KR100999043B1 - 융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 - Google Patents
융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100999043B1 KR100999043B1 KR1020070125162A KR20070125162A KR100999043B1 KR 100999043 B1 KR100999043 B1 KR 100999043B1 KR 1020070125162 A KR1020070125162 A KR 1020070125162A KR 20070125162 A KR20070125162 A KR 20070125162A KR 100999043 B1 KR100999043 B1 KR 100999043B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leu
- glu
- val
- ser
- arg
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 상기 PTP 활성 도메인을 예측하여 상기 도메인만을 융합 단백질을 사용하지 않고 활성 및 안정성을 지닌 형태로 발현할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 PTP는 신약개발을 위한 고효율 약물검색, 선택적 항체 제작을 위한 항원 단백질 및 PTP 구조 및 기능 연구를 위한 단백질로 이용될 수 있다.
단백질 타이로신 탈인산화 효소, 대량발현정제, 활성 도메인
Description
본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 PTP 활성 도메인을 예측하여 상기 도메인만을 융합 단백질을 사용하지 않고 활성 및 안정성을 지닌 형태로 발현할 수 있는 방법에 관한 것이다.
단백질 타이로신의 인산화-탈인산화 과정은 세포내 신호전달 체계에서 매우 중요한 수단으로 이용된다. 특히 세포 외부의 자극에 의한 세포의 반응, 세포의 성장, 분화 및 사멸에 단백질 타이로신의 인산화-탈인산화가 핵심적인 역할을 하고 있기 때문에, 상기와 같은 세포상태의 변화를 수반하는 암, 혈관질환, 면역질환 및 신경질환 등의 질환의 치료 표적 단백질로 단백질 타이로신 인산화 효소(protein tyrosine kinase; 이하, PTK; Curr Pharm Des 13:2751-65, 2007; Curr Med Chem 14:2214-34, 2007) 및 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 가 중요한 위치를 차지한다(Curr Cancer Drug Targets 6:519-32, 2006; Med Res Rev 27:553-73, 2007). 그 대표적인 예로 만성골수암의 치료제 신약으로 최근 각광을 받고 있는 글리벡은 PTK의 하나인 abl-PTK의 저해제이다(Curr Opin Drug Discov Devel 7:639-48, 2004). PTK에 비하여 PTP는 아직 많은 연구가 진행되어 있지는 않았으나, 이미 몇 가지 PTP는 암 및 당뇨병의 치료제 표적으로 활발한 연구가 진행되고 있고 앞으로 많은 PTP들이 질병 표적 단백질로 사용될 것으로 예측되고 있다(Curr Cancer Drug Targets 6:519-532, 2006; Med Res Rev 27:553-73, 2007).
세포내 신호전달 체계의 파괴는 쉽게 질병으로 이어지기 때문에 실제로 많은 PTP들이 질병과 관계되어 있다는 것이 알려져 왔고 몇몇 PTP들은 신약 개발의 표적이 되어 왔다. 인간에게는 약 100여 종의 PTP가 존재하며(Cell 117:699-711, 2004), 이들 중 20여 종은 질병과의 관련이 밝혀져 신약개발 표적으로 사용되고 있다. 나머지 80여 종도 질병과 관련이 있을 것으로 생각되고 있다. 그러나 효과적인 신약을 개발하려면 표적으로 하는 PTP의 활성만 저해하고 다른 PTP에는 영향을 주지 않아야 하는데 PTP는 활성부위 구조가 비슷해서 하나의 PTP의 활성을 저해하는 화합물이 다른 PTP의 활성도 저해하는 경우가 많다. 이런 경우에는 세포의 신호전달 네트워크를 무작위적으로 교란할 가능성이 있어서 약물의 부작용이 나타나게 된다. 특히 아직 세포기능이 잘 알려져 있지 않은 PTP의 경우 그 위험성이 더욱 크다.
따라서 PTP 단백질의 저해제 개발에는 가능한 한 모든 PTP 단백질의 활성을 한꺼번에 조사해서 특정 PTP에만 선택적으로 작용하는 화합물을 발굴하는 것이 중요한데, 이는 각 PTP의 활성형 단백질을 확보해야만 가능한 일이다. 또한 이러한 활성형 단백질은 PTP의 질병관련 세포기능을 연구하거나 질병진단을 위하여 필요한 항체의 개발에 필요하다. 특히 상기 목적으로 PTP를 사용할 때 안정한 상태로 활성도를 장기간 유지할 수 있도록 하는 것이 필요하며 효과적인 항체의 제작을 위해서는 MBP 및 GST 같은 융합 단백질이 붙어 있지 않은 것이 유리하다.
그러나 아직까지 PTP 단백질군 100여 개 단백질에 대해서 대량발현을 성공시킨 예는 보고된 바가 없으며 본 발명자 그룹에서 MBP 융합을 이용하여 77개의 단백질을 대장균에게서 발현시킨 것이 유일하다(대한민국 등록특허 746993). MBP 융합 단백질의 경우 MBP를 제거하고 나면 단백질의 안정성이 저하되는 경우가 많아 저해제 개발을 위한 활성도 측정이나 선택적 항체 제작에 사용하기 용이치 않은 경우가 많았다.
이에 본 발명자들은 융합 단백질을 사용하지 않고 PTP 활성 도메인 단백질을 안정하게 발현하기 위하여, 컴퓨터를 이용한 단백질 구조 예측 기법으로 PTP 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단을 정확히 예측하여 상기 부위를 클로닝 및 발현하여 60개의 PTP 활성 도메인을 융합 단백질 없이 안정하게 발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 현재까지 다른 그룹에서 산발적으로 활성 도메인을 발현하고 구조 및 기능 연구를 수행한 경우가 있으나 그 수가 약 20여 개에 그치고 있고 활성도 및 안정성의 측정이 제대로 보고되지 않았다. 본 발명에 의해 제조된 PTP 활성 도메인 단백질들은 높은 활성을 가지면서도 수십만 개의 화합물을 이용한 HTS(high throughput screening) 시스템에서도 안정된 활성을 유지할 수 있도록 발현되고 정제되었다.
본 발명의 목적은 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 대량생산하는 데에 있어서 PTP 활성 도메인을 예측하여 상기 도메인만을 융합 단백질을 사용하지 않고 활성 및 안정성을 지닌 형태로 발현할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 서브그룹별 상동성 조사를 수행하여 유사도가 가장 높은 부분을 선정하는 단계;
2) 단계 1)의 선정된 부분이 각 서브그룹별로 이미 2차 및 3차 구조가 규명된 표준 단백질의 활성 도메인에 해당되는지 확인하는 단계;
3) 단계 1)의 선정된 부분에 대한 2차 구조를 분석하여 2차 구조상 헬릭스 또는 시트를 가지지 않는 위치를 활성 도메인의 경계로 나누는 단계;
4) 단계 3)의 결정된 활성 도메인의 아미노산 분석을 통해 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단이 가용성질일 수 있도록 N-말단 및 C-말단의 경계를 결정하는 단계;
5) 단계 4)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레 오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 형질전환체를 배양하여 재조합 활성 도메인의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 PTP 활성 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 PTP 활성 도메인을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 포함하는 PTP 저해제 또는 촉진제 검색용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 이용하여 제조한 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 PTP 특이적 기질 및 후보 물질을 처리하고 흡광도 변화를 측정하는 단계; 및
2) 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 재조합 PTP 활성 도메인의 활성을 감소시키거나 증진시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 PTP 활성 저해제 또는 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료에 본 발명의 항체를 첨가하여 PTP와 결합시키는 단계; 및,
2) 단계 1)의 항체와 결합한 PTP의 양을 측정하는 단계를 포함하는 PTP 발현량 측정 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"PTP 활성 도메인"은 PTP 단백질의 전장이 아닌 본 발명의 방법에 의해 결정된 기능성 단편을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 서브그룹별 상동성 조사를 수행하여 유사도가 가장 높은 부분을 선정하는 단계;
2) 단계 1)의 선정된 부분이 각 서브그룹별로 이미 2차 및 3차 구조가 규명된 표준 단백질의 활성 도메인에 해당되는지 확인하는 단계;
3) 단계 1)의 선정된 부분에 대한 2차 구조를 분석하여 2차 구조상 헬릭스 또는 시트를 가지지 않는 위치를 활성 도메인의 경계로 나누는 단계;
4) 단계 3)의 결정된 활성 도메인의 아미노산 분석을 통해 활성 도메인의 N- 말단 및 C-말단이 가용성질일 수 있도록 N-말단 및 C-말단의 경계를 결정하는 단계;
5) 단계 4)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 형질전환체를 배양하여 재조합 활성 도메인의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 PTP 활성 도메인의 제조방법을 제공한다.
대표적인 PTP 활성 도메인(PTP1B)의 삼차구조를 도 1의 리본그림으로 나타내었다. PTP는 몇 개의 알파-헬릭스가 가운데의 베타-시트를 둘러싸고 있는 구조로 되어 있으며 100여 개의 PTP가 비슷한 구조로 되어 있을 것이다. 본 발명에서는 안정한 형태의 PTP를 생산하기 위하여 구조가 알려진 PTP를 바탕으로 구조가 안 알려진 PTP의 아미노산 잔기를 비교하여 안정한 형태의 활성화 도메인이 아미노산 서열상 어디에 해당하는지 예측하여 발현하는 방법을 사용하였다(도 3 및 도 4 참조).
단계 1)의 상동성 조사는 ClustalX, KALIGN(At Karolinska Institute or at EB), MAFFT(At Kyushu University, EBI or at MyHits) 및 Muscle(At Berkeley or at BioAssist) 등의 프로그램으로 수행될 수 있다. 또한, 단계 1)의 서브그룹은 리셉터(receptor), 비-리셉터(non-receptor), MKP(Mitogen-Activated protein Kinase phosphatase), DUSP(Dual-specificity phosphatases) 및 CDC14(Cell division cycle 14) 상동체(homologue)의 5 종류로 구성된다. 이들 5개 그룹은 아미노산 서열 및 활성도메인의 구조가 비교적 유사한 PTP들로 구성되어 있어서, 각 그룹에서 이미 구조가 규명된 PTP의 삼차구조를 활용하여 같은 그룹의 다른 PTP들의 이차구조 및 삼차구조를 예측할 수 있었다. 각 그룹에서 사용한 기존에 알려진 삼차구조 및 PDB(Protein Data Bank) 접근 코드(accession code)는 다음과 같다: 리셉터(receptor): RPTPα(1YFO) 및 LAR(1LAR); 비-리셉터(non-receptor): PTP1B(2HNQ) 및 TCPTP(1L8K); MKP: PYST1(1MKP); DUSP: VHR(1VHR); CDC14: CDC14B(1FPZ).
또한, 단계 3)의 2차 구조 분석은 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(http://pbil.ibcp.fr/), PHDsec (http://www.predictprotein.org/)등의 프로그램으로 수행될 수 있다.
또한, 단계 4)의 N-말단과 C-말단 경계는 PTP 활성 도메인의 N-말단과 C-말단의 2 내지 3개의 아미노산이 가용성질의 아미노산으로 이루어지고, 단백질의 접힘이 일어나는 시작과 끝이 구조적으로 표면에 노출되며, 또한 이차구조상 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조를 가지지 않도록 수행되는 것이 바람직하다. 상기 가용성질의 아미노산은 작은 아미노산 또는 전하를 가진 아미노산이고, 상기 작은 아미노산에는 세린 또는 글리신이 포함되고, 전하를 가진 아미노산에는 라이신, 아르기닌, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산 및 아스파르트산 등이 포함된다.
N-말단과 C-말단이 가용성질일 경우 상기 말단이 수용성 외부에 노출되기 쉬우며 수용액에서 안정하게 발현될 수 있고, 주로 단백질의 접힘에 중요한 역할을 하는 헬릭스나 시트 구조가 도메인의 말단에 위치하면 단백질의 접힘이 제대로 일어나지 않고 안정한 상태로 수용액상에 있기가 어렵기 때문이다.
이에 본 발명자들은 ExPASy 서버(Swiss Institute of Bioinformatics)의 ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)를 이용하여 아미노산의 소수성질 및 이차구조의 구성을 분석하였다(도 5 참조).
상기 활성 도메인 경계를 결정은 수득한 재조합 PTP 활성 도메인의 활성 및 안정성을 확인한 후(도 6 및 도 7 참조), 그 활성 및 안정성이 낮을 경우 프로테아제 처리에 의해 PTP 활성 도메인의 경계가 재설계되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 트립신 또는 키모트립신을 이용하여 활성 및 안정성을 유지하는 PTP 활성 도메인을 재설계할 수 있었다. 예측된 경계가 한번에 안정된 형태의 도메인으로 발현되는 것은 드물고 N-말단 및 C-말단 부위를 변경한 여러 도메인을 발현하는 시도 후에 최적의 도메인을 찾을 수 있었다. 도 8에서는 최종적으로 안정한 형태의 활성형 도메인의 발현에 사용된 경계를 표시하였다. 이에 PTP 활성 도메인 경계 내부의 서열번호 113 내지 168의 아미노산 서열을 수득하였다.
단계 3)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 도 2에 나타난 바와 같다. 상기 PTP 발현 시 융합 단백질, 분리정제용 태그 또는 절단효소 인식부위와의 인위적 연결을 포함하지 않도록 하기 위해서 PTP 활성 도메인만 발현되었다. 단계 1) 및 단계 2)의 단백질 구조 예측을 통해 PTP 단백질의 구조적 접힘이 안정하게 일어날 수 있는 부위를 결정 하여 발현함으로써 구조적 접힘이 되는 도메인 아미노산 이외의 인위적 연결부위 등이 없어도 단백질이 수용성으로 안정하게 발현될 수 있었다(도 9 참조).
단계 5)의 재조합 PTP 활성 도메인을 수득하는 단계는 산화환원 조건을 유지하는 상태에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 DTT 또는 베타-머캅토에탄올을 5 내지 20 mM을 사용하여 상기 산화환원 조건을 유지할 수 있었다. 상기 방법으로 수득한 재조합 PTP 활성 도메인 약 30개의 안정화된 PTP 활성형 도메인을 발현하여 정제한 후 단백질의 순도를 SDS-PAGE에 의해서 확인하였고(도 9 참조), 그 활성 및 안정성이 유지되는 것으로 확인되었다(도 7 참조).
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 PTP 활성 도메인을 제공한다.
본 발명의 PTP 활성 도메인은 높은 활성 및 안정성을 지니고 있어서(도 7 참조), 수십만 개의 화합물을 이용한 HTS 시스템에서도 안정한 활성을 나타내면서 다양한 세포기능 연구 및 질병 진단에 사용가능할 수 있다. 상기 재조합 PTP 활성 도메인은 서열번호 113 내지 168 및 서열번호 169 내지 177의 아미노산 서열로 기재되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
뼈대 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 연결되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 113 내지 168 및 서열번호 169 내지 177의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 폴리펩티드를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 내부에 포함되지 않은 제한 효소 부위를 다중 클로닝 부위에 많이 포함하는 벡터가 바람직하다. pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pET28a 벡터에 서열번호 113 내지 168의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 폴리펩티드를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결함으로써(도 2 참조), 서열번호 113 내지 168의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 발현하는 pET28a-PTP1 내지 pET28a-PTP56의 발현벡터를 제작하였다.
또한, 본 발명의 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체는 다양한 세포기능 연구 및 질병 진단에 사용가능한 PTP 활성 도메인의 대량 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 포함하는 PTP 저해제 또는 촉진제 검색용 키트를 제공한다.
상기 재조합 PTP 활성 도메인은 고체 담체에 고정된 형태로 포함될 수 있다. 상기 키트는 상기 PTP 활성 도메인의 활성 측정용 기질, 반응 완충용액 및 반응 종결 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 기질은 DiFMUP(6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate)이 사용되었다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 PTP 활성 도메인을 이용하여 제조한 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
상기 항체는 단일 항체 또는 다클론성 항체일 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 이미 알려져 있는 항체 제조방법을 통해 본 발명의 재조합 PTP 활성 도메인을 항원으로 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상기 재조합 PTP 활성 도메인에 PTP 특이적 기질 및 후보 물질을 처리하고 흡광도 변화를 측정하는 단계; 및
2) 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 재조합 PTP 활성 도메인의 활성을 감소시키거나 증진시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 PTP 활성 저해제 또는 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료에 본 발명의 항체를 첨가하여 PTP와 결합시키는 단계; 및,
2) 단계 1)의 항체와 결합한 PTP의 양을 측정하는 단계를 포함하는 PTP 발현량 측정 방법을 제공한다.
단계 1)의 시료는 혈액, 조직 및 분비물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 또한, 단계 2)의 측정 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 PTP는 신약개발을 위한 고효율 약물검색, 선택적 항체 제작을 위한 항원 단백질 및 PTP 구조 및 기능 연구를 위한 단백질로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
PTP
활성 도메인의 N-말단 및 C-말단 경계 결정
<1-1>
PTP
아미노산 서열의 비교 및 구조 예측
PTP의 활성 도메인을 크게 리셉터(receptor), 비-리셉터(non-receptor), MKP(Map kinase phosphatase), DUSP(Dual-specificity phosphatases) 및 CDC14(Cell division cycle 14) 상동체(homologue)와 같이 5종류의 그룹으로 나누어 아미노산 서열을 서로 비교분석 하였다. 상기 5종류의 그룹은 아미노산 서열의 유사성에 의해 비슷한 구조가 예측되어 일반적으로 PTP의 서브그룹(subgroup)을 나누는데 사용되고 있다(Alonso et al ., Cell 117:699-711, 2004). 각 그룹은 이미 알려진 삼차구조[리셉터: RPTPα(1YFO); 비-리셉터: PTP1B(2HNQ) 및 TCPTP(1L8K); MKP: PYST1(1MKP); DUSP: VHR(1VHR); CDC14: CDC14B(1FPZ)]를 기반으로 하여 Clustal X 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 서로 정렬하였다(도 3). 구체적으로 11종의 MKP를 Clustal X 프로그램으로 분석하여 가장 유사성이 있는 부분(빨간색 화살표)을 선택하였고 삼차구조가 알려져 있는 MKP3(pk9)의 이차구조 및 삼차구조를 이용하여 활성도메인을 결정하였다.
또한 동시에 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(http://pbil.ibcp.fr/)를 이용하여 이차구조를 예측하였으며, 도 4는 여러 PTP 중 MKP3(pk9) 전장 단백질의 이차구조예측결과를 나타내었다. 파란색 막대는 알파 헬릭스, 빨간색 막대는 베타 시트 그리고 보라색 막대는 루프 또는 유동성 있는(flexible) 영역, 파란색 화살표는 실제 3차 구조의 경계를 표시한 것이다. 상기 결과를 통해 PTP 의 활성도메인의 대략적인 경계를 알 수 있었다.
<1-3>
PTP
활성 도메인의 N-말단 및 C-말단 경계 결정
수용액에서 안정하게 발현이 되기 위해서는 단백질의 N-말단 및 C-말단이 수 용성 아미노산으로 이루어져 있는 것이 유리하기 때문에 ExPASy 서버(Swiss Institute of Bioinformatics)의 ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)를 이용하여 아미노산의 소수성질 및 이차구조의 구성을 분석하였다(도 5). 예를 들어 MKP3(pk9)의 아미노산서열의 친수성/소수성 부분을 ExPASy 서버로 예측해본 결과(도 5)를 토대로 친수성질(빨간색화살표)의 경계면을 도메인으로 선택하였다. 상기 방법으로 선택된 도메인은 N-말단 및 C-말단이 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조의 이차구조를 갖고 있을 확률이 작으며 따라서 구조적 접힘(folding)이 되어 있는 부분을 피할 수 있다. 구조적 접힘이 있는 부분을 발현의 말단으로 선택할 경우 발현된 단백질이 제대로 구조적 접힘이 일어나지 않고 수용액에서 안정한 상태를 가지지 못하기 때문이다. 단백질의 접힘이 일어나는 시작과 끝은 구조적으로 표면에 노출되어야 유리하며, N-말단과 C-말단의 시작과 끝은 적어도 2 내지 3 아미노산이 반드시 표면에 노출되기 위해서 가용성질을 지닌 아미노산이 유리하며, 또한 이차구조상 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조를 가지지 않도록 수행되는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명자들은 가용성질을 가진 2 내지 3개의 아미노산을 가지고 이차구조상 헬릭스(helix)나 시트(Sheet)구조를 가지지 않는 부분을 N-말단 및 C-말단으로 선정하였다. 그 이유는 헬릭스나 시트 구조는 주로 단백질의 접힘에 중요한 역할을 하고 그런 부위에 도메인의 말단이 오게 되면 단백질의 접힘이 제대로 일어나지 않고 안정한 상태로 수용액상에 있기가 어렵기 때문이다. 또한 N-말단이나 C-말단의 끝 부분은 세린 또는 글리신과 같은 작은 아미노산, 전하를 가진 아미노산 및 가용성 질의 아미노산이 안정한 도메인 형성에 N-말단이나 C-말단의 아미노산이 영향을 덜 주게 된다.
그 결과, 용해도 향상을 위해 경계가 재조정된 아미노산 서열 1 내지 52개를 수득하였다.
<1-4> 용해도 및 안정성을 향상시키기 위한 도메인 경계 재설계
<1-4-1> 용해도 및 안정성 확인
실시예 1의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인을 일정 시간 보관 후, 일정량 단백질용액과 동일양의 단백질용액을 초고속 원심분리 후, 상등액과 침전물로 분리하여 실시예 3과 동일한 SDS-PAGE 방법으로 침전물에 해당 단백질이 포함되는지 여부를 확인함으로서 용해도를 측정하였다.
<1-4-2> 안정한 활성 도메인 경계
실시예 1-4-1의 결과를 바탕으로 용해도 및 안정성이 낮은 PTP 활성 도메인을 트립신(Sigma, USA) 또는 키모트립신(Sigma, USA)의 프로테아제로 한번 반응에 1 ㎎/㎖ 농도의 PTP활성도메인 20 ㎍을 각각 1:1에서 1:1,000까지 반응 비율로 변화시키면서 37℃에서 30분 반응 후, 실시예 3과 동일한 SDS-PAGE 방법을 통하여 절단 정도를 확인하였다.
