CN103585196B - 通经草提取物在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通经草提取物的新用途，该新用途是通经草提取物在制备抗癌药物中的应用。所述通经草提取物是按如下方法制备的：以通经草为原料，用50%-90%乙醇提取，通过高速逆流色谱、大孔吸附树脂等色谱纯化得到。本发明提供的通经草提取物对制备抗癌药物，尤其是抗肝癌、肺癌、胃癌药物具有重要意义。

Description

通经草提取物在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物在制备抗癌药物中的应用，具体是涉及通经草提取物在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

据2010年2月卫生部统计资料，每年全球癌症死亡人数达1000万。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌症所致，并预测按目前的趋势发展下去，到2050年将有二分之一的死亡者是由于患了癌症。我国恶性癌发病率以每年2.5-5%速度增长，已成为严重危害人类生命的元凶。在各种类型的癌症当中以肺癌、胃癌、肝癌等发病率较高。

血管为正常组织器官的形成发生于功能维护所必需，它与人体发育失调和多种病因导致的种种疾病密切相关。肿瘤新血管形成在肿瘤发生、发展、转移和复发起举足轻重作用。一系列研究表明只要有效抑制肿瘤新血管形成，就能抑制肿瘤生成、转移和复发。此外，糖尿病和风湿性关节炎等疾病都有血管增生，其血管异常与肿瘤血管非常相似。因此，血管增生抑制剂也可用于治疗糖尿病和风湿性关节炎等血管增生性疾病。近年来，人们对肿瘤血管生成机制的研究不断深入，许多抗肿瘤血管生成的药物如Avastin、Angiostatin等相继被开发出来，已在临床上推广应用。这类药物不但可以用于大多数实体瘤的治疗，还可以用于肿瘤的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗，同时对其他与血管生成有关的疾病如糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有一定的理论和现实意义。

肿瘤中的肿瘤细胞可分为两类。一类为普通的肿瘤细胞，一类为肿瘤干细胞。普通的肿瘤细胞具有快速分裂，对抗肿瘤药敏感，没有自身更新能力等特点。因此普通的肿瘤细胞在分裂一定代数后会死亡。肿瘤干细胞则具有如下特点：通常情况下处于静止状态，及不分裂状态，对抗肿瘤药不敏感，具有自身更新能力，即具有无限繁殖的能力。在肿瘤化疗中，大量的肿瘤细胞被杀死（因为对化疗药敏感），然而肿瘤干细胞会生存下来（因为对化疗药不敏感）。肿瘤的复发是由于肿瘤化疗药对肿瘤干细胞无效。找能有效治疗肿瘤干细胞的药物是当前的一个方向。能否根除肿瘤的关键不在于能否杀灭普通的肿瘤细胞，而在于根除肿瘤干细胞。

中医药治疗癌症的历史源远流长，迄今已有紫杉、喜树、砒霜、绿茶、灵芝、人参、长春花、天门冬、半枝莲、天葵子等用于临床治疗癌症，取得了一些较好的效果。长期以来，人们应用传统思维、理念和方法研发抗癌中草药，虽然已取得了进步，但收效甚微。迄今中草药尚未在国内外成为首选抗癌药物，现有临床中草药的抗癌疗效丞需进一步提高。因此，研发中草药抗癌药物是目前治疗恶性癌的当务之急，而阐明内源性低分子抑瘤物的化学本质是这一领域研究的核心问题。

通经草系中国蕨科植物银粉背蕨(Aleuritopterisargentea（Gmel.）Fee)的干燥全草。秋季采收，除去杂质晒干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册》。其性平，味微苦，具有明目、愈伤、止血、活血调经、止咳、利湿、解毒消肿等功效，可用于目赤、视力减退、胸伤、骨伤、肺痨咳嗽、吐血。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关通经草的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，通经草含有粉背蕨酸（alepterolicacid），蔗糖（sucrose）和黄酮类化合物，其他化学成分不详；药理作用研究表明，通经草黄酮是一种天然有效的自由基清除剂通经草黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢具有很强的清除作用，其EC₅₀分别为0.0099、0.0060和0.0190mg/mL，且呈浓度依赖关系，其他药理作用未见报道。

