CN109438535B

CN109438535B - 一种具有抗胃癌作用的新的苯并呋喃甲基酮型化合物及其提取分离方法

Info

Publication number: CN109438535B
Application number: CN201811146089.7A
Authority: CN
Inventors: 窦德强; 冉小库; 王宇萌; 蔡德成
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Dalian Wuzhou Shencao Health Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2038-09-29
Also published as: CN109438535A

Abstract

本发明涉及一种中药活性成分的提取、分离领域，具体涉及到一种新的苯并呋喃甲基酮型化合物，分子式为C₁₉H₂₄O₉，命名为2‑(5‑乙酰基‑6‑羟基‑2,3‑二氢苯并呋喃‑2基)‑丙烯基‑1‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷（2‑(5‑acetyl‑6‑hydroxy‑2,3‑dihydrobenzofuran‑2‑yl)‑propenyl‑1‑O‑β‑D‑glucopyranoside）。本发明还提供一种新的苯并呋喃甲基酮化合物的提取分离方法，依次采用乙醇提取、大孔吸附树脂、MCI GEL柱、制备液相分离，简单、快速的提取分离出新的苯并呋喃甲基酮型化合物，该化合物具有抗胃癌的作用，可用于开发研制治疗抗胃癌的药物。

Description

一种具有抗胃癌作用的新的苯并呋喃甲基酮型化合物及其提取分离方法

技术领域

本发明涉及中医药技术领域，尤其涉及一种孔雀草中药中新的苯并呋喃甲基酮型化合物的提取、分离及其在制备抗胃癌药物中的用途。

背景技术

孔雀草（Tagetes patula L.）又名红黄草、藤菊、小万寿菊，为菊科万寿菊属植物，为一年生草本。我国各地均有栽培，是一种常见的观赏花卉。孔雀草有药用和保健作用，花叶可以入药，有清热化痰、补血通经的功效。能治疗百日咳、气管炎、感冒等症。

从20世纪80年代开始，人们即开始对孔雀草的化学成分进行研究，分离得到万寿菊素（patuletin），槲皮万寿菊素（quercetagetin），槲皮万寿菊甙（quercetagitrin）等黄酮类化合物，并在根中分离得到α-三联噻吩。5-（4-乙酰氧基-1-丁炔基）-2，2-联噻吩[5-（4-acetoxy-1-butynyl）-2，2-bithiophene]，5-（1-丁烯基）-2，2-联噻吩[5[（1-nuten-1-yl）-2，2-bithiophene]等噻吩类化合物，以及分离得到异泽兰素、泽兰素、二氢泽兰素等苯并呋喃型化合物（国家中医药管理局《中华本草》编委会，中华本草[M]，上海科学技术出版社，1999年版；Sütfeld R. Distribution of thiophene derivatives in differentorgans of Tagetes patula seedlings grown under various conditions. PLANTA1982;156:536；Sütfeld R, Balza F, Neil Towers GH. A benzofuran from Tagetespatula seedlings. PHYTOCHEMISTRY 1985;24:876）。目前人们多对孔雀草花卉进行研究，药用价值研究较少。

孔雀草的药理作用与其主要化学成分包括黄酮类、噻吩、苯并呋喃类、氨基酸、各种色素类和矿物质类等有很大关系。现已从孔雀草中分离得到了异泽兰素、泽兰素、二氢泽兰素、荨麻叶泽兰酮、2,3-二氢-14-异丁酰氧基泽兰素（2,3-dihydro-l4-isobutyryloxyeupar）、14-异丁酰氧基泽兰素（14-isobutyryloxyeupar）等苯并呋喃化合物。但是对本申请中孔雀草的新化合物的分离和药理活性研究未见报道，目前从孔雀草中分离出的化学成分大多数是已知的，并且药理活性比较弱，因此，对孔雀草中新化合物的开发和分离亟待需要。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种简便、快速、纯度高的新的苯并呋喃甲基酮型化合物及其提取分离方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种新的苯并呋喃甲基酮型化合物，分子式为C₁₉H₂₄O₉，命名为2-(5-乙酰基-6-羟基-2,3-二氢苯并呋喃-2基)-丙烯基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2-(5-acetyl-6-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-2-yl)-propenyl-1-O-β-D-glucopyranoside)，化学结构式如图1。

