CN110229128B - 一种新苯骈呋喃型化合物及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种新苯骈呋喃型化合物，分子式为C12H12O5，命名为1‑(2‑(1，2‑dihydroxyethyl)‑6‑hydroxybenzofuran‑5‑yl)ethanone，化学结构式如式(I)所示。本发明还提供一种新苯骈呋喃化合物的提取分离方法，依次采用乙醇提取、大孔吸附树脂、硅胶柱层析、ODS中压柱分离、重结晶，简单、快速的提取分离出新的苯骈呋喃型化合物，该化合物具有抗炎的作用，可用于制备治疗炎症的药物。式(I)如下
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取、分离领域，尤其涉及一种孔雀草药材中新苯骈呋喃型化合物的提取、分离及其在制备抗炎药物中的用途。
背景技术
孔雀草(Tagetes patula L.)又名红黄草、藤菊、小万寿菊，为菊科万寿菊属植物，为一年生草本。我国各地均有栽培，是一种常见的观赏花卉。孔雀草有药用和保健作用，花叶可以入药，有清热化痰、补血通经的功效。能治疗百日咳、气管炎、感冒等。
从20世纪80年代开始，人们即开始对孔雀草的化学成分进行研究，分离得到万寿菊素(patuletin)，槲皮万寿菊素(quercetagetin)，槲皮万寿菊甙(quercetagitrin)等黄酮类化合物，并在根中分离得到α-三联噻吩。5-(4-乙酰氧基-1-丁炔基)-2，2-联噻吩[5-(4-acetoxy-1-butynyl)-2，2-bithiophene]，5-(1-丁烯基)-2，2-联噻吩[5[(1-nuten-1-yl)-2，2-bithiophene]等噻吩类化合物，以及分离得到异泽兰素、泽兰素、二氢泽兰素等苯骈呋喃型化合物(国家中医药管理局《中华本草》编委会，中华本草[M]，上海科学技术出版社，1999年版；Sütfeld R.Distribution of thiophene derivatives in differentorgans of Tagetes patula seedlings grown under various conditions.PLANTA1982；156：536；Sütfeld R，Balza F，Neil Towers GH.A benzofuran from Tagetespatula seedlings.PHYTOCHEMISTRY 1985；24：876)。目前人们多对孔雀草花卉进行研究，药用价值研究较少。
孔雀草的药理作用与其主要化学成分包括黄酮类、噻吩、苯骈呋喃类、氨基酸、各种色素类和矿物质类等有很大关系。其中，苯骈呋喃类是孔雀草中一类重要的化学成分，现已从孔雀草中分离得到了异泽兰素、泽兰素、二氢泽兰素、荨麻叶泽兰酮、2，3-dihydro-14-i.sobutyryloxyeupar、14-isobutyryloxyeupar等苯骈呋喃化合物。但是对本申请中孔雀草的新化合物的分离和药理活性研究未见报道，目前从孔雀草中分离出的化学成分大多数是已知的，并且是药理活性比较弱，因此，对孔雀草中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
1.针对上述问题，本发明提供一种简便、快速、纯度高的新苯骈呋喃化合物及其提取分离方法。
为实现本发明的上述目的，本发明提供一种新苯骈呋喃型化合物，分子式为C12H12O5，命名为1-(2-(1，2-dihydroxyethyl)-6-hydroxybenzofuran-5-yl)ethanone，化学结构式如下。
本发明提供一种新生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1、取孔雀草干燥药材，经粉碎成粗粉后，采用乙醇提取，醇提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，得药液备用；
步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，依次以水和乙醇梯度洗脱，对乙醇洗脱液进行减压浓缩至近干，置真空干燥箱干燥，备用；
步骤3、将步骤2中乙醇洗脱物经硅胶柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的部分洗脱部位，将合并后的洗脱部位浓缩至干，备用；
步骤4、将步骤3中所得物再经ODS柱层析分离，用甲醇-水等度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并部分洗脱部位，浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤5、将步骤4中所得浓缩物，经重结晶得到所述新的苯骈呋喃型化合物。
所述孔雀草为全草包括根及地上部分花；所述孔雀草粗粉粒度为2目-100目。提取所用乙醇浓度为30％～95％，回流提取1～3次，每次0.5-3小时。
所述步骤2中大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
本发明提供一种新苯骈呋喃化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇提取、大孔吸附树脂、、硅胶柱层析、ODS中压柱、及重结晶，简便、快速的提取分离出新苯骈呋喃型化合物，该化合物具有抗炎作用，可以辅以药学上常用的辅料可以制备片剂、颗粒剂、胶囊等剂型，用于炎症的治疗。
2.苯骈呋喃化合物用于治疗炎症的研究
体外药理学实验证明，所制备的新苯骈呋喃化合物具有抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放IL-6、TNF-α、PGE2及COX-2作用，表明分离得到的新苯骈呋喃化合物，具有较强的抗炎作用。
3.所得苯骈呋喃化合物可单独或与其它药物组合，制成抗炎的药物。
附图说明
图1为本发明新苯骈呋喃化合物的高分辨质谱图。
图2为本发明新苯骈呋喃化合物的1H-NMR。
图3为本发明新苯骈呋喃化合物的13C-NMR。