그 결과, T38의 경우 프로테아제 처리 후 프로테아제 농도가 증가하더라도 안정하게 유지되는 도메인을 찾을 수 있었다(도 8).
<1-4-3> 도메인 경계의 재설계
실시예 1-4-2의 방법으로 수득한 안정한 PTP 활성 도메인을 N-말단 시퀀싱과 질량분석 스펙트럼을 이용하여 재설계하고 제작하였다.
실시예 1-4-2의 방법으로 수득한 프로테아제에 의해 절단된 단백질의 밴드를 PVDF 멤브레인에 옮긴 후, 그 밴드를 절단하여 N-말단을 인식하여 자르는 시약처리 후 순차적으로 HPLC를 통해 아미노산의 순서를 정하였으며, 절단밴드를 빼내어 질량분석 스펙트럼을 이용하여 정확한 질량을 계산하여 안정한 도메인을 결정하였다. 아울러, 상기 방법으로 재설계된 도메인들을 실시예 4의 방법으로 다시 활성 및 안정성을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 재설계된 도메인 pk7(MKP2)을 확인할 수 있었다. 구체적으로 도 9a에서 전장 pk7의 용해도 및 안정성이 낮은 반면, 도 9b에서 재설계된 pk7은 용해도 및 안정성이 높은 것을 확인하였다. 즉, 용해도가 좋지 않았던 최초 발현 시도에서부터 최종적으로 발현양 및 안정성이 좋은 PTP 활성도메인을 발현할 수 있었다. 상기 방법으로 재설계된 안정한 도메인을 표 1에 나타내었다.
PTP 명 | 안정성저하 도메인 |
안정한도메인 | 서열번호 |
p18 | 299-457 | 306-450 | 158 |
pk14 | 1-210 | 27-210 | 145 |
pk17 | 35-211 | 35-211 | 155 |
pk32 | 1-360 | 63-360 | 130 |
T20 | 840-1400 | 890-1180 | 125 |
T23 | 1042-1305 | 1024-1335 | 117 |
T38 | 636-979 | 709-979 | 120 |
Eya2 | 339-514 | 244-514 | 168 |
pK7 | 1-394 | 174-338 | 136 |
<
실시예
2>
PTP
활성 도메인의 대량발현 및 정제
<2-1>
PTP
활성 도메인의
클로닝
실시예 1에 의해 PTP 활성 도메인 1 내지 56개를 융합 단백질의 도움 없이 발현할 수 있는 벡터를 제조하였다.
pET28a 벡터(Novagen, USA)의 다중 클로닝 부위는 PTP 활성 도메인(서열번호 113 내지 168)의 DNA 염기서열 내에 포함되지 않은 제한효소부위를 가장 많이 포함하고 있기에 본 발명의 뼈대 벡터로 사용하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 113 내지 168로 기재된 PTP 활성 도메인 1 내지 56의 DNA 염기서열을 증폭하기 위하여, 서열번호 1 내지 112로 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 Clontech사에서 구입한 뇌(brain), 근육(muscle), 정도(testis)등의 cDNA라이브러리를 주형 DNA로 하여 95℃ 5분, 95℃ 1분, 55-60℃ 1분, 72℃ 1분 30초, 30회 반복, 72℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소NdeI, EcoRI 또는 BamHI으로 각각 처리하여 pET28a 벡터(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI, EcoRI 또는 BamHI자리에 삽입하였고 이를 pET28a-PTP 1 내지 56이라고 명명하였다(도 2).
번호 | 이름 | 아미노산 위치 (서열번호) |
정방향 프라이머 | 서열번호 |
DNA 위치 | 역방향 프라이머 | |||
1 | T4 | 225-793(113) | CGCGACGCTAGCATGGCAGACGACAATAAGCTCTTC | 1 |
673-2379 | GCTGCGAAGCTTTACTTGAAGTTGGCATAATCTGA | 2 | ||
2 | T7 | 1684-1967(114) | GGCACCCATATGCTAGTGGCTGTTGTTGCCTTATTG | 3 |
5050-5901 | GCGGGATCCTCAATGCCTTGAATAGACTGGATC | 4 | ||
3 | T48 | 1316-1897(115) | GCCCCACATATGCGAGACCACCCACCCATCCCC | 5 |
3946-5691 | GGAAGATCTCTACGTTGCATAGTGGTCAAAGCTGCC | 6 | ||
4 | T8 | 821-1089(116) | GCGCCATATGGCAGACAAGTACCAGCAACTCTCCCTG | 7 |
2461-3267 | GCGCGGATCCCTCGGCTGGGGCCTGGGCTGACTGTTG | 8 | ||
5 | T23 | 1024-1335(117) | CCGTTACATATGGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTC | 9 |
3070-4005 | CCCGAATTCTTAGGCGATGTAACCATTGGTCTTTC | 10 | ||
6 | T39 | 879-1440(118) | CACATTGCTAGCATGAAGACATCAGACAGCTATGGG | 11 |
2635-4320 | CGGCTCAAGCTTCTAAGATGATTCCAGGTACTCCAA | 12 | ||
7 | T5 | 848-1452(119) | GCCCACCATATGGCCAGCGATACCAGCAGCCTG | 13 |
2542-4356 | GCGAGATCTTCAGCCAGAATTCAAGTATTCCAG | 14 | ||
8 | T38 | 709-979(120) | GACCGGCATATGCTTGCCAAGGAGTGGCAGGCCCTC | 15 |
2125-2935 | CCGGGATCCTCACTGGGGCAGGGCCTTGAGGAT | 16 | ||
9 | T12 | 674-1015(121) | CGCCAGCATATGGCCACGCGGCCACCAGACCGA | 17 |
2020-3045 | GCGGGATCCTCACTGGGGAAGGGCCTTGAGGAT | 18 | ||
10 | T15 | 851-1216(122) | GAGCATGCTAGCATGGCTAGGGAGTGTGGAGCTGGT | 19 |
2551-3648 | GCGGGATCCCTAGGACTTGCTAACATTCTCGTATAT | 20 | ||
11 | T10 | 327-650(123) | CCTTTCCATATGAAGCCCATAGGACTTCAAGAGAGAAG | 21 |
979-1950 | GACAGTAAGCTTTCAAAGTCTGCTCTCATACAGGCACA | 22 | ||
12 | T22 | 1367-1650(124) | CGCGAACATATGCTTAGCCACCCGCCAATTCCC | 23 |
4099-4950 | GGCGGATCCTCAGCCCACGGCCTCCAGCAGGGCCTC | 24 | ||
13 | T20 | 890-1180(125) | TTCGCTAGCGCCATCCGGGTGGCTGACTTG | 25 |
2668-3540 | GCGGGATCCCTAAAAGGAGCTTAAATATTCCAGTGCCA | 26 | ||
14 | PTP1B | 1-299(126) | ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC | 27 |
1-897 | GTCAACATGTGCGTGGCTACGGTCCTCACG | 28 | ||
15 | T25 | 1-387(127) | GCTCCCGCTAGCATGCCCACCATCGAGCGGGAG | 29 |
1-1161 | CGCGGATCCTTAGGTGTCTGTCAATCTTGGCCT | 30 | ||
16 | T41 | 157-537(128) | TCAGAGCATATGGAGGAGAAGATCGAGGATGAC | 31 |
469-1611 | GTGGACGCTAGCATGAAATATTTGGGCAGTCCCATT | 32 | ||
17 | T18 | 1-595(129) | GCCCCCCATATGGTGAGGTGGTTTCACCGAGAC | 33 |
1-1785 | CCGGAATTCTCACTTCCTCTTGAGGGAACCCTTG | 34 | ||
18 | pk32 | 63-360(130) | GAACCCCATATGTCTGTGAACACACCCCGGGAGGTC | 35 |
187-1080 | CGGGATCCTCAGGGGCTGGGTTCCTCAGGCAG | 36 | ||
19 | pk28 | 1-526(131) | CCGCGGCATATGGAACATCACGGGCAATTAAAA | 37 |
1-1578 | CGGGATCCTCACCTGCAGTGCACCACGACCGG | 38 | ||
20 | T32 | 2095-2490(132) | GCAGTACATATGAATGGGAAGTTATCAGAAGAG | 39 |
6283-7468 | GGCGGATCCTCACTTCAGAAGCTGAGGCTGCTGTTTTT | 40 |
번호 | 이름 | 아미노산 위치 (서열번호) |
정방향 프라이머 | 서열번호 |
DNA 위치 | 역방향 프라이머 | |||
21 | T40 | 866-1187(133) | GAGCAGCATATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAG | 41 |
2596-3561 | CGCGGATCCTTAAATGAGTCTGGAGTTTTGGAG | 42 | ||
22 | T2 | 839-1174(134) | CTAGGGCATATGAAAAAGACTCGAGTAGATGCA | 43 |
2515-3522 | CGCGGATCCTTAGATGAGCCTGGAGCTTTTCAG | 44 | ||
23 | pk4 | 173-323(135) | AGGCCGCATATGGTCATGGAAGTGGGCACCCTG | 45 |
517-969 | GGCGGATCCTCAGCTCCCAGCCTCTGCCGAACAG | 46 | ||
24 | pk7 | 174-338(136) | GTTCATATGAGTGCCACAGAGCCCTTGGAC | 47 |
520-1012 | GCGGGATCCTCAGGACGTGGCCAGCACCTGGGACTC | 48 | ||
25 | pk8 | 178-321(137) | GCGGACCATATGGGCCCAGTTGAAATCCTTCCCTTC | 49 |
532-962 | GCGAGATCTTCACGTGGAGGGCAGGATCTCAGATTCG | 50 | ||
26 | pk9 | 205-348(138) | GGCAGCCATATGTCCTTCCCAGTGGAGATCTTGCCC | 51 |
613-1044 | CGCGGATCCTCAGCTGAGTCCCAGCGTCCTCTCGAA | 52 | ||
27 | pk10 | 192-338(139) | GCTGGCCATATGTTGCGCCGCCTGCGCAAGGGC | 53 |
574-1014 | CGGGATCCTCACGTGGACTCCAGCGTATTGAG | 54 | ||
28 | T33 | 160-312(140) | TGCCCCCATATGGCTGGGGACCGGCTCCCGAGG | 55 |
478-934 | GCGGGATCCTCATGAGGGGGTGCCCGGGTCGCCCTG | 56 | ||
29 | pk12 | 201-351(141) | CGATCGCATATGGAGGGTCTGGGCCGCTCGTG | 57 |
601-1053 | CGGGATCCCTAGGTGGGGGCCAGCTCGAAGG | 58 | ||
30 | pk13 | 320-467(142) | CTGGACCATATGCAGCGGCTGAACATCGGCTAC | 59 |
958-1401 | CGGGATCCTCACACAACCGTCTCCACTCCCATC | 60 | ||
31 | T27 | 192-339(143) | GTTGCCCATATGGGGCCAACCCGAATTCTTC | 61 |
574-1017 | GGATCCTTATGATGCTCCAGTCTGGTTC | 62 | ||
32 | pk6 | 1-185(144) | GCCGCCCATATGTCGGGCTCGTTCGAGCTCTCG | 63 |
1-555 | CGGGATCCCTAGGGTTTCAACTTCCCCTCC | 64 | ||
33 | pk14 | 27-210(145) | GCCAAGCATATGGGCGGAAACCACATCCCCGAAAGG | 65 |
79-628 | GCGGGATCCTCAGGAATTCCAATTCTTTCTGATAGG | 66 | ||
34 | pk15 | 21-340(146) | AGCGCCCATATGGTCAGCTGTGCCGGGCAGATGCTG | 67 |
61-1020 | CGGGATCCTCATATTTTTCCTGTTTGTGATCC | 68 | ||
35 | pk33 | 1-188(147) | GGCTGGCATATGGCTGAGACCTCTCTCCCAGAG | 69 |
1-564 | CGGGATCCTCAGCTCTGGCCGGCACCCCGC | 70 | ||
36 | p44 | 1-198(148) | TCCCACCATATGGACTCACTGCAGAAGCAGGAC | 71 |
1-601 | GCCAAGGGTCAGGGATCCTGGCTG | 72 | ||
37 | p21 | 1-157(149) | CCCGGGCATATGGGCAATGGCATGACCAAGGTAC | 73 |
1-471 | GCGGGATCCTCACTTGCCGCCCTTGCGGGACAG | 74 | ||
38 | pk35 | 1-188(150) | GCGGGATCCTCACTTGCCGCCCTTGCGGGACAG | 75 |
1-564 | CGGGATCCTCACAGTGGAATCATCAAACGGAC | 76 | ||
39 | NE1 | 1-217(151) | CCAGGGGCTAGCCGCTAACTGGAAAGAAAA | 77 |
1-651 | GTCGGATCCTTAGCTTTCTTTGCCCTCTTG | 78 | ||
40 | p19 | 1-190(152) | ATGACAGCATCCGCGTCCTCCTTTTC | 79 |
1-570 | TTACATTGATATCATCATACGTAG | 80 | ||
41 | pk18 | 1-184(153) | GCAGCCCATATGGGGAATGGGATGAACAAGATC | 81 |
1-552 | CGGGATCCTTACAGTCTTCTGAGAAAGGCCCAG | 82 | ||
42 | p12 | 31-211(154) | GGGAAGCATATGGGTCGGGCGCACCGGGACTGG | 83 |
91-603 | GGCACCAAGCTTTCAGAACTCTTTAAGAACATCCAGCT | 84 | ||
43 | pk17 | 35-211(155) | CTGGAGCATATGCCAACCGTTCAACATCCTTTCC | 85 |
103-633 | GCGGGATCCTCATGCTTCCAGACCCTGCCGCAGC | 86 |
번호 | 이름 | 아미노산 위치 (서열번호) |
정방향 프라이머 | 서열번호 |
DNA 위치 | 역방향 프라이머 | |||
44 | p16 | 1-150(156) | GCGGCGGCTAGCATGGGCGTGCAGCCCCCCAACTTC | 87 |
1-450 | CGCGCCTCGAGTTTCGTTCGCTGGTAGAACTGGAA | 88 | ||
45 | T16 | 1-210(157) | GGCGGCGCTAGCATGGCTCACAACAAGATCCCGCCG | 89 |
1-630 | TGAGGATCCTTATGATTCCTTCTTTCCATCCTCATC | 90 | ||
46 | p18 | 306-450(158) | CCGGGACATATGGACAAGCCCTCCCTTATCTTC | 91 |
916-1350 | GCGGGATCCTCAGCTTGCATCCAAGATGCCTTC | 92 | ||
47 | NE3 | 306-350(159) | CTTGGTCATATGGATAGCCCTACACAGATATTTG | 93 |
916-1350 | GCGGGATCCTCACCTTGCCAGCAAGATCCCCTG | 94 | ||
48 | pk3 | 4-163(160) | GCGGCTCATATGAACCGCCCAGCTCCTGTGGAA | 95 |
10-489 | GCGGGATCCTCAGGAATCTTTGAAACGCAGCCGCAT | 96 | ||
49 | p49 | 14-167(161) | CGCCGAGCTAGCATGCGTTTTCTGATAACTCACAAC | 97 |
40-501 | CGGGATCCCTACTGAACACAGCAATGCCCATTG | 98 | ||
50 | p26 | 4-161(162) | GCGACCCATATGGCCCCGGTGGAGGTGAGCTACA | 99 |
10-483 | CGCGGATCCTCAGGTCTTGTGCGTGTGTGGGTCTTTG | 100 | ||
51 | T29 | 37-391(163) | GGCGGCCATATGTCGTCGACCTCGCCGGGTGTGAAG | 101 |
109-1173 | GCCGGATCCTTATTTGGAGAAGGCTGCTCTGTGTTGTC | 102 | ||
52 | T46 | 1-157(164) | ATGGCGGAACAGGCTACCAAGTCCGTG | 103 |
1-471 | TCAGTGGGCCTTCTCCAAGAACGCTCTGC | 104 | ||
53 | pk1 | 336-523(165) | GCTCTAGACTTATAGGAGACTTCTCCAAGGG | 105 |
1006-1569 | GCCCTAGGTCAGAGCTTCTTCAGACGACTGTAC | 106 | ||
54 | T47 | 378-566(166) | GACCACCATATGCTGATTGGAGATTACTCTAAGGCC | 107 |
1132-1701 | CCGGGATCCTCACTGGTCCTGCAGCCGGCTACA | 108 | ||
55 | T45 | 207-400(167) | GATTCTGCTAGCGGGCACCTGATTGGTGATTTTTCC | 109 |
619-1200 | CCGGGATCCTCATGGGCTCATGTCCTTCACCAG | 110 | ||
56 | Eya2 | 244-514(168) | GACAATCATATGGAGCGTGTGTTCGTGTGGGAC | 111 |
730-1542 | GAATTCTTATAAATACTCCAGCTCCAGGGCGTG | 112 |
<2-2> 활성도 및 안정성을 유지하기 위한 대량발현 조건
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 2-1에서 제조한 56개의 벡터를 대장균에 각각 형질전환 하였다.
구체적으로, CaCl2로 처리한 대장균 BL21-DE3-RIL에 실시예 2-1의 벡터들을 열충격 방법으로 각각 형질전환시킨 후, 카나마이신(kanamycin; Sigma, USA) 이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 카나마이신 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 30 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 대장균을 정지기(stationary phase) 전까지 배양하였다. 이후 배양액을 새 400 ㎖/flask의 LB 배지에 1:100의 희석비율로 접종하였고, 온도를 37℃에서 17℃까지 서서히 낮추면서 약 2 내지 3시간 동안 배양한 후, 17℃에서 200 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.5에 이르렀을 때 IPTG를 가능한 낮은 농도(0.05 ~ 0.1 mM)로 첨가하여 20 내지 16-18 시간 배양하여 PTP 활성 도메인의 발현을 유도하였다.
<2-3> 활성도 및 안정성을 유지하는 정제 및 저장 조건
실시예 2-2의 방법으로 배양한 대장균을 4℃에서 6,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 균체 침전물을 회수한 후 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 4℃에서 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 Ni-NTA 레진(Qiagen, USA)을 이용하여 4℃에서 약 3시간 동안 저농도 완충용액[20 mM Tris-HCl pH 7.5 0.2 M NaCl 1.0 mM PMSF, 4mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)]에서 고농도 완충용액[저농도 완충용액에 0.5M 이미다졸 추가로 포함(Sigma, USA)]으로 선형농도구배법을 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 N-말단의 히스티딘 태그는 프로테아제인 트롬빈(Sigma, USA)을 단백질 100 ㎍ 당 1 유닛의 트롬빈 비율로 처리하여 제거하였고, 이온교환 크로마토그래피(GE Healthcare, USA) 및 겔 여과 크로마토그래피(GE Healthcare, USA)를 이용하여 정제하였다. PTP 활성 도메인의 정제과정 중 10 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA) 또는 DTT(Promega, USA)를 완충용액에 10 mM의 농도로 계속 첨가하면서 정제하였고, 완충용액의 pH는 6.5 ~ 8.0으로 맞추었다. 상기 방법으로 정제된 PTP 활성 도메인은 10% 글리세롤을 단백질 용액[pH7.5-8.0 트리스 완충용액에 100-250 mM NaCl, 10 mM 환원제(β-머캅토에탄올 또는 DTT), 0.5~2 ㎍/㎖, 프로테아제 저해제(Sigma, USA)를 포함한 10% 글리세롤용액]에 첨가하여 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
3>
PTP
활성 도메인의
SDS
-
PAGE
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 정제 결과(단백질의 크기 및 순도)를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit)를 이용하여 측정하였다. 상기 단백질을 5ㅧSDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE겔의 웰에 1-2 ㎍을 로딩하였고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 예측되는 단백질 크기가 확인된 95% 이상의 순도로 정제된 PTP 활성 도메인을 확인하였다.
<
실시예
4>
PTP
활성 도메인의 활성 및 안정성 평가
<4-1>
DiFMUP
를 이용한 활성 측정
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 활성을 DiFMUP(Molecular probe, USA) 기질을 이용하여 측정하였다.
10mM DiFMUP(Molecular probe, USA) 현탁액을 반응 완충용액(20mM Tris-HCl pH8.0, 0.01% Triton X-100, 5mM DTT; sigma, USA)로 희석하여 최종 10 μM 기질을 0 또는 표 3에 나타난 바와 같은 최종농도로 실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인과 90분 동안 상온에서 반응한 후, 1 mM sodium orthovanadate(Sigma, USA)를 가하여 반응을 종결하였다. 상기 90분 동안 일정 시간 간격으로 상대적인 형광도(Relative Fluorescence Unit, RFU)를 victor21420 multilabel counter plate reader(Perkin Elmer, USA) 를 이용하여 흡광도 355(여기)/460(방출) ㎚에서 형광값을 측정하였고, 기질만 있을 때의 값과 비교하여 활성을 측정하였다.
PTP | 반응농도 | PTP | 반응농도 | PTP | 반응농도 |
T4 | 7.69 | pk18 | 500 | p26 | 526 |
T7 | 1.35 | T10 | 17.24 | T29 | 1219 |
T48 | 0.74 | T22 | 1.47 | T40 | 13.15 |
T8 | 8.06 | T20 | 16.13 | T2 | 658 |
T23 | 1.61 | PTP1B | 1.43 | pk4 | 588 |
T39 | 7.69 | T25 | 1.11 | pk7 | 625 |
T5 | 7.14 | T41 | 11.36 | pk9 | 781 |
T38 | 161 | T18 | 7.35 | pk10 | 625 |
T12 | 1282 | pk32 | 1.47 | T33 | 882 |
T15 | 1.16 | pk28 | 83.3 | pk12 | 1178 |
pk6 | 75 | T32 | 5.55 | pk13 | 117 |
pk14 | 625 | p12 | 52 | T27 | 526 |
pk15 | 1351 | pk17 | 2500 | T46 | 277 |
pk33 | 9522 | p16 | 156 | pk1 | 108 |
p44 | 909 | T16 | 2083 | T47 | 91 |
p21 | 147 | p18 | 588 | T45 | 543 |
pk35 | 119 | NE3 | 580 | pk8 | 1250 |
NE1 | 300 | pk3 | 2631 | ||
p19 | 119 | p49 | 2941 |
그 결과, 도 7의 반응성 포화곡선(reaction saturation curve)에 나타난 바와 같이, 정제된 PTP는 정상적인 효소의 성질인 기질 분해성과 시간이 지남에 따라 반응성 포화(saturation)를 형성하는 것을 관찰할 수 있었고 반응성 포화가 20-30분 안에 일어나 실제 저해제 탐색 등 실험에 용이한 시간대임을 확인하였다.