专利申请号为CN96102241.8的专利公开了一种治疗肝胆结石和抗复发的特效药物组方，其中含有通经草。专利申请号为CN200310110176.4的专利申请公开了公开了一种治疗鼻窦炎的药物组方，其中含有通经草。专利申请号为CN200310110531.8的专利公开了一种用于治疗再生障碍性贫血的中草药剂，其由回生草、神仙草、通经草等近20种中草药经水熬煮加白酒配制而成。专利申请号为CN97107327.9的专利公开了一种治疗妇女痛经的中草药，配方的组成包括：通经草、苍术、鸡内金等。专利申请号为CN201210440734.2的专利公开了一种治疗儿童急性良性肌炎的药物，其原料配方和重量配比为：通经草6～10份，丝瓜络8～15份，走马风8～15份等。专利申请号为CN201210462718.3的专利公开了一种治疗乳房疾病的药物，其特征在于组分和重量配比是：通经草1：灯笼草2：白术1.5等。

上述文献及专利等，尚未见通经草或通经草提取物用于制备抗癌药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供通经草提取物的一种新用途。本发明所提供的通经草提取物的一种新用途是在制备抗癌药物中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所用通经草为中国蕨科植物银粉背蕨(Aleuritopterisargentea（Gmel.）Fee)的干燥全草。

通经草提取物在制备抗癌药物中的应用，所述通经草提取物的制备方法为：

（1）通经草，用浓度50%～90%乙醇作为溶剂，在50℃～80℃温浸提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6～15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加5～20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3：2：2：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度30%～70%的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B、通经草提取物C，其中一种或两种按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物。

通经草提取物的制备方法为:

（1）通经草，用浓度50%～90%乙醇作为溶剂，在50℃～80℃温浸提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6～15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加5～20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3：2：2：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度30%～70%的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B与通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物。

优选的本发明通经草提取物制备方法:

（1）通经草，用浓度70%乙醇作为溶剂，在70℃温浸提取，提取2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为通经草重量的12倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加10倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3：2：2：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过HPD600大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度50%的乙醇溶液进行洗脱，收集50%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B与通经草提取物C混匀，即得本发明的通经草提取物。

本发明的通经草提取物中，通经草提取物B主要含有：粉背蕨酸(alepterolicacid)；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-dioicacid；methyl8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid-15-oate；15-acetoxy-8(17)，13(E)-labdadi-en-19-oicacid；15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-diol；共6个半日花烷型二萜类成分。

本发明的通经草提取物中，通经草提取物C主要含有：金粉蕨素（Onychin）；金粉蕨素-2'-O-β-D-葡萄糖苷；金粉蕨素-2'-O-β-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)；去甲氧基荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-二氢黄酮)；共7个二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分。

本发明的通经草提取物制备方法，其特征在于：所采用的大孔吸附树脂为LSA-40大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂。

本发明的通经草提取物，可以通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的各种口服剂型。

本发明的通经草提取物可用于制备抗癌药物，尤其是抗肺癌、肝癌、胃癌药物。

本发明的通经草提取物与化学药或中药或天然药物组成的抗癌药物。

本发明的通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C在制备抗癌药物中的应用。

本发明的通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C与化学药或中药或天然药物组成的抗癌药物。

本发明首次探索研究以中国蕨科植物银粉背蕨(Aleuritopterisargentea（Gmel.）Fee)的干燥全草为原料提取制备抗癌提取物。本实验研究表明，通经草提取物对小鼠S180肉瘤的抑瘤率为49.2%，可见具有较强抗癌的作用，在此基础上我们进一步研究其对血管生成的影响。评价癌血管生成程度的最客观标准时癌组织内的微血管数目，本实验通过小鼠移植性癌模型体内实验，瘤体微血管标记染色，微血管密度计数显示，通经草各提取物均可抑制癌血管的生成，和对照组比较，具有显著性差异。本发明测定通经草提取物杀伤癌细胞(HepG2、GLC、MFC)的作用结果显示，其主要表现为浓度依赖型的细胞毒作用特点，即随着药物剂量增加，抑制作用逐渐增强。