本发明提供一种新的苯并呋喃甲基酮化合物的提取分离方法，具体步骤如下。

步骤1、取孔雀草干燥药材，经粉碎成粗粉后，按照所述孔雀草药材粉末与所述乙醇水溶液重量比1.0：8-15加热回流1-3次提取，回流温度为50-70℃，醇提液过滤，合并滤液用70℃水浴加热浓缩至近干，得乙醇药液浸膏备用。

步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，用乙醇与水按照体积比0:1至1:0的混合物进行梯度洗脱，对洗脱液进行减压浓缩至近干，得浸膏，置真空干燥箱干燥48h，备用。

步骤3、将步骤2中部分乙醇洗脱物Fr.B经MCI GEL（型号CHP20P）柱层析分离，用甲醇与水按照体积比0:1至1:0的混合物进行梯度洗脱，分离得到6个馏分（Fr.B1- Fr.B6），浓缩至干，得浓缩物备用。

步骤4、将步骤3中所得Fr.B3馏分，经半制备液相色谱以甲醇-水（42:58）为流动相等度洗脱，分离得到本发明所述新的苯并呋喃甲基酮型化合物。

所述孔雀草为全草包括根及地上部分花；所述孔雀草粗粉粒度为2-100目。提取所用乙醇浓度为30%~95%，回流提取1~3次，每次0.5-3小时。

所述步骤2中大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过6小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。

与现有技术比较，本发明提供一种新苯并呋喃化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇提取、大孔吸附树脂、MCI GEL柱、及制备液相，简便、快速的提取分离出新苯并呋喃型化合物，该化合物具有抗氧化自由基作用，可以辅以药学上常用的辅料可以制备片剂、颗粒剂、胶囊等剂型，用于改善和治疗胃癌等病症。

体外药理学实验证明，所制备新的苯并呋喃化合物具有抑制AGS细胞增殖的作用，能够抑制血管内皮生长因子及转移生长因子-β的作用，具有较强的抗胃癌的作用。

所述的苯并呋喃甲基酮化合物可单独或与其它药物组合，制成抗胃癌的药物。

附图说明

图1苯并呋喃甲基酮化合物的结构式。

图2苯并呋喃甲基酮化合物的高分辨质谱图。

图3苯并呋喃甲基酮化合物的¹H-NMR图。

图4苯并呋喃甲基酮化合物的¹H-NMR放大图。

图5苯并呋喃甲基酮化合物的¹³C-NMR图。

图6苯并呋喃甲基酮化合物的HSQC图。

图7苯并呋喃甲基酮化合物的HMBC图。

图8苯并呋喃甲基酮化合物的纯度图。

具体实施方式

本发明提供一种新的苯并呋喃甲基酮型化合物，分子式为C₁₉H₂₄O₉，化学结构式如图1。

所述新的苯并呋喃甲基酮化合物根据结构命名为2-(5-乙酰基-6-羟基-2,3-二氢苯并呋喃-2基)-丙烯基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2-(5-acetyl-6-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-2-yl)-propenyl-1-O-β-D-glucopyranoside），表1.为该苯并呋喃甲基酮化合物以CD₃OD为测试溶剂的核磁数据(见图2-6)。

一、苯并呋喃甲基酮化合物的提取分离方法。

步骤1：称取孔雀草干燥药材10kg，采用30-75%的乙醇水提取，优选乙醇-水（60:40）回流提取；按照所述孔雀草药材粉末与所述溶剂乙醇水溶液重量比1.0：8-15提取，优选1.0:10提取；50-70℃加热回流提取1-3次，优选65℃加热回流提取2次；每次煎煮1-3小时，优选2小时。提取液过滤，合并滤液，70℃水浴加热浓缩，得药液（1.2kg）备用。

所述孔雀草为全草包括根及地上部分花；所述孔雀草粗粉粒度为2目-100目，优选20目。

步骤2：将步骤1中所得药液经预处理过的净制大孔吸附树脂（型号HP-20）吸附除杂，树脂量10.5Kg，依次用乙醇与水按照体积比0:1至1:0的混合物进行梯度洗脱；具体按照水与乙醇体积比1:0、60:40、95:5的混合物进行5倍柱体积洗脱，将60:40乙醇与水洗脱液65℃进行减压浓缩至近干，得浸膏Fr.B（0.3kg），置真空干燥箱干燥48h，备用。

步骤3：将步骤2中乙醇洗脱物加少量甲醇溶解，经MCI GEL（型号CHP20P）柱层析分离，其中填料粒度为40～60μm，用甲醇与水按照体积比0:1至1:0的混合物进行梯度洗脱，具体按照甲醇与水体积比(30:70→40:60→45:55→50:50→55:45→80:20)梯度洗脱(流速为1ml/min，温度为室温)，得6个馏分（Fr.B1- Fr.B6）， 50℃以下减压浓缩至干，备用。