<4-2> 상온 및 저온에서의 저장 후 활성 평가
실시예 2의 방법으로 수득한 PTP 활성 도메인의 안정성을 측정하였다.
실시예 4-1의 방법으로 측정한 활성과 상온에서 다양한 시간 또는 저온(4℃)에서 다양한 농도로 다양한 시간 동안 보관 후 실시예 4-1의 방법과 동일하게 측정한 활성과 비교하였다. 반응 단백질의 농도 및 반응시간은 기질에 대해 서로 다르게 결정되므로 일정하지 않으나, 일반적으로 기질이 전부 반응생성물로 되지 않는 농도로 단백질의 농도를 정하였고, 도 7에서 확인한 바와 같이 일정농도의 단백질이 기질과 반응하여 반응생성물이 더 이상 생성되지 않는 시간이 약 20 내지 30분 사이가 되도록 반응 조건을 조절하였다.
그 결과, 상온에서 6시간 정도는 활성도가 일정하게 유지되었고, 저온 보관시 0.5 ~ 1.0 ㎎/㎖ 농도로 약 2주 정도 보관하여도 활성을 유지하였다.
도 1은 PTP 단백질의 활성 도메인 삼차구조를 나타낸다(PTP1B: 맨 처음 정제되고 특성이 확인된 PTP).
도 2는 PTP 활성 도메인을 삽입한 발현벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 3은 Clustal X 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 서로 정렬한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(http://pbil.ibcp.fr/)를 이용하여 이차구조를 예측한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 ExPASy 서버를 이용한 아미노산 서열의 친수성/소수성 예측한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 순수 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 DiFMUP를 이용한 PTP 활성 도메인(PTP1B)의 활성측정 결과를 나타낸 도이다(원: 기질만 있는 경우, 네모: PTP1B).
도 8은 프로테아제 처리 방법에 의한 안정한 도메인(T38) 설계를 나타낸 도이다(화살표 A: 프로테아제 처리전 불안정한 도메인의 위치, 화살표 B: 프로테아제 처리후 안정한 도메인의 위치):
레인 1: 프로테아제를 처리하지 않은 T38; 및,
레인 2 내지 13: 프로테아제 농도를 증가시키면서 처리한 T38.
도 9는 재설계 도메인[pk7(MKP2)]의 용해도 및 안정성 측정 결과를 나타낸 도이다(화살표: 전장 pk7의 위치).
a: 전장 pk7의 용해도 및 안정성 결과; 및,
(레인 1, 3, 4 및 6: 표준레인[pk7의 위치 확인용] ; 레인 2 및 5: 세포파쇄 후 상등액)
b: 재설계 도메인 pk7의 용해도 및 안정성 결과:
(레인 1, 3, 5, 6 및 8: 표준 레인; 레인 2: 마커; 레인 4 및 7: 세포파쇄 후 상등액).
<110> Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Method for large scale preparation of the active domain of human
protein tyrosine phosphatase without fusion protein
<130> 7P-10-50
<160> 168
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T4 Forward primer
<400> 1
cgcgacgcta gcatggcaga cgacaataag ctcttc 36
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T4 Reverse primer
<400> 2
gctgcgaagc tttacttgaa gttggcataa tctga 35
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Forward primer
<400> 3
ggcacccata tgctagtggc tgttgttgcc ttattg 36
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 Reverse primer
<400> 4
gcgggatcct caatgccttg aatagactgg atc 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T48 Forward primer
<400> 5
gccccacata tgcgagacca cccacccatc ccc 33
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T48 Reverse primer
<400> 6
ggaagatctc tacgttgcat agtggtcaaa gctgcc 36
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T8 Forward primer
<400> 7
gcgccatatg gcagacaagt accagcaact ctccctg 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T8 Reverse primer
<400> 8
gcgcggatcc ctcggctggg gcctgggctg actgttg 37
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T23 Forward primer
<400> 9
ccgttacata tggtggagaa ttttgaggcc tacttc 36
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T23 Reverse primer
<400> 10
cccgaattct taggcgatgt aaccattggt ctttc 35
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T39 Forward primer
<400> 11
cacattgcta gcatgaagac atcagacagc tatggg 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T39 Reverse primer
<400> 12
cggctcaagc ttctaagatg attccaggta ctccaa 36
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T5 Forward primer
<400> 13
gcccaccata tggccagcga taccagcagc ctg 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T5 Reverse primer
<400> 14
gcgagatctt cagccagaat tcaagtattc cag 33
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T38 Forward primer
<400> 15
gaccggcata tgcttgccaa ggagtggcag gccctc 36
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T38 Reverse primer
<400> 16
ccgggatcct cactggggca gggccttgag gat 33
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T12 Forward primer
<400> 17
cgccagcata tggccacgcg gccaccagac cga 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T12 Reverse primer
<400> 18
gcgggatcct cactggggaa gggccttgag gat 33
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T15 Forward primer
<400> 19
gagcatgcta gcatggctag ggagtgtgga gctggt 36
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T15 Reverse primer
<400> 20
gcgggatccc taggacttgc taacattctc gtatat 36
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T10 Forward primer
<400> 21
cctttccata tgaagcccat aggacttcaa gagagaag 38
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T10 Reverse primer
<400> 22
gacagtaagc tttcaaagtc tgctctcata caggcaca 38
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T22 Forward primer
<400> 23
cgcgaacata tgcttagcca cccgccaatt ccc 33
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T22 Reverse primer
<400> 24
ggcggatcct cagcccacgg cctccagcag ggcctc 36
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T20 Forward primer
<400> 25
ttcgctagcg ccatccgggt ggctgacttg 30
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T20 Reverse primer
<400> 26
gcgggatccc taaaaggagc ttaaatattc cagtgcca 38
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTP1B Forward primer
<400> 27
atggagatgg aaaaggagtt cgagcagatc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTP1B Reverse primer
<400> 28
gtcaacatgt gcgtggctac ggtcctcacg 30
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T25 Forward primer
<400> 29
gctcccgcta gcatgcccac catcgagcgg gag 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T25 Reverse primer
<400> 30
cgcggatcct taggtgtctg tcaatcttgg cct 33
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T41 Forward primer
<400> 31
tcagagcata tggaggagaa gatcgaggat gac 33
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T41 Reverse primer
<400> 32
gtggacgcta gcatgaaata tttgggcagt cccatt 36
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T18 Forward primer
<400> 33
gccccccata tggtgaggtg gtttcaccga gac 33
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T18 Reverse primer
<400> 34
ccggaattct cacttcctct tgagggaacc cttg 34
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk32 Forward primer
<400> 35
gaaccccata tgtctgtgaa cacaccccgg gaggtc 36
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk32 Reverse primer
<400> 36
cgggatcctc aggggctggg ttcctcaggc ag 32
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk28 Forward primer
<400> 37
ccgcggcata tggaacatca cgggcaatta aaa 33
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk28 Reverse primer
<400> 38
cgggatcctc acctgcagtg caccacgacc gg 32
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T32 Forward primer
<400> 39
gcagtacata tgaatgggaa gttatcagaa gag 33
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T32 Reverse primer
<400> 40
ggcggatcct cacttcagaa gctgaggctg ctgttttt 38
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T40 Forward primer
<400> 41
gagcagcata tggcaggcct ggaggcacag aag 33
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T40 Reverse primer
<400> 42
cgcggatcct taaatgagtc tggagttttg gag 33
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2 Forward primer
<400> 43
ctagggcata tgaaaaagac tcgagtagat gca 33
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2 Reverse primer
<400> 44
cgcggatcct tagatgagcc tggagctttt cag 33
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk4 Forward primer
<400> 45
aggccgcata tggtcatgga agtgggcacc ctg 33
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk4 Reverse primer
<400> 46
ggcggatcct cagctcccag cctctgccga acag 34
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk7 Forward primer
<400> 47
gttcatatga gtgccacaga gcccttggac 30
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk7 Reverse primer
<400> 48
gcgggatcct caggacgtgg ccagcacctg ggactc 36
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk8 Forward primer
<400> 49
gcggaccata tgggcccagt tgaaatcctt cccttc 36
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk8 Reverse primer
<400> 50
gcgagatctt cacgtggagg gcaggatctc agattcg 37
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk9 Forward primer
<400> 51
ggcagccata tgtccttccc agtggagatc ttgccc 36
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk9 Reverse primer
<400> 52
cgcggatcct cagctgagtc ccagcgtcct ctcgaa 36
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk10 Forward primer
<400> 53
gctggccata tgttgcgccg cctgcgcaag ggc 33
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk10 Reverse primer
<400> 54
cgggatcctc acgtggactc cagcgtattg ag 32
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T33 Forward primer
<400> 55
tgcccccata tggctgggga ccggctcccg agg 33
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T33 Reverse primer
<400> 56
gcgggatcct catgaggggg tgcccgggtc gccctg 36
<210> 57
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk12 Forward primer
<400> 57
cgatcgcata tggagggtct gggccgctcg tg 32
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk12 Reverse primer
<400> 58
cgggatccct aggtgggggc cagctcgaag g 31
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk13 Forward primer
<400> 59
ctggaccata tgcagcggct gaacatcggc tac 33
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk13 Reverse primer
<400> 60
cgggatcctc acacaaccgt ctccactccc atc 33
<210> 61
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T27 Forward primer
<400> 61
gttgcccata tggggccaac ccgaattctt c 31
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T27 Reverse primer
<400> 62
ggatccttat gatgctccag tctggttc 28
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk6 Forward primer
<400> 63
gccgcccata tgtcgggctc gttcgagctc tcg 33
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk6 Reverse primer
<400> 64
cgggatccct agggtttcaa cttcccctcc 30
<210> 65
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk14 Forward primer
<400> 65
gccaagcata tgggcggaaa ccacatcccc gaaagg 36
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk14 Reverse primer
<400> 66
gcgggatcct caggaattcc aattctttct gatagg 36
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk15 Forward primer
<400> 67
agcgcccata tggtcagctg tgccgggcag atgctg 36
<210> 68
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk15 Reverse primer
<400> 68
cgggatcctc atatttttcc tgtttgtgat cc 32
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk33 Forward primer
<400> 69
ggctggcata tggctgagac ctctctccca gag 33
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk33 Reverse primer
<400> 70
cgggatcctc agctctggcc ggcaccccgc 30
<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p44 Forward primer
<400> 71
tcccaccata tggactcact gcagaagcag gac 33
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p44 Reverse primer
<400> 72
gccaagggtc agggatcctg gctg 24
<210> 73
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p21 Forward primer
<400> 73
cccgggcata tgggcaatgg catgaccaag gtac 34
<210> 74
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p21 Reverse primer
<400> 74
gcgggatcct cacttgccgc ccttgcggga cag 33
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk35 Forward primer
<400> 75
gcgggatcct cacttgccgc ccttgcggga cag 33
<210> 76
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk35 Reverse primer
<400> 76
cgggatcctc acagtggaat catcaaacgg ac 32
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NE1 Forward primer
<400> 77
ccaggggcta gccgctaact ggaaagaaaa 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NE1 Reverse primer
<400> 78
gtcggatcct tagctttctt tgccctcttg 30
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p19 Forward primer
<400> 79
atgacagcat ccgcgtcctc cttttc 26
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p19 Reverse primer
<400> 80
ttacattgat atcatcatac gtag 24
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk18 Forward primer
<400> 81
gcagcccata tggggaatgg gatgaacaag atc 33
<210> 82
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk18 Reverse primer
<400> 82
cgggatcctt acagtcttct gagaaaggcc cag 33
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p12 Forward primer
<400> 83
gggaagcata tgggtcgggc gcaccgggac tgg 33
<210> 84
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p12 Reverse primer
<400> 84
ggcaccaagc tttcagaact ctttaagaac atccagct 38
<210> 85
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk17 Forward primer
<400> 85
ctggagcata tgccaaccgt tcaacatcct ttcc 34
<210> 86
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk17 Reverse primer
<400> 86
gcgggatcct catgcttcca gaccctgccg cagc 34
<210> 87
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p16 Forward primer
<400> 87
gcggcggcta gcatgggcgt gcagcccccc aacttc 36
<210> 88
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p16 Reverse primer
<400> 88
cgcgcctcga gtttcgttcg ctggtagaac tggaa 35
<210> 89
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T16 Forward primer
<400> 89
ggcggcgcta gcatggctca caacaagatc ccgccg 36
<210> 90
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T16 Reverse primer
<400> 90
tgaggatcct tatgattcct tctttccatc ctcatc 36
<210> 91
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p18 Forward primer
<400> 91
ccgggacata tggacaagcc ctcccttatc ttc 33
<210> 92
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p18 Reverse primer
<400> 92
gcgggatcct cagcttgcat ccaagatgcc ttc 33
<210> 93
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NE3 Forward primer
<400> 93
cttggtcata tggatagccc tacacagata tttg 34
<210> 94
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NE3 Reverse primer
<400> 94
gcgggatcct caccttgcca gcaagatccc ctg 33
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk3 Forward primer
<400> 95
gcggctcata tgaaccgccc agctcctgtg gaa 33
<210> 96
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk3 Reverse primer
<400> 96
gcgggatcct caggaatctt tgaaacgcag ccgcat 36
<210> 97
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p49 Forward primer
<400> 97
cgccgagcta gcatgcgttt tctgataact cacaac 36
<210> 98
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p49 Reverse primer
<400> 98
cgggatccct actgaacaca gcaatgccca ttg 33
<210> 99
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p26 Forward primer
<400> 99
gcgacccata tggccccggt ggaggtgagc taca 34
<210> 100
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p26 Reverse primer
<400> 100
cgcggatcct caggtcttgt gcgtgtgtgg gtctttg 37
<210> 101
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T29 Forward primer
<400> 101
ggcggccata tgtcgtcgac ctcgccgggt gtgaag 36
<210> 102
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T29 Reverse primer
<400> 102
gccggatcct tatttggaga aggctgctct gtgttgtc 38
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T46 Forward primer
<400> 103
atggcggaac aggctaccaa gtccgtg 27
<210> 104
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T46 Reverse primer
<400> 104
tcagtgggcc ttctccaaga acgctctgc 29
<210> 105
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk1 Forward primer
<400> 105
gctctagact tataggagac ttctccaagg g 31
<210> 106
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk1 Reverse primer
<400> 106
gccctaggtc agagcttctt cagacgactg tac 33
<210> 107
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T47 Forward primer
<400> 107
gaccaccata tgctgattgg agattactct aaggcc 36
<210> 108
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T47 Reverse primer
<400> 108
ccgggatcct cactggtcct gcagccggct aca 33
<210> 109
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T45 Forward primer
<400> 109
gattctgcta gcgggcacct gattggtgat ttttcc 36
<210> 110
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T45 Reverse primer
<400> 110
ccgggatcct catgggctca tgtccttcac cag 33
<210> 111
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Eya2 Forward primer
<400> 111
gacaatcata tggagcgtgt gttcgtgtgg gac 33
<210> 112
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Eya2 Reverse primer
<400> 112
gaattcttat aaatactcca gctccagggc gtg 33
<210> 113
<211> 569
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T4
<400> 113
Met Ala Asp Asp Asn Lys Leu Phe Arg Glu Glu Phe Asn Ala Leu Pro
1 5 10 15
Ala Cys Pro Ile Gln Ala Thr Cys Glu Ala Ala Ser Lys Glu Glu Asn
20 25 30
Lys Glu Lys Asn Arg Tyr Val Asn Ile Leu Pro Tyr Asp His Ser Arg
35 40 45
Val His Leu Thr Pro Val Glu Gly Val Pro Asp Ser Asp Tyr Ile Asn
50 55 60
Ala Ser Phe Ile Asn Gly Tyr Gln Glu Lys Asn Lys Phe Ile Ala Ala
65 70 75 80
Gln Gly Pro Lys Glu Glu Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp
85 90 95
Glu Gln Asn Thr Ala Thr Ile Val Met Val Thr Asn Leu Lys Glu Arg
100 105 110
Lys Glu Cys Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro Asp Gln Gly Cys Trp Thr
115 120 125
Tyr Gly Asn Ile Arg Val Ser Val Glu Asp Val Thr Val Leu Val Asp
130 135 140
Tyr Thr Val Arg Lys Phe Cys Ile Gln Gln Val Gly Asp Met Thr Asn
145 150 155 160
Arg Lys Pro Gln Arg Leu Ile Thr Gln Phe His Phe Thr Ser Trp Pro
165 170 175
Asp Phe Gly Val Pro Phe Thr Pro Ile Gly Met Leu Lys Phe Leu Lys
180 185 190
Lys Val Lys Ala Cys Asn Pro Gln Tyr Ala Gly Ala Ile Val Val His
195 200 205
Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Val Val Ile Asp Ala
210 215 220
Met Leu Asp Met Met His Thr Glu Arg Lys Val Asp Val Tyr Gly Phe
225 230 235 240
Val Ser Arg Ile Arg Ala Gln Arg Cys Gln Met Val Gln Thr Asp Met
245 250 255
Gln Tyr Val Phe Ile Tyr Gln Ala Leu Leu Glu His Tyr Leu Tyr Gly
260 265 270
Asp Thr Glu Leu Glu Val Thr Ser Leu Glu Thr His Leu Gln Lys Ile
275 280 285
Tyr Asn Lys Ile Pro Gly Thr Ser Asn Asn Gly Leu Glu Glu Glu Phe
290 295 300