图4为本发明新苯骈呋喃化合物的HSQC光谱图。
图5为本发明新苯骈呋喃化合物的HMBC光谱图。
具体实施方式
本发明提供一种新苯骈呋喃型化合物，分子式为C12H12O5，化学结构式如下。
所述新苯骈呋喃化合物根据结构命名为1-(2-(1，2-dihydroxyethyl)-6-hydroxybenzofuran-5-yl)ethanone，表1为该新苯骈呋喃化合物以CDOD为测试溶剂的核磁数据。
表1：新苯骈呋喃化合物的核磁数据
本发明还提供上述新苯骈呋喃化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1：称取孔雀草干燥药材10kg，采用60％乙醇回流提取，乙醇用量为药材的10倍，回流提取两次，每次煎煮2小时，提取液过滤，合并滤液减压浓缩，得药液备用。
步骤2：将步骤1中所得药液直接经预处理过的净制D101大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和80％乙醇梯度洗脱，水洗脱除杂用量为2～3个柱体积，80％乙醇洗脱用量为冲至颜色变浅为止，对80％乙醇洗脱液进行减压浓缩至近干，置真空干燥箱干燥，备用。
步骤3：将步骤2中乙醇洗脱物加乙醇溶解，加100～200目硅胶拌样后，干法上样，经硅胶柱层析分离，其中分离硅胶为200～300目，依次用二氯甲烷-甲醇(100∶1、50∶1、30∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脱，每个比例洗脱得25瓶，每瓶500ml，共得到125个部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的52～89洗脱部位。将合并后的52～89部位经50℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤4：将步骤3中所得物再经ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(50/50，80/20)分别等度洗脱(流速为3ml/min，温度为室温)，得每个梯度接收4个部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并2～5个部位，50℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤5：将步骤4中所得物经甲醇重结晶，得到新苯骈呋喃化合物。经高效液相色谱，以归一化法测定纯度均为90～99％。
本发明中新苯骈呋喃化合物的抗炎作用。
1.药品和试剂
实验所用新苯骈呋喃化合物由上述方法制备，纯度为98.5％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。吲哚美辛(Sigma公司，批号：BCBP0623V)；MTT(Amreso公司，批号：1028D058)；DMSO(Sigma公司，批号：302A0317)；DMEM培养基(HyClone公司，批号：8115120)；胰蛋白酶(HyClone公司，批号：J140026)；胎牛血清(Gibco公司，批号：8166872)；双抗(Hyclone公司，批号：J120721)；PBS磷酸盐缓冲液(Solarbio公司，批号：1225F021)；诱导剂为脂多糖(LPS，Sigma公司，批号：1010A033)，IL-6ELISA试剂盒(北京诚林生物科技有限公司，批号：201708)；TNF-αELISA试剂盒(北京诚林生物科技有限公司，批号：201708)；PGE2ELISA试剂盒(北京诚林生物科技有限公司，批号：201708)。
2.细胞株
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7(TCM13)，购于中国科学院上海细胞库。
3.方法
将细胞置于37℃，含5％CO2的培养箱中，细胞呈圆形，贴壁生长，每天换液，待细胞贴壁达70-80％时，倒掉旧培养液，加入5mL的新鲜培养液，轻轻吹打细胞，传代到新的培养瓶中。传代比例1∶3，两天传代一次。
3.1MTT法检测新苯骈呋喃化合物对RAW264.7细胞增殖作用的影响
取对数生长期RAW264.7的细胞，调整细胞密度为2×105个/mL，每孔100μL接种于96孔板中，当细胞铺满板底达70％-80％时，每孔分别加入终浓度为200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、1μmol/L的新苯骈呋喃化合物，同时设置阴性对照组(只接种细胞)和空白对照组(不接种细胞，只加培养液)。24h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT，继续在培养箱中孵育4h，吸出含MTT的培养液，每孔加入100μL的DMSO，震荡10min，在酶标仪492nm处检测吸光度(参考波长为630nm)，并计算细胞增殖抑制率。
增殖抑制率(％)＝((1-(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组))×100％
3.2ELISA法检测IL-6、TNF-α、PGE2的释放量及COX-2酶活性
细胞上清液的收集：取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，每孔1mL接种于24孔板中。待细胞贴壁达70％-80％时，设置阴性对照组(只接种细胞)、模型组(接种细胞，只加LPS)、阳性对照组(接种细胞，加吲哚美辛和LPS)、实验组(接种细胞，加待测物和LPS)，除空白对照组和模型组外，阳性对照组加入终浓度为200μmol/L的吲哚美辛，实验组加入终浓度为10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的新苯骈呋喃化合物预处理2h后，除空白对照组外，每孔加入终浓度为10mg/L的LPS。作用24h后，收集每孔的细胞上清液，3000转/分离心20分钟，仔细收集上清液，用于ELISA试剂盒检测。