具体实施方式

下面通过具体实验例和实施例对通经草提取物在制备抗癌药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。

实施例1：通经草提取物及单体化合物制备

（1）通经草20kg，用浓度70%乙醇作为溶剂，在70℃温浸提取，提取2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为通经草重量的12倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加10倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3：2：2：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过HPD600大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液进行洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B与通经草提取物C混匀，即得本发明的通经草提取物。

如上所述方法制备通经草提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:1-3:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，石油醚-丙酮（1:2）重结晶，分别得到粉背蕨酸(alepterolicacid)；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-dioicacid；methyl8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid-15-oate；15-acetoxy-8(17)，13(E)-labdadi-en-19-oicacid；15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-diol等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测粉背蕨酸等半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数55%。

如上所述方法制备通经草提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-3:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到金粉蕨素（Onychin）；金粉蕨素-2'-O-β-D-葡萄糖苷；金粉蕨素-2'-O-β-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)；去甲氧基荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-二氢黄酮)等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数50%。

实施例2：通经草提取物及单体化合物制备

（1）通经草20kg，用浓度90%乙醇作为溶剂，在50℃温浸提取，提取次数为3次，每次提取时间为1小时，每次溶剂用量为通经草重量的15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3：2：2：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度70%的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物，其中通经草提取物B占20%，通经草提取物C占80%。

如上所述方法制备通经草提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:1-3:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，石油醚-丙酮（1:2）重结晶，分别得到粉背蕨酸(alepterolicacid)；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-dioicacid；methyl8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid-15-oate；15-acetoxy-8(17)，13(E)-labdadi-en-19-oicacid；15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-diol等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测粉背蕨酸等半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数80%。

如上所述方法制备通经草提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-3:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到金粉蕨素（Onychin）；金粉蕨素-2'-O-β-D-葡萄糖苷；金粉蕨素-2'-O-β-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)；去甲氧基荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-二氢黄酮)等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数30%。

实施例3：通经草提取物及单体化合物制备

（1）通经草5kg，用浓度50%乙醇作为溶剂，在80℃温浸提取，提取次数为1次，每次提取时间为4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加5倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3：2：2：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过LSA-40大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度30%的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）将上述通经草提取物B和通经草提取物C按一定比例混匀，即得本发明的通经草提取物，其中通经草提取物B占85%，通经草提取物C占15%。

如上所述方法制备通经草提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:1-3:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，石油醚-丙酮（1:2）重结晶，分别得到粉背蕨酸(alepterolicacid)；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-dioicacid；methyl8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid-15-oate；15-acetoxy-8(17)，13(E)-labdadi-en-19-oicacid；15-hydroxy-8(17)，13(E)-labdadien-19-oicacid；8(17)，13(E)-labdadien-15，19-diol等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测粉背蕨酸等半日花烷型二萜类成分在通经草提取物B中的含量为质量分数30%。

如上所述方法制备通经草提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-3:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到金粉蕨素（Onychin）；金粉蕨素-2'-O-β-D-葡萄糖苷；金粉蕨素-2'-O-β-D-阿洛糖苷；高山金粉蕨甲素；高山金粉蕨乙素；荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-4-甲氧基-二氢黄酮)；去甲氧基荚果蕨素(5,7-二羟基-6,8-二甲基-二氢黄酮)等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。含量经高效液相色谱检测金粉蕨素等二氢黄酮及二氢黄酮苷类成分在通经草提取物C中的含量为质量分数70%。

实施例4:通经草提取物片剂的制备

取上述实施例1中通经草提取物345g，加入50g淀粉，混匀，制粒，过筛，加13g微晶纤维素，0.5g硬脂酸镁，混匀，压制成1000片,即为本发明的通经草提取物片剂。