Lys Lys Leu Thr Ser Ile Lys Ile Gln Asn Asp Lys Met Arg Thr Gly
305 310 315 320
Asn Leu Pro Ala Asn Met Lys Lys Asn Arg Val Leu Gln Ile Ile Pro
325 330 335
Tyr Glu Phe Asn Arg Val Ile Ile Pro Val Lys Arg Gly Glu Glu Asn
340 345 350
Thr Asp Tyr Val Asn Ala Ser Phe Ile Asp Gly Tyr Arg Gln Lys Asp
355 360 365
Ser Tyr Ile Ala Ser Gln Gly Pro Leu Leu His Thr Ile Glu Asp Phe
370 375 380
Trp Arg Met Ile Trp Glu Trp Lys Ser Cys Ser Ile Val Met Leu Thr
385 390 395 400
Glu Leu Glu Glu Arg Gly Gln Glu Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro Ser
405 410 415
Asp Gly Leu Val Ser Tyr Gly Asp Ile Thr Val Glu Leu Lys Lys Glu
420 425 430
Glu Glu Cys Glu Ser Tyr Thr Val Arg Asp Leu Leu Val Thr Asn Thr
435 440 445
Arg Glu Asn Lys Ser Arg Gln Ile Arg Gln Phe His Phe His Gly Trp
450 455 460
Pro Glu Val Gly Ile Pro Ser Asp Gly Lys Gly Met Ile Ser Ile Ile
465 470 475 480
Ala Ala Val Gln Lys Gln Gln Gln Gln Ser Gly Asn His Pro Ile Thr
485 490 495
Val His Cys Ser Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Phe Cys Ala Leu
500 505 510
Ser Thr Val Leu Glu Arg Val Lys Ala Glu Gly Ile Leu Asp Val Phe
515 520 525
Gln Thr Val Lys Ser Leu Arg Leu Gln Arg Pro His Met Val Gln Thr
530 535 540
Leu Glu Gln Tyr Glu Phe Cys Tyr Lys Val Val Gln Glu Tyr Ile Asp
545 550 555 560
Ala Phe Ser Asp Tyr Ala Asn Phe Lys
565
<210> 114
<211> 284
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7
<400> 114
Lys Ile Asn Gln Phe Glu Gly His Phe Met Lys Leu Gln Ala Asp Ser
1 5 10 15
Asn Tyr Leu Leu Ser Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Val Gly Arg
20 25 30
Asn Gln Ser Cys Asp Ile Ala Leu Leu Pro Glu Asn Arg Gly Lys Asn
35 40 45
Arg Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Tyr Asp Ala Thr Arg Val Lys Leu Ser
50 55 60
Asn Val Asp Asp Asp Pro Cys Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Gly Asn Asn Phe Arg Arg Glu Tyr Ile Val Thr Gln Gly Pro Leu
85 90 95
Pro Gly Thr Lys Asp Asp Phe Trp Lys Met Val Trp Glu Gln Asn Val
100 105 110
His Asn Ile Val Met Val Thr Gln Cys Val Glu Lys Gly Arg Val Lys
115 120 125
Cys Asp His Tyr Trp Pro Ala Asp Gln Asp Ser Leu Tyr Tyr Gly Asp
130 135 140
Leu Ile Leu Gln Met Leu Ser Glu Ser Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile
145 150 155 160
Arg Glu Phe Lys Ile Cys Gly Glu Glu Gln Leu Asp Ala His Arg Leu
165 170 175
Ile Arg His Phe His Tyr Thr Val Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu
180 185 190
Thr Thr Gln Ser Leu Ile Gln Phe Val Arg Thr Val Arg Asp Tyr Ile
195 200 205
Asn Arg Ser Pro Gly Ala Gly Pro Thr Val Val His Cys Ser Ala Gly
210 215 220
Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Leu Asp Arg Ile Leu Gln Gln
225 230 235 240
Leu Asp Ser Lys Asp Ser Val Asp Ile Tyr Gly Ala Val His Asp Leu
245 250 255
Arg Leu His Arg Val His Met Val Gln Thr Glu Cys Gln Tyr Val Tyr
260 265 270
Leu His Gln Cys Val Arg Asp Val Leu Arg Ala Arg
275 280
<210> 115
<211> 582
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T48
<400> 115
Gly Arg Ile Val Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Arg Ser Tyr Gln Phe Asn
1 5 10 15
Val Lys Thr Val Ser Gly Asp Ser Trp Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Ile
20 25 30
Phe Gly Ser Val Arg Thr Lys Pro Asp Lys Ile Gln Asn Leu His Cys
35 40 45
Arg Pro Gln Asn Ser Thr Ala Ile Ala Cys Ser Trp Ile Pro Pro Asp
50 55 60
Ser Asp Phe Asp Gly Tyr Ser Ile Glu Cys Arg Lys Met Asp Thr Gln
65 70 75 80
Glu Val Glu Phe Ser Arg Lys Leu Glu Lys Glu Lys Ser Leu Leu Asn
85 90 95
Ile Met Met Leu Val Pro His Lys Arg Tyr Leu Val Ser Ile Lys Val
100 105 110
Gln Ser Ala Gly Met Thr Ser Glu Val Val Glu Asp Ser Thr Ile Thr
115 120 125
Met Ile Asp Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ile Arg Val Asn Glu
130 135 140
Lys Asp Val Leu Ile Ser Lys Ser Ser Ile Asn Phe Thr Val Asn Cys
145 150 155 160
Ser Trp Phe Ser Asp Thr Asn Gly Ala Val Lys Tyr Phe Thr Val Val
165 170 175
Val Arg Glu Ala Asp Gly Ser Asp Glu Leu Lys Pro Glu Gln Gln His
180 185 190
Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Glu Tyr Arg His Asn Ala Ser Ile Arg Val
195 200 205
Tyr Gln Thr Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Cys Ala Glu Asn Pro Asn Ser
210 215 220
Asn Ser Lys Ser Phe Asn Ile Lys Leu Gly Ala Glu Met Glu Ser Leu
225 230 235 240
Gly Gly Lys Arg Asp Pro Thr Gln Gln Lys Phe Cys Asp Gly Pro Leu
245 250 255
Lys Pro His Thr Ala Tyr Arg Ile Ser Ile Arg Ala Phe Thr Gln Leu
260 265 270
Phe Asp Glu Asp Leu Lys Glu Phe Thr Lys Pro Leu Tyr Ser Asp Thr
275 280 285
Phe Phe Ser Leu Pro Ile Thr Thr Glu Ser Glu Pro Leu Phe Gly Ala
290 295 300
Ile Glu Gly Val Ser Ala Gly Leu Phe Leu Ile Gly Met Leu Val Ala
305 310 315 320
Val Val Ala Leu Leu Ile Cys Arg Gln Lys Val Ser His Gly Arg Glu
325 330 335
Arg Pro Ser Ala Arg Leu Ser Ile Arg Arg Asp Arg Pro Leu Ser Val
340 345 350
His Leu Asn Leu Gly Gln Lys Gly Asn Arg Lys Thr Ser Cys Pro Ile
355 360 365
Lys Ile Asn Gln Phe Glu Gly His Phe Met Lys Leu Gln Ala Asp Ser
370 375 380
Asn Tyr Leu Leu Ser Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Val Gly Arg
385 390 395 400
Asn Gln Ser Cys Asp Ile Ala Leu Leu Pro Glu Asn Arg Gly Lys Asn
405 410 415
Arg Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Tyr Asp Ala Thr Arg Val Lys Leu Ser
420 425 430
Asn Val Asp Asp Asp Pro Cys Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile
435 440 445
Pro Gly Asn Asn Phe Arg Arg Glu Tyr Ile Val Thr Gln Gly Pro Leu
450 455 460
Pro Gly Thr Lys Asp Asp Phe Trp Lys Met Val Trp Glu Gln Asn Val
465 470 475 480
His Asn Ile Val Met Val Thr Gln Cys Val Glu Lys Gly Arg Val Lys
485 490 495
Cys Asp His Tyr Trp Pro Ala Asp Gln Asp Ser Leu Tyr Tyr Gly Asp
500 505 510
Leu Ile Leu Gln Met Leu Ser Glu Ser Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile
515 520 525
Arg Glu Phe Lys Ile Cys Gly Glu Glu Gln Leu Asp Ala His Arg Leu
530 535 540
Ile Arg His Phe His Tyr Thr Val Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu
545 550 555 560
Thr Thr Gln Ser Leu Ile Gln Phe Val Arg Thr Val Arg Asp Tyr Ile
565 570 575
Asn Arg Ser Pro Gly Ala
580
<210> 116
<211> 269
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T8
<400> 116
Pro Val Lys Asp Leu Thr Leu Arg Asn Arg Ser Thr Glu Asp Leu His
1 5 10 15
Val Thr Trp Ser Gly Ala Asn Gly Asp Val Asp Gln Tyr Glu Ile Gln
20 25 30
Leu Leu Phe Asn Asp Met Lys Val Phe Pro Pro Phe His Leu Val Asn
35 40 45
Thr Ala Thr Glu Tyr Arg Phe Thr Ser Leu Thr Pro Gly Arg Gln Tyr
50 55 60
Lys Ile Leu Val Leu Thr Ile Ser Gly Asp Val Gln Gln Ser Ala Phe
65 70 75 80
Ile Glu Gly Phe Thr Val Pro Ser Ala Val Lys Asn Ile His Ile Ser
85 90 95
Pro Asn Gly Ala Thr Asp Ser Leu Thr Val Asn Trp Thr Pro Gly Gly
100 105 110
Gly Asp Val Asp Ser Tyr Thr Val Ser Ala Phe Arg His Ser Gln Lys
115 120 125
Val Asp Ser Gln Thr Ile Pro Lys His Val Phe Glu His Thr Phe His
130 135 140
Arg Leu Glu Ala Gly Glu Gln Tyr Gln Ile Met Ile Ala Ser Val Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Lys Asn Gln Ile Asn Val Val Gly Arg Thr Val Pro Ala
165 170 175
Ser Val Gln Gly Val Ile Ala Asp Asn Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Leu
180 185 190
Ile Val Ser Trp Gln Lys Ala Ala Gly Val Ala Glu Arg Tyr Asp Ile
195 200 205
Leu Leu Leu Thr Glu Asn Gly Ile Leu Leu Arg Asn Thr Ser Glu Pro
210 215 220
Ala Thr Thr Lys Gln His Lys Phe Glu Asp Leu Thr Pro Gly Lys Lys
225 230 235 240
Tyr Lys Ile Gln Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Leu Phe Ser Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Thr Glu Gly Arg Thr Val Pro Ala Ala Val Thr
260 265
<210> 117
<211> 312
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T23
<400> 117
Glu Asn Phe Glu Ala Tyr Phe Lys Lys Gln Gln Ala Asp Ser Asn Cys
1 5 10 15
Gly Phe Ala Glu Glu Tyr Glu Asp Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser Gln
20 25 30
Pro Lys Tyr Ala Ala Glu Leu Ala Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg Tyr
35 40 45
Asn Asn Val Leu Pro Tyr Asp Ile Ser Arg Val Lys Leu Ser Val Gln
50 55 60
Thr His Ser Thr Asp Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Met Pro Gly Tyr
65 70 75 80
His Ser Lys Lys Asp Phe Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr
85 90 95
Leu Lys Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Lys Asn Val Tyr Ala Ile
100 105 110
Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu Gln Gly Arg Thr Lys Cys Glu Glu
115 120 125
Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln Asp Tyr Gly Asp Ile Thr Val Ala
130 135 140
Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro Glu Trp Thr Ile Arg Asp Phe Thr
145 150 155 160
Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser Glu Ser His Pro Leu Arg Gln Phe His
165 170 175
Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu Leu
180 185 190
Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro Pro
195 200 205
Glu Ser Pro Ile Leu Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly
210 215 220
Thr Phe Ile Ala Ile Asp Arg Leu Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Asn
225 230 235 240
Thr Val Asp Val Tyr Gly Ile Val Tyr Asp Leu Arg Met His Arg Pro
245 250 255
Leu Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys Val
260 265 270
Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile Tyr
275 280 285
Gln Asn Thr Thr Ala Met Thr Ile Tyr Glu Asn Leu Ala Pro Val Thr
290 295 300
Thr Phe Gly Lys Thr Asn Gly Tyr
305 310
<210> 118
<211> 561
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T39
<400> 118
Met Lys Thr Ser Asp Ser Tyr Gly Phe Lys Glu Glu Tyr Glu Ser Phe
1 5 10 15
Phe Glu Gly Gln Ser Ala Ser Trp Asp Val Ala Lys Lys Asp Gln Asn
20 25 30
Arg Ala Lys Asn Arg Tyr Gly Asn Ile Ile Ala Tyr Asp His Ser Arg
35 40 45
Val Ile Leu Gln Pro Val Glu Asp Asp Pro Ser Ser Asp Tyr Ile Asn
50 55 60
Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr Gln Arg Pro Ser His Tyr Ile Ala Thr
65 70 75 80
Gln Gly Pro Val His Glu Thr Val Tyr Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp
85 90 95
Gln Glu Gln Ser Ala Cys Ile Val Met Val Thr Asn Leu Val Glu Val
100 105 110
Gly Arg Val Lys Cys Tyr Lys Tyr Trp Pro Asp Asp Thr Glu Val Tyr
115 120 125
Gly Asp Phe Lys Val Thr Cys Val Glu Met Glu Pro Leu Ala Glu Tyr
130 135 140
Val Val Arg Thr Phe Thr Leu Glu Arg Arg Gly Tyr Asn Glu Ile Arg
145 150 155 160
Glu Val Lys Gln Phe His Phe Thr Gly Trp Pro Asp His Gly Val Pro
165 170 175
Tyr His Ala Thr Gly Leu Leu Ser Phe Ile Arg Arg Val Lys Leu Ser
180 185 190
Asn Pro Pro Ser Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Ala
195 200 205
Gly Arg Thr Gly Cys Tyr Ile Val Ile Asp Ile Met Leu Asp Met Ala
210 215 220
Glu Arg Glu Gly Val Val Asp Ile Tyr Asn Cys Val Lys Ala Leu Arg
225 230 235 240
Ser Arg Arg Ile Asn Met Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Ile Phe Ile
245 250 255
His Asp Ala Ile Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Glu Thr Ala Ile Pro
260 265 270
Val Cys Glu Phe Lys Ala Ala Tyr Phe Asp Met Ile Arg Ile Asp Ser
275 280 285
Gln Thr Asn Ser Ser His Leu Lys Asp Glu Phe Gln Thr Leu Asn Ser
290 295 300
Val Thr Pro Arg Leu Gln Ala Glu Asp Cys Ser Ile Ala Cys Leu Pro
305 310 315 320
Arg Asn His Asp Lys Asn Arg Phe Met Asp Met Leu Pro Pro Asp Arg
325 330 335
Cys Leu Pro Phe Leu Ile Thr Ile Asp Gly Glu Ser Ser Asn Tyr Ile
340 345 350
Asn Ala Ala Leu Met Asp Ser Tyr Arg Gln Pro Ala Ala Phe Ile Val
355 360 365
Thr Gln Tyr Pro Leu Pro Asn Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg Leu Val
370 375 380
Tyr Asp Tyr Gly Cys Thr Ser Ile Val Met Leu Asn Glu Val Asp Leu
385 390 395 400
Ser Gln Gly Cys Pro Gln Tyr Trp Pro Glu Glu Gly Met Leu Arg Tyr
405 410 415
Gly Pro Ile Gln Val Glu Cys Met Ser Cys Ser Met Asp Cys Asp Val
420 425 430
Ile Asn Arg Ile Phe Arg Ile Cys Asn Leu Thr Arg Pro Gln Glu Gly
435 440 445
Tyr Leu Met Val Gln Gln Phe Gln Tyr Leu Gly Trp Ala Ser His Arg
450 455 460
Glu Val Pro Gly Ser Lys Arg Ser Phe Leu Lys Leu Ile Leu Gln Val
465 470 475 480
Glu Lys Trp Gln Glu Glu Cys Glu Glu Gly Glu Gly Arg Thr Ile Ile
485 490 495
His Cys Leu Asn Gly Gly Gly Arg Ser Gly Met Phe Cys Ala Ile Gly
500 505 510
Ile Val Val Glu Met Val Lys Arg Gln Asn Val Val Asp Val Phe His
515 520 525
Ala Val Lys Thr Leu Arg Asn Ser Lys Pro Asn Met Val Glu Ala Pro
530 535 540
Glu Gln Tyr Arg Phe Cys Tyr Asp Val Ala Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
545 550 555 560
Ser
<210> 119
<211> 605
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T5
<400> 119
Met Ala Ser Asp Thr Ser Ser Leu Val Gln Ser His Thr Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Arg Glu Pro Ala Asp Val Pro Tyr Gln Thr Gly Gln Leu His Pro Ala
20 25 30
Ile Arg Val Ala Asp Leu Leu Gln His Ile Thr Gln Met Lys Cys Ala
35 40 45
Glu Gly Tyr Gly Phe Lys Glu Glu Tyr Glu Ser Phe Phe Glu Gly Gln
50 55 60
Ser Ala Pro Trp Asp Ser Ala Lys Lys Asp Glu Asn Arg Met Lys Asn
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Asn Ile Ile Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Arg Leu Gln
85 90 95
Thr Ile Glu Gly Asp Thr Asn Ser Asp Tyr Ile Asn Gly Asn Tyr Ile
100 105 110
Asp Gly Tyr His Arg Pro Asn His Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Met
115 120 125
Gln Glu Thr Ile Tyr Asp Phe Trp Arg Met Val Trp His Glu Asn Thr
130 135 140
Ala Ser Ile Ile Met Val Thr Asn Leu Val Glu Val Gly Arg Val Lys
145 150 155 160
Cys Cys Lys Tyr Trp Pro Asp Asp Thr Glu Ile Tyr Lys Asp Ile Lys
165 170 175
Val Thr Leu Ile Glu Thr Glu Leu Leu Ala Glu Tyr Val Ile Arg Thr
180 185 190
Phe Ala Val Glu Lys Arg Gly Val His Glu Ile Arg Glu Ile Arg Gln
195 200 205
Phe His Phe Thr Gly Trp Pro Asp His Gly Val Pro Tyr His Ala Thr
210 215 220
Gly Leu Leu Gly Phe Val Arg Gln Val Lys Ser Lys Ser Pro Pro Ser
225 230 235 240
Ala Gly Pro Leu Val Val His Cys Ser Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly
245 250 255
Cys Phe Ile Val Ile Asp Ile Met Leu Asp Met Ala Glu Arg Glu Gly
260 265 270
Val Val Asp Ile Tyr Asn Cys Val Arg Glu Leu Arg Ser Arg Arg Val
275 280 285
Asn Met Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Val Phe Ile His Asp Ala Ile
290 295 300
Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Asp Thr Ser Val Pro Ala Ser Gln Val
305 310 315 320
Arg Ser Leu Tyr Tyr Asp Met Asn Lys Leu Asp Pro Gln Thr Asn Ser
325 330 335
Ser Gln Ile Lys Glu Glu Phe Arg Thr Leu Asn Met Val Thr Pro Thr
340 345 350
Leu Arg Val Glu Asp Cys Ser Ile Ala Leu Leu Pro Arg Asn His Glu
355 360 365
Lys Asn Arg Cys Met Asp Ile Leu Pro Pro Asp Arg Cys Leu Pro Phe
370 375 380
Leu Ile Thr Ile Asp Gly Glu Ser Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Ala Leu
385 390 395 400
Met Asp Ser Tyr Lys Gln Pro Ser Ala Phe Ile Val Thr Gln His Pro
405 410 415
Leu Pro Asn Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg Leu Val Leu Asp Tyr His
420 425 430
Cys Thr Ser Val Val Met Leu Asn Asp Val Asp Pro Ala Gln Leu Cys
435 440 445
Pro Gln Tyr Trp Pro Glu Asn Gly Val His Arg His Gly Pro Ile Gln
450 455 460
Val Glu Phe Val Ser Ala Asp Leu Glu Glu Asp Ile Ile Ser Arg Ile
465 470 475 480
Phe Arg Ile Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Gln Asp Gly Tyr Arg Met Val
485 490 495
Gln Gln Phe Gln Phe Leu Gly Trp Pro Met Tyr Arg Asp Thr Pro Val
500 505 510
Ser Lys Arg Ser Phe Leu Lys Leu Ile Arg Gln Val Asp Lys Trp Gln
515 520 525
Glu Glu Tyr Asn Gly Gly Glu Gly Pro Thr Val Val His Cys Leu Asn
530 535 540
Gly Gly Gly Arg Ser Gly Thr Phe Cys Ala Ile Ser Ile Val Cys Glu
545 550 555 560
Met Leu Arg His Gln Arg Thr Val Asp Val Phe His Ala Val Lys Thr
565 570 575
Leu Arg Asn Asn Lys Pro Asn Met Val Asp Leu Leu Asp Gln Tyr Lys
580 585 590
Phe Cys Tyr Glu Val Ala Leu Glu Tyr Leu Asn Ser Gly
595 600 605
<210> 120
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T38
<400> 120
Leu Ala Lys Glu Trp Gln Ala Leu Cys Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn
1 5 10 15
Thr Cys Ala Thr Ala Gln Gly Glu Gly Asn Ile Lys Lys Asn Arg His
20 25 30
Pro Asp Phe Leu Pro Tyr Asp His Ala Arg Ile Lys Leu Lys Val Glu
35 40 45
Ser Ser Pro Ser Arg Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Pro Ile Ile Glu
50 55 60
His Asp Pro Arg Met Pro Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ser
65 70 75 80
His Thr Ile Ala Asp Phe Trp Gln Met Val Trp Glu Ser Gly Cys Thr
85 90 95
Val Ile Val Met Leu Thr Pro Leu Val Glu Asp Gly Val Lys Gln Cys
100 105 110
Asp Arg Tyr Trp Pro Asp Glu Gly Ala Ser Leu Tyr His Val Tyr Glu
115 120 125
Val Asn Leu Val Ser Glu His Ile Trp Cys Glu Asp Phe Leu Val Arg
130 135 140
Ser Phe Tyr Leu Lys Asn Val Gln Thr Gln Glu Thr Arg Thr Leu Thr
145 150 155 160
Gln Phe His Phe Leu Ser Trp Pro Ala Glu Gly Thr Pro Ala Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Leu Leu Asp Phe Arg Arg Lys Val Asn Lys Cys Tyr Arg Gly
180 185 190
Arg Ser Cys Pro Ile Ile Val His Cys Ser Asp Gly Ala Gly Arg Thr
195 200 205
Gly Thr Tyr Ile Leu Ile Asp Met Val Leu Asn Arg Met Ala Lys Gly
210 215 220
Val Lys Glu Ile Asp Ile Ala Ala Thr Leu Glu His Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Arg Pro Gly Leu Val Arg Ser Lys Asp Gln Phe Glu Phe Ala Leu Thr
245 250 255
Ala Val Ala Glu Glu Val Asn Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro
260 265 270
<210> 121
<211> 342
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T12
<400> 121
Met Ala Thr Arg Pro Pro Asp Arg Pro Glu Gly Pro His Thr Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser Ser Val Ser Ser Gln Phe Ser Asp Gly Pro Ile Pro Ser Pro
