CN104983756A - 灰灰菜全株植物提取物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开灰灰菜全株植物提取物的新用途，属于药物、天然药物技术领域。该新用途是灰灰菜全株植物石油醚相的提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。所述提取物的制备方法如下：以95%乙醇为提取剂，利用超声提取法对灰灰菜全株进行提取，得到其乙醇总提物，然后用石油醚对乙醇总提物进行萃取，浓缩萃取液得到石油醚相提取物。本发明所提供的灰灰菜全株植物的石油醚相提取物对非小细胞肺癌A549细胞具有明显的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡作用。
Description
技术领域
本发明涉及灰灰菜全株植物提取物的新用途，属于药物、天然药物技术领域。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的重大疾病，已成为当今世界面临的一个重大的公共卫生问题。肺癌是世界范围内排名首位的肿瘤致死性疾病，肺癌根据病理形态可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer， SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85%左右。非小细胞肺癌大部分在发现时已经为晚期病例且其5年生存率只有15%-16%。另外目前临床上采用的化疗药物多数疗效有限具有较大的毒副作用且易被肿瘤耐受，严重影响患者的治疗效果，因此亟待开发有效的药物。中药是我国传统的天然医药，具备传统化疗药物不具备的特殊优势:种类繁多，来源广泛；活性化合物具有立体空间结构优势，毒副作用低；作用靶点众多。近年来的一些的研究证明，药用植物的提取物在体内和体外都显示出良好的抗癌活性。
灰灰菜（Chenopodium album Linn）又名藜，为藜科一年生草本植物，广泛分布于世界各国，多生于田间路边，全草可入药，亦可作为野菜而食用，灰灰菜有多种药理学功效，它可以用作抗病毒，抗真菌，抗炎，抗过敏及免疫调节活性。然而对此种植物的抗癌功效研究比较少，Menka Khoobchandani 等学者研究发现其灰灰菜采用石油醚、乙醇和甲醇进行提取，发现其甲醇相提取物对乳腺癌细胞的生长抑制最为明显，但其在抗肺癌活性及其作用机理没有进行探究。
发明内容
本发明的目的是提供灰灰菜全株植物石油醚提取物的一种新用途，该新用途是灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述灰灰菜全株植物石油醚相提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）利用95%乙醇对灰灰菜枝叶进行浸泡过夜，然后超声提取（在50~80℃，功率为200W条件下）至少3次，每次提取0.5~2h，减压抽滤得到乙醇提液，再多次用相同体积的乙醇浸泡并重复第一次的提取流程，直到乙醇提取液无色为止，最后合并所有的乙醇提取液；
（2）利用旋转蒸发仪对灰灰菜全株植物的乙醇提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取物浸膏，然后用蒸馏水对其进行溶解；
（3）用石油醚对灰灰菜全株植物的乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取相无色为止，合并多次萃取得到石油醚相萃取物；
本发明的有益效果：
（1）本发明首次探索研究灰灰菜石油醚相提取物在抗非小细胞肺癌上的应用。
（2）试验证明，本发明的灰灰菜全株植物石油醚相提取物对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖具有一定程度的抑制作用，随着提取物作用浓度的增加及作用时间的延长，对A549细胞生长的抑制作用呈现出明显的剂量-时间依赖效应，Hoechst染色及流式细胞仪检测结果表明灰灰菜石油醚相提取物可以引起细胞核染色质聚缩、细胞周期G1期阻滞及诱导早期凋亡的细胞比例增加，并且呈现明显的剂量依赖关系；因此本发明对于制备抗非小细胞肺癌药物具有重要意义。
附图说明
图1为灰灰菜全株植物石油醚相提取物对A549细胞的生长抑制柱形图；
图2为灰灰菜全株植物石油醚提取物对A549细胞克隆形成剂量曲线图；
图3为灰灰菜全株植物石油醚相取物对A549细胞核染色图；
图4为流式细胞仪检石油醚相提取物对A549细胞周期影响图；
图5为流式细胞仪检测石油醚相提取物对A549细胞早期凋亡作用图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
灰灰菜全株植物石油醚相提取物的制备，具体包括以下步骤：
（1）对采集得到的全株灰灰菜枝叶进行阴干，得到干燥的灰灰菜全株植184.25g，与浓度95%乙醇混合浸泡过夜，然后超声提取3次，超声提取的温度为50℃，功率为200W，每次提取0.5 h，然后将超声提取液过滤得到滤液1，再以与初始比例相同的浓度95%乙醇浸泡滤渣，不断重复上述相同的提取流程，得到滤液2-n，直到浓度95%乙醇提取液无色为止，最后合并所有的滤液，得到总的浓度95%乙醇提取液。
（2）利用旋转蒸发仪对灰灰菜总的浓度95%乙醇提取液进行减压蒸馏，得到浓度95%乙醇提取物浸膏，然后用蒸馏水对其进行溶解。
