CN111358804A - Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体涉及的是Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用,药理研究表明,Cynanoside H通过诱导S期周期阻滞,抑制MDA‑MB‑231细胞增殖;逆转上皮间质转化从而抑制MDA‑MB‑231细胞迁移和侵袭,发挥防治乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的作用,为预防和/或治疗乳腺癌药物的研发提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及的是Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
根据美国癌症学会发布全球癌症统计报告(GLOBOCAN),2018年全球新发乳腺癌病例约为210万,占所有癌症新发病例的11.6%,占女性癌症新发病例的24.2%,乳腺癌死亡病例占女性癌症死亡病例15%,是全球女性癌症发病率及死亡率最高的肿瘤疾病。乳腺癌同其他肿瘤一样,是一种异质性疾病,且发病机理较复杂。目前乳腺癌治疗手段主要有手术治疗、放化疗、内分泌治疗及靶向治疗等。但是值得注意的是占乳腺癌患者中约为15%的三阴性乳腺癌患者,因为无雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2的表达,内分泌治疗和靶向治疗受到限制。而且有报道显示三阴性乳腺癌的复发及转移率相对较高。因此,迫切需要寻找更多、更有效的抗乳腺癌的药物。
白薇(Cynanchum atratum Bunge.)为萝藦科鹅绒藤属多年生草本植物。《中国药典》记载其根及部分根茎供药用,具有清热凉血,利尿通淋,解毒疗疮之功效,用于温邪伤营发热,阴虚发热,骨蒸劳热,产后血虚发热,热淋,血淋,痈疽肿毒。白薇根及根茎中含有白薇素、挥发油、强心甙等多种活性成分。C21甾体皂苷是白薇中的重要化学成分,自上世纪八十年代张壮鑫等从直立白薇的根中分离得到C21甾体皂苷以来,国内外的学者已从白薇中分得数十种C21甾体皂苷类化合物。Cynanoside H是从白薇根分离得到一种双裂孕烷型甾体化合物,现有研究报道Cynanoside H具有显著的抗烟草花叶病毒(TMV)活性,但是关于Cynanoside H还具有何种药理作用尚未见报道。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用,通过诱导S期周期阻滞,抑制MDA-MB-231细胞增殖;逆转上皮间质转化从而抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭,发挥治疗和/或预防乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的作用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用,所述CynanosideH具有式I所示的结构:
在本发明中,所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本发明还提供了Cynanoside H在制备抑制乳腺癌细胞活性的药物中的应用,所述Cynanoside H具有式I所示的结构:
本发明还提供了Cynanoside H在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用,所述Cynanoside H具有式I所示的结构:
本发明还提供了Cynanoside H在制备抑制乳腺癌细胞迁移的药物中的应用,所述Cynanoside H具有式I所示的结构:
本发明还提供了Cynanoside H在制备抑制乳腺癌细胞侵袭的药物中的应用,所述Cynanoside H具有式I所示的结构:
其中,作为优选的,本发明所述乳腺癌细胞为MDA-MB-231细胞。
在本发明中,所述药物包括Cynanoside H和Cynanoside H在医学上可接受的辅料。
作为优选的,本发明所述药物中Cynanoside H的质量百分含量为0.05~99.95%。
优选的,本发明所述药物的剂型包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、舌下片剂、栓剂、滴剂或滴丸剂。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明提供了Cynanoside H在制备防治乳腺癌药物中的应用,本发明发现不同浓度的Cynanoside H均能抑制MDA-MB-231的细胞活力,并且具有浓度依赖性,IC50为6.34±1.52μM;Cynanoside H可显著提高S期MDA-MB-231细胞的比例,阻滞了MDA-MB-231细胞由S期至G2期的转化,通过诱导S期周期阻滞抑制MDA-MB-231细胞增殖;Cynanoside H通过逆转上皮间质转化从而抑制MDA-MB-231细胞行迁移和侵袭,从而发挥防治乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的作用,为治疗和/或预防乳腺癌药物的研发提供新思路。
附图说明