20 25 30
Ser Ala Arg Ser Ser Ala Ser Ser Trp Ser Glu Glu Pro Val Gln Ser
35 40 45
Asn Met Asp Ile Ser Thr Gly His Met Ile Leu Ser Tyr Met Glu Asp
50 55 60
His Leu Lys Asn Lys Asn Arg Leu Glu Lys Glu Trp Glu Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ala Tyr Gln Ala Glu Pro Asn Ser Ser Phe Val Ala Gln Arg Glu Glu
85 90 95
Asn Val Pro Lys Asn Arg Ser Leu Ala Val Leu Thr Tyr Asp His Ser
100 105 110
Arg Val Leu Leu Lys Ala Glu Asn Ser His Ser His Ser Asp Tyr Ile
115 120 125
Asn Ala Ser Pro Ile Met Asp His Asp Pro Arg Asn Pro Ala Tyr Ile
130 135 140
Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Ala Thr Val Ala Asp Phe Trp Gln Met
145 150 155 160
Val Trp Glu Ser Gly Cys Val Val Ile Val Met Leu Thr Pro Leu Ala
165 170 175
Glu Asn Gly Val Arg Gln Cys Tyr His Tyr Trp Pro Asp Glu Gly Ser
180 185 190
Asn Leu Tyr His Ile Tyr Glu Val Asn Leu Val Ser Glu His Ile Trp
195 200 205
Cys Glu Asp Phe Leu Val Arg Ser Phe Tyr Leu Lys Asn Leu Gln Thr
210 215 220
Asn Glu Thr Arg Thr Val Thr Gln Phe His Phe Leu Ser Trp Tyr Asp
225 230 235 240
Arg Gly Val Pro Ser Ser Ser Arg Ser Leu Leu Asp Phe Arg Arg Lys
245 250 255
Val Asn Lys Cys Tyr Arg Gly Arg Ser Cys Pro Ile Ile Val His Cys
260 265 270
Ser Asp Gly Ala Gly Arg Ser Gly Thr Tyr Val Leu Ile Asp Met Val
275 280 285
Leu Asn Lys Met Ala Lys Gly Ala Lys Glu Ile Asp Ile Ala Ala Thr
290 295 300
Leu Glu His Leu Arg Asp Gln Arg Pro Gly Met Val Gln Thr Lys Glu
305 310 315 320
Gln Phe Glu Phe Ala Leu Thr Ala Val Ala Glu Glu Val Asn Ala Ile
325 330 335
Leu Lys Ala Leu Pro Gln
340
<210> 122
<211> 366
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T15
<400> 122
Met Ala Arg Glu Cys Gly Ala Gly Thr Phe Val Asn Phe Ala Ser Leu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Gly Lys Leu Pro Tyr Asn Trp Arg Arg Ser Ile Phe Ala
20 25 30
Phe Leu Thr Leu Leu Pro Ser Cys Leu Trp Thr Asp Tyr Leu Leu Ala
35 40 45
Phe Tyr Ile Asn Pro Trp Ser Lys Asn Gly Leu Lys Lys Arg Lys Leu
50 55 60
Thr Asn Pro Val Gln Leu Asp Asp Phe Asp Ala Tyr Ile Lys Asp Met
65 70 75 80
Ala Lys Asp Ser Asp Tyr Lys Phe Ser Leu Gln Phe Glu Glu Leu Lys
85 90 95
Leu Ile Gly Leu Asp Ile Pro His Phe Ala Ala Asp Leu Pro Leu Asn
100 105 110
Arg Cys Lys Asn Arg Tyr Thr Asn Ile Leu Pro Tyr Asp Phe Ser Arg
115 120 125
Val Arg Leu Val Ser Met Asn Glu Glu Glu Gly Ala Asp Tyr Ile Asn
130 135 140
Ala Asn Tyr Ile Pro Gly Tyr Asn Ser Pro Gln Glu Tyr Ile Ala Thr
145 150 155 160
Gln Gly Pro Leu Pro Glu Thr Arg Asn Asp Phe Trp Lys Met Val Leu
165 170 175
Gln Gln Lys Ser Gln Ile Ile Val Met Leu Thr Gln Cys Asn Glu Lys
180 185 190
Arg Arg Val Lys Cys Asp His Tyr Trp Pro Phe Thr Glu Glu Pro Ile
195 200 205
Ala Tyr Gly Asp Ile Thr Val Glu Met Ile Ser Glu Glu Glu Gln Asp
210 215 220
Asp Trp Ala Cys Arg His Phe Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Glu Met Gln
225 230 235 240
Asp Val Met His Phe Asn Tyr Thr Ala Trp Pro Asp His Gly Val Pro
245 250 255
Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ser Ile Leu Gln Phe Val His Met Val Arg
260 265 270
Gln Gln Ala Thr Lys Ser Lys Gly Pro Met Ile Ile His Cys Ser Ala
275 280 285
Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Leu Asp Arg Leu Leu Gln
290 295 300
His Ile Arg Asp His Glu Phe Val Asp Ile Leu Gly Leu Val Ser Glu
305 310 315 320
Met Arg Ser Tyr Arg Met Ser Met Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Ile
325 330 335
Phe Ile His Gln Cys Val Gln Leu Met Trp Met Lys Lys Lys Gln Gln
340 345 350
Phe Cys Ile Ser Asp Val Ile Tyr Glu Asn Val Ser Lys Ser
355 360 365
<210> 123
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T10
<400> 123
Met Lys Pro Ile Gly Leu Gln Glu Arg Arg Gly Ser Asn Val Ser Leu
1 5 10 15
Thr Leu Asp Met Ser Ser Leu Gly Asn Ile Glu Pro Phe Val Ser Ile
20 25 30
Pro Thr Pro Arg Glu Lys Val Ala Met Glu Tyr Leu Gln Ser Ala Ser
35 40 45
Arg Ile Leu Thr Arg Ser Gln Leu Arg Asp Val Val Ala Ser Ser His
50 55 60
Leu Leu Gln Ser Glu Phe Met Glu Ile Pro Met Asn Phe Val Asp Pro
65 70 75 80
Lys Glu Ile Asp Ile Pro Arg His Gly Thr Lys Asn Arg Tyr Lys Thr
85 90 95
Ile Leu Pro Asn Pro Leu Ser Arg Val Cys Leu Arg Pro Lys Asn Val
100 105 110
Thr Asp Ser Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Arg Gly Tyr
115 120 125
Ser Gly Lys Glu Lys Ala Phe Ile Ala Thr Gln Gly Pro Met Ile Asn
130 135 140
Thr Val Asp Asp Phe Trp Gln Met Val Trp Gln Glu Asp Ser Pro Val
145 150 155 160
Ile Val Met Ile Thr Lys Leu Lys Glu Lys Asn Glu Lys Cys Val Leu
165 170 175
Tyr Trp Pro Glu Lys Arg Gly Ile Tyr Gly Lys Val Glu Val Leu Val
180 185 190
Ile Ser Val Asn Glu Cys Asp Asn Tyr Thr Ile Arg Asn Leu Val Leu
195 200 205
Lys Gln Gly Ser His Thr Gln His Val Lys His Tyr Trp Tyr Thr Ser
210 215 220
Trp Pro Asp His Lys Thr Pro Asp Ser Ala Gln Pro Leu Leu Gln Leu
225 230 235 240
Met Leu Asp Val Glu Glu Asp Arg Leu Ala Ser Gln Gly Arg Gly Pro
245 250 255
Val Val Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile
260 265 270
Ala Thr Ser Ile Gly Cys Gln Gln Leu Lys Glu Glu Gly Val Val Asp
275 280 285
Ala Leu Ser Ile Val Cys Gln Leu Arg Met Asp Arg Gly Gly Met Val
290 295 300
Gln Thr Ser Glu Gln Tyr Glu Phe Val His His Ala Leu Cys Leu Tyr
305 310 315 320
Glu Ser
<210> 124
<211> 284
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T22
<400> 124
Met Leu Ser His Pro Pro Ile Pro Ile Ala Asp Met Ala Glu His Thr
1 5 10 15
Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr Glu
20 25 30
Ser Ile Asp Pro Gly Gln Gln Phe Thr Trp Glu His Ser Asn Leu Glu
35 40 45
Val Asn Lys Pro Lys Asn Arg Tyr Ala Asn Val Ile Ala Tyr Asp His
50 55 60
Ser Arg Val Ile Leu Gln Pro Ile Glu Gly Ile Met Gly Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Ile Asn Ala Asn Tyr Val Asp Gly Tyr Arg Arg Gln Asn Ala Tyr Ile
85 90 95
Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro Glu Thr Phe Gly Asp Phe Trp Arg Met
100 105 110
Val Trp Glu Gln Arg Ser Ala Thr Ile Val Met Met Thr Arg Leu Glu
115 120 125
Glu Lys Ser Arg Ile Lys Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Asn Arg Gly Thr
130 135 140
Glu Thr Tyr Gly Phe Ile Gln Val Thr Leu Leu Asp Thr Ile Glu Leu
145 150 155 160
Ala Thr Phe Cys Val Arg Thr Phe Ser Leu His Lys Asn Gly Ser Ser
165 170 175
Glu Lys Arg Glu Val Arg Gln Phe Gln Phe Thr Ala Trp Pro Asp His
180 185 190
Gly Val Pro Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Leu Ala Phe Leu Arg Arg Val
195 200 205
Lys Thr Cys Asn Pro Pro Asp Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser
210 215 220
Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Val Ile Asp Ala Met Leu
225 230 235 240
Glu Arg Ile Lys Pro Glu Lys Thr Val Asp Val Tyr Gly His Val Thr
245 250 255
Leu Met Arg Ser Gln Arg Asn Tyr Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr
260 265 270
Ser Phe Ile His Glu Ala Leu Leu Glu Ala Val Gly
275 280
<210> 125
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T20
<400> 125
Ala Ile Arg Val Ala Asp Leu Leu Gln His Ile Thr Gln Met Lys Arg
1 5 10 15
Gly Gln Gly Tyr Gly Phe Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Leu Pro Glu Gly
20 25 30
Gln Thr Ala Ser Trp Asp Thr Ala Lys Glu Asp Glu Asn Arg Asn Lys
35 40 45
Asn Arg Tyr Gly Asn Ile Ile Ser Tyr Asp His Ser Arg Val Arg Leu
50 55 60
Leu Val Leu Asp Gly Asp Pro His Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr
65 70 75 80
Ile Asp Gly Tyr His Arg Pro Arg His Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro
85 90 95
Met Gln Glu Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Gln Glu Asn
100 105 110
Ser Ala Ser Ile Val Met Val Thr Asn Leu Val Glu Val Gly Arg Val
115 120 125
Lys Cys Val Arg Tyr Trp Pro Asp Asp Thr Glu Val Tyr Gly Asp Ile
130 135 140
Lys Val Thr Leu Ile Glu Thr Glu Pro Leu Ala Glu Tyr Val Ile Arg
145 150 155 160
Thr Phe Thr Val Gln Lys Lys Gly Tyr His Glu Ile Arg Glu Leu Arg
165 170 175
Leu Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Cys Tyr Ala
180 185 190
Thr Gly Leu Leu Gly Phe Val Arg Gln Val Lys Phe Leu Asn Pro Pro
195 200 205
Glu Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Ala Gly Arg Thr
210 215 220
Gly Cys Phe Ile Ala Ile Asp Thr Met Leu Asp Met Ala Glu Asn Glu
225 230 235 240
Gly Val Val Asp Ile Phe Asn Cys Val Arg Glu Leu Arg Ala Gln Arg
245 250 255
Val Asn Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Val Phe Val His Asp Ala
260 265 270
Ile Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Asn Thr Ala Ile Pro Val Cys Glu
275 280 285
Phe Arg Ser
290
<210> 126
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTP1B
<400> 126
Met Glu Met Glu Lys Glu Phe Glu Gln Ile Asp Lys Ser Gly Ser Trp
1 5 10 15
Ala Ala Ile Tyr Gln Asp Ile Arg His Glu Ala Ser Asp Phe Pro Cys
20 25 30
Arg Val Ala Lys Leu Pro Lys Asn Lys Asn Arg Asn Arg Tyr Arg Asp
35 40 45
Val Ser Pro Phe Asp His Ser Arg Ile Lys Leu His Gln Glu Asp Asn
50 55 60
Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Leu Ile Lys Met Glu Glu Ala Gln Arg Ser
65 70 75 80
Tyr Ile Leu Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Cys Gly His Phe Trp
85 90 95
Glu Met Val Trp Glu Gln Lys Ser Arg Gly Val Val Met Leu Asn Arg
100 105 110
Val Met Glu Lys Gly Ser Leu Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro Gln Lys
115 120 125
Glu Glu Lys Glu Met Ile Phe Glu Asp Thr Asn Leu Lys Leu Thr Leu
130 135 140
Ile Ser Glu Asp Ile Lys Ser Tyr Tyr Thr Val Arg Gln Leu Glu Leu
145 150 155 160
Glu Asn Leu Thr Thr Gln Glu Thr Arg Glu Ile Leu His Phe His Tyr
165 170 175
Thr Thr Trp Pro Asp Phe Gly Val Pro Glu Ser Pro Ala Ser Phe Leu
180 185 190
Asn Phe Leu Phe Lys Val Arg Glu Ser Gly Ser Leu Ser Pro Glu His
195 200 205
Gly Pro Val Val Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Ser Gly Thr
210 215 220
Phe Cys Leu Ala Asp Thr Cys Leu Leu Leu Met Asp Lys Arg Lys Asp
225 230 235 240
Pro Ser Ser Val Asp Ile Lys Lys Val Leu Leu Glu Met Arg Lys Phe
245 250 255
Arg Met Gly Leu Ile Gln Thr Ala Asp Gln Leu Arg Phe Ser Tyr Leu
260 265 270
Ala Val Ile Glu Gly Ala Lys Phe Ile Met Gly Asp Ser Ser Val Gln
275 280 285
Asp Gln Trp Lys Glu Leu Ser His Glu Asp Leu
290 295
<210> 127
<211> 387
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T25
<400> 127
Met Pro Thr Thr Ile Glu Arg Glu Phe Glu Glu Leu Asp Thr Gln Arg
1 5 10 15
Arg Trp Gln Pro Leu Tyr Leu Glu Ile Arg Asn Glu Ser His Asp Tyr
20 25 30
Pro His Arg Val Ala Lys Phe Pro Glu Asn Arg Asn Arg Asn Arg Tyr
35 40 45
Arg Asp Val Ser Pro Tyr Asp His Ser Arg Val Lys Leu Gln Asn Ala
50 55 60
Glu Asn Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Leu Val Asp Ile Glu Glu Ala Gln
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ile Leu Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Cys Cys His
85 90 95
Phe Trp Leu Met Val Trp Gln Gln Lys Thr Lys Ala Val Val Met Leu
100 105 110
Asn Arg Ile Val Glu Lys Glu Ser Val Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro
115 120 125
Thr Asp Asp Gln Glu Met Leu Phe Lys Glu Thr Gly Phe Ser Val Lys
130 135 140
Leu Leu Ser Glu Asp Val Lys Ser Tyr Tyr Thr Val His Leu Leu Gln
145 150 155 160
Leu Glu Asn Ile Asn Ser Gly Glu Thr Arg Thr Ile Ser His Phe His
165 170 175
Tyr Thr Thr Trp Pro Asp Phe Gly Val Pro Glu Ser Pro Ala Ser Phe
180 185 190
Leu Asn Phe Leu Phe Lys Val Arg Glu Ser Gly Ser Leu Asn Pro Asp
195 200 205
His Gly Pro Ala Val Ile His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Ser Gly
210 215 220
Thr Phe Ser Leu Val Asp Thr Cys Leu Val Leu Met Glu Lys Gly Asp
225 230 235 240
Asp Ile Asn Ile Lys Gln Val Leu Leu Asn Met Arg Lys Tyr Arg Met
245 250 255
Gly Leu Ile Gln Thr Pro Asp Gln Leu Arg Phe Ser Tyr Met Ala Ile
260 265 270
Ile Glu Gly Ala Lys Cys Ile Lys Gly Asp Ser Ser Ile Gln Lys Arg
275 280 285
Trp Lys Glu Leu Ser Lys Glu Asp Leu Ser Pro Ala Phe Asp His Ser
290 295 300
Pro Asn Lys Ile Met Thr Glu Lys Tyr Asn Gly Asn Arg Ile Gly Leu
305 310 315 320
Glu Glu Glu Lys Leu Thr Gly Asp Arg Cys Thr Gly Leu Ser Ser Lys
325 330 335
Met Gln Asp Thr Met Glu Glu Asn Ser Glu Ser Ala Leu Arg Lys Arg
340 345 350
Ile Arg Glu Asp Arg Lys Ala Thr Thr Ala Gln Lys Val Gln Gln Met
355 360 365
Lys Gln Arg Leu Asn Glu Asn Glu Arg Lys Arg Lys Arg Pro Arg Leu
370 375 380
Thr Asp Thr
385
<210> 128
<211> 381
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T41
<400> 128
Val Ser Arg Gln Pro Ser Phe Thr Tyr Ser Glu Trp Met Glu Glu Lys
1 5 10 15
Ile Glu Asp Asp Phe Leu Asp Leu Asp Pro Val Pro Glu Thr Pro Val
20 25 30
Phe Asp Cys Val Met Asp Ile Lys Pro Glu Ala Asp Pro Thr Ser Leu
35 40 45
Thr Val Lys Ser Met Gly Leu Gln Glu Arg Arg Gly Ser Asn Val Ser
50 55 60
Leu Thr Leu Asp Met Cys Thr Pro Gly Cys Asn Glu Glu Gly Phe Gly
65 70 75 80
Tyr Leu Met Ser Pro Arg Glu Glu Ser Ala Arg Glu Tyr Leu Leu Ser
85 90 95
Ala Ser Arg Val Leu Gln Ala Glu Glu Leu His Glu Lys Ala Leu Asp
100 105 110
Pro Phe Leu Leu Gln Ala Glu Phe Phe Glu Ile Pro Met Asn Phe Val
115 120 125
Val Pro Lys Glu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Cys Arg Lys Asn Arg Tyr
130 135 140
Lys Thr Ile Leu Pro Asn Pro His Ser Arg Val Cys Leu Thr Ser Pro
145 150 155 160
Asp Pro Asp Asp Pro Leu Ser Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Arg
165 170 175
Gly Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Val Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Ile
180 185 190
Val Ser Thr Val Ala Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Gln Glu His Thr
195 200 205
Pro Ile Ile Val Met Ile Thr Asn Ile Glu Glu Met Asn Glu Lys Cys
210 215 220
Thr Glu Tyr Trp Pro Glu Glu Gln Val Ala Tyr Asp Gly Val Glu Ile
225 230 235 240
Thr Val Gln Lys Val Ile His Thr Glu Asp Tyr Arg Leu Arg Leu Ile
245 250 255
Ser Leu Lys Ser Gly Thr Glu Glu Arg Gly Leu Lys His Tyr Trp Phe
260 265 270
Thr Ser Trp Pro Asp Gln Lys Thr Pro Asp Arg Ala Pro Pro Leu Leu
275 280 285
His Leu Val Arg Glu Val Glu Glu Ala Ala Gln Gln Glu Gly Pro His
290 295 300
Cys Ala Pro Ile Ile Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly
305 310 315 320
Cys Phe Ile Ala Thr Ser Ile Cys Cys Gln Gln Leu Arg Gln Glu Gly
325 330 335
Val Val Asp Ile Leu Lys Thr Thr Cys Gln Leu Arg Gln Asp Arg Gly
340 345 350
Gly Met Ile Gln His Cys Glu Gln Tyr Gln Phe Val His His Val Met
355 360 365
Ser Leu Tyr Glu Lys Gln Leu Ser His Gln Ser Pro Glu
370 375 380
<210> 129
<211> 595
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T18
<400> 129
Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser
20 25 30
Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln
35 40 45
Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu
85 90 95
Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His
100 105 110
Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly
115 120 125
Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp
130 135 140
Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser
145 150 155 160
Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr
165 170 175
Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu
180 185 190
His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr
195 200 205
Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr Ala Thr Arg Val Asn Ala Ala Asp Ile Glu
210 215 220
Asn Arg Val Leu Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Lys Ala Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val
245 250 255
Lys Asn Leu His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly
260 265 270
Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile
275 280 285
Leu Gln Gly Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala
290 295 300
Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Tyr Ile Ala Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp
325 330 335
Gln Met Ala Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg
340 345 350
Glu Val Glu Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val
355 360 365
Gly Met Gln Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu
370 375 380
His Asp Thr Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu
385 390 395 400
Asp Asn Gly Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser
405 410 415
Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe
420 425 430
Leu Asp Gln Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro
435 440 445
Ile Ile Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile
450 455 460
Val Ile Asp Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys
465 470 475 480
Asp Ile Asp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser
485 490 495
Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile
500 505 510
Ala Gln Phe Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys Leu Glu Val Leu Gln Ser
515 520 525
Gln Lys Gly Gln Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Ile Thr Tyr Pro Pro Ala
530 535 540
Met Lys Asn Ala His Ala Lys Ala Ser Arg Thr Ser Ser Lys His Lys
545 550 555 560
Glu Asp Val Tyr Glu Asn Leu His Thr Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys
565 570 575
Val Lys Lys Gln Arg Ser Ala Asp Lys Glu Lys Ser Lys Gly Ser Leu
580 585 590
Lys Arg Lys
595
<210> 130
<211> 298
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk32
<400> 130
Gln Pro Pro Pro Glu Lys Thr Pro Ala Lys Lys His Val Arg Leu Gln
1 5 10 15
Glu Arg Arg Gly Ser Asn Val Ala Leu Met Leu Asp Val Arg Ser Leu
20 25 30
Gly Ala Val Glu Pro Ile Cys Ser Val Asn Thr Pro Arg Glu Val Thr
35 40 45
Leu His Phe Leu Arg Thr Ala Gly His Pro Leu Thr Arg Trp Ala Leu
50 55 60