步骤4：将步骤3中所得浓缩物Fr.B3（45:55），经制备液相制备，色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×10 mm，5 μm），流动相A：42%甲醇、流动相B：58%水，紫外检测波长：210nm，流速：2mL/min，进样量：20-100μL。收集保留时间28min的馏分，再经旋转蒸发仪50℃减压回收分离得到所述新的苯并呋喃甲基酮型化合物。经高效液相色谱检测，以归一化法测定纯度大于95％，如图8所示。

二、苯并呋喃甲基酮化合物的抗胃癌作用研究。

1.药品和试剂。

实验所用苯并呋喃甲基酮化合物由上述方法制备，纯度为98.7％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。MTT（Amreso公司，批号：1028D058）；DMSO（Sigma公司，批号：302A0317）；DMEM培养基（HyClone公司，批号：8115120）；0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司，批号：1830857）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号：8166872）；双抗（Hyclone公司，批号：J120721）；PBS磷酸盐缓冲液（北京Solarbio公司，批号：721H026）；5-氟尿嘧啶（5-Fu）（批号：1126A023；美国Sigma公司）；血管内皮生长因子 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20180315）；转化生长因子-β ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20180315）。

2.细胞株。

人胃腺癌细胞AGS，购于中国科学院上海细胞库。

3.方法。

将细胞放置于37℃，含5% CO₂的培养箱中，细胞呈上皮细胞样，贴壁生长，每天换一次培养液，待细胞贴壁达70-80%时，倒掉培养液，加入0.25%胰酶1mL，至培养箱中消化半分钟，待细胞变圆，弃去消化液，加入培养液终止消化，轻轻吹打细胞，离心后弃去培养液，传代到新的培养瓶中。传代比例1:3，每两天传代一次。

3.1 MTT法检测苯并呋喃甲基酮化合物对AGS细胞增殖作用的影响。

取对数生长期AGS的细胞，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，在培养箱中37℃孵育24h后，每孔分别加入终浓度为80 μmol/L、40 μmol/L、20μmol/L、10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L的含5-Fu的培养液及终浓度为80 μmol/L、40 μmol/L、20μmol/L、10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L的含新苯并呋喃甲基酮化合物的培养液，每个浓度设3个复孔，同时设置空白对照孔（只接种细胞）和调零孔（只加等体积培养液）。孵育24h后，每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续在培养箱中孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入100 μL的DMSO，震荡10 min，在酶标仪492 nm处检测吸光度A值，并计算细胞增殖抑制率，抑制率为正值，表现抑制细胞增长，抑制率为负值表现促进细胞增长。

增殖抑制率（%）=（（1-（A_实验组-A_{空白对照组}）/（A_{阴性对照组}-A_{空白对照组}））×100%。

3.2 ELISA法检测AGS细胞培养上清液中TGF-β、VEGF的测定。

细胞上清液的收集：取对数生长期的AGS细胞，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，每孔1 mL接种于24孔平底培养板中。在37℃、5%CO₂的培养箱内培养至细胞贴壁达70%-80%时，设置阴性对照组（只接种细胞）、阳性对照组（接种细胞，加5-Fu）、实验组（接种细胞，加待测物），除空白对照组外，阳性对照组加入终浓度为80μmol/L的5-Fu，实验组替换入含终浓度为10 μmol/L、20 μmol/L、40μmol/L 、60 μmol/L的苯并呋喃甲基酮化合物的新鲜培养液。干预48h后，收集每孔的细胞上清液，3000转/分离心20分钟，仔细收集上清液，用于ELISA试剂盒检测。

ELISA试剂盒的检测方法：空白孔除外，在酶标包被板上分别加入不同浓度的标准品和稀释好的样品50 μL，再加入生物素抗原工作液50μL。轻轻摇晃，贴上封板膜，37 ℃孵育60 min后，揭去封板膜，洗板5次，拍干；除空白孔外，每孔加入50 μL亲和素-HRP，轻轻摇晃，贴上封板膜，37 ℃孵育60 min后，揭去封板膜，洗板5次，拍干；每孔加入显色剂A、B各50μL，震荡混匀，在37 ℃避光孵育显色10min，每孔加终止液50 μL终止反应，在450 nm处测定各组吸光度值。