实施例5：通经草提取物胶囊的制备

取上述实施例2中通经草提取物345g，加入淀粉80g，制粒，整粒，加入适量硬脂酸镁，装胶囊1000粒，即得本发明的通经草提取物胶囊。

实施例6：通经草提取物颗粒的制备

取上述实施例3中通经草提取物245g，加入糊精100g，制粒，整粒，即得本发明的通经草提取物颗粒。

实验例1：通经草各提取物对小鼠移植性S₁₈₀肉瘤血管形成抑制作用

方法：小鼠肉瘤S₁₈₀瘤株，腹腔传代接种。待腹水生长旺盛时，抽出腹水，细胞计数，调整细胞浓度为2×10⁷个细胞/毫升，在小鼠腋下scS₁₈₀肉瘤细胞，每只接种0.2ml。

实验动物及瘤株：昆明小鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重(20±2)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。小鼠肉瘤S₁₈₀由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。

药品：通经草提取物、通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C为（按实施例1方法制备所得，批号分别为：20120404、20120405、20120406、20120407），分别配置成0.1g/ml生理盐水溶液。

治疗及分组：150只小鼠于接种当天随机分为5组：空白对照组、通经草提取物组、通经草提取物A组、通经草提取物B组、通经草提取物C组。通经草提取物组、通经草提取物A组、通经草提取物B组、通经草提取物C组，分别予以注射液25ml/kg。对照组予以生理盐水0.2ml/只。治疗10d后处死小鼠，剥离瘤体称重，按公式计算抑瘤率：抑瘤率=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重*100%。

微血管染色：免疫组化SABC法染色血管，即用微型血管染色试剂盒(一抗为人相关第八因子)为武汉博士德生物公司产品。通经草提取物各组和对照组瘤体剥离后，切取标本，固定，包埋，切片。经染色后的切片，内皮细胞褐染，血管呈黄褐色，易于辨认。MVD的测定按Bosari等报道的方法进行，先在低倍视野下选取癌微血管最丰富的区域，即“热点”，再在400倍视野范围计数被染成棕色的微血管数目，取3个数值的平均值作为MVD值。任何棕染的内皮细胞或内皮细胞簇，只要与临近的微血管、癌细胞或其他结缔组织分开，就视为一个血管，尽管血管腔常可看到，但并不作为判断血管的标准。为了避免较大血管对计数的干扰，对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔>8个红细胞面积的血管不予计数。

VEGF、bFGF免疫组化：VEGF、bFGF免疫组化检测试剂盒(即用型)购自武汉博士德生物公司。阳性细胞呈棕黄色，免疫组化染色评分按Rahman等的方法进行，即VEGF、bFGF的评分标准是：根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度，染色范围(阳性细胞比率)分为0-4级，阴性为0分；阳性细胞1%-25%为1分；阳性细胞26%-50%为2分；阳性细胞51%-75%为3分；阳性细胞76%-100%为1分。染色强度划分为0-3级；阴性为0分；弱阳性为1分；中等强度为2分；强阳性为3分，得分相加为最后评分。

统计方法：运用SPSS统计软件，采用t检验。

结果：

(1)荷瘤鼠对治疗措施的反应以及抑瘤率

接种后第6天，各组荷瘤鼠腋下移植瘤已有黄豆大小，小鼠活泼，饮食正常。对照组小鼠第8天后瘤体生长加快，部分小鼠不活泼，进食差；治疗各组小鼠活泼，饮食正常，毛发光泽正常，瘤体生长缓慢。通经草各提取物组对小鼠S₁₈₀肉瘤均有抑制作用。见表1

表1通经草各提取物对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制作用(n=12)

(2)通经草各提取物对S₁₈₀瘤体微血管密度的影响

经免疫组化SABC法染色后的切片，血管内皮细胞被褐染，对照组可见微血管广泛分布于癌组织间质内，实验组微血管相对少见，P<0.05，见表2

表2通经草各提取物对小鼠S₁₈₀移植瘤内微血管密度的影响(n=12)