（3）用石油醚对灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取相无色为止，合并多次萃取得到的萃取相，利用旋转蒸发仪对上述萃取相进行减压蒸馏，得到灰灰菜全株植物石油醚提取部分的浸膏。
实施例2
（1）对采集得到的全株灰灰菜枝叶进行阴干，得到干燥的灰灰菜全株植物184.25g，与浓度95%乙醇混合浸泡过夜，然后超声提取4次，超声提取的温度为60℃，功率为200W，每次提取1 h，然后将超声提取液过滤得到滤液1，再以与初始比例相同的浓度95%乙醇浸泡滤渣，不断重复上述相同的提取流程，得到滤液2-n，直到浓度95%乙醇提取液无色为止，最后合并所有的滤液，得到总的浓度95%乙醇提取液。
（2）利用旋转蒸发仪对灰灰菜总的浓度95%乙醇提取液进行减压蒸馏，得到浓度95%乙醇提取物浸膏，然后用蒸馏水对其进行溶解。
（3）用石油醚对灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取相无色为止，合并多次萃取得到的萃取相，利用旋转蒸发仪对上述萃取相进行减压蒸馏，得到灰灰菜全株植物石油醚提取部分的浸膏。
实施例3
（1）对采集得到的全株灰灰菜枝叶进行阴干，得到干燥的灰灰菜全株植物184.25g，与浓度95%乙醇混合浸泡过夜，然后超声提取5次，超声提取的温度为80℃，功率为200W，每次提取2 h，然后将超声提取液过滤得到滤液1，再以与初始比例相同的浓度95%乙醇浸泡滤渣，不断重复上述相同的提取流程，得到滤液2-n，直到浓度95%乙醇提取液无色为止，最后合并所有的滤液，得到总的浓度95%乙醇提取液。
（2）利用旋转蒸发仪对灰灰菜总的浓度95%乙醇提取液进行减压蒸馏，得到浓度95%乙醇提取物浸膏，然后用蒸馏水对其进行溶解。
（3）用石油醚对灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取相无色为止，合并多次萃取得到的萃取相，利用旋转蒸发仪对上述萃取相进行减压蒸馏，得到灰灰菜全株植物石油醚提取部分的浸膏。
实施例1~3中得到的灰灰菜全株植物石油醚提取物在抑制癌细胞生长中的应用
将非小细胞肺癌A549培养在含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的混合液的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃，5%CO2的培养箱中，细胞进入对数生长期后，加入0.25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞，然后用RPMI-1640完全培养基调整成浓度为5×104个/ml的细胞悬液；再将其接种于96孔培养板中，每孔100μl，于37℃， 5%CO2的培养箱中培养24h使细胞贴壁；
（1）将实施例1、2、3中制得的灰灰菜全株植物石油醚提取物溶解于DMSO中，制成浓度为100mg/ml的筛选母液备用。
（2）利用DMSO进行倍比稀释，分别得到石油醚提取物终浓度为500μg /ml， 250μg /ml，125μg /ml，62.5μg /ml，31.25μg /ml，15.63μg /ml，7.81/ml的DMSO溶液，分别设置试验组和对照组进行试验：
试验组：将灰灰菜石油醚提取物加入到96孔板的A549细胞培养孔内，每孔加入1μl，再向每个培养孔中补加100μlRPMI-1640完全培养基。设置不同的提取物作用浓度，石油醚提取物溶液终浓度为500μg /ml ，250μg /ml，125μg /ml，62.5μg /ml，31.25μg /ml，15.63μg /ml和7.81μg /ml。每个处理设置5个重复孔。
对照组：非小细胞肺癌A549的培养孔内加入DMSO，每孔加入1μl，然后再向每个培养孔中补加100μlRPMI-1640完全培养基，一共设置5个DMSO阴性对照孔。
将上述培养板置于37℃，5%CO2的培养箱内继续培养72h。
72h后向每孔加入20μl新鲜配制的浓度为5mg/ml的四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液，并在37℃， 5%CO2的条件下继续培养4h，小心吸除上清；每孔加入100μl的DMSO，室温下震荡10min，在多功能酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值（OD值），按公式计算癌细胞生长抑制率：癌细胞增殖抑制率 =（对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值）/ 对照孔测定的平均OD 值×100%。
利用GraphPad Prism 5软件对结果进行分析处理，得到灰灰菜全株植物石油醚相提取物对非小细胞肺癌A549作用72h后的半数抑制浓度（IC50），结果如下表1所示：表1
灰灰菜全株植物的石油醚提取物对A549细胞分别作用24h，48h，72h后生长抑制的剂量-效应柱形图如图1所示；结果显示随着提取物处理细胞浓度的增加及作用时间的延长，其对A549细胞的生长抑制明显的增加，呈现明显的剂量-时间依赖效应。
细胞克隆形成试验
A549细胞进入对数生长期后，加入0.25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为200个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔加入1ml肿瘤细胞悬液。接种细胞后继续培养24h 加入向每个孔中各加入10μl终浓度为7.81，15.63，31.25，62.5和125μg/ml石油醚相提取物，对照组加入10μl的DMSO，再向每个孔补加1ml的RPMI1640培养基，继续培养12天后弃培养基，4%多聚甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下观察，计算细胞数大于50的细胞克隆数；结果如图2所示，随着提取物浓度的增加，形成的细胞克隆数目明显的减少，提取物对细胞的毒性呈现明显的剂量依赖性。