Gln Arg Gln Pro Pro Ser Pro Lys Gln Leu Glu Glu Glu Phe Leu Lys
65 70 75 80
Ile Pro Ser Asn Phe Val Ser Pro Glu Asp Leu Asp Ile Pro Gly His
85 90 95
Ala Ser Lys Asp Arg Tyr Lys Thr Ile Leu Pro Asn Pro Gln Ser Arg
100 105 110
Val Cys Leu Gly Arg Ala Gln Ser Gln Glu Asp Gly Asp Tyr Ile Asn
115 120 125
Ala Asn Tyr Ile Arg Gly Tyr Asp Gly Lys Glu Lys Val Tyr Ile Ala
130 135 140
Thr Gln Gly Pro Met Pro Asn Thr Val Ser Asp Phe Trp Glu Met Val
145 150 155 160
Trp Gln Glu Glu Val Ser Leu Ile Val Met Leu Thr Gln Leu Arg Glu
165 170 175
Gly Lys Glu Lys Cys Val His Tyr Trp Pro Thr Glu Glu Glu Thr Tyr
180 185 190
Gly Pro Phe Gln Ile Arg Ile Gln Asp Met Lys Glu Cys Pro Glu Tyr
195 200 205
Thr Val Arg Gln Leu Thr Ile Gln Tyr Gln Glu Glu Arg Arg Ser Val
210 215 220
Lys His Ile Leu Phe Ser Ala Trp Pro Asp His Gln Thr Pro Glu Ser
225 230 235 240
Ala Gly Pro Leu Leu Arg Leu Val Ala Glu Val Glu Glu Ser Pro Glu
245 250 255
Thr Ala Ala His Pro Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Ile
260 265 270
Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Ala Thr Arg Ile Gly Cys Gln Gln Leu
275 280 285
Lys Ala Arg Gly Glu Val Asp Ile Leu Gly
290 295
<210> 131
<211> 526
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk28
<400> 131
Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala
1 5 10 15
Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg
20 25 30
Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn
35 40 45
Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp
50 55 60
Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr
65 70 75 80
Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile
85 90 95
Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp
100 105 110
Phe His Gly His Leu Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu
115 120 125
Lys Gly Lys His Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro
130 135 140
Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser
145 150 155 160
Asn Asp Gly Lys Ser Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu
165 170 175
Leu Lys Tyr Asp Val Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp
180 185 190
Leu Val Glu His Tyr Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly Thr
195 200 205
Val Leu Gln Leu Lys Gln Pro Leu Asn Thr Thr Arg Ile Asn Ala Ala
210 215 220
Glu Ile Glu Ser Arg Val Arg Glu Leu Ser Lys Leu Ala Glu Thr Thr
225 230 235 240
Asp Lys Val Lys Gln Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Thr Leu Gln Gln
245 250 255
Gln Glu Cys Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Lys Glu Gly Gln Arg Gln Glu
260 265 270
Asn Lys Asn Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Thr
275 280 285
Arg Val Val Leu His Asp Gly Asp Pro Asn Glu Pro Val Ser Asp Tyr
290 295 300
Ile Asn Ala Asn Ile Ile Met Pro Glu Phe Glu Thr Lys Cys Asn Asn
305 310 315 320
Ser Lys Pro Lys Lys Ser Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Cys Leu Gln Asn
325 330 335
Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg Met Val Phe Gln Glu Asn Ser Arg Val
340 345 350
Ile Val Met Thr Thr Lys Glu Val Glu Arg Gly Lys Ser Lys Cys Val
355 360 365
Lys Tyr Trp Pro Asp Glu Tyr Ala Leu Lys Glu Tyr Gly Val Met Arg
370 375 380
Val Arg Asn Val Lys Glu Ser Ala Ala His Asp Tyr Thr Leu Arg Glu
385 390 395 400
Leu Lys Leu Ser Lys Val Gly Gln Gly Asn Thr Glu Arg Thr Val Trp
405 410 415
Gln Tyr His Phe Arg Thr Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Asp Pro
420 425 430
Gly Gly Val Leu Asp Phe Leu Glu Glu Val His His Lys Gln Glu Ser
435 440 445
Ile Met Asp Ala Gly Pro Val Val Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly
450 455 460
Arg Thr Gly Thr Phe Ile Val Ile Asp Ile Leu Ile Asp Ile Ile Arg
465 470 475 480
Glu Lys Gly Val Asp Cys Asp Ile Asp Val Pro Lys Thr Ile Gln Met
485 490 495
Val Arg Ser Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Arg
500 505 510
Phe Ile Tyr Met Ala Val Gln His Tyr Ile Glu Thr Leu Gln
515 520 525
<210> 132
<211> 396
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T32
<400> 132
Met Asn Gly Lys Leu Ser Glu Glu Arg Thr Glu Asp Thr Asp Cys Asp
1 5 10 15
Gly Ser Pro Leu Pro Glu Tyr Phe Thr Glu Ala Thr Lys Met Asn Gly
20 25 30
Cys Glu Glu Tyr Cys Glu Glu Lys Val Lys Ser Glu Ser Leu Ile Gln
35 40 45
Lys Pro Gln Glu Lys Lys Thr Asp Asp Asp Glu Ile Thr Trp Gly Asn
50 55 60
Asp Glu Leu Pro Ile Glu Arg Thr Asn His Glu Asp Ser Asp Lys Asp
65 70 75 80
His Ser Phe Leu Thr Asn Asp Glu Leu Ala Val Leu Pro Val Val Lys
85 90 95
Val Leu Pro Ser Gly Lys Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Lys Ser Val Ile
100 105 110
Arg Val Leu Arg Gly Leu Leu Asp Gln Gly Ile Pro Ser Lys Glu Leu
115 120 125
Glu Asn Leu Gln Glu Leu Lys Pro Leu Asp Gln Cys Leu Ile Gly Gln
130 135 140
Thr Lys Glu Asn Arg Arg Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Tyr
145 150 155 160
Asp Ala Thr Arg Val Pro Leu Gly Asp Glu Gly Gly Tyr Ile Asn Ala
165 170 175
Ser Phe Ile Lys Ile Pro Val Gly Lys Glu Glu Phe Val Tyr Ile Ala
180 185 190
Cys Gln Gly Pro Leu Pro Thr Thr Val Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile
195 200 205
Trp Glu Gln Lys Ser Thr Val Ile Ala Met Met Thr Gln Glu Val Glu
210 215 220
Gly Glu Lys Ile Lys Cys Gln Arg Tyr Trp Pro Asn Ile Leu Gly Lys
225 230 235 240
Thr Thr Met Val Ser Asn Arg Leu Arg Leu Ala Leu Val Arg Met Gln
245 250 255
Gln Leu Lys Gly Phe Val Val Arg Ala Met Thr Leu Glu Asp Ile Gln
260 265 270
Thr Arg Glu Val Arg His Ile Ser His Leu Asn Phe Thr Ala Trp Pro
275 280 285
Asp His Asp Thr Pro Ser Gln Pro Asp Asp Leu Leu Thr Phe Ile Ser
290 295 300
Tyr Met Arg His Ile His Arg Ser Gly Pro Ile Ile Thr His Cys Ser
305 310 315 320
Ala Gly Ile Gly Arg Ser Gly Thr Leu Ile Cys Ile Asp Val Val Leu
325 330 335
Gly Leu Ile Ser Gln Asp Leu Asp Phe Asp Ile Ser Asp Leu Val Arg
340 345 350
Cys Met Arg Leu Gln Arg His Gly Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr
355 360 365
Ile Phe Cys Tyr Gln Val Ile Leu Tyr Val Leu Thr Arg Leu Gln Ala
370 375 380
Glu Glu Glu Gln Lys Gln Gln Pro Gln Leu Leu Lys
385 390 395
<210> 133
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T40
<400> 133
Met Leu Ala Ala Leu Asn Gly Leu Ser Val Ala Arg Val Ser Gly Arg
1 5 10 15
Glu Glu Asn Arg Val Asp Ala Thr Arg Val Pro Met Asp Glu Arg Phe
20 25 30
Arg Thr Leu Lys Lys Lys Leu Glu Glu Gly Met Val Phe Thr Glu Tyr
35 40 45
Glu Gln Ile Pro Lys Lys Lys Ala Asn Gly Ile Phe Ser Thr Ala Ala
50 55 60
Leu Pro Glu Asn Ala Glu Arg Ser Arg Ile Arg Glu Val Val Pro Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asn Arg Val Glu Leu Ile Pro Thr Lys Glu Asn Asn Thr Gly
85 90 95
Tyr Ile Asn Ala Ser His Ile Lys Val Val Val Gly Gly Ala Glu Trp
100 105 110
His Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro His Thr Cys His Asp Phe
115 120 125
Trp Gln Met Val Trp Glu Gln Gly Val Asn Val Ile Ala Met Val Thr
130 135 140
Ala Glu Glu Glu Gly Gly Arg Thr Lys Ser His Arg Tyr Trp Pro Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Lys His Ser Ser Ala Thr Tyr Gly Lys Phe Lys Val Thr
165 170 175
Thr Lys Phe Arg Thr Asp Ser Val Cys Tyr Ala Thr Thr Gly Leu Lys
180 185 190
Val Lys His Leu Leu Ser Gly Gln Glu Arg Thr Val Trp His Leu Gln
195 200 205
Tyr Thr Asp Trp Pro Asp His Gly Cys Pro Glu Asp Val Gln Gly Phe
210 215 220
Leu Ser Tyr Leu Glu Glu Ile Gln Ser Val Arg Arg His Thr Asn Ser
225 230 235 240
Met Leu Glu Gly Thr Lys Asn Arg His Pro Pro Ile Val Val His Cys
245 250 255
Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Val Leu Ile Leu Ser Glu Leu Met
260 265 270
Ile Tyr Cys Leu Glu His Asn Glu Lys Val Glu Val Pro Met Met Leu
275 280 285
Arg Leu Leu Arg Glu Gln Arg Met Phe Met Ile Gln Thr Ile Ala Gln
290 295 300
Tyr Lys Phe Val Tyr Gln Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Asn Ser Arg
305 310 315 320
Leu Ile
<210> 134
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2
<400> 134
Met Lys Lys Thr Arg Val Asp Ala Lys Lys Ile Gly Pro Leu Lys Leu
1 5 10 15
Ala Ala Leu Asn Gly Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Leu Pro Asp Glu
20 25 30
Gly Lys Glu Val Ala Thr Arg Ala Thr Asn Asp Glu Arg Cys Lys Ile
35 40 45
Leu Glu Gln Arg Leu Glu Gln Gly Met Val Phe Thr Glu Tyr Glu Arg
50 55 60
Ile Leu Lys Lys Arg Leu Val Asp Gly Glu Cys Ser Thr Ala Arg Leu
65 70 75 80
Pro Glu Asn Ala Glu Arg Asn Arg Phe Gln Asp Val Leu Pro Tyr Asp
85 90 95
Asp Val Arg Val Glu Leu Val Pro Thr Lys Glu Asn Asn Thr Gly Tyr
100 105 110
Ile Asn Ala Ser His Ile Lys Val Ser Val Ser Gly Ile Glu Trp Asp
115 120 125
Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Gln Asn Thr Cys Gln Asp Phe Trp
130 135 140
Gln Met Val Trp Glu Gln Gly Ile Ala Ile Ile Ala Met Val Thr Ala
145 150 155 160
Glu Glu Glu Gly Gly Arg Glu Lys Ser Phe Arg Tyr Trp Pro Arg Leu
165 170 175
Gly Ser Arg His Asn Thr Val Thr Tyr Gly Arg Phe Lys Ile Thr Thr
180 185 190
Arg Phe Arg Thr Asp Ser Gly Cys Tyr Ala Thr Thr Gly Leu Lys Met
195 200 205
Lys His Leu Leu Thr Gly Gln Glu Arg Thr Val Trp His Leu Gln Tyr
210 215 220
Thr Asp Trp Pro Glu His Gly Cys Pro Glu Asp Leu Lys Gly Phe Leu
225 230 235 240
Ser Tyr Leu Glu Glu Ile Gln Ser Val Arg Arg His Thr Asn Ser Thr
245 250 255
Ser Asp Pro Gln Ser Pro Asn Pro Pro Leu Leu Val His Cys Ser Ala
260 265 270
Gly Val Gly Arg Thr Gly Val Val Ile Leu Ser Glu Ile Met Ile Ala
275 280 285
Cys Leu Glu His Asn Glu Val Leu Asp Ile Pro Arg Val Leu Asp Met
290 295 300
Leu Arg Gln Gln Arg Met Met Leu Val Gln Thr Leu Cys Gln Tyr Thr
305 310 315 320
Phe Val Tyr Arg Val Leu Ile Gln Phe Leu Lys Ser Ser Arg Leu Ile
325 330 335
<210> 135
<211> 151
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk4
<400> 135
Gly Pro Val Glu Ile Leu Pro Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr His
1 5 10 15
Ala Ser Arg Lys Asp Met Leu Asp Ala Leu Gly Ile Thr Ala Leu Ile
20 25 30
Asn Val Ser Ala Asn Cys Pro Asn His Phe Glu Gly His Tyr Gln Tyr
35 40 45
Lys Ser Ile Pro Val Glu Asp Asn His Lys Ala Asp Ile Ser Ser Trp
50 55 60
Phe Asn Glu Ala Ile Asp Phe Ile Asp Ser Ile Lys Asn Ala Gly Gly
65 70 75 80
Arg Val Phe Val His Cys Gln Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr Ile
85 90 95
Cys Leu Ala Tyr Leu Met Arg Thr Asn Arg Val Lys Leu Asp Glu Ala
100 105 110
Phe Glu Phe Val Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Ser Pro Asn Phe Ser
115 120 125
Phe Met Gly Gln Leu Leu Gln Phe Glu Ser Gln Val Leu Ala Pro His
130 135 140
Cys Ser Ala Glu Ala Gly Ser
145 150
<210> 136
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk7
<400> 136
Ser Ala Thr Glu Pro Leu Asp Leu Gly Cys Ser Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu His Asp Gln Gly Gly Pro Val Glu Ile Leu Pro Phe Leu Tyr Leu
20 25 30
Gly Ser Ala Tyr His Ala Ala Arg Arg Asp Met Leu Asp Ala Leu Gly
35 40 45
Ile Thr Ala Leu Leu Asn Val Ser Ser Asp Cys Pro Asn His Phe Glu
50 55 60
Gly His Tyr Gln Tyr Lys Cys Ile Pro Val Glu Asp Asn His Lys Ala
65 70 75 80
Asp Ile Ser Ser Trp Phe Met Glu Ala Ile Glu Tyr Ile Asp Ala Val
85 90 95
Lys Asp Cys Arg Gly Arg Val Leu Val His Cys Gln Ala Gly Ile Ser
100 105 110
Arg Ser Ala Thr Ile Cys Leu Ala Tyr Leu Met Met Lys Lys Arg Val
115 120 125
Arg Leu Glu Glu Ala Phe Glu Phe Val Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile
130 135 140
Ser Pro Asn Phe Ser Phe Met Gly Gln Leu Leu Gln Phe Glu Ser Gln
145 150 155 160
Val Leu Ala Thr Ser
165
<210> 137
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk8
<400> 137
Gly Pro Val Glu Ile Leu Pro Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr His
1 5 10 15
Ala Ser Lys Cys Glu Phe Leu Ala Asn Leu His Ile Thr Ala Leu Leu
20 25 30
Asn Val Ser Arg Arg Thr Ser Glu Ala Cys Ala Thr His Leu His Tyr
35 40 45
Lys Trp Ile Pro Val Glu Asp Ser His Thr Ala Asp Ile Ser Ser His
50 55 60
Phe Gln Glu Ala Ile Asp Phe Ile Asp Cys Val Arg Glu Lys Gly Gly
65 70 75 80
Lys Val Leu Val His Cys Glu Ala Gly Ile Ser Arg Ser Pro Thr Ile
85 90 95
Cys Met Ala Tyr Leu Met Lys Thr Lys Gln Phe Arg Leu Lys Glu Ala
100 105 110
Phe Asp Tyr Ile Lys Gln Arg Arg Ser Met Val Ser Pro Asn Phe Gly
115 120 125
Phe Met Gly Gln Leu Leu Gln Tyr Glu Ser Glu Ile Leu Pro Ser Thr
130 135 140
<210> 138
<211> 144
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk9
<400> 138
Ser Phe Pro Val Glu Ile Leu Pro Phe Leu Tyr Leu Gly Cys Ala Lys
1 5 10 15
Asp Ser Thr Asn Leu Asp Val Leu Glu Glu Phe Gly Ile Lys Tyr Ile
20 25 30
Leu Asn Val Thr Pro Asn Leu Pro Asn Leu Phe Glu Asn Ala Gly Glu
35 40 45
Phe Lys Tyr Lys Gln Ile Pro Ile Ser Asp His Trp Ser Gln Asn Leu
50 55 60
Ser Gln Phe Phe Pro Glu Ala Ile Ser Phe Ile Asp Glu Ala Arg Gly
65 70 75 80
Lys Asn Cys Gly Val Leu Val His Cys Leu Ala Gly Ile Ser Arg Ser
85 90 95
Val Thr Val Thr Val Ala Tyr Leu Met Gln Lys Leu Asn Leu Ser Met
100 105 110
Asn Asp Ala Tyr Asp Ile Val Lys Met Lys Lys Ser Asn Ile Ser Pro
115 120 125
Asn Phe Asn Phe Met Gly Gln Leu Leu Asp Phe Glu Arg Thr Leu Gly
130 135 140
<210> 139
<211> 147
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk10
<400> 139
Ala Phe Pro Val Gln Ile Leu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gly Cys Ala Lys
1 5 10 15
Asp Ser Thr Asn Leu Asp Val Leu Gly Lys Tyr Gly Ile Lys Tyr Ile
20 25 30
Leu Asn Val Thr Pro Asn Leu Pro Asn Ala Phe Glu His Gly Gly Glu
35 40 45
Phe Thr Tyr Lys Gln Ile Pro Ile Ser Asp His Trp Ser Gln Asn Leu
50 55 60
Ser Gln Phe Phe Pro Glu Ala Ile Ser Phe Ile Asp Glu Ala Arg Ser
65 70 75 80
Lys Lys Cys Gly Val Leu Val His Cys Leu Ala Gly Ile Ser Arg Ser
85 90 95
Val Thr Val Thr Val Ala Tyr Leu Met Gln Lys Met Asn Leu Ser Leu
100 105 110
Asn Asp Ala Tyr Asp Phe Val Lys Arg Lys Lys Ser Asn Ile Ser Pro
115 120 125
Asn Phe Asn Phe Met Gly Gln Leu Leu Asp Phe Glu Arg Thr Leu Gly
130 135 140
Leu Ser Ser
145
<210> 140
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T33
<400> 140
Gly Leu Thr Arg Ile Leu Pro His Leu Tyr Leu Gly Ser Gln Lys Asp
1 5 10 15
Val Leu Asn Lys Asp Leu Met Thr Gln Asn Gly Ile Ser Tyr Val Leu
20 25 30
Asn Ala Ser Asn Ser Cys Pro Lys Pro Asp Phe Ile Cys Glu Ser Arg
35 40 45
Phe Met Arg Val Pro Ile Asn Asp Asn Tyr Cys Glu Lys Leu Leu Pro
50 55 60
Trp Leu Asp Lys Ser Ile Glu Phe Ile Asp Lys Ala Lys Leu Ser Ser
65 70 75 80
Cys Gln Val Ile Val His Cys Leu Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr
85 90 95
Ile Ala Ile Ala Tyr Ile Met Lys Thr Met Gly Met Ser Ser Asp Asp
100 105 110
Ala Tyr Arg Phe Val Lys Asp Arg Arg Pro Ser Ile Ser Pro Asn Phe
115 120 125
Asn Phe Leu Gly Gln Leu Leu Glu Tyr Glu Arg Thr Leu Lys Leu Leu
130 135 140
Ala Ala Leu Gln Gly Asp Pro Gly Thr
145 150
<210> 141
<211> 151
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk12
<400> 141
Ala Ser Phe Pro Val Gln Ile Leu Pro Asn Leu Tyr Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Arg Asp Ser Ala Asn Leu Glu Ser Leu Ala Lys Leu Gly Ile Arg Tyr
20 25 30
Ile Leu Asn Val Thr Pro Asn Leu Pro Asn Phe Phe Glu Lys Asn Gly
35 40 45
Asp Phe His Tyr Lys Gln Ile Pro Ile Ser Asp His Trp Ser Gln Asn
50 55 60
Leu Ser Arg Phe Phe Pro Glu Ala Ile Glu Phe Ile Asp Glu Ala Leu
65 70 75 80
Ser Gln Asn Cys Gly Val Leu Val His Cys Leu Ala Gly Val Ser Arg
85 90 95
Ser Val Thr Val Thr Val Ala Tyr Leu Met Gln Lys Leu His Leu Ser
100 105 110
Leu Asn Asp Ala Tyr Asp Leu Val Lys Arg Lys Lys Ser Asn Ile Ser
115 120 125
Pro Asn Phe Asn Phe Met Gly Gln Leu Leu Asp Phe Glu Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Glu Glu Arg His Ser
145 150
<210> 142
<211> 148
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk13
<400> 142
Ala Glu Leu Thr Pro Ile Leu Pro Phe Leu Phe Leu Gly Asn Glu Gln
1 5 10 15
Asp Ala Gln Asp Leu Asp Thr Met Gln Arg Leu Asn Ile Gly Tyr Val
20 25 30
Ile Asn Val Thr Thr His Leu Pro Leu Tyr His Tyr Glu Lys Gly Leu
35 40 45
Phe Asn Tyr Lys Arg Leu Pro Ala Thr Asp Ser Asn Lys Gln Asn Leu
50 55 60
Arg Gln Tyr Phe Glu Glu Ala Phe Glu Phe Ile Glu Glu Ala His Gln
65 70 75 80
Cys Gly Lys Gly Leu Leu Ile His Cys Gln Ala Gly Val Ser Arg Ser
85 90 95
Ala Thr Ile Val Ile Ala Tyr Leu Met Lys His Thr Arg Met Thr Met
100 105 110
Thr Asp Ala Tyr Lys Phe Val Lys Gly Lys Arg Pro Ile Ile Ser Pro
115 120 125
Asn Leu Asn Phe Met Gly Gln Leu Leu Glu Phe Glu Glu Asp Leu Asn
130 135 140
Asn Gly Val Thr
145
<210> 143
<211> 148
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T27
<400> 143
Gly Pro Thr Arg Ile Leu Pro Asn Leu Tyr Leu Gly Cys Gln Arg Asp
1 5 10 15
Val Leu Asn Lys Glu Leu Met Gln Gln Asn Gly Ile Gly Tyr Val Leu
20 25 30
Asn Ala Ser Asn Thr Cys Pro Lys Pro Asp Phe Ile Pro Glu Ser His
35 40 45
Phe Leu Arg Val Pro Val Asn Asp Ser Phe Cys Glu Lys Ile Leu Pro
50 55 60
Trp Leu Asp Lys Ser Val Asp Phe Ile Glu Lys Ala Lys Ala Ser Asn
65 70 75 80
Gly Cys Val Leu Val His Cys Leu Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Thr
85 90 95
Ile Ala Ile Ala Tyr Ile Met Lys Arg Met Asp Met Ser Leu Asp Glu
100 105 110
Ala Tyr Arg Phe Val Lys Glu Lys Arg Pro Thr Ile Ser Pro Asn Phe
115 120 125
Asn Phe Leu Gly Gln Leu Leu Asp Tyr Glu Lys Lys Ile Lys Asn Gln
130 135 140
Thr Gly Ala Ser
145
<210> 144
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk6
<400> 144
Met Ser Gly Ser Phe Glu Leu Ser Val Gln Asp Leu Asn Asp Leu Leu
1 5 10 15
Ser Asp Gly Ser Gly Cys Tyr Ser Leu Pro Ser Gln Pro Cys Asn Glu
20 25 30
Val Thr Pro Arg Ile Tyr Val Gly Asn Ala Ser Val Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Pro Lys Leu Gln Lys Leu Gly Ile Thr His Val Leu Asn Ala Ala Glu
50 55 60