ELISA试剂盒的检测方法：在酶标包被板上加入样品稀释液40μL和细胞上清液10μL，贴上封板膜，37℃温育30min后，揭去封板膜，每孔加入250μL的洗板液，洗板5次，拍干；每孔加入酶标试剂50μL，贴上封板膜，37℃温育30min后，揭去封板膜，每孔加入250μL的洗板液，洗板5次，拍干；每孔加入显色剂A、B各50μL，震荡混匀，在37℃避光孵育显色15min，每孔加终止液50μL终止反应，在450nm处测定各组吸光度值。
根据各组单体化合物的PGE2释放量计算COX-2酶活性的抑制作用，根据以下公式计算[23]：
抑制率％＝(ALPS组-A实验组)/(ALPS组-A阴性对照组)×100％
3.3数据处理
全部实验数据采用EXCEL处理，以均数±标准差
表示增殖抑制率和细胞因子的释放量及COX-2酶活性的抑制率，组间比较采用SPSS17.0的单因素方差分析(one-wayANOVA)，LSD法进行统计。
4.结果
4.1新苯骈呋喃化合物对RAW264.7细胞增殖作用的影响
按上述实验过程操作，新苯骈呋喃化合物对RAW264.7细胞的增殖抑制率如表2所示。
表2 不同浓度的新苯骈呋喃化合物作用于RAW264.7细胞24h后的细胞增殖抑制率(％)
4.2新苯骈呋喃化合物对LPS诱导RAW264.7细胞IL-6、TNF-α、PGE2的释放量及COX-2酶活性的影响
4.2.1对IL-6释放量的影响
表3 新苯骈呋喃化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL-6的影响
注：##P＜0.01，与阴性对照组比较；**P＜0.01，与LPS模型组比较
4.2.2对TNF-α释放量的影响
表4 新苯骈呋喃对LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α的影响
注：##P＜0.01，与阴性对照组比较；**P＜0.01，与LPS模型组比较。
4.2.3对PGE2释放量的影响
表5 新苯骈呋喃对LPS诱导的RAW264.7细胞释放PGE2的影响
注：##P＜0.01，与阴性对照组比较；**P＜0.01，与LPS模型组比较
4.2.4对COX-2酶活性的影响
新苯骈呋喃化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞COX-2酶活性的影响如表6所示。
表6 新苯骈呋喃化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞COX-2酶活性的影响
注：##P＜0.01，与阴性对照组比较；**P＜0.01，与LPS模型组比较
以上结果表明，分离得到的新苯骈呋喃化合物对细胞增殖有抑制作用，且随着化合物浓度增大抑制作用增强。
LPS模型组的炎症因子释放量明显高于阴性对照组，结果具有统计学差异(P＜0.01)。新苯骈呋喃化合物组的细胞炎症因子释放量低于LPS模型组，且随着剂量的增大，细胞炎症因子的释放量逐渐减低，结果有统计学差异(P＜0.01)，表明分离得到的新苯骈呋喃化合物具有较强的抗炎活性，其具有开发成具有治疗炎症药物的潜力，可单独或与其他药物联合应用用于改善或治疗炎症等病症。
综上所述，本发明提供一种新苯骈呋喃化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇提取、大孔吸附树脂纯化、硅胶柱层析、ODS中压柱、重结晶，成功的提取分离出新苯骈呋喃化合物，该化合物具有较好的抗炎活性，并从常见植物孔雀草中提取出来，因此可以作为天然产物开发中药的一类新药，具有广阔的前景。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (4)
1.新苯骈呋喃型化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1、取孔雀草干燥药材，经粉碎成粗粉后，采用乙醇提取，醇提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，得药液备用；
步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，依次以水和乙醇梯度洗脱，对乙醇洗脱液进行减压浓缩至近干，置真空干燥箱干燥，备用；
步骤3、将步骤2中乙醇洗脱物经硅胶柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的部分洗脱部位，将合并后的洗脱部位浓缩至干，备用；
步骤4、将步骤3中所得物再经ODS柱层析分离，用甲醇-水等度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并部分洗脱部位，浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤5、将步骤4中所得浓缩物，经重结晶得到的新苯骈呋喃型化合物，其化学结构式为：
2.如权利要求1所述的新苯骈呋喃型化合物的提取分离方法，其特征在于，所述孔雀草为全草包括根及地上部分花；所述孔雀草粗粉粒度为2目-100目。
3.如权利要求1所述的新苯骈呋喃型化合物的提取分离方法，其特征在于，提取乙醇浓度为30％～95％，回流提取1～3次，每次0.5-3小时。
4.如权利要求1所述的新苯骈呋喃型化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
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| Antiviral benzofurans from Eupatorium chinense;Wen-Jing Wang et al.;《Phytochemistry》;20151207;第122卷;第238-245页 * |
| 广东土牛膝的化学成分;廖彭莹等;《云南植物研究》;20101231;第32卷(第2期);第183-188页 * |
| 苯并呋喃类化合物的生物活性及构效关系研究;李雪虎等;《亚太传统医药》;20110930;第7卷(第9期);第136-139页 * |
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