33258核酸染料：DMEM培养基比例为1：1000比例配制染液，每个小皿加500μL染液，培养箱中孵育染色30min。孵育完将染液吸弃，加入1mL的PBS在荧光显微镜下观察并拍照，得结果如图15～16所示。
图15为LRBL0627-BB的HepG2细胞定位荧光成像结果；图16为RBL0627-BB的HepG2细胞定位荧光成像结果，根据图15～16可以看出，Hoechst 33258发出蓝色荧光，而LRBL0627-BB和RBL0627-BB能够发出红色荧光，且在2.5μM或5μM浓度下，LRBL0627-BB和RBL0627-BB均能够在HepG2的细胞包浆部位进行富集并发出荧光，能够对HepG2细胞进行有效的定位。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物素修饰钌(II)配合物，其特征在于，具有式I所示结构：
式I中：R为-C6H5、-C6H5F、-C6H5Cl、-C6H5Br、-C6H4CF3、-C6H4C≡CC6H5、-CH＝CHC6H5或-C6H4CF3；
2.根据权利要求1所述的生物素修饰钌(II)配合物，其特征在于，所述生物素修饰钌(II)配合物为以下结构的化合物中的任意一种：
3.权利要求1或2所述生物素修饰钌(II)配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物、乙酸铵和冰乙酸混合进行缩合反应，得到配体；所述醛类化合物的化学式为RCHO；所述配体的结构如式A所示；
式A和RCHO中，R的种类和式I中一致；
(2)将所述配体、前体化合物和溶剂混合进行配位反应，得到钌(II)配合物；所述前体化合物为[Ru(bpy)2Cl2]、[Ru(phen)2Cl2]、L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]或D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，其中bpy表示联吡啶，phen表示邻菲罗啉，py表示吡啶；所述钌(II)配合物的结构如式B所示：
式B中
的种类和式I中一致；
(3)将所述钌(II)配合物、1,4-二溴丁烷、焙烧碳酸钾和溶剂混合进行第一取代反应，得到烷烃链修饰的钌(II)配合物，所述烷烃链修饰的钌(II)配合物的结构式如式C所示：
(4)将所述烷烃链修饰的钌(II)配合物、生物素、焙烧碳酸钾、KI和溶剂混合进行第二取代反应，得到具有式I所示结构的生物素修饰钌(II)配合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮、醛类化合物和乙酸铵的摩尔比为1:1.5:43～44；
所述缩合反应的温度为100～120℃，时间为4～6h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中前体化合物和所述配体的摩尔比为1:1.4～1.6；
所述配位反应的温度为110～120℃，时间为6～24h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2和D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2的制备方法包括以下步骤：
将[Ru(bpy)2Cl2]、吡啶和水混合进行反应，得到[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，将所述[Ru(bpy)2(py)2Cl2]进行手性拆分，得到L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]和D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]；所述手性拆分用拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠或O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠；当所述拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-L-酒石酸钠时，所得产物为L-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]，当所述拆分剂为O,O′-二苯甲酰基-D-酒石酸钠时，所得产物为D-[Ru(bpy)2(py)2Cl2]。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中钌(II)配合物和1,4-二溴丁烷的摩尔比为1:40～1:100；
所述第一取代反应的温度为60～90℃，时间为6～24h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中烷烃链修饰的钌(II)配合物和生物素的摩尔比为1:1.1～1.2；
所述第二取代反应的温度为55～60℃，时间为24～48h。
9.权利要求1或2所述的生物素修饰钌(II)配合物或权利要求3～8任意一项所述生物素修饰钌(II)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用以及作为靶向肿瘤的荧光探针的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、肝癌或脑胶质瘤。
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