注：与对照组相比*P<0.05，**与对照组相比P<0.01。

(3)通经草各提取物对S₁₈₀瘤体VEGF、bFGF表达的影响

免疫组化结果显示，VEGF、bFGF蛋白在S₁₈₀肉瘤组织中呈高表达，主要表达于细胞的细胞浆。通经草各提取物对VEGF、bFGF的表达有明显的抑制作用，结果见表3。

表3通经草提取物对小鼠S₁₈₀瘤体VEGF、bFGF表达的影响(n=12)

注：与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01。

本实验研究表明，通经草各提取物对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率为49.2%，可见具有较强抗癌的作用，在此基础上我们进一步研究其对血管生成的影响。评价癌血管生成程度的最客观标准时癌组织内的微血管数目，本实验通过小鼠移植性癌模型体内实验，瘤体微血管标记染色，微血管密度计数显示，通经草各提取物均可抑制癌血管的生成，和对照组比较，具有显著性差异。血管形成，即从已有的血管上抽芽生成新的毛细血管，这一多步骤过程依赖于血管形成促进因子和抑制因子的协调产生。研究表明，VEGF、bFGF在多种癌中均有表达，VEGF、bFGF在多种癌的血管新生中起着重要的作用。

实施例7通经草提取物体外抗癌试验

1、造模方法：取生长良好的贴壁细胞一瓶，用0.1%-0.2%的胰蛋白酶消化5min。离心后取收集细胞，用含10%小牛血清的培养液洗涤细胞1次，作成单个分散细胞悬液、调节到每毫升含60个细胞。取5ml注入60min塑料培养皿中，铺满培养皿表面，使细胞均匀分布，每皿含300-500个细胞，将培养皿置37℃5%CO₂培养箱中过夜。在倒置显微镜下，观察细胞贴壁分布情况，若贴壁良好，分布均匀，弃去培养液即可加不同的待试药(一般用含10%小牛血清的培养液配制待试药)，若待试药为中药粗制剂，如水煎剂、醇提液等，目前一般不直接加粗制剂于细胞培养皿中，而是加不同量的含药血清，这样可以提高实验结果的可信度。既给供血动物(一般用大鼠或家兔)喂中药粗制剂，隔一段时间后取血，分离血清(具体方法另章介绍)。药物与细胞作用一定时间(2-4h)后，倒去含药培养液。用新鲜培养液漂洗后，加入无药血清培养液培养10-12d即可进行克隆记数。弃去培养液，再用Han’s液洗涤1-2次，加入新配制的固定液，即甲醇冰醋液(3:1)3-5ml，固定10min，弃去固定液，干燥后加入10%Giemsa染色液染色约20min，在20x解剖显微镜下，记数含50个以上的集落数(克隆)。

2、通经草各提取物的体外抗癌实验研究

方法按上述方法造模。细胞培养：人肺腺癌细胞GLC(上海细胞研究所引进)、人肝癌细胞株HepG2(上海细胞研究所引进)、鼠前胃癌细胞MFC(上海细胞研究所引进)。在含10%小牛血清的RPM1640(美国Gibco)培养液中(内含0.1%青霉素、链霉素)培养，37℃4%CO₂饱和湿度的培养箱内备用。

药物：阳性对照顺铂(PDD)系齐鲁制药厂的产品，5-氟尿嘧啶(5-FU)系天津人民制药厂的产品，使用时新鲜配制，其浓度PDD为20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，5-FU为100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，通经草提取物、通经草提取物A、通经草提取物B、通经草提取物C实验组均为为50μg/ml，25μg/ml，12μg/ml。

药物抑制试验：细胞毒试验采用改良MTT法，制成3*10⁵/ml细胞悬液，置入96孔培养板内，每孔100μL。实验设癌细胞阴性对照组(以生理盐水代替)、阳性对照组及通经草提取物组、通经草提取物A组、通经草提取物B组、通经草提取物C组。将不同浓度样品分别加在96孔板内。每种剂量3个平行孔。药物作用48h后，弃上清每孔加入MTT10μl，37℃孵育4h，弃上清后每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl，微量振荡器震荡5min，自动酶标读数仪测OD值(波长570μm)，计算药物对癌细胞的抑制率。癌细胞杀伤率=对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值/对照孔测定的平均OD值*100%。

