KR101910168B1 - 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커 - Google Patents

암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커 Download PDF

Info

Publication number
KR101910168B1
KR101910168B1 KR1020160084889A KR20160084889A KR101910168B1 KR 101910168 B1 KR101910168 B1 KR 101910168B1 KR 1020160084889 A KR1020160084889 A KR 1020160084889A KR 20160084889 A KR20160084889 A KR 20160084889A KR 101910168 B1 KR101910168 B1 KR 101910168B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cdh1
protein
phosphorylated
amino acid
ser
Prior art date
Application number
KR1020160084889A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180005023A (ko
Inventor
강동민
임정미
김수리
Original Assignee
이화여자대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이화여자대학교 산학협력단 filed Critical 이화여자대학교 산학협력단
Priority to KR1020160084889A priority Critical patent/KR101910168B1/ko
Publication of KR20180005023A publication Critical patent/KR20180005023A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101910168B1 publication Critical patent/KR101910168B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03016—Phosphoprotein phosphatase (3.1.3.16), i.e. calcineurin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

암세포 검출용 바이오마커, 상기 바이오마커의 검출 제제를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 바이오마커를 이용한 암 진단에 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

Description

암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커{Phosphor-Cdh1 peptide biomarker for detecting cancer cell}
암세포 검출용 바이오마커, 상기 바이오마커의 검출 제제를 포함하는 암 진단용 조성물, 상기 바이오마커를 이용한 암 진단에 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
생체를 구성하는 세포들의 분열, 증식 및 분화는 생명 현상을 유지하는 기본적 메커니즘이다. 세포의 증식 및 성장은 정교한 세포내 신호전달 체계에 의해서 조절되며, 이러한 일련의 과정은 세포가 외부로부터 받은 신호를 여러 단백질(PLC, PKC, Shc, Grb2, Raf, MAPK, MEK 등)과 분자 매개체(GTP, cAMP 등)를 통해 핵내의 세포 시계로 전달시킴으로써 수행된다. 이러한 과정 중에서 어느 한 부분에 이상이 발생하게 되면 대부분의 경우에는 질병으로 발전하게 된다. 특히, 세포내 핵에서 일어나는 세포주기는 세포들의 생명유지를 조절하는 중요한 과정 중의 하나이다.
세포주기는 Gap1(G1), DNA 합성단계(S), Gap2(G2) 및 분열기(M)로 이루어진다. 상기 세포주기 이외에도 세포가 높은 밀도로 존재하거나, 낮은 농도의 성장 인자의 환경에서 장기간 방치되면, 세포는 휴면기라고 불리는 성장 멈춤(Go)상태로 들어가게 된다.
여러 가지 요인으로 인하여 세포 주기의 조절 메커니즘에 장애가 발생하는 경우, 유전 물질의 불안정성을 증가시켜 조절되지 않은 세포 성장을 야기하게 되고, 암과 같은 무절제한 세포 성장을 유도하게 되며, 이는 암과 같은 병적 상태를 야기하게 된다.
따라서, 무절제한 세포 성장이 유도된 세포를 검출함으로써, 암과 같은 병적 상태를 검출할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.
US2015-0141262 (2015.05.21)
본 발명은 신규한 암세포 검출용 바이오마커 및 용도와 관련된 것이다.
일 예는 인산화된 Cdh1 (pCdh1) 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 암세포 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 특이적으로 결합하는 분자를 제공한다. 상기 분자는 인산화된 Cdh1과 특이적으로 결합하는 펩타이드 및/또는 항체일 수 있다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제를 포함하는 암세포 검출용 조성물을 제공한다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제 및 검출 기기를 포함하는 암세포 검출용 키트를 제공한다.
다른 예는 세포 시료를 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 암세포 검출 방법을 제공한다. 상기 세포 시료는 생체로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제 및 검출 기기를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
다른 예는 세포 시료를 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 세포 시료는 생체로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.
상기 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 검출 가능한 제제는 상기 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 Cdh1 단백질의 인산화 부위의 아미노산이 결실 또는 인산화가 불가능한 아미노산으로 치환된 Cdh1 단백질의 변이체를 제공한다.