图1为不同浓度Cynanoside H对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率;
图2为Cynanoside H对MDA-MB-231细胞形态学的影响;
图3为Cynanoside H抑制MDA-MB-231细胞的增殖;
图4为Cynanoside H诱导MDA-MB-231细胞发生S期周期阻滞;其中,(A)为不同浓度Cynanoside H作用48h和72h后对MDA-MB-231细胞周期的影响;(B)为细胞在不同时期(G1,S,G2)比例统计;
图5为Cynanoside H对MDA-MB-231细胞中周期相关蛋白的调控;
图6为Cynanoside H抑制MDA-MB-231细胞转移;其中,(A)为Transwell迁移;(B)为Transwell侵袭;
图7为Cynanoside H对MDA-MB-231细胞中转移相关分子的调控。
具体实施方式
本发明提供了Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用,其中CynanosideH具有式I所示的结构:
本发明对Cynanoside H的来源并没有特殊限定,采用常规的提取方法提取得到或者市售产品即可;作为一个可实施的方式,本发明优选根据Seco-pregnane steroidalglycosides from the roots of Cynanchum atratum and their anti-TMV activity(Ying Yan,Jian-xin Zhang等,Fitoterapia,Volume 97,September 2014,Pages 50-63)中所述化合物8的提取方法从白薇根中分离得到Cynanoside H,但并非是对本发明技术方案的具体限定。
作为优选的实施方式,本发明中乳腺癌优选为三阴性乳腺癌。
本发明还提供了Cynanoside H在制备抑制乳腺癌细胞活性与增殖的药物中的应用。
本发明对乳腺癌细胞来源并没有特殊限定,现有技术中的已知或市售乳腺癌细胞均能用于本发明中;作为一个可实施的方式,本发明中乳腺癌细胞优选为MDA-MB-231细胞。
在本发明中,应用Cynanoside H诱导MDA-MB-231细胞发生S期阻滞,进一步应用Cynanoside H抑制c-Myc、cyclinE1、CDK1和CDK2周期相关蛋白的表达,从而抑制乳腺癌细胞增殖。其中,C-myc基因的表达一般与细胞的生长状态有关,其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用;同时,不同种类的周期蛋白表达的时间不同,各种周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)沿细胞周期相交替活化,磷酸化相应底物,使细胞周期事件有条不紊地进行下去。抑制c-Myc、cyclinE1、CDK1和CDK2周期相关蛋白的表达,可抑制细胞增殖。
本发明还提供了Cynanoside H在制备抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的药物中的应用。
本发明对乳腺癌细胞来源并没有特殊限定,现有技术中的已知或市售乳腺癌细胞均能用于本发明中;作为一个可实施的方式,本发明中乳腺癌细胞优选为MDA-MB-231细胞。
在本发明中,应用Cynanoside H改变细胞形态,进一步应用Cynanoside H逆转上皮间质转化,更进一步应用Cynanoside H调控上皮间质转化,从而发挥抑制MDA-MB-231细胞转移与侵袭的作用。其中,上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系。上调上皮分子E-cadherin的表达,下调间质分子vimentin的表达,同时也使β-catenin的表达下调可使转移性肿瘤细胞由长梭形向圆形转变,从而抑制MDA-MB-231细胞转移与侵袭。
在本发明优选的实施方式中,防治乳腺癌的药物包括Cynanoside H和CynanosideH在医学上可接受的辅料。
作为优选的,本发明所述药物中Cynanoside H的质量百分含量为0.05~99.95%;进一步优选质量百分含量为5.00~95.00%。
本发明对药物的剂型没有特殊限定,任何现有技术中已知的给药剂型均可用于本发明中,制备防治乳腺癌的药物;其中,本发明药物的剂型优选注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、舌下片剂、栓剂、滴剂或滴丸剂。
本发明应用不同浓度的Cynanoside H,均能抑制MDA-MB-231的细胞活力与增殖;抑制MDA-MB-231细胞行迁移和侵袭,从而发挥防治乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的作用,为预防和/或治疗乳腺癌药物的研发提供新思路。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的具体实施例中,Cynanoside H根据Seco-pregnane steroidalglycosides from the roots of Cynanchum atratum and their anti-TMV activity(Ying Yan,Jian-xin Zhang等,Fitoterapia,Volume 97,September 2014,Pages 50-63)中所述化合物8的提取方法从白薇根中分离得到,以下将Cynanoside H简称为BW18;