Hoechst33342染色试验：
A549细胞进入对数生长期后，加入0.25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为1Χ105个/ml的细胞悬液，加入24孔细胞培养板中，每孔加入1ml肿瘤细胞悬液。细胞接种后继续培养24h 加入向每个孔中各加入10μl终浓度为62.5ug/ml 和31.25ug/ml的灰灰菜石油醚相提取物，对照组加入10μl的DMSO，再向每个孔补加1ml的RPMI-1640培养基，继续培养24h。弃掉培养基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定15-20min，PBS洗2遍，Hoechst33342染色液室温下避光染色30min，PBS洗2遍，用倒置荧光显微镜蓝色荧光观察、拍照。结果如图在灰灰菜浓度62.5μg/ml时如图3B所示与细胞对照组（图3A）相比，加药物的细胞出现核染色质皱缩，出现月牙形或者是断裂的片段，亮度增加，明显的细胞早期凋亡的细胞学表型
细胞周期检测：
A549细胞进入对数生长期后，加入0.25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为5Χ105个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔加入1ml肿瘤细胞悬液。细胞接种后继续培养24h， 向孔中各加入10μl终浓度为62.5ug/ml 和31.25ug/ml灰灰菜石油醚相提取物，对照组加入10μl的DMSO，再向每个孔补加1ml的RPMI1640培养基，继续培养24h。用胰酶消化细胞，1000g离心3-5分钟沉淀细胞。小心吸除上清加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。1000g离心3-5分钟沉淀细胞，75%冰浴预冷的95%乙醇重悬细胞混匀后4℃固定24h。洗去固定液，碘化丙啶染色室温下避光孵育30min，流式细胞仪检测，其结果用Flowjo.7.6软件进行分析。结果如图4 所示灰灰菜全株植物石油醚相提取物以62.5ug/ml的浓度处理细胞后（图4C）G1期占76.93%，31.25ug/ml的浓度处理细胞后（图4B）G1期占69.74%与对照组细胞（图4A）相比细胞周期明显的阻滞在G1期且对着药物浓度的增加G1期阻滞效果越明显。
细胞凋亡检测：
A549细胞进入对数生长期后，加入0.25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为5Χ105个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔加入1ml肿瘤细胞悬液；细胞接种24h后，加入10μl终浓度为62.5ug/ml 和31.25ug/ml石油醚提取物，对照组加入10μl的DMSO，再向每个孔补加1ml的RPMI1640培养基，继续培养24h。用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250μl结合缓冲液重新重悬细胞，加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20μg/ml的碘化丙啶溶液，混匀后于室温避光孵育15min。流式细胞仪检测，其结果用Flowjo.7.6软件进行分析。结果如图5 所示灰灰菜全株植物石油醚相提取物以62.5ug/ml的浓度处理细胞后（图5C）细胞凋亡比率为23.3%，31.25ug/ml的浓度处理细胞后（图5B）细胞凋亡率为11.9%，与对照组细胞（图5A）相比提取物能诱导细胞的凋亡且随着药物浓度的增加细胞的凋亡率也随之增加。
Claims (4)
1.灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于，灰灰菜全株植物提取物的制备方法具体包括以下步骤：
（1）利用乙醇对灰灰菜全株植物枝叶进行浸泡过夜，然后超声提取至少 3次，每次提取0.5~2h，减压抽滤得到乙醇提液，再多次用相同体积的乙醇浸泡并重复第一次的提取流程，直到乙醇提取液无色为止，最后合并所有的乙醇提取液；
（2）利用旋转蒸发仪对灰灰菜叶的乙醇提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取物浸膏，然后用蒸馏水对其进行溶解；
（3）用石油醚对灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取相无色为止，合并多次萃取得到石油醚相萃取物。
3.根据权利要求2所述灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于：所述超声提取的温度为50~80℃，功率为200W。
4.根据权利要求2所述灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于：所述乙醇的体积百分比浓度为95%。
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