Gly Arg Ser Phe Met His Val Asn Thr Asn Ala Asn Phe Tyr Lys Asp
65 70 75 80
Ser Gly Ile Thr Tyr Leu Gly Ile Lys Ala Asn Asp Thr Gln Glu Phe
85 90 95
Asn Leu Ser Ala Tyr Phe Glu Arg Ala Ala Asp Phe Ile Asp Gln Ala
100 105 110
Leu Ala Gln Lys Asn Gly Arg Val Leu Val His Cys Arg Glu Gly Tyr
115 120 125
Ser Arg Ser Pro Thr Leu Val Ile Ala Tyr Leu Met Met Arg Gln Lys
130 135 140
Met Asp Val Lys Ser Ala Leu Ser Ile Val Arg Gln Asn Arg Glu Ile
145 150 155 160
Gly Pro Asn Asp Gly Phe Leu Ala Gln Leu Cys Gln Leu Asn Asp Arg
165 170 175
Leu Ala Lys Glu Gly Lys Leu Lys Pro
180 185
<210> 145
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk14
<400> 145
Gly Gly Asn His Ile Pro Glu Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gln Arg Met Pro Gly Thr Arg Phe Ile Ala Phe Lys Val Pro Leu Gln
20 25 30
Lys Ser Phe Glu Lys Lys Leu Ala Pro Glu Glu Cys Phe Ser Pro Leu
35 40 45
Asp Leu Phe Asn Lys Ile Arg Glu Gln Asn Glu Glu Leu Gly Leu Ile
50 55 60
Ile Asp Leu Thr Tyr Thr Gln Arg Tyr Tyr Lys Pro Glu Asp Leu Pro
65 70 75 80
Glu Thr Val Pro Tyr Leu Lys Ile Phe Thr Val Gly His Gln Val Pro
85 90 95
Asp Asp Glu Thr Ile Phe Lys Phe Lys His Ala Val Asn Gly Phe Leu
100 105 110
Lys Glu Asn Lys Asp Asn Asp Lys Leu Ile Gly Val His Cys Thr His
115 120 125
Gly Leu Asn Arg Thr Gly Tyr Leu Ile Cys Arg Tyr Leu Ile Asp Val
130 135 140
Glu Gly Val Arg Pro Asp Asp Ala Ile Glu Leu Phe Asn Arg Cys Arg
145 150 155 160
Gly His Cys Leu Glu Arg Gln Asn Tyr Ile Glu Asp Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Pro Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser
180
<210> 146
<211> 320
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk15
<400> 146
Val Ser Cys Ala Gly Gln Met Leu Glu Val Gln Pro Gly Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Gly Ala Ala Ala Val Ala Glu Pro Asp His Leu Arg Glu Ala Gly
20 25 30
Ile Thr Ala Val Leu Thr Val Asp Ser Glu Glu Pro Ser Phe Lys Ala
35 40 45
Gly Pro Gly Val Glu Asp Leu Trp Arg Leu Phe Val Pro Ala Leu Asp
50 55 60
Lys Pro Glu Thr Asp Leu Leu Ser His Leu Asp Arg Cys Val Ala Phe
65 70 75 80
Ile Gly Gln Ala Arg Ala Glu Gly Arg Ala Val Leu Val His Cys His
85 90 95
Ala Gly Val Ser Arg Ser Val Ala Ile Ile Thr Ala Phe Leu Met Lys
100 105 110
Thr Asp Gln Leu Pro Phe Glu Lys Ala Tyr Glu Lys Leu Gln Ile Leu
115 120 125
Lys Pro Glu Ala Lys Met Asn Glu Gly Phe Glu Trp Gln Leu Lys Leu
130 135 140
Tyr Gln Ala Met Gly Tyr Glu Val Asp Thr Ser Ser Ala Ile Tyr Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Arg Leu Gln Lys Val Thr Glu Lys Tyr Pro Glu Leu Gln Asn
165 170 175
Leu Pro Gln Glu Leu Phe Ala Val Asp Pro Thr Thr Val Ser Gln Gly
180 185 190
Leu Lys Asp Glu Val Leu Tyr Lys Cys Arg Lys Cys Arg Arg Ser Leu
195 200 205
Phe Arg Ser Ser Ser Ile Leu Asp His Arg Glu Gly Ser Gly Pro Ile
210 215 220
Ala Phe Ala His Lys Arg Met Thr Pro Ser Ser Met Leu Thr Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gln Ala Gln Cys Thr Ser Tyr Phe Ile Glu Pro Val Gln Trp Met
245 250 255
Glu Ser Ala Leu Leu Gly Val Met Asp Gly Gln Leu Leu Cys Pro Lys
260 265 270
Cys Ser Ala Lys Leu Gly Ser Phe Asn Trp Tyr Gly Glu Gln Cys Ser
275 280 285
Cys Gly Arg Trp Ile Thr Pro Ala Phe Gln Ile His Lys Asn Arg Val
290 295 300
Asp Glu Met Lys Ile Leu Pro Val Leu Gly Ser Gln Thr Gly Lys Ile
305 310 315 320
<210> 147
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk33
<400> 147
Met Ala Glu Thr Ser Leu Pro Glu Leu Gly Gly Glu Asp Lys Ala Thr
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ser Ile Leu Glu Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Gly Lys
20 25 30
Ser Ser Cys Ser Arg Val Asp Glu Val Trp Pro Asn Leu Phe Ile Gly
35 40 45
Asp Ala Ala Thr Ala Asn Asn Arg Phe Glu Leu Trp Lys Leu Gly Ile
50 55 60
Thr His Val Leu Asn Ala Ala His Arg Gly Leu Tyr Cys Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Asp Phe Tyr Gly Ser Ser Val Ser Tyr Leu Gly Val Pro Ala His
85 90 95
Asp Leu Pro Asp Phe Asp Ile Ser Ala Tyr Phe Ser Ser Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Ile His Arg Ala Leu Asn Thr Pro Gly Ala Lys Val Leu Val His
115 120 125
Cys Val Val Gly Val Ser Arg Ser Ala Thr Leu Val Leu Ala Tyr Leu
130 135 140
Met Leu His Gln Arg Leu Ser Leu Arg Gln Ala Val Ile Thr Val Arg
145 150 155 160
Gln His Arg Trp Val Phe Pro Asn Arg Gly Phe Leu His Gln Leu Cys
165 170 175
Arg Leu Asp Gln Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gln Ser
180 185
<210> 148
<211> 198
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p44
<400> 148
Met Asp Ser Leu Gln Lys Gln Asp Leu Arg Arg Pro Lys Ile His Gly
1 5 10 15
Ala Val Gln Ala Ser Pro Tyr Gln Pro Pro Thr Leu Ala Ser Leu Gln
20 25 30
Arg Leu Leu Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Leu Asn His Ile Asp Glu
35 40 45
Val Trp Pro Ser Leu Phe Leu Gly Asp Ala Tyr Ala Ala Arg Asp Lys
50 55 60
Ser Lys Leu Ile Gln Leu Gly Ile Thr His Val Val Asn Ala Ala Ala
65 70 75 80
Gly Lys Phe Gln Val Asp Thr Gly Ala Lys Phe Tyr Arg Gly Met Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Tyr Gly Ile Glu Ala Asp Asp Asn Pro Phe Phe Asp Leu
100 105 110
Ser Val Tyr Phe Leu Pro Val Ala Arg Tyr Ile Arg Ala Ala Leu Ser
115 120 125
Val Pro Gln Gly Arg Val Leu Val His Cys Ala Met Gly Val Ser Arg
130 135 140
Ser Ala Thr Leu Val Leu Ala Phe Leu Met Ile Tyr Glu Asn Met Thr
145 150 155 160
Leu Val Glu Ala Ile Gln Thr Val Gln Ala His Arg Asn Ile Cys Pro
165 170 175
Asn Ser Gly Phe Leu Arg Gln Leu Gln Val Leu Asp Asn Arg Leu Gly
180 185 190
Arg Glu Thr Gly Arg Phe
195
<210> 149
<211> 157
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p21
<400> 149
Met Gly Asn Gly Met Thr Lys Val Leu Pro Gly Leu Tyr Leu Gly Asn
1 5 10 15
Phe Ile Asp Ala Lys Asp Leu Asp Gln Leu Gly Arg Asn Lys Ile Thr
20 25 30
His Ile Ile Ser Ile His Glu Ser Pro Gln Pro Leu Leu Gln Asp Ile
35 40 45
Thr Tyr Leu Arg Ile Pro Val Ala Asp Thr Pro Glu Val Pro Ile Lys
50 55 60
Lys His Phe Lys Glu Cys Ile Asn Phe Ile His Cys Cys Arg Leu Asn
65 70 75 80
Gly Gly Asn Cys Leu Val His Cys Phe Ala Gly Ile Ser Arg Ser Thr
85 90 95
Thr Ile Val Thr Ala Tyr Val Met Thr Val Thr Gly Leu Gly Trp Arg
100 105 110
Asp Val Leu Glu Ala Ile Lys Ala Thr Arg Pro Ile Ala Asn Pro Asn
115 120 125
Pro Gly Phe Arg Gln Gln Leu Glu Glu Phe Gly Trp Ala Ser Ser Gln
130 135 140
Lys Leu Arg Arg Gln Leu Glu Glu Arg Phe Gly Glu Ser
145 150 155
<210> 150
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk35
<400> 150
Met Thr Ala Pro Ser Cys Ala Phe Pro Val Gln Phe Arg Gln Pro Ser
1 5 10 15
Val Ser Gly Leu Ser Gln Ile Thr Lys Ser Leu Tyr Ile Ser Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ala Asn Asn Lys Leu Met Leu Ser Ser Asn Gln Ile Thr Met
35 40 45
Val Ile Asn Val Ser Val Glu Val Val Asn Thr Leu Tyr Glu Asp Ile
50 55 60
Gln Tyr Met Gln Val Pro Val Ala Asp Ser Pro Asn Ser Arg Leu Cys
65 70 75 80
Asp Phe Phe Asp Pro Ile Ala Asp His Ile His Ser Val Glu Met Lys
85 90 95
Gln Gly Arg Thr Leu Leu His Cys Ala Ala Gly Val Ser Arg Ser Ala
100 105 110
Ala Leu Cys Leu Ala Tyr Leu Met Lys Tyr His Ala Met Ser Leu Leu
115 120 125
Asp Ala His Thr Trp Thr Lys Ser Cys Arg Pro Ile Ile Arg Pro Asn
130 135 140
Ser Gly Phe Trp Glu Gln Leu Ile His Tyr Glu Phe Gln Leu Phe Gly
145 150 155 160
Lys Asn Thr Val His Met Val Ser Ser Pro Val Gly Met Ile Pro Asp
165 170 175
Ile Tyr Glu Lys Glu Val Arg Leu Met Ile Pro Leu
180 185
<210> 151
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NE1
<400> 151
Met Tyr Ser Leu Asn Gln Glu Ile Lys Ala Phe Ser Arg Asn Asn Leu
1 5 10 15
Arg Lys Gln Cys Thr Arg Val Thr Thr Leu Thr Gly Lys Lys Ile Ile
20 25 30
Glu Thr Trp Lys Asp Ala Arg Ile His Val Val Glu Glu Val Glu Pro
35 40 45
Ser Ser Gly Gly Gly Cys Gly Tyr Val Gln Asp Leu Ser Ser Asp Leu
50 55 60
Gln Val Gly Val Ile Lys Pro Trp Leu Leu Leu Gly Ser Gln Asp Ala
65 70 75 80
Ala His Asp Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asn Lys Val Thr His Ile Leu
85 90 95
Asn Val Ala Tyr Gly Val Glu Asn Ala Phe Leu Ser Asp Phe Thr Tyr
100 105 110
Lys Ser Ile Ser Ile Leu Asp Leu Pro Glu Thr Asn Ile Leu Ser Tyr
115 120 125
Phe Pro Glu Cys Phe Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Arg Lys Asp Gly
130 135 140
Val Val Leu Val His Cys Asn Ala Gly Val Ser Arg Ala Ala Ala Ile
145 150 155 160
Val Ile Gly Phe Leu Met Asn Ser Glu Gln Thr Ser Phe Thr Ser Ala
165 170 175
Phe Ser Leu Val Lys Asn Ala Arg Pro Ser Ile Cys Pro Asn Ser Gly
180 185 190
Phe Met Glu Gln Leu Arg Thr Tyr Gln Glu Gly Lys Glu Ser Asn Lys
195 200 205
Cys Asp Arg Ile Gln Glu Asn Ser Ser
210 215
<210> 152
<211> 190
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p19
<400> 152
Met Thr Ala Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Gln Gly Val Gln Gln
1 5 10 15
Pro Ser Ile Tyr Ser Phe Ser Gln Ile Thr Arg Ser Leu Phe Leu Ser
20 25 30
Asn Gly Val Ala Ala Asn Asp Lys Leu Leu Leu Ser Ser Asn Arg Ile
35 40 45
Thr Ala Ile Val Asn Ala Ser Val Glu Val Val Asn Val Phe Phe Glu
50 55 60
Gly Ile Gln Tyr Ile Lys Val Pro Val Thr Asp Ala Arg Asp Ser Arg
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Phe Phe Asp Pro Ile Ala Asp Leu Ile His Thr Ile Asp
85 90 95
Met Arg Gln Gly Arg Thr Leu Leu His Cys Met Ala Gly Val Ser Arg
100 105 110
Ser Ala Ser Leu Cys Leu Ala Tyr Leu Met Lys Tyr His Ser Met Ser
115 120 125
Leu Leu Asp Ala His Thr Trp Thr Lys Ser Arg Arg Pro Ile Ile Arg
130 135 140
Pro Asn Asn Gly Phe Trp Glu Gln Leu Ile Asn Tyr Glu Phe Lys Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asn Asn Thr Val Arg Met Ile Asn Ser Pro Val Gly Asn Ile
165 170 175
Pro Asp Ile Tyr Glu Lys Asp Leu Arg Met Met Ile Ser Met
180 185 190
<210> 153
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk18
<400> 153
Met Gly Asn Gly Met Asn Lys Ile Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Gly Asn
1 5 10 15
Phe Lys Asp Ala Arg Asp Ala Gly Gln Leu Ser Arg Asn Lys Val Thr
20 25 30
His Ile Leu Ser Val His Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val
35 40 45
Lys Tyr Leu Cys Ile Pro Ala Ala Asp Ser Pro Ser Gln Asn Leu Thr
50 55 60
Arg His Phe Lys Glu Ser Ile Lys Phe Ile His Glu Cys Arg Leu Arg
65 70 75 80
Gly Glu Ser Cys Leu Val His Cys Leu Ala Gly Val Ser Arg Ser Val
85 90 95
Thr Leu Val Ile Ala Tyr Ile Met Thr Val Thr Asp Phe Gly Trp Glu
100 105 110
Asp Ala Leu His Thr Val Arg Ala Gly Arg Ser Cys Ala Asn Pro Asn
115 120 125
Val Gly Phe Gln Arg Gln Leu Gln Glu Phe Glu Lys His Glu Val His
130 135 140
Gln Tyr Arg Gln Trp Leu Lys Glu Glu Tyr Gly Glu Ser Pro Leu Gln
145 150 155 160
Asp Ala Glu Glu Ala Lys Asn Ile Leu Ala Ala Pro Gly Ile Met Lys
165 170 175
Phe Trp Ala Phe Leu Arg Arg Leu
180
<210> 154
<211> 171
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p12
<400> 154
Gly Arg Ala His Arg Asp Trp Tyr His Arg Ile Asp Pro Thr Val Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Leu Pro Leu Arg Ser Leu Thr Arg Gln Leu Val Gln Asp
20 25 30
Glu Asn Val Arg Gly Val Ile Thr Met Asn Glu Glu Tyr Glu Thr Arg
35 40 45
Phe Leu Cys Asn Ser Ser Gln Glu Trp Lys Arg Leu Gly Val Glu Gln
50 55 60
Leu Arg Leu Ser Thr Val Asp Met Thr Gly Ile Pro Thr Leu Asp Asn
65 70 75 80
Leu Gln Lys Gly Val Gln Phe Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Leu Gly Gln
85 90 95
Cys Val Tyr Val His Cys Lys Ala Gly Arg Ser Arg Ser Ala Thr Met
100 105 110
Val Ala Ala Tyr Leu Ile Gln Val His Lys Trp Ser Pro Glu Glu Ala
115 120 125
Val Arg Ala Ile Ala Lys Ile Arg Ser Tyr Ile His Ile Arg Pro Gly
130 135 140
Gln Leu Asp Val Leu Lys Glu Phe His Lys Gln Ile Thr Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Lys Asp Gly Thr Phe Val Ile Ser Lys Thr
165 170
<210> 155
<211> 177
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk17
<400> 155
Met Pro Thr Val Gln His Pro Phe Leu Asn Val Phe Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Thr Gly Lys Thr Ala Cys Asn His Ala Asp Glu Val Trp
20 25 30
Pro Gly Leu Tyr Leu Gly Asp Gln Asp Met Ala Asn Asn Arg Arg Glu
35 40 45
Leu Arg Arg Leu Gly Ile Thr His Val Leu Asn Ala Ser His Ser Arg
50 55 60
Trp Arg Gly Thr Pro Glu Ala Tyr Glu Gly Leu Gly Ile Arg Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Val Glu Ala His Asp Ser Pro Ala Phe Asp Met Ser Ile His Phe
85 90 95
Gln Thr Ala Ala Asp Phe Ile His Arg Ala Leu Ser Gln Pro Gly Gly
100 105 110
Lys Ile Leu Val His Cys Ala Val Gly Val Ser Arg Ser Ala Thr Leu
115 120 125
Val Leu Ala Tyr Leu Met Leu Tyr His His Leu Thr Leu Val Glu Ala
130 135 140
Ile Lys Lys Val Lys Asp His Arg Gly Ile Ile Pro Asn Arg Gly Phe
145 150 155 160
Leu Arg Gln Leu Leu Ala Leu Asp Arg Arg Leu Arg Gln Gly Leu Glu
165 170 175
Ala
<210> 156
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p16
<400> 156
Met Gly Val Gln Pro Pro Asn Phe Ser Trp Val Leu Pro Gly Arg Leu
1 5 10 15
Ala Gly Leu Ala Leu Pro Arg Leu Pro Ala His Tyr Gln Phe Leu Leu
20 25 30
Asp Leu Gly Val Arg His Leu Val Ser Leu Thr Glu Arg Gly Pro Pro
35 40 45
His Ser Asp Ser Cys Pro Gly Leu Thr Leu His Arg Leu Arg Ile Pro
50 55 60
Asp Phe Cys Pro Pro Ala Pro Asp Gln Ile Asp Arg Phe Val Gln Ile
65 70 75 80
Val Asp Glu Ala Asn Ala Arg Gly Glu Ala Val Gly Val His Cys Ala
85 90 95
Leu Gly Phe Gly Arg Thr Gly Thr Met Leu Ala Cys Tyr Leu Val Lys
100 105 110
Glu Arg Gly Leu Ala Ala Gly Asp Ala Ile Ala Glu Ile Arg Arg Leu
115 120 125
Arg Pro Gly Ser Ile Glu Thr Tyr Glu Gln Glu Lys Ala Val Phe Gln
130 135 140
Phe Tyr Gln Arg Thr Lys
145 150
<210> 157
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T16
<400> 157
Met Ala His Asn Lys Ile Pro Pro Arg Trp Leu Asn Cys Pro Arg Arg
1 5 10 15
Gly Gln Pro Val Ala Gly Arg Phe Leu Pro Leu Lys Thr Met Leu Gly
20 25 30
Pro Arg Tyr Asp Ser Gln Val Ala Glu Glu Asn Arg Phe His Pro Ser
35 40 45
Met Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Leu Lys Val Lys Met Gly Leu Leu
50 55 60
Val Asp Leu Thr Asn Thr Ser Arg Phe Tyr Asp Arg Asn Asp Ile Glu
65 70 75 80
Lys Glu Gly Ile Lys Tyr Ile Lys Leu Gln Cys Lys Gly His Gly Glu
85 90 95
Cys Pro Thr Thr Glu Asn Thr Glu Thr Phe Ile Arg Leu Cys Glu Arg
100 105 110
Phe Asn Glu Arg Asn Pro Pro Glu Leu Ile Gly Val His Cys Thr His
115 120 125
Gly Phe Asn Arg Thr Gly Phe Leu Ile Cys Ala Phe Leu Val Glu Lys
130 135 140
Met Asp Trp Ser Ile Glu Ala Ala Val Ala Thr Phe Ala Gln Ala Arg
145 150 155 160
Pro Pro Gly Ile Tyr Lys Gly Asp Tyr Leu Lys Glu Leu Phe Arg Arg
165 170 175
Tyr Gly Asp Ile Glu Glu Ala Pro Pro Pro Pro Leu Leu Pro Asp Trp
180 185 190
Cys Phe Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Gly Lys Lys
195 200 205
Glu Ser
210
<210> 158
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p18
<400> 158
Met Leu Leu Ile Leu Gly Gln Met Asp Lys Pro Ser Leu Ile Phe Asp
1 5 10 15
His Leu Tyr Leu Gly Ser Glu Trp Asn Ala Ser Asn Leu Glu Glu Leu
20 25 30
Gln Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ile Leu Asn Val Thr Arg Glu Ile Asp
35 40 45
Asn Phe Phe Pro Gly Leu Phe Ala Tyr His Asn Ile Arg Val Tyr Asp
50 55 60
Glu Glu Thr Thr Asp Leu Leu Ala His Trp Asn Glu Ala Tyr His Phe
65 70 75 80
Ile Asn Lys Ala Lys Arg Asn His Ser Lys Cys Leu Val His Cys Lys
85 90 95
Met Gly Val Ser Arg Ser Ala Ser Thr Val Ile Ala Tyr Ala Met Lys
100 105 110
Glu Phe Gly Trp Pro Leu Glu Lys Ala Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Lys
115 120 125
Arg Ser Ile Thr Arg Pro Asn Ala Gly Phe Met Arg Gln Leu Ser Glu
130 135 140
Tyr Glu Gly Ile Leu Asp Ala Ser
145 150
<210> 159
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NE3
<400> 159
Met Asp Ser Pro Thr Gln Ile Phe Glu His Val Phe Leu Gly Ser Glu
1 5 10 15
Trp Asn Ala Ser Asn Leu Glu Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Arg Tyr
20 25 30
Ile Leu Asn Val Thr Arg Glu Ile Asp Asn Phe Phe Pro Gly Val Phe
35 40 45
Glu Tyr His Asn Ile Arg Val Tyr Asp Glu Glu Ala Thr Asp Leu Leu
50 55 60
Ala Tyr Trp Asn Asp Thr Tyr Lys Phe Ile Ser Lys Ala Lys Lys His
65 70 75 80
Gly Ser Lys Cys Leu Val His Cys Lys Met Gly Val Ser Arg Ser Ala
85 90 95
Ser Thr Val Ile Ala Tyr Ala Met Lys Glu Tyr Gly Trp Asn Leu Asp
100 105 110
Arg Ala Tyr Asp Tyr Val Lys Glu Arg Arg Thr Val Thr Lys Pro Asn
115 120 125
Pro Ser Phe Met Arg Gln Leu Glu Glu Tyr Gln Gly Ile Leu Leu Ala
130 135 140
Arg
145
<210> 160
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk3
<400> 160
Met Asn Arg Pro Ala Pro Val Glu Val Thr Tyr Lys Asn Met Arg Phe
1 5 10 15
Leu Ile Thr His Asn Pro Thr Asn Ala Thr Leu Asn Lys Phe Ile Glu
20 25 30
Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Val Thr Thr Ile Val Arg Val Cys Glu Ala
35 40 45
Thr Tyr Asp Thr Thr Leu Val Glu Lys Glu Gly Ile His Val Leu Asp
50 55 60
Trp Pro Phe Asp Asp Gly Ala Pro Pro Ser Asn Gln Ile Val Asp Asp
65 70 75 80
Trp Leu Ser Leu Val Lys Ile Lys Phe Arg Glu Glu Pro Gly Cys Cys
85 90 95
Ile Ala Val His Cys Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Pro Val Leu Val
100 105 110
Ala Leu Ala Leu Ile Glu Gly Gly Met Lys Tyr Glu Asp Ala Val Gln
115 120 125
Phe Ile Arg Gln Lys Arg Arg Gly Ala Phe Asn Ser Lys Gln Leu Leu
130 135 140
Tyr Leu Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Met Arg Leu Arg Phe Lys Asp Ser
145 150 155 160
<210> 161
<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p49
<400> 161
Met Arg Phe Leu Ile Thr His Asn Pro Thr Asn Ala Thr Leu Asn Lys
1 5 10 15
Phe Thr Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Val Thr Thr Leu Val Arg Val
20 25 30
Cys Asp Ala Thr Tyr Asp Lys Ala Pro Val Glu Lys Glu Gly Ile His
35 40 45
Val Leu Asp Trp Pro Phe Asp Asp Gly Ala Pro Pro Pro Asn Gln Ile