MDA-MB-231细胞株为ATCC购得;
在本发明中,若无特殊说明,所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
实施例1
细胞活力测试
收集对数期细胞,MDA-MB-231细胞按照6×103个/孔的密度种植于96孔板中,培养过夜,待细胞贴壁后,加入不同浓度的Cynanoside H(以下简称为BW18)处理,以0.1%DMSO为对照组。药物作用72h后,每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT,37℃孵育4h,弃上清,每孔加入160μL DMSO溶解,待蓝紫色结晶甲臜完全溶解后,酶标仪测定吸光度值OD(490nm)。
抑制率的计算方法:抑制率=(对照组OD490nm-处理组OD490nm)/对照组OD490nm。半抑制率(IC50)的计算方法:采用forecast函数求得化合物对应的IC50。
结果表明:如图1所示,用20μM、10μM、5μM和2.5μM的BW18处理MDA-MB-231细胞。72h后,MTT法检测不同浓度BW18对MDA-MB-231细胞的抑制率。不同浓度的BW18均能抑制MDA-MB-231的细胞活力,并且具有浓度依赖性,IC50为6.34±1.52μM。
实施例2
细胞形态观察
收集对数期细胞,MDA-MB-231细胞按照4×103个/孔的密度种植于96孔板中,培养过夜,待细胞贴壁后,加入高、中和低(10μM、5μM和2.5μM)浓度的BW18处理MDA-MB-231细胞,以0.1%DMSO为对照组。72h后,观察细胞的形态变化。
结果如图2所示,随着BW18浓度的增加,MDA-MB-231细胞的数目明显减少。5μΜ和10μΜBW18抑制细胞生长较明显,并且BW18作用MDA-MB-231细胞后,细胞形态由长梭形向圆形转变。
实施例3
细胞生长曲线测定
收集对数期细胞,MDA-MB-231细胞按照4×103个/孔的密度种植于96孔板中,培养过夜,待细胞贴壁后,加入高、中和低(10μM、5μM和2.5μM)浓度的BW18处理,分别于0h、12h、24h、36h、48h、72h和96h测定OD490nm,并绘制生长曲线。
结果如图3所示,与对照组相比,不同浓度的BW18均能抑制MDA-MB-231细胞的增殖,并且随着BW18浓度的增加,MDA-MB-231细胞的生长速度逐渐减慢,说明BW18能够呈浓度和时间依赖性的方式抑制MDA-MB-231的增殖。
实施例4
细胞周期检测
将MDA-MB-231细胞按1.5×105个/孔种植于6孔板中进行培养,待细胞贴壁后,分别用高、中和低浓度的BW18(10μM,5μM和2.5μM)作用48h或72h后,收集细胞。1000rpm离心5min,用预冷的PBS洗一次,再用70%预冷的乙醇重悬细胞,-20℃固定过夜。1000rpm离心5min,弃上清,再用PBS洗一次,1000rpm离心5min,收集细胞沉淀。用500μL PBS重悬细胞,加入RNase A 5μL,PI 25μL和Triton X-100 0.25μL,轻弹混匀,37℃避光孵育30min后,1000rpm离心5min,弃掉染料,用200μL PBS重悬,利用流式细胞仪进行分析。
结果如图4所示,与对照组比,BW18处理48h后,S期细胞比例从9.31%±2.10%增加至14.45%±1.88%(2.5μM),19.12%±2.77%(5μM)和23.51%±1.35%(10μM);BW18处理72h后,S期细胞比例从9.33%±2.15%增加至15.00%±1.72%(2.5μM),21.59%±1.77%(5μM)和32.55%±2.11%(10μM)。这些结果表明,BW18可显著提高S期MDA-MB-231细胞的比例,阻滞了MDA-MB-231细胞由S期至G2期的转化,且具有一定的浓度依赖性。
实施例5
BW18对MDA-MB-231细胞中周期相关蛋白的调控
Western blot法
(1)收集与裂解细胞:将MDA-MB-231细胞按1×106个/孔种植于直径10cm的培养皿中进行培养,待细胞贴壁后,分别用高、中和低浓度的BW18(10μM,5μM和2.5μM)作用24h后,收集细胞。PBS洗一次,用含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解细胞30min。每5min涡旋一次,12000rpm4℃离心15min,收集上清。
(2)BCA蛋白定量:按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量,计算蛋白浓度后,依据所收集蛋白样品的体积,按5∶1的量加入5×loading buffer,100℃金属浴变性5min,-80℃保存。
(3)SDS-PAGE电泳:根据蛋白分子量配制8-12%的分离胶及5%的浓缩胶,待胶制备好后,用微量注射器,每孔加入50μg的蛋白样品,80V电压电泳至蛋白样品进入分离胶,将电压调至100V,电泳至溴酚蓝至胶板底部。
(4)转膜:PVDF膜在使用前须经甲醇浸润和活化,利用三明治法将胶、PVDF膜和滤纸依次排放,放入转膜槽中,加入湿转转膜液,设定转膜条件为:恒流220mA,时间120min。
(5)封闭:转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先加入TBS液的Western blot洗膜盒中,漂洗1-2min,以洗去膜上的转膜液。倒掉洗膜液,加入3%的BSA封闭液,室温封闭60min。
(6)一抗孵育:按照一抗的说明书,以适当比例用3%的BSA封闭液稀释一抗,用滴管吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,在侧摆摇床上缓慢摇动,4℃孵育过夜。
(7)二抗孵育:回收一抗,用TBS液在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5min,共3次。按照二抗的说明书,以1:30000的比例,用5%的脱脂奶粉稀释二抗。用滴管吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温在侧摆摇床上缓慢摇动,避光孵育2h。
(8)蛋白检测:回收二抗,加入TBS液,在侧摆摇床上缓慢摇动,避光洗涤5min,共3次。利用Odyssey成像仪检测目的蛋白。
利用Western blot检测BW18对MDA-MB-231细胞周期相关蛋白的调控。结果如图5所示,BW18作用细胞后,c-Myc、cyclinE1、CDK1和CDK2的蛋白表达呈剂量依赖性的下调。说明BW18能够通过抑制c-Myc、cyclin E1、CDK1和CDK2周期相关蛋白的表达而诱导MDA-MB-231细胞S期阻滞。
实施例6
Transwell迁移和侵袭实验
(1)将MDA-MB-231细胞按1.5×105个/孔种植于6孔板中进行培养,待细胞贴壁后,分别用高、中和低浓度的BW18(10μM,5μM和2.5μM)作用48h后,收集细胞,计数,无血清培养基(含0.05%的BSA)制备单细胞悬液,调整浓度为1×105个/mL。
(2)Matrigel胶包被Transwell侵袭小室:将Matrigel胶储液用无血清培养基按1∶5比例稀释,按100μL/孔加入到Transwell侵袭小室中,37℃放置4h(Transwell迁移实验无需Matrigel胶包被)。
(3)向24孔培养板中加入600μL含15%FBS的培养基,然后将Transwell小室轻轻放入,防止底部产生气泡,再向小室中加入200μL无血清单细胞悬液。
(4)培养24h,取出Transwell小室,弃掉小室中的培养液,用棉签轻轻擦掉上层的细胞,将小室用甲醇固定30min,然后用0.1%结晶紫染液染色20min。
(5)将Transwell小室用PBS洗3遍,用棉签轻轻擦掉上层中的水分,在倒置显微镜下(200×)随机选取5个视野拍照,计数。
(6)最后冰醋酸脱色,用酶标仪(OD 570nm)进行定量。
通过形态学观察,我们发现BW18作用后MDA-MB-231细胞从长梭形向圆形转变,同时利用Transwell迁移及侵袭实验从二维和三维水平检测了BW18对MDA-MB-231细胞转移能力的影响。如图6所示,BW18处理组的细胞穿至下室的数目显著减少,并且具有一定的浓度依赖性。这表明了BW18能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭。
利用实施例5所述Western blot法检测转移相关的分子,结果如图7所示:高浓度(10μM)的BW18可以显著上调上皮分子E-cadherin的表达,下调间质分子vimentin的表达,同时也使β-catenin的表达下调。这表明,BW18能够通过逆转上皮间质转化而在体外发挥抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231转移的作用。
以上实施例中,每个实验独立重复三次,所有数据用mean±SD进行表示,用GraphPad Prism6进行Student’s t-test检验,P<0.05被认为具有统计学意义,*P<0.05,**P<0.01。
由以上实施例可知,BW18通过诱导S期周期阻滞,抑制MDA-MB-231细胞增殖;逆转上皮间质转化从而抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭,发挥防治乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的作用,为预防和/或治疗乳腺癌药物的研发提供新思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
7.根据权利要求3-6任一项所述的应用,其特征在于,所述乳腺癌细胞为MDA-MB-231细胞。
8.根据权利要求1-6任一项所述的应用,其特征在于,所述药物包括Cynanoside H和Cynanoside H在医学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物中Cynanoside H的质量百分含量为0.05~99.95%。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、舌下片剂、栓剂、滴剂或滴丸剂。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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