细胞形态学变化的分析：收集通经草各提取物、PDD处理的细胞，用相差显微镜观察并拍照。

细胞凋亡的侧定：培养细胞配制成1*10⁵/ml细胞悬液，接种在放有盖玻片的24孔培养板中，设正常癌细胞阴性对照和PDD(10μg/ml)、5-FU(25μg/ml)及通经草提取物12μg/ml作用48h后，用PBS液洗2次，用10%中性福尔马林固定，PBS洗3次，过氧化氢处理后，加标记缓冲液37℃孵育，PBS洗3次，再加生物素化的dUTP标记，37℃孵育，PBS洗3次，0.5%DAB底物反应显色苏木素复染，常规封片，镜检。

统计学方法：每种药物做平行测定3孔，求其±s，采用SAS软件方差分析，q检验，每个药物试验组与阴性对照组比较。

2.结果

(1)通经草各提取物组等对癌细胞的影响：5-FU、PDD、通经草各提取物组，对癌细胞的杀伤力随药物浓度的增加抑制率逐渐增加，见表4。

表4MTT法测定通经草各提取物组对癌细胞的影响

(2)通经草提取物的抗癌作用MIT法的作用原理是MIT能被活细胞线粒体的线粒体脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶和心肌黄酶），还原成紫蓝色的甲臢（Fornazan）,死细胞或红细胞则无这种能力，从而可用比色法推测细胞的存活和增殖程度。该方法操作简单、快速、敏感，近年来不仅用于抗癌药物体外敏感性实验，美国国立癌症研究所已用其作为常规筛选化疗药物的方法。我们采用MTT法筛选抗癌新药，缩短了实验周期，重复性较好。

本发明测定通经草各提取物杀伤癌细胞(HepG2、GLC、MFC)的作用结果显示，其主要表现为浓度依赖型的细胞毒作用特点。即随着药物剂量增加，抑制作用逐渐增强(见表4)。通经草提取物的杀伤能力与5-FU较接近，稍次于PDD。细胞凋亡结果显示，通经草提取物能有效地诱导癌细胞凋亡，凋亡指数，与阳性药物PDD、5-FU较一致。

Claims (8)

1.通经草提取物在制备抗癌药物中的应用，所述通经草提取物的制备方法为：

（1）通经草，用浓度50%～90%乙醇作为溶剂，在50℃～80℃温浸提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6～15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加5～20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；

将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以份数比3：2：2：1的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度30%～70%的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B、通经草提取物C，其中一种或两种按一定比例混匀，即得通经草提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述通经草提取物的制备方法为：

（1）通经草，用浓度50%～90%乙醇作为溶剂，在50℃～80℃温浸提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～4小时，每次溶剂用量为通经草重量的6～15倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加5～20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；

将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以份数比3：2：2：1的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度30%～70%的乙醇溶液进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B与通经草提取物C按一定比例混匀，即得通经草提取物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述通经草提取物的制备方法为：

（1）通经草，用浓度70%乙醇作为溶剂，在70℃温浸提取，提取2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为通经草重量的12倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得通经草提取物A；

（2）将步骤（1）得到的通经草提取物A加10倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；

将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以份数比3：2：2：1的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得通经草提取物B；

（3）将步骤（2）得到的药液A，通过HPD600大孔吸附树脂柱，用水洗脱，再用浓度50%的乙醇溶液进行洗脱，收集50%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得通经草提取物C；

（4）上述通经草提取物B与通经草提取物C混匀，即得:通经草提取物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所采用的大孔吸附树脂为LSA-40大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述癌为肺癌、肝癌、胃癌。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的通经草提取物与化学药或中药组成的抗癌药物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的通经草提取物B、通经草提取物C在制备抗癌药物中的应用。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的通经草提取物B、通经草提取物C与化学药或中药组成的抗癌药物。