50 55 60
Val Asp Asp Trp Leu Asn Leu Leu Lys Thr Lys Phe Arg Glu Glu Pro
65 70 75 80
Gly Cys Cys Val Ala Val His Cys Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Pro
85 90 95
Val Leu Val Ala Leu Ala Leu Ile Glu Cys Gly Met Lys Tyr Glu Asp
100 105 110
Ala Val Gln Phe Ile Arg Gln Lys Arg Arg Gly Ala Phe Asn Ser Lys
115 120 125
Gln Leu Leu Tyr Leu Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Met Arg Leu Arg Phe
130 135 140
Arg Asp Thr Asn Gly His Cys Cys Val Gln
145 150
<210> 162
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p26
<400> 162
Met Asn Arg Pro Ala Pro Val Glu Val Ser Tyr Lys His Met Arg Phe
1 5 10 15
Leu Ile Thr His Asn Pro Thr Asn Ala Thr Leu Ser Thr Phe Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Lys Lys Tyr Gly Ala Thr Thr Val Val Arg Val Cys Glu Val
35 40 45
Thr Tyr Asp Lys Thr Pro Leu Glu Lys Asp Gly Ile Thr Val Val Asp
50 55 60
Trp Pro Phe Asp Asp Gly Ala Pro Pro Pro Gly Lys Val Val Glu Asp
65 70 75 80
Trp Leu Ser Leu Val Lys Ala Lys Phe Cys Glu Ala Pro Gly Ser Cys
85 90 95
Val Ala Val His Cys Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Pro Val Leu Val
100 105 110
Ala Leu Ala Leu Ile Glu Ser Gly Met Lys Tyr Glu Asp Ala Ile Gln
115 120 125
Phe Ile Arg Gln Lys Arg Arg Gly Ala Ile Asn Ser Lys Gln Leu Thr
130 135 140
Tyr Leu Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Gln Arg Leu Arg Phe Lys
145 150 155
<210> 163
<211> 355
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T29
<400> 163
Gln Asp Pro Arg Arg Arg Asp Pro Gln Asp Asp Val Tyr Leu Asp Ile
1 5 10 15
Thr Asp Arg Leu Cys Phe Ala Ile Leu Tyr Ser Arg Pro Lys Ser Ala
20 25 30
Ser Asn Val His Tyr Phe Ser Ile Asp Asn Glu Leu Glu Tyr Glu Asn
35 40 45
Phe Tyr Ala Asp Phe Gly Pro Leu Asn Leu Ala Met Val Tyr Arg Tyr
50 55 60
Cys Cys Lys Ile Asn Lys Lys Leu Lys Ser Ile Thr Met Leu Arg Lys
65 70 75 80
Lys Ile Val His Phe Thr Gly Ser Asp Gln Arg Lys Gln Ala Asn Ala
85 90 95
Ala Phe Leu Val Gly Cys Tyr Met Val Ile Tyr Leu Gly Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Glu Ala Tyr Arg Ile Leu Ile Phe Gly Glu Thr Ser Tyr Ile Pro
115 120 125
Phe Arg Asp Ala Ala Tyr Gly Ser Cys Asn Phe Tyr Ile Thr Leu Leu
130 135 140
Asp Cys Phe His Ala Val Lys Lys Ala Met Gln Tyr Gly Phe Leu Asn
145 150 155 160
Phe Asn Ser Phe Asn Leu Asp Glu Tyr Glu His Tyr Glu Lys Ala Glu
165 170 175
Asn Gly Asp Leu Asn Trp Ile Ile Pro Asp Arg Phe Ile Ala Phe Cys
180 185 190
Gly Pro His Ser Arg Ala Arg Leu Glu Ser Gly Tyr His Gln His Ser
195 200 205
Pro Glu Thr Tyr Ile Gln Tyr Phe Lys Asn His Asn Val Thr Thr Ile
210 215 220
Ile Arg Leu Asn Lys Arg Met Tyr Asp Ala Lys Arg Phe Thr Asp Ala
225 230 235 240
Gly Phe Asp His His Asp Leu Phe Phe Ala Asp Gly Ser Thr Pro Thr
245 250 255
Asp Ala Ile Val Lys Glu Phe Leu Asp Ile Cys Glu Asn Ala Glu Gly
260 265 270
Ala Ile Ala Val His Cys Lys Ala Gly Leu Gly Arg Thr Gly Thr Leu
275 280 285
Ile Ala Cys Tyr Ile Met Lys His Tyr Arg Met Thr Ala Ala Glu Thr
290 295 300
Ile Ala Trp Val Arg Ile Cys Arg Pro Gly Ser Val Ile Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Gln Phe Leu Val Met Lys Gln Thr Asn Leu Trp Leu Glu Gly Asp
325 330 335
Tyr Phe Arg Gln Lys Leu Lys Gly Gln Glu Asn Gly Gln His Arg Ala
340 345 350
Ala Phe Ser
355
<210> 164
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T46
<400> 164
Met Ala Glu Gln Ala Thr Lys Ser Val Leu Phe Val Cys Leu Gly Asn
1 5 10 15
Ile Cys Arg Ser Pro Ile Ala Glu Ala Val Phe Arg Lys Leu Val Thr
20 25 30
Asp Gln Asn Ile Ser Glu Asn Trp Val Ile Asp Ser Gly Ala Val Ser
35 40 45
Asp Trp Asn Val Gly Arg Ser Pro Asp Pro Arg Ala Val Ser Cys Leu
50 55 60
Arg Asn His Gly Ile His Thr Ala His Lys Ala Arg Gln Ile Thr Lys
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Asp Tyr Ile Leu Cys Met Asp Glu Ser Asn
85 90 95
Leu Arg Asp Leu Asn Arg Lys Ser Asn Gln Val Lys Thr Cys Lys Ala
100 105 110
Lys Ile Glu Leu Leu Gly Ser Tyr Asp Pro Gln Lys Gln Leu Ile Ile
115 120 125
Glu Asp Pro Tyr Tyr Gly Asn Asp Ser Asp Phe Glu Thr Val Tyr Gln
130 135 140
Gln Cys Val Arg Cys Cys Arg Ala Phe Leu Glu Lys Ala His
145 150 155
<210> 165
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pk1
<400> 165
Leu Ile Gly Asp Phe Ser Lys Gly Tyr Leu Phe His Thr Val Ala Gly
1 5 10 15
Lys His Gln Asp Leu Lys Tyr Ile Ser Pro Glu Ile Met Ala Ser Val
20 25 30
Leu Asn Gly Lys Phe Ala Asn Leu Ile Lys Glu Phe Val Ile Ile Asp
35 40 45
Cys Arg Tyr Pro Tyr Glu Tyr Glu Gly Gly His Ile Lys Gly Ala Val
50 55 60
Asn Leu His Met Glu Glu Glu Val Glu Asp Phe Leu Leu Lys Lys Pro
65 70 75 80
Ile Val Pro Thr Asp Gly Lys Arg Val Ile Val Val Phe His Cys Glu
85 90 95
Phe Ser Ser Glu Arg Gly Pro Arg Met Cys Arg Tyr Val Arg Glu Arg
100 105 110
Asp Arg Leu Gly Asn Glu Tyr Pro Lys Leu His Tyr Pro Glu Leu Tyr
115 120 125
Val Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Glu Phe Phe Met Lys Cys Gln Ser Tyr
130 135 140
Cys Glu Pro Pro Ser Tyr Arg Pro Met His His Glu Asp Phe Lys Glu
145 150 155 160
Asp Leu Lys Lys Phe Arg Thr Lys Ser Arg Thr Trp Ala Gly Glu Lys
165 170 175
Ser Lys Arg Glu Met Tyr Ser Arg Leu Lys Lys Leu
180 185
<210> 166
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T47
<400> 166
Leu Ile Gly Asp Tyr Ser Lys Ala Phe Leu Leu Gln Thr Val Asp Gly
1 5 10 15
Lys His Gln Asp Leu Lys Tyr Ile Ser Pro Glu Thr Met Val Ala Leu
20 25 30
Leu Thr Gly Lys Phe Ser Asn Ile Val Asp Lys Phe Val Ile Val Asp
35 40 45
Cys Arg Tyr Pro Tyr Glu Tyr Glu Gly Gly His Ile Lys Thr Ala Val
50 55 60
Asn Leu Pro Leu Glu Arg Asp Ala Glu Ser Phe Leu Leu Lys Ser Pro
65 70 75 80
Ile Ala Pro Cys Ser Leu Asp Lys Arg Val Ile Leu Ile Phe His Cys
85 90 95
Glu Phe Ser Ser Glu Arg Gly Pro Arg Met Cys Arg Phe Ile Arg Glu
100 105 110
Arg Asp Arg Ala Val Asn Asp Tyr Pro Ser Leu Tyr Tyr Pro Glu Met
115 120 125
Tyr Ile Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Gln His Pro Asn
130 135 140
Phe Cys Glu Pro Gln Asp Tyr Arg Pro Met Asn His Glu Ala Phe Lys
145 150 155 160
Asp Glu Leu Lys Thr Phe Arg Leu Lys Thr Arg Ser Trp Ala Gly Glu
165 170 175
Arg Ser Arg Arg Glu Leu Cys Ser Arg Leu Gln Asp Gln
180 185
<210> 167
<211> 194
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T45
<400> 167
Gly His Leu Ile Gly Asp Phe Ser Lys Val Cys Ala Leu Pro Thr Val
1 5 10 15
Ser Gly Lys His Gln Asp Leu Lys Tyr Val Asn Pro Glu Thr Val Ala
20 25 30
Ala Leu Leu Ser Gly Lys Phe Gln Gly Leu Ile Glu Lys Phe Tyr Val
35 40 45
Ile Asp Cys Arg Tyr Pro Tyr Glu Tyr Leu Gly Gly His Ile Gln Gly
50 55 60
Ala Leu Asn Leu Tyr Ser Gln Glu Glu Leu Phe Asn Phe Phe Leu Lys
65 70 75 80
Lys Pro Ile Val Pro Leu Asp Thr Gln Lys Arg Ile Ile Ile Val Phe
85 90 95
His Cys Glu Phe Ser Ser Glu Arg Gly Pro Arg Met Cys Arg Cys Leu
100 105 110
Arg Glu Glu Asp Arg Ser Leu Asn Gln Tyr Pro Ala Leu Tyr Tyr Pro
115 120 125
Glu Leu Tyr Ile Leu Lys Gly Gly Tyr Arg Asp Phe Phe Pro Glu Tyr
130 135 140
Met Glu Leu Cys Glu Pro Gln Ser Tyr Cys Pro Met His His Gln Asp
145 150 155 160
His Lys Thr Glu Leu Leu Arg Cys Arg Ser Gln Ser Lys Val Gln Glu
165 170 175
Gly Glu Arg Gln Leu Arg Glu Gln Ile Ala Leu Leu Val Lys Asp Met
180 185 190
Ser Pro
<210> 168
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Eya2
<400> 168
Glu Arg Val Phe Val Trp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Ile Ile Phe His
1 5 10 15
Ser Leu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Ser Arg Tyr Gly Lys Asp Thr Thr
20 25 30
Thr Ser Val Arg Ile Gly Leu Met Met Glu Glu Met Ile Phe Asn Leu
35 40 45
Ala Asp Thr His Leu Phe Phe Asn Asp Leu Glu Asp Cys Asp Gln Ile
50 55 60
His Val Asp Asp Val Ser Ser Asp Asp Asn Gly Gln Asp Leu Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Asn Phe Ser Ala Asp Gly Phe His Ser Ser Ala Pro Ala Ala Asn
85 90 95
Leu Cys Leu Gly Ser Gly Val His Gly Gly Val Asp Trp Met Arg Lys
100 105 110
Leu Ala Phe Arg Tyr Arg Arg Val Lys Glu Met Tyr Asn Thr Tyr Lys
115 120 125
Asn Asn Val Gly Gly Leu Ile Gly Thr Pro Lys Arg Glu Thr Trp Leu
130 135 140
Gln Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Leu Thr Asp Leu Trp Leu Thr His
145 150 155 160
Ser Leu Lys Ala Leu Asn Leu Ile Asn Ser Arg Pro Asn Cys Val Asn
165 170 175
Val Leu Val Thr Thr Thr Gln Leu Ile Pro Ala Leu Ala Lys Val Leu
180 185 190
Leu Tyr Gly Leu Gly Ser Val Phe Pro Ile Glu Asn Ile Tyr Ser Ala
195 200 205
Thr Lys Thr Gly Lys Glu Ser Cys Phe Glu Arg Ile Met Gln Arg Phe
210 215 220
Gly Arg Lys Ala Val Tyr Val Val Ile Gly Asp Gly Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
Gln Gly Ala Lys Lys His Asn Met Pro Phe Trp Arg Ile Ser Cys His
245 250 255
Ala Asp Leu Glu Ala Leu Arg His Ala Leu Glu Leu Glu Tyr Leu
260 265 270
Claims (30)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 1) 서열번호 113 내지 서열번호 135 및, 서열번호 137 내지 168로 구성된 군의 아미노산 서열로 구성된 재조합 PTP 활성 도메인 모두를 포함하는 키트에 PTP 특이적 기질 및 후보 물질을 처리하고 흡광도 변화를 측정하는 단계; 및,2) 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 재조합 PTP 활성 도메인의 활성을 감소시키거나 증진시킨 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 PTP 활성 저해제 또는 촉진제의 스크리닝 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 22항에 있어서, 상기 단계 1)의 재조합 PTP 활성 도메인은 하기 단계로 구성되는 방법을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법:a) 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)를 서브그룹별 상동성 조사를 수행하여 유사도가 가장 높은 부분을 선정하는 단계;b) 단계 a)의 선정된 부분이 각 서브그룹별로 이미 2차 및 3차 구조가 규명된 표준 단백질의 활성 도메인에 해당되는지 확인하는 단계;c) 단계 a)의 선정된 부분에 대한 2차 구조를 분석하여 2차 구조상 헬릭스 또는 시트를 가지지 않는 위치를 활성 도메인의 경계로 나누는 단계;d) 단계 c)의 결정된 활성 도메인의 아미노산 분석을 통해 활성 도메인의 N-말단 및 C-말단이 가용성질일 수 있도록, N-말단 및 C-말단의 2 내지 3개의 아미노산이 가용성질의 아미노산이 되도록 경계를 결정하는 단계;e) 단계 d)의 PTP 활성 도메인 경계 내부의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;f) 단계 e)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,g) 단계 f)의 형질전환체를 배양하여 재조합 활성 도메인의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계.
- 제 26항에 있어서, 서브그룹은 PTP를 리셉터(receptor), 비-리셉터(non-receptor), MKP(Mitogen-Activated protein Kinase phosphatase), DUSP(Dual-specificity phosphatases) 및 CDC14(Cell division cycle 14) 상동체(homologue)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 단계 a)의 상동성 조사는 ClustalX, KALIGN(At Karolinska Institute or at EB), MAFFT(At Kyushu University, EBI or at MyHits) 및 Muscle(At Berkeley or at BioAssist)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로그램으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 단계 c)의 2차 구조 분석은 GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(//pbil.ibcp.fr/), PHDsec(//www.predictprotein.org/)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로그램으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 가용성질의 아미노산은 세린, 글리신, 라이신, 아르기닌, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020070125162A KR100999043B1 (ko) | 2007-12-04 | 2007-12-04 | 융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 |
US12/746,438 US20100261213A1 (en) | 2007-12-04 | 2008-08-04 | Method for large scale preparation of the active domain of human protein tyrosine phosphatase without fusion protein |
PCT/KR2008/004524 WO2009072726A1 (en) | 2007-12-04 | 2008-08-04 | Method for large scale preparation of the active domain of human protein tyrosine phosphatase without fusion protein |
US13/772,708 US20130224779A1 (en) | 2007-12-04 | 2013-02-21 | Method for large scale preparation of the active domain of human protein tyrosine phosphatase without fusion protein |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020070125162A KR100999043B1 (ko) | 2007-12-04 | 2007-12-04 | 융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20090058404A KR20090058404A (ko) | 2009-06-09 |
KR100999043B1 true KR100999043B1 (ko) | 2010-12-09 |
Family
ID=40717886
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020070125162A KR100999043B1 (ko) | 2007-12-04 | 2007-12-04 | 융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20100261213A1 (ko) |
KR (1) | KR100999043B1 (ko) |
WO (1) | WO2009072726A1 (ko) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100916651B1 (ko) * | 2007-12-04 | 2009-09-08 | 한국생명공학연구원 | 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법 |
US20130171163A1 (en) * | 2010-08-06 | 2013-07-04 | Marschall Runge | Inhibition of LAR Phosphatase to Enhance Therapeutic Angiogenesis |
US9068172B2 (en) * | 2010-09-15 | 2015-06-30 | Stc.Unm | STEP-derived peptide for brain injury treatment |
US10786541B2 (en) | 2012-04-09 | 2020-09-29 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for treating heart disease and/or injury |
US10729777B2 (en) | 2012-04-09 | 2020-08-04 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for inhibiting the activity of LAR family phosphatases |
US10206967B2 (en) | 2012-04-09 | 2019-02-19 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for treating heart disease and/or injury |
AU2013246034B2 (en) * | 2012-04-09 | 2017-12-07 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for inhibiting the activity of LAR family phosphatases |
US10258672B2 (en) | 2014-10-09 | 2019-04-16 | Case Western Reserve University | Compositions and methods of treating root avulsion injury |
GB201522667D0 (en) * | 2015-12-22 | 2016-02-03 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers |
CN114126715A (zh) | 2019-05-31 | 2022-03-01 | 罗根生物技术有限公司 | 组合物以及解除细菌内毒素毒性的方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7115710B2 (en) * | 1997-06-11 | 2006-10-03 | Sugen, Inc. | Diagnosis and treatment of PTP related disorders |
CA2379983A1 (en) * | 1999-07-20 | 2001-01-25 | Ceptyr, Inc. | Dsp-11 dual-specificity map kinase phosphatase |
US20040091908A1 (en) * | 2002-07-08 | 2004-05-13 | Weixin Xu | Crystal structures of Kv channel proteins and uses thereof |
US20060275794A1 (en) * | 2005-03-07 | 2006-12-07 | Invitrogen Corporation | Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents |
KR100759389B1 (ko) * | 2005-10-10 | 2007-09-19 | 한국생명공학연구원 | 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α를 특이적으로인식하는 단일클론항체 및 항원 펩티드 |
US20080004325A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-03 | Wyeth | PTP1B inhibitors |
KR100916651B1 (ko) * | 2007-12-04 | 2009-09-08 | 한국생명공학연구원 | 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법 |
-
2007
- 2007-12-04 KR KR1020070125162A patent/KR100999043B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-08-04 WO PCT/KR2008/004524 patent/WO2009072726A1/en active Application Filing
- 2008-08-04 US US12/746,438 patent/US20100261213A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-02-21 US US13/772,708 patent/US20130224779A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. Mol. Biol. 제360권 제946-955면(2006년)* |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009072726A1 (en) | 2009-06-11 |
US20130224779A1 (en) | 2013-08-29 |
US20100261213A1 (en) | 2010-10-14 |
KR20090058404A (ko) | 2009-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100999043B1 (ko) | 융합 단백질을 사용하지 않는 인간 단백질 타이로신탈인산화 효소의 활성 도메인 대량 생산 방법 | |
Lorenzo‐Orts et al. | Identity and functions of inorganic and inositol polyphosphates in plants | |
Xing et al. | Structure of protein phosphatase 2A core enzyme bound to tumor-inducing toxins | |
US7655757B2 (en) | Cytotoxic ribonuclease variants | |
US20060141529A1 (en) | Compositions, kits and assays containing reagents directed to cortactin and an ARG/ABL protein kinase | |
Singh et al. | Enzymatic and structural characterisation of amphinase, a novel cytotoxic ribonuclease from Rana pipiens oocytes | |
Poulsen et al. | Characterization of human phosphodiesterase 12 and identification of a novel 2′-5′ oligoadenylate nuclease–The ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 | |
Campos-Sandoval et al. | Expression of functional human glutaminase in baculovirus system: affinity purification, kinetic and molecular characterization | |
Koval et al. | Plant multifunctional nuclease TBN1 with unexpected phospholipase activity: structural study and reaction-mechanism analysis | |
Yakovlev et al. | Ribonuclease inhibitors | |
JPH09509319A (ja) | Rna修正酵素およびその使用方法 | |
KR101587622B1 (ko) | 상피세포 성장인자 수용체의 세포외 도메인과 결합하는 신규 폴리펩타이드 | |
JP2003523723A (ja) | ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法 | |
Rasmussen et al. | Biochemical characterization of the recombinant human Drosophila homologues Timekeeper and Andante involved in the Drosophila circadian oscillator | |
US6812015B1 (en) | Histidine protein-phosphatase | |
Feeney et al. | Novel protein purification system utilizing an N-terminal fusion protein and a caspase-3 cleavable linker | |
Demulder et al. | Crystal structure of Arabidopsis thaliana casein kinase 2 α1 | |
GB2493982A (en) | Disease treatments involving histone deacetylases | |
JP2004500848A (ja) | 新しいモータータンパク質とその使用法 | |
KR101910168B1 (ko) | 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커 | |
Krela et al. | Variations in the enzymatic activity of S1-type nucleases results from differences in their active site structures | |
US20060166304A1 (en) | Polynucleotides encoding insect 3-ketosphinganine reductase and uses thereof | |
Gorczyca | Elucidating Regulatory Events Along GC-1 | |
Henager | Enzyme-Catalyzed Expressed Protein Ligation | |
WO2007069604A1 (ja) | 修飾蛋白質の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131029 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141202 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151126 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |