CN102942595A - 一类钌配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明旨在开发一类新的DNA拓扑异构酶I和II双重抑制剂。合成了含多个羟基配体的单核钌(II)配合物，这些配合物结构稳定，水溶性比目前常见的有机小分子抑制剂好，并表现出对I型和II型DNA拓扑异构酶的双重毒剂效果以及对体内癌细胞生长有着明显的抑制作用。

Description

一类钌配合物及其制备方法和应用

技术领域

 本发明涉及拓扑异构酶I/II和抗癌药物领域，具体涉及一类新的钌多吡啶配合物的制备方法和应用。

背景技术

DNA 作为遗传信息的携带者，在整个生命过程中起着重要的作用。细胞内DNA都是以一个惊人的超螺旋的形式存在，而DNA双螺旋链必须在复杂的超螺旋状态与解旋状态之间不断进行转换，所有过程的正常进行都离不开一种核酶—DNA拓扑异构酶 (Topoisomerase, Topo) (Cancer Treatment Reviews 1994, 20, 73)。DNA 拓扑异构酶通过基因重组、细胞周期检验点、DNA修复等信号通路来维持细胞基因组的稳定，它对细胞的正常增殖至关重要。 但当其活性过度表达时，则对细胞产生负面影响，甚至导致基因突变(Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2011, 12, 827)。正因为拓扑异构酶在细胞增殖中具有如此重要生物功能，在正常细胞中，拓扑异构酶活性被严格控制，而在肿瘤细胞中，拓扑异构酶活性表现出高水平表达，促使了肿瘤细胞的快速增殖。抑制拓扑异构酶的活性可以有效的抑制癌细胞增殖，因此DNA拓扑异构酶已经成为公认的抗癌药物的作用靶点。

根据Topo作用机制及生物结构的不同，主要将其分为两类：I型DNA拓扑异构酶(Topo I)和II型DNA拓扑异构酶(Topo II)。Topo I为单体蛋白，相对分子质量为91 KD，位于第20号染色体。Topo II为同源二聚体，有a、β两种亚型，相对分子量分别为170 KD和 180 KD, 分别定位于17号染色体和3号染色体(Comprehensive Natural Products Chemistry, 1999, 7, 593)。又根据药物作用底物及作用机制的不同，可以将其分为Topo毒剂和催化抑制剂。Topo毒剂可以与Topo-DNA形成的断裂复合物键合，形成药物-Topo-DNA三元复合物，稳定了Topo-DNA的瞬态断裂产物。Topo毒剂的作用使酶变成生理上的毒药，致使Topo诱导的 DNA 瞬时断裂变为永久断裂，最终导致细胞凋亡(Nat. Rev. Cancer, 2009, 9, 338)。与Topo毒剂相比，催化抑制剂的作用机理有所不同，它不能稳定Topo-DNA断裂复合物，而是通过阻滞Topo的某一特定功能或催化反应中的某一步骤，进而抑制Topo催化活性。

尽管以Topo I—喜树碱camptothecin, CPT (Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 1585) 或Topo II—依托泊苷Etoposide, VP-16 (Curr. Med. Chem. 2005, 5, 363) 为靶点的抗癌药物现在已经成功应用于临床, 但是以单一拓扑异构酶为靶点的抗癌药物却存在着很多缺陷。有研究证明，对一种拓扑异构酶的选择性抑制可以引起另一种DNA拓扑异构酶的过度表达, 进而引起细胞耐药性增加(J. Oncol. Pharm. Pract. 2000, 6, 92)。因此DNA拓扑异构酶的双重抑制剂研究可以很好的解决由抑制单一拓扑异构酶引起的细胞耐药性问题。

目前所报道有许多金属类 DNA 拓扑异构酶抑制剂，主要集中在 Pt、Ru及少数Au金属配合物方面。与有机化合物相比, 金属配合物分子结构具有更好的可塑性，容易在配体上引入其它分子活性基团，可以针对不同的底物结合环境进行相应的结构修饰；而且金属配合物相对比较稳定，容易在体内环境产生药效。我们课题组在以Topo酶为靶点的 Ru(II) 金属配合物研究方面积累了丰富的经验, 也发现了众多的有效的DNA拓扑异构酶II抑制剂(J. Biol. Inorg. Chem. 2007, 12, 1015; J. Inorg. Biochem. 2008, 102, 1050)，近两年来我们又陆续发现了一些具有良好拓扑异构酶Topo I/II双重抑制活性的Ru (II) 金属配合物(Eur. J. Med. Chem. 2011,46, 1056; J. Biol. Inorg. Chem. 2012, 17, 81)。因此，合成有效的拓扑异构酶双重抑制剂, 并深入研究其肿瘤细胞毒性及诱导细胞凋亡机理, 对于新的有效的抗肿瘤药物的开发有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于以下几项：提供一类新的含羟基配体钌多吡啶配合物，以及其制备方法和应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一类新的含羟基配体的钌多吡啶配合物，结构式如式Ⅰ所示：