다른 예는 상기 Cdh1 단백질의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 Cdh1 단백질의 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 Cdh1 단백질의 인산화 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물 및/또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 Cdh1 단백질의 인산화 저해 단계를 포함하는 세포주기 조절 방법을 제공한다. 상기 Cdh1 단백질의 인산화 저해 단계는 세포 시료에 Cdh1의 인산화 저해제를 접촉시키거나, Cdh1의 인산화 부위를 결실 또는 인산화 불가능한 아미노산으로 치환하여 Cdh1 단백질의 변이체를 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 Cdh1 단백질의 변이체를 생산하는 단계는 상기 Cdh1 단백질의 변이체를 합성적으로 생산하거나 상기 Cdh1 단백질의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 숙주 세포에서 발현시키는 재조합적 방법에 의하여 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 Cdh1을 포함하는 세포 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준을 측정하는 단계; 상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준과 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준을 비교하는 단계; 및 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준보다 낮은 경우 상기 후보 화합물을 세포 주기 조절제 또는 암 치료제의 후보 물질로 결정하는 단계를 포함하는, 세포 주기 조절제 또는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 명세서는 세포 분열 개시시의 퍼옥시레독신 (PrxI)의 인산화에 의하여 중심체 주위의 H2O2의 농도의 증가, Cdk1에 반대되는 탈인산화효소(Cdk1-opposing phosphatases)의 불활성화, Cdh1의 인산화의 축적 등을 포함하는 연속적인 현상이 발생함과, 이 중에서 Cdh1의 인산화가 Cdh1과 APC/C(anaphase-promoting complex/cyclosome)와의 결합 및 복합체 형성을 억제하여 정상적인 세포 분열의 조절을 저해함을 확인하여, 무절제한 세포 분열을 야기하며, 무절제한 세포 분열이 일어나는 세포의 표지가 될 수 있음을 제안한다. 이에, 본 발명은 인산화된 Cdh1의 무절제한 세포 분열이 일어난 세포, 예컨대, 암세포의 검출과 관련된 용도를 제공한다.
일 예는 인산화된 Cdh1(phosphorylated Cdh1-1; pCdh-1) 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 암세포 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
Cdh1 단백질은 효모에서 Hct1으로 알려져 있고, 초파리, 개구리, 마우스, 인간 등에서 Fizzy-related protein이라도 불리며, Anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C)의 활성자로 알려져 있다. Cdh1 단백질은 세포조절 작용에 중요한 유비퀴틴 (ubiquitin) 의존적 단백질 분해에 중요한 APC/C의 활성자로 역할을 갖고 있다. Cdh1 단백질은 세포주기 단계인 G0와 G1 상태와 세포분열기의 탈출 등에 중요한 조절자로 알려져 있다. 또한 Cdh1 단백질은 게놈 안정성에 기여한다.
본 발명의 적용 가능한 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자는 모든 유기체, 예컨대, 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 등의 균류, Xenopus laevis 등의 양서류, 마우스, 인간, 등의 포유류 등으로 이루어진 군에서 선택된 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 Cdh1 단백질은 효모 (Saccharomyces cerevisiae) Cdh1 단백질 (NCBI Nucleotide Accession No. NP_011512.1 (mRNA: NM_001180868.1), 등), 개구리 (Xenopus laevis) Cdh1 단백질 (예컨대, NCBI Nucleotide Accession No. CAA74576.1 (mRNA: Y14163), 등), 마우스 Cdh1 단백질 (예컨대, NCBI Nucleotide Accession No. NP_062731.1 (mRNA: NM_019757.1), 등), 인간 Cdh1 단백질 (예컨대, NCBI Nucleotide Accession No. NP_001129670.1 (서열번호 2) (mRNA: NM_001136198.1 (서열번호 1)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바에 따르면, 인산화된 Cdh1 (pCdh1) 단백질은 인간 Cdh1의 아미노산 서열을 기준으로 29번째부터 166번째까지의 아미노산 영역에 위치하는 아미노산 잔기들 중에서 선택된 1 내지 9개의 아미노산이 인산화된 것이며, 상기 1 내지 9개의 아미노산은 각각 독립적으로 Ser 및 Thr 중에서 선택된 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바에 따르면, 별도의 기재가 없는 한, 인산화된 Cdh1 단백질은 전장 단백질뿐 아니라 일부를 포함하는 단백질 단편을 모두 포괄하는 의미로 사용된다.