3.3 数据处理。

全部实验数据采用EXCEL处理，以均数±标准差（±s）表示增殖抑制率，组间比较采用SPSS17.0的单因素方差分析（one-way ANOVA），LSD法进行统计。

4. 结果。

4.1苯并呋喃甲基酮化合物对AGS细胞增殖作用的影响。

按上述实验过程操作，苯并呋喃甲基酮化合物及5-Fu对AGS细胞的增殖抑制率如表2.所示。

4.2对TGF-β表达的影响。

注：与空白组比较，* P＜0.05，** P＜0.01。

4.3对 VEGF分泌的影响。

注：与空白组比较，* P＜0.05，** P＜0.01。

以上结果表明，分离得到的苯并呋喃甲基酮化合物对细胞增殖有抑制作用，且随着化合物浓度增大抑制作用增强。

血管能为肿瘤的生长提供所需营养物质，血管内皮生长因子（VEGF），作为一种公认的最有效的促血管生长特异性因子，在诱导和调节肿瘤血管形成中具有重要作用。VEGF可以促进肿瘤新血管的生成，从而推动肿瘤病情的发展。转化生长因子（TGF-β）对肿瘤的作用具有多样性，在肿瘤发生早期，其具有抑制细胞增殖、启动细胞分化、诱导凋亡的作用。但在肿瘤的发展期具有抑制免疫功能、增加血管生成、诱导细胞外基质的产生，从而促进肿瘤的侵袭和转移。因此，选取VEGF、及TGF-β作为抗胃癌的指标。

苯并呋喃化合物组的TGF-β、VEGF表达量低于空白对照组，且随着剂量的增大，TGF-β、VEGF表达量逐渐降低，结果有统计学差异（P<0.01），表明分离得到的新苯并呋喃甲基酮化合物具有较强的抗胃癌活性，其具有开发成治疗抗胃癌药物的潜力，可单独或与其他药物联合应用用于改善或治疗癌症病症。

综上所述，本发明提供一种新的苯并呋喃甲基酮化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇提取、大孔吸附树脂纯化、MCI GEL及制备液相，成功的提取分离出新苯并呋喃甲基酮化合物，该化合物具有较好的抗胃癌活性，并从常见植物孔雀草中提取出来，因此可以作为天然产物开发中药的一类新药，具有广阔的前景。

上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims

1.一种苯并呋喃甲基酮型化合物，其特征在于，分子式为C₁₉H₂₄O₉，化学结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的苯并呋喃甲基酮型化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1、取孔雀草干燥药材，经粉碎成粗粉后，按照所述孔雀草药材粗粉与所述乙醇水溶液重量比1.0：8-15加热回流1-3次提取，回流温度为50-70℃，醇提液过滤，合并滤液用70℃水浴加热浓缩至近干，得乙醇药液浸膏备用；

步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，用乙醇与水按照体积比0:1至1:0的混合物进行梯度洗脱，对洗脱液进行减压浓缩至近干，得浸膏，置真空干燥箱干燥48h，备用；

步骤3、将步骤2中部分乙醇洗脱物Fr.B经型号CHP20P MCI GEL柱层析分离，用甲醇与水按照体积比0:1至1:0的混合物进行梯度洗脱，分离得到6个馏分为Fr.B1-Fr.B6，浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤4、将步骤3中所得Fr.B3馏分，经半制备液相色谱以甲醇-水体积比42:58为流动相等度洗脱，分离得到本发明所述新的苯并呋喃甲基酮型化合物。

3.如权利要求2所述的苯并呋喃甲基酮型化合物的提取分离方法，其特征在于：所述步骤1中，孔雀草为全草包括根及地上部分花，所述孔雀草粗粉粒度为2目-100目。

4.如权利要求2所述的苯并呋喃甲基酮型化合物的提取分离方法，其特征在于：提取乙醇浓度为30%~95%，回流提取1~3次，每次0.5-3小时。

5.如权利要求2所述的苯并呋喃型化合物的提取分离方法，其特征在于；所述步骤2中大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过4-12小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。

6.如权利要求1所述的苯并呋喃甲基酮型化合物，其特征在于该苯并呋喃甲基酮型化合物辅以药学上常用的辅料制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂型，具有抗胃癌的作用。

7.如权利要求1所述的苯并呋喃甲基酮型化合物，其特征在于所得的苯并呋喃甲基酮型化合物单独或与其它已知具有抗胃癌的药物合用在制备用于改善和治疗胃癌药物中的用途。