式I

简记为[Ir(pq)₂(azobpy)Ir(pq)₂]²⁺

为方便表述，下文对各种配体简记如下：

上述多吡啶钌配合物的制备方法为：

由Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O（Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-dibenzoyl-D-tartrate]·12H₂O），

或Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O（Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-dibenzoyl-L-tartrate]·12H₂O），

分别和配体2,4,6-PIPTH、2,3,4-PIPTH、 2,5-PIPDH、或3,5-PIPDH反应，制得对应的Δ-配合物或Λ-配合物。

具体来说，制备方法为将所述的Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O， Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O分别和所述配体在乙二醇中回流反应，加入饱和NaClO₄水溶液（质量分数66.7%），析出红色固体。红色固体进一步干燥获得粗产品，再经过氧化铝柱色谱分离提纯后，干燥得到目标产物。

Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂] [O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O，Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂] [O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O可根据参考文献(Dalton Trans. 1997, 3773)的方法合成。

所述的回流反应时间为8-10小时。

NaClO₄水溶液的质量分数为66.7%。

作为一种实施方案，可由以下步骤制备获得本发明的含羟基配体钌多吡啶配合物：先制备Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O，Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O。然后按照计量摩尔比分别和2,4,6-PIPTH; 2,3,4-PIPTH; 2,5-PIPDH; 3,5-PIPDH在乙二醇中回流反应8-10小时后，加入饱和NaClO₄水溶液，析出红色固体。抽滤干燥的粗产品经过氧化铝柱色谱分离提纯后，旋干干后得到目标产物。

本发明提供的钌配合物可应用于抑制拓扑异构酶I和II活性，也可进一步作为抗癌药物。

经研究表明，本发明的上述一类钌配合物，合成简单，结构稳定，由于羟基的引入，在水溶性上比起相应的有机小分子有了很大提高，在水中均有很好的溶解性。配合物D-1和L-1对Topo I和Topo II双重抑制IC₅₀ = 3~5 mM，优于常见的有机拓扑异构酶抑制剂CPT和VP-16，是具有高效Topo I/II双重抑制作用的金属配合物。并且这些化合物对肿瘤细胞的生长有很好的抑制作用。是一类潜在靶向拓扑异构酶的抗癌药物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的含羟基配体的配合物具有Topo I和Topo II双重抑制作用，这样可以克服单一拓扑异构酶为靶点的抗癌药物存在的缺陷。例如DNA拓扑异构酶的双重抑制剂可以很好的解决单一拓扑异构酶引起的细胞耐药性问题。同时对癌细胞的生长有明显的抑制作用。

附图说明

图1  本发明的配体分子结构；

图2  本发明的拓扑异构酶抑制剂Ru(II)配合物的分子结构；

图3  配体合成途径；

图4  Ru(II)配合物CD光谱图；

图5  配合物抑制拓扑异构酶I型（A）和II型 ( B ) 的凝胶电泳实验图。

具体实施方式

实施例1配体和配合物的制备方法

(1) 配体2,4,6-PIPTH; 2,3,4-PIPTH; 2,5-PIPDH; 3,5-PIPDH的合成方法：

a)邻菲咯林-5,6-二胺的合成方法：

邻菲咯林-5,6-二胺的合成按照(Tetrahedron Letters, 2006, 38, 8159)方法：将4.2g邻菲咯林-5,6-二酮溶解在200mL无水乙醇中，并加入4.8g盐酸羟胺和5.9gBaCO₃，80℃回流12小时后旋蒸除去溶剂，所得固体用稀HCl溶解后调pH约为6，搅拌半小时，有绿色固体析出，过滤，洗涤，干燥后溶于300mL无水乙醇中，加入4.0g10%钯碳，Ar保护下80℃回流后开始滴加N₂H₄·H₂O和乙醇的混合液(35mL/150mL)，1小时内滴完后继续通Ar回流12h。趁热用硅藻土过滤，将所得红色液体旋干，固体用100mL水溶解，4℃过夜，得黄色细针状晶体，抽滤，洗涤，干燥，产率84%。

b) 2,4,6-PIPTH合成方法

邻菲咯啉-5,6-二胺(0.21 g, 1 mmol) 和适当的2,4,6-三羟基苯甲醛 (0.154 g, 1 mmol) 在乙醇溶液中加热回流24小时。 冷却到室温，得到黄色沉淀，收集沉淀。以乙醇为洗脱剂，60-80目的硅胶过柱，真空旋干，干燥得到淡黄色固体。产率0.22g, 64%。元素分析C₁₉H₁₂N₄O₃ (分子量 344)，实验值：C, 66.28; H, 3.51; N, 16.27; O, 13.94；理论值：C, 66.32; H, 3.47; N, 16.30; O, 13.91。FAB-MS: m/z = 345 (C₁₉H₁₂N₄O₃ 345)。

c) 2,3,4-PIPTH合成方法

合成方法同2,4,6-PIPTH，将2,4,6-三羟基苯甲醛取代2,3,4-三羟基苯甲醛，其他步骤相同。产率0.20g, 58%。元素分析C₁₉H₁₂N₄O₃ (分子量 344)，实验值：C, 66.28; H, 3.51; N, 16.27; O, 13.94；理论值：C, 66.32; H, 3.47; N, 16.30; O, 13.91。FAB-MS: m/z = 345 (C₁₉H₁₂N₄O₃ 345)。

d) 2,5-PIPTH合成方法

合成方法同2,4,6-PIPTH，将2,4,6-三羟基苯甲醛取代2,5-二羟基苯甲醛，其他步骤相同。产率0.19 g, 58%。元素分析C₁₉H₁₂N₄O₂ (分子量 327)，理论值：C, 69.51; H, 3.68; N, 17.06; O, 9.75；实验值：C, 69.46; H, 3.73; N, 17.00; O, 9.81。FAB-MS: m/z = 328 (C₁₉H₁₂N₄O₃ 327)。

e) 3,5-PIPTH合成方法

合成方法同2,4,6-PIPTH，将2,4,6-三羟基苯甲醛取代3，5-三羟基苯甲醛，其他步骤相同。产率0.20 g, 61%。元素分析C₁₉H₁₂N₄O₂ (分子量 327)，理论值：C, 69.51; H, 3.68; N, 17.06; O, 9.75；实验值：C, 69.47; H, 3.72; N, 17.02; O, 9.79。FAB-MS: m/z = 328 (C₁₉H₁₂N₄O₃ 327)。

(2) 配合物D-1和L-1; D-2和L-2; D-3和L-3; D-4和L-4的合成方法：

a) cis-[Ru(bpy)₂(py)₂]Cl₂ 的合成 

按照参考文献 (Dalton Trans. 1997, 3773)合成方法，在250 mL的圆底烧瓶中加入4.0 g cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O, 46 mL 吡啶和 80 mL水，加热搅拌，回流 4小时后得澄清红色溶液。减压蒸去全部溶剂后，用30 mL甲醇溶解所得到的红色固体，然后加入 200 mL 乙醚。室温放置 1 小时，析出大量红色晶体。抽滤，用乙醚洗涤数次，得红色晶体4.0 g。

b) Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂] [O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O，Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂] [O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O合成

    按照参考文献(Dalton Trans. 1997, 3773)合成方法,在 250 mL 的锥形瓶中加入1.95 g cis-[Ru(bpy)₂]Cl₂, 30 mL H₂O, 室温搅拌下加入0.5 mol L-1的O,O’-二苯甲酰基-D/L-酒石酸钠溶液19.0 mL (由 O,O’ -二苯甲酰基-D/L-酒石酸与氢氧化钠溶液中和所得)。搅拌 10分钟后，将所得溶液置于新烘好的硅胶的干燥器中，一星期后有大量红色晶体析出，产率，50%。 

c) 配合物D-1和L-1; D-2和L-2; D-3和L-3; D-4和L-4合成

按照计量摩尔比Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂] [O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O，Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂] [O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O分别和2,4,6-PIPTH; 2,3,4-PIPTH; 2,5-PIPDH; 3,5-PIPDH在乙二醇中回流反应10小时后，加入NaClO₄水溶液，析出红色固体。抽滤干燥的粗产品经过氧化铝柱色谱分离提纯后，旋干干后得到目标产物。

D-1和L-1：产率0.12 g, 79.2%。元素分析C₃₉H₂₈N₈O₃Ru（分子量 758），实验值：C, 61.82; H, 3.72; N, 14.79; O, 6.33；理论值：C, 61.85; H, 3.73; N, 14.74; O, 6.37; Ru, 13.31。ES-MS [CH₃CN, m/z]: 758([M-2ClO₄+H]⁺), 379([M-2ClO₄]²⁺)。 

D-2和L-2：产率0.10 g, 66.0%。元素分析C₃₉H₂₈N₈O₃Ru（分子量 758），实验值：C, 61.82; H, 3.72; N, 14.79; O, 6.33; Ru, 13.34；理论值：C, 61.80; H, 3.75; N, 14.70; O, 6.41; Ru, 13.31. ES-MS[CH₃CN, m/z]: 758([M-2ClO₄+H]⁺), 379([M-2ClO₄]²⁺)。

D-3和L-3：产率0.1 g, 67.0%。元素分析C₃₉H₂₈N₈O₂Ru（分子量 742），实验值：C, 63.15; H, 3.80; N, 15.11; O, 4.31; Ru, 13.63；理论值：C, 63.10; H, 3.85; N, 15.10; O, 4.41; Ru, 13.42. ES-MS [CH₃CN, m/z]: 742 ([M-2ClO₄+H]⁺), 371 ([M-2ClO₄]²⁺)。

D-4和L-4：产率0.09 g, 60.8%。元素分析C₃₉H₂₈N₈O₂Ru（分子量 742），实验值：C, 63.05; H, 3.85; N, 15.16; O, 4.38; Ru, 13.56；理论值：C, 63.10; H, 3.85; N, 15.10; O, 4.41; Ru, 13.42. ES-MS[CH₃CN, m/z]: 742 (M-2ClO₄+H]⁺), 371 ([M-2ClO₄]²⁺). 

实施例2 CD光谱分析

在圆形光中，当一束偏振光通过具有旋光性介质时，左旋及右旋圆振成分出现相位差，这就是圆二色谱的基本原理。根据已拆分的异构体CD 谱的变化，可获得手性配合物的对称性。固定浓度的钌配合物10μM在200-700nm的波长下分析其CD光谱(图4)。

实施例3 Ru(II)配合物的拓扑异构酶抑制实验

按照药物抑制拓扑异构酶解旋实验的方法进行抑制能力的判定。将该类化合物与pBR322 DNA及拓扑异构酶在适当的缓冲液中进行反应，反应混合物在37 °C温育一定时间后，加入反应终止液终止反应。在0.9 %的琼脂搪(TBE)凝胶上，80 V的恒压条件下电泳。凝胶用1.5 μg/mL的EB溶液染色，并在紫外光下拍照。将抑制50%的Topo I或Topo II活性的配合物浓度定义为IC₅₀。实验结果表明配合物是Topo I和Topo II的双重抑制剂，表现出非常好的抑制能力，IC₅₀值大约为3~5 mM (图5)。并且所有配合物在水溶性方面优于已报道的有机小分子抑制剂，稳定性好。

实施例4 细胞毒性MTT实验

取对数生长期的肿瘤细胞，调整细胞密度5×10³个/ml，接种于 96孔培养板中，实验各样品均为100，50，25，12.5，6.25，3.125mM共 6个浓度。 每个浓度设4个复孔， 对照设8个以上复孔。 实验样品以DMSO助溶，用 DMEM培养液稀释。24小时加样后，仍将细胞置于 37 ℃, 5% CO₂培养箱内继续培养 48小时，然后加MTT，再继续培养 4小时，吸去上清液，每孔加150mM DMSO，用酶联免疫检测仪在 490nm波长测各孔吸光度，计算细胞增殖抑制率 (表1)。求出IC₅₀值 (抑制率等于50%的时候的药物浓度)

。

Claims (8)

1.一类拓扑异构酶双重抑制钌配合物，其结构式如式Ⅰ所示：

式I。

2.权利要求1所述多吡啶钌配合物的制备方法，其特征在于：

由Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O，

或Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O，

分别和配体2,4,6-PIPTH、2,3,4-PIPTH、 2,5-PIPDH、或3,5-PIPDH反应制得；

所述的配体2,4,6-PIPTH; 2,3,4-PIPTH; 2,5-PIPDH; 3,5-PIPDH 分别为：

。

3.如权利要求2所述的多吡啶钌配合物的制备方法，其特征在于：将所述的Δ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-D-酒石酸钠]·12H₂O，或Λ-[Ru(bpy)₂(py)₂][O,O'-二苯甲酰基-L-酒石酸钠]·12H₂O，分别和所述配体在乙二醇中回流反应，加入饱和NaClO₄水溶液，析出红色固体。

4.如权利要求3所述的多吡啶钌配合物的制备方法，其特征在于：所述的红色固体进一步干燥获得粗产品，再经过氧化铝柱色谱分离提纯后，干燥得到目标产物。

5.如权利要求3所述的多吡啶钌配合物的制备方法，其特征在于：所述的回流反应时间为8-10小时。

6.如权利要求3所述的多吡啶钌配合物的制备方法，其特征在于：所述的饱和NaClO₄水溶液（质量分数为66.7%）。

7.权利要求1所述钌配合物在抑制拓扑异构酶I和II活性方面的应用。

8.权利要求1所述钌配合物在作为抗癌药物方面的应用。

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