일 예에서, 인산화된 Cdh1 (pCdh1) 단백질은
(1) 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 32 번째 위치의 Thr, 36 번째 위치의 Ser, 40 번째 위치의 Ser, 70 번째 위치의 Ser, 121 번째 위치의 Thr, 138 번째 위치의 Ser, 146 번째 잔기 Ser, 151 번째 잔기 Ser, 및 163 번째 잔기 Ser로 이루어진 군 또는 이에 해당하는 인간 이외의 유기체 유래의 Cdh1 단백질의 아미노산 잔기들 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화된 단백질;
(2) 상기 하나 이상의 인산화된 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상 (최대값은 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수 또는 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수보다 하나 적은 개수임)의 아미노산(예컨대, 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산)을 포함하는 단백질 단편;
(3) 상기 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각 독립적으로 인산화 모방(mimetic) 아미노산 (예컨대, Aspartic acid (Asp) 및/또는 Glutamic acid (glu))으로 치환된 인산화된 Cdh1 단백질 유사체; 및
(4) 상기 치환된 인산화 모방 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상 (최대값은 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수 또는 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수보다 하나 적은 개수임)의 아미노산(예컨대, 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산)을 포함하는 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 단편
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 예에서, 인산화된 Cdh1 (pCdh1) 단백질은
(i) 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40 번째 위치의 아미노산 잔기인 Ser(Serine) 또는 이에 해당하는 다른 유기체 유래 Cdh1 단백질의 Ser 잔기가 인산화된 단백질,
(ii) 상기 인산화된 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상 (최대값은 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수 또는 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수보다 하나 적은 개수임)의 아미노산(예컨대, 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산)을 포함하는 단백질 단편,
(iii) 상기 Ser 잔기가 인산화 모방(mimetic) 아미노산 (예컨대, Aspartic acid (Asp) 및/또는 Glutamic acid (glu))으로 치환된 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및
(iv) 상기 치환된 인산화 모방 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상 (최대값은 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수 또는 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수보다 하나 적은 개수임)의 아미노산(예컨대, 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산)을 포함하는 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 단편
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기와 같이 인산화 또는 인산화 모방이 일어나는 인간 Cdh1 단백질의 잔기들, 예컨대, 40 번째 잔기, 마우스 Cdh1 단백질의 40 번째 잔기, 개구리 Cdh1 단백질의 40 번째 잔기, 효모 Cdh1 단백질의 42 번째 잔기에서 매우 잘 보존되어 있다. 따라서, 상기 기재된 인산화되거나 인산화 모방 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 종류 (Ser 또는 Thr) 및 위치는 인간 유래 Cdh1 단백질뿐 아니라 다른 유기체, 예컨대, 효모, 특히 양서류, 포유류 등의 척추 동물 유래 Cdh1 단백질에도 적용 가능하다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제를 포함하는 암세포 검출용 조성물을 제공한다. 다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 및 검출 기기를 포함하는 암세포 검출용 키트를 제공한다. 다른 예는 세포 시료에 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 암세포 검출 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이후에 상기 제제와 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와의 상호작용에 의한 검출 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 및 검출 기기를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 다른 예는 대상으로부터 분리된 세포 시료를 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자 검출 가능한 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 접촉시키는 단계 이후에 상기 제제와 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와의 상호작용에 의한 검출 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예는 암 진단을 위하여 대상으로부터 분리된 세포 시료에 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자 검출 가능한 제제를 접촉시켜 상기 제제의 검출 신호를 측정하는 방법을 제공한다.
상기 조성물 및/또는 키트가 적용되거나 상기 방법이 적용되는 대상은 모든 동물일 수 있으며, 예컨대 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류일 수 있다. 상기 조성물 및/또는 키트가 적용되거나 상기 방법에 사용되는 세포 시료는 상기 대상 (생체)으로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다. 상기 세포 시료는 동물, 예컨대, 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류로부터 얻어진 (분리된) 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 암에 걸리거나, 암의 위험이 있는 상기 동물로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이의 배양물일 수 있다.
