CN103655674A

CN103655674A - 乳浆大戟提取物及其制备方法和应用

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Publication number: CN103655674A
Application number: CN201210333567.1A
Authority: CN
Inventors: 陈红波; 黄来强; 范强旺; 明平红; 宁勇
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明公开了一种乳浆大戟提取物及其制备方法和应用。本发明提供了用有机溶剂提取乳浆大戟得到的乳浆大戟提取物，可用于制备具有如下功能的产品：（1）抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长；（2）抑制肿瘤细胞的克隆形成能力；（3）促进肿瘤细胞凋亡；（4）将肿瘤细胞的发育周期抑制在G0/G1期；（5）治疗癌症。本发明的发明人发现乳浆大戟提取物能显著以时间和剂量依赖的方式抑制宫颈癌细胞的生长和增殖，能使宫颈癌细胞的线粒体膜电位显著降低、诱导细胞发生凋亡性细胞死亡。本发明为开发乳浆大戟的药用价值开辟了新的途径，对宫颈癌的治疗具有重要价值。

Description

乳浆大戟提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种乳浆大戟提取物及其制备方法和应用。

背景技术

乳浆大戟，属于大戟科，拉丁名为Euphorbia esula Linn.，野生于山坡或路旁，在我国华东、东北到西南各省区都有分布。

乳浆大戟是一种有毒多年生草本植物，形态特征如下：高15-40厘米；有白色乳液；茎直立，下部带淡紫色；短枝或营养校上的叶密生，线状倒披针形；长枝或生花的茎上的叶互生，倒披针形或线状披针形，长1-3．5厘米，宽0．2-0．8厘米，顶端钝、微凹或有细凸尖；多歧聚伞花序顶生，通常3-5枝呈伞状，每伞梗再2-3回叉状分枝；总苞片对生，半圆形，顶端短尖；杯状总苞顶4裂，腺体4，位于裂片之间，新月形，两端有短角；蒴果无毛；种子灰褐色或有棕色斑点，长约2毫米。

在临床上，内用乳浆大戟可治疗四肢浮肿、小便不利、肠炎、疟疾、慢性气管炎等，外用乳浆大戟可治颈淋巴结结核、疮癣、瘙痒等，尚无其它临床应用的报道。

宫颈癌是第二常见的妇科恶性肿瘤。在2002年全球癌症统计中，约有273000人死于宫颈癌，是全球死亡率的一个主要因素。在女性恶性肿瘤中宫颈癌占15％，其中83％发生在发展中国家。预防、诊断和治疗宫颈癌成了维护妇女健康的首要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳浆大戟提取物及其制备方法和应用。

本发明提供的乳浆大戟提取物，是用有机溶剂提取乳浆大戟得到的。

所述有机溶剂具体可为乙醇或乙醇溶液。所述乙醇溶液具体可为乙醇水溶液，如95%（体积百分含量）乙醇水溶液。

所述提取的方法具体可为浸提，为了提高有机溶剂的效率，浸提过程中同时进行溶剂回流。

为了增加提取效率，提取前可将乳浆大戟进行烘干和粉碎。

所述乳浆大戟可为全植株，也可为根、茎或叶。

所述提取的方法具体可为将100.0g乳浆大戟干粉加入500mL 95%（体积百分含量）乙醇水溶液，室温条件下浸提24小时（为了有效利用溶剂，浸提过程中同时进行溶剂回流）。

为了增加有效成分的浓度，在进行所述提取后，可将整个体系进行浓缩。现有的浓缩方法均可采用，如旋转蒸发。

以上任一所述乳浆大戟提取物在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述产品的功能为如下（1）至（5）中的至少一种：（1）抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长；（2）抑制肿瘤细胞的克隆形成能力；（3）促进肿瘤细胞凋亡；（4）将肿瘤细胞的发育周期抑制在G0/G1期；（5）治疗癌症。所述（1）和/或（2）和/或（3）和/或（4）中，所述肿瘤细胞可为宫颈癌细胞。所述（5）中，所述癌症可为宫颈癌。

本发明还保护一种产品，它的活性成分为以上任一所述的乳浆大戟提取物。所述产品的功能为如下（1）至（5）中的至少一种：（1）抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长；（2）抑制肿瘤细胞的克隆形成能力；（3）促进肿瘤细胞凋亡；（4）将肿瘤细胞的发育周期抑制在G0/G1期；（5）治疗癌症。所述（1）和/或（2）和/或（3）和/或（4）中，所述肿瘤细胞可为宫颈癌细胞。所述（5）中，所述癌症可为宫颈癌。

以上任一所述宫颈癌细胞可为HeLa细胞或caski细胞。以上任一所述宫颈癌具体可为HeLa细胞和/或caski细胞引起的宫颈癌。

以上任一所述“将肿瘤细胞的发育周期抑制在G0/G1期”是通过降低细胞中的细胞周期蛋白Cyclin E和周期依赖性激酶CDK4的表达水平，同时升高P21蛋白的表达水平引起的。

本发明的发明人发现乳浆大戟提取物能显著以时间和剂量依赖的方式抑制宫颈癌细胞的生长和增殖，能使宫颈癌细胞的线粒体膜电位显著降低、诱导细胞发生凋亡性细胞死亡，能显著阻滞宫颈癌细胞停留在G0/G1期、降低cyclinD1、cyclinE和CDK4的表达水平，增加P21的表达水平。本发明为开发乳浆大戟的药用价值开辟了新的途径，对宫颈癌的治疗具有重要价值。

附图说明

图1为MTT增殖抑制实验的结果。

图2为细胞克隆形成实验的结果；A：空白对照；B：乳浆大戟提取物浓度为1μg/mL；C：乳浆大戟提取物浓度为2μg/mL；D：乳浆大戟提取物浓度为4μg/mL；E：乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL；F：乳浆大戟提取物浓度为16μg/mL。

图3为Annexin V-PI双染细胞凋亡率分析的结果；A：空白对照；B：乳浆大戟提取物浓度为2μg/mL；C：乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL；D：乳浆大戟提取物浓度为16μg/mL。

图4为DAPI染色后细胞核形态观察的结果；A：空白对照；B：乳浆大戟提取物浓度为2μg/mL；C：乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL；D：乳浆大戟提取物浓度为16μg/mL。

图5为线粒体膜电位检测的结果；A：空白对照；B：乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL。

图6为PI单染流式细胞周期分析的结果；A：空白对照；B：乳浆大戟提取物浓度为2μg/mL；C：乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL；D：乳浆大戟提取物浓度为16μg/mL。

图7为Western blot蛋白分析的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的细胞培养均采用高糖DEME培养基。

HeLa细胞（宫颈癌细胞）：购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，产品目录号:3142C0001000000009。caski细胞（宫颈癌细胞）：购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，产品目录号:3142C0001000000117。

乳浆大戟：公众可从清华大学深圳研究生院获得；参考文献：王韧,王建锋.内蒙古草原乳浆大戟及其天敌.中国草地1992,(2):16-19.。

实施例1、乳浆大戟提取物的制备

1、将乳浆大戟全植株（包括根、茎、叶）洗净、烘干、粉碎至60目（实际应用中20-100目均可），得到干粉。

2、取100.0g步骤1得到的干粉，加入500mL 95%乙醇水溶液，室温条件下静置浸提24小时（浸提过程中溶剂连续回流）。

3、将完成步骤2的全部液体体系用旋转蒸发仪浓缩至50mL，然后加入无菌蒸馏水并用无菌蒸馏水定容至100ml，即为乳浆大戟提取物，以步骤2中的干粉计，乳浆大戟提取物的浓度为1g/mL。

实施例2、乳浆大戟提取物抑制宫颈癌细胞的生长和增殖

分别将HeLa细胞和Caski细胞进行如下实验（乳浆大戟提取物的浓度以干粉计）：

一、MTT增殖抑制实验

将HeLa细胞悬液（细胞密度为1×10⁴/ml）接种至96孔板中；然后加入实施例1制备的乳浆大戟提取物，使其在各个孔中的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL或16μg/mL（每个浓度设置9个复孔），设置用等体积液体培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照，37℃培养；从加入乳浆大戟提取物开始计时，分别于24h、48h或72h（每个处理时间设置3个复孔）后加入MTT溶液（每孔20ul），37℃培养4h，弃上清，加入DMSO（每孔150ul）并震荡反应10min，然后于490nm测吸光度（OD_490nm）。

抑制率=（空白对照组的OD_490nm数值-实验组的OD_490nm数值）÷空白对照组的OD_490nm数值×100%。

各浓度处理实验组的抑制率结果见图1和表1。

表1各浓度处理实验组的抑制率结果（平均值）

结果表明，乳浆大戟提取物以时间和剂量依赖的方式显著抑制了宫颈癌细胞的生长和增殖。

二、细胞克隆形成实验

将Caski细胞悬液（细胞密度为0.5×10³/ml）接种至6孔板上层（6孔板的每个孔中，上层为1ml含0.6g/100ml软琼脂和实施例1制备的乳浆大戟提取物的2×DMEM培养基，下层为含1.2g/100ml软琼脂和实施例1制备的乳浆大戟提取物的2×DMEM培养基；上层和下层的乳浆大戟提取物浓度相等；使各孔中乳浆大戟提取物的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL或16μg/mL，每个浓度设置3个复孔；设置用等体积培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照），37℃培养2周，然后用1％多聚甲醛固定并进行0.1％结晶紫染色（染色时间约15分钟），然后在光学显微镜下计数克隆数，拍照。

结果见图2。乳浆大戟提取物以剂量依赖的方式显著抑制了宫颈癌细胞的克隆形成能力。

实施例3、乳浆大戟提取物促进宫颈癌细胞凋亡

一、Annexin V-PI双染细胞凋亡率分析

将HeLa细胞接种至6孔板中（1×10⁶个/孔），37℃培养12h；然后加入实施例1制备的乳浆大戟提取物，使其在各个孔中的浓度分别为2μg/mL、8μg/mL或16μg/mL（每个浓度设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照，37℃培养24h；利用Invitrogen公司凋亡试剂盒(invitrogen货号v13241）进行检测，具体方法如下（方法中的各个溶液和试剂均为试剂盒的组分）:胰酶消化后每孔收集1×10⁶个细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入195μl Annexin V-FITC结合液,轻轻重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC,并轻轻混匀，室温避光孵育10分钟，然后1000rpm离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10μl PI染色液，轻轻混匀，避光放置，用300目尼龙网过滤后进行流式细胞仪检测。

结果见图3。空白对照中，Annexin V-FITC阳性的细胞比例为0.110%。乳浆大戟提取物浓度为2μg/mL的实验组中，Annexin V-FITC阳性的细胞比例为0.240%。乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL的实验组中，Annexin V-FITC阳性的细胞比例为0.473%。乳浆大戟提取物浓度为16μg/mL的实验组中，Annexin V-FITC阳性的细胞比例为82.9%。结果表明，随着乳浆大戟提取物浓度的升高，Annexin V-FITC阳性的细胞比例逐渐增多，说明乳浆大戟提取物诱导了细胞凋亡的发生。

二、DAPI染色后细胞核形态观察

将Caski细胞接种至6孔板中（1×10⁶个/孔），37℃培养12h；然后加入实施例1制备的乳浆大戟提取物，使其在各个孔中的浓度分别为2μg/mL、8μg/mL或16μg/mL（每个浓度设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照，37℃培养24h；吸弃培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，用4%多聚甲醛固定15min，用PBS缓冲液洗涤2次，用0.1%Tritonx-100打孔5min，用PBS缓冲液洗涤2次，加入100μL DAPI染色工作液，室温放置10min，吸除DAPI染色液，用PBS缓冲液洗涤3次，然后利用荧光显微镜观察细胞形态。

结果见图4。空白对照中，细胞核呈现圆形、边缘清晰，而且着色均匀。用乳浆大戟提取物处理后，细胞核变得不规则，染色质呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。以上结果说明，乳浆大戟提取物诱导了宫颈癌细胞凋亡的发生。

三、线粒体膜电位检测

将HeLa细胞接种至6孔板中（1×10⁶个/孔），37℃培养12h；然后加入实施例1制备的乳浆大戟提取物，使其在孔中的浓度为8μg/mL（设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照，37℃培养24h；吸弃培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入1ml液体培养基和1ml JC-1染色工作液（碧云天公司,货号:C2005），充分混匀，在细胞培养箱中37℃孵育20分钟，用冰的1×JC-1染色缓冲液（碧云天公司,货号:C2005）洗涤2次，加入2ml液体培养基，荧光显微镜下观察。

结果见图5。空白对照组中，细胞可以看到红色荧光标记的完整的颗粒状的线粒体，表明细胞线粒体膜完整，膜电位处于正常值。用乳浆大戟提取物处理后，细胞线粒体明显受到损伤，颗粒状的线粒体减少，线粒体膜电位降低，荧光呈现绿色。结果表明，乳浆大戟提取物诱导的细胞凋亡是通过线粒体途径的。

实施例4、乳浆大戟提取物对宫颈癌细胞周期的影响

一、PI单染流式细胞周期分析

将HeLa细胞接种至6孔板中（1×10⁶个/孔），37℃培养12h；然后加入实施例1制备的乳浆大戟提取物，使其在各个孔中的浓度分别为2μg/mL、8μg/mL或16μg/mL（每个浓度设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照，37℃培养24h；胰酶消化细胞，收集对数生长期的1×10⁶个细胞，用1ml PBS缓冲液重悬，滴加至4mL预冷70%乙醇水溶液中，4℃固定过夜，离心弃上清，用PBS缓冲液洗涤2次，用1ml PBS缓冲液重悬并加入RNaseA（使其浓度为20μg/mL），37℃孵育30min，离心弃上清，用PBS缓冲液洗涤1次，用500μL PBS缓冲液重悬并加入1μL PI染色液，室温避光染色30min，用300目尼龙网过滤后进行流式细胞仪分析。

结果见图6。空白对照中，处于G1期的细胞比例为47.20%。乳浆大戟提取物浓度为2μg/mL的实验组中，处于G1期的细胞比例为50.15%。乳浆大戟提取物浓度为8μg/mL的实验组中，处于G1期的细胞比例为71.49%。乳浆大戟提取物浓度为16μg/mL的实验组中，处于G1期的细胞比例为88.65%。结果表明，随着乳浆大戟提取物浓度的升高，细胞周期显著抑制在G0/G1期，而且在高浓度作用下，伴随着细胞周期抑制，还出现了明显的凋亡峰。

二、Western blot蛋白分析

将HeLa细胞接种至6孔板中（1×10⁶个/孔），37℃培养12h；然后加入实施例1制备的乳浆大戟提取物，使其在各个孔中的浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL或16μg/mL（每个浓度设置3个复孔），设置用等体积液体培养基代替乳浆大戟提取物的空白对照，37℃培养24h；提取细胞总蛋白并进行Wesern blot分析（每个泳道采用等量总蛋白上样），一抗4℃过夜，HRP标记的二抗室温孵育1h，X-光片曝光、显影。采用β-actin作为内参。

用于检测CDK4的一抗购自Abcalm（目录号ab7955）。用于检测CyclinD1的一抗购自Abcalm（目录号ab6152）。用于检测CyclinE的一抗购自Abcalm（目录号ab7959）。用于检测P21的一抗购自Abcalm（目录号ab7960）。HRP标记的二抗购自KPL公司。

结果见图7。乳浆大戟提取物显著降低了细胞周期蛋白Cyclin E和周期依赖性激酶CDK4的表达水平，同时升高了P21蛋白的含量。上述结果表明，乳浆大戟提取物是通过影响细胞相关蛋白的表达水平进而影响细胞周期进展并引起细胞凋亡的。

Claims

1.一种乳浆大戟提取物，是用有机溶剂提取乳浆大戟得到的。

2.如权利要求1所述的乳浆大戟提取物，其特征在于：所述有机溶剂为乙醇或乙醇溶液。

3.权利要求1或2所述乳浆大戟提取物在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（1）至（5）中的至少一种：（1）抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长；（2）抑制肿瘤细胞的克隆形成能力；（3）促进肿瘤细胞凋亡；（4）将肿瘤细胞的发育周期抑制在G0/G1期；（5）治疗癌症。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述（1）和/或（2）和/或（3）和/或（4）中，所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述（5）中，所述癌症为宫颈癌。

6.一种产品，它的活性成分为权利要求1或2所述乳浆大戟提取物。

7.如权利要求6所述的产品，其特征在于：所述产品的功能为如下（1）至（5）中的至少一种：（1）抑制肿瘤细胞的增殖和/或生长；（2）抑制肿瘤细胞的克隆形成能力；（3）促进肿瘤细胞凋亡；（4）将肿瘤细胞的发育周期抑制在G0/G1期；（5）治疗癌症。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于：所述（1）和/或（2）和/或（3）和/或（4）中，所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞。

9.如权利要求7所述的产品，其特征在于：所述（5）中，所述癌症为宫颈癌。