상기 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제는 상기 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자에 특이적으로 상호작용하는, 예컨대, 특이적으로 인식하거나, 특이적으로 결합하는, 모든 물질 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 조성물 및/또는 키트 및/또는 방법에서의 인산화된 Cdh1 단백질은 앞서 설명한 바 ((1) 내지 (2) 또는 (i) 내지 (iv))와 같다.
상기 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 (상호작용하는 물질)은 상기한 바와 같은 인산화된 Cdh1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 상호작용 하는 모든 물질, 예컨대, 특이적으로 인식하거나, 특이적으로 결합하는, 모든 물질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 (상호작용하는 물질)은 앞서 설명한 바와 같은 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 잔기 (인간 Cdh1단백질을 기준으로, 32 번째 위치의 Thr, 36 번째 위치의 Ser, 40 번째 위치의 Ser, 70 번째 위치의 Ser, 121 번째 위치의 Thr, 138 번째 위치의 Ser, 146 번째 잔기 Ser, 151 번째 잔기 Ser, 및 163 번째 잔기 Ser로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 이에 해당하는 인간 이외의 유기체 유래의 Cdh1 단백질의 아미노산 잔기들 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기)가 인산화된 Cdh1 단백질, 인산화된 Cdh1 단백질의 단편, 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 단편, 및 상기 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체 및 단백질 유사체 단편을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 소분자 화합물 (small molecular chemical), 펩타이드 (예컨대, 압타머 등), 단백질 (예컨대, 항체, 항체 유사체 (펩티바디, 나노바디 등), 등), 핵산 분자 (올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 상호작용하는 물질은
앞서 설명한 바와 같은 인산화된 Cdh1 단백질, 즉 앞서 설명한 특정 위치의 아미노산 잔기가 인산화된 Cdh1 단백질, 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 소분자 화합물, 단백질 (예컨대, 항체), 압타머 (펩타이드 또는 올리고뉴클레오타이드) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상,
상기 특정 위치의 아미노산 잔기가 인산화된 Cdh1 단백질, 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및 이들의 단편을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 전부 또는 일부에 결합하는 소분자 화합물, 펩타이드 (예컨대, 압타머), 단백질 (예컨대, 항체), 핵산 분자(예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는
이들의 조합
일 수 있다.
상기 인산화된 Cdh1 단백질의 검출 가능한 제제는
일 예에서, 상기 인산화된 Cdh1 단백질의 검출 가능한 제제는 인산화된 Cdh1 단백질 내의 인산화된 펩타이드 (인간 Cdh1의 아미노산 서열을 기준으로 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역)인 Ser-Pro-Val-Ser-pSer-Pro-Ser-Lys-His-Gly (서열번호 3; pSer: 인산화된 세린을 의미) (또는 이에 해당하는 다른 유기체 유래의 Cdh1 단백질의 아미노산 영역) 또는 상기 인산화된 펩타이드를 포함하는 Cdh1 단백질 내 연속하는 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 아미노산을 포함하는 단백질 단편, 또는 전장(full-length)의 인산화된 Cdh1 단백질을 항원으로 이용하여 제작한 항체들 및 이들의 항원 결합 단편 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 마우스 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체는 하이브리도마로부터 얻어지거나, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.
상기 인산화된 Cdh1 단백질의 검출 가능한 제제와 인산화된 Cdh1 단백질과의 상호작용은 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 등의 검출 신호를 통하여 측정될 수 있으며, 이를 위하여, 검출 가능한 제제는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 측정을 통하여 검출 가능한 신호를 발생할 수 있는 표지 (예컨대, 특정 효소 기질, 형광 단백질, 발광 단백질, 방사성동위원소 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 검출 가능한 제제와 인산화된 Cdh1 단백질과의 상호작용은 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이법, 유세포 측정(Flow cytometry), 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 검출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 인산화된 Cdh1 단백질 (즉 앞서 설명한 특정 위치의 아미노산 잔기가 인산화된 Cdh1 단백질, 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및/또는 이들의 단편)을 암호화 하는 유전자 (전장DNA, cDNA 또는 mRNA)의 수준은 통상의 유전자 분석 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, 예컨대 상기 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 또는 압타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR; 예컨대 qPCR, real-time PCR 등), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 통상의 염기서열 시퀀싱 방법 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 프라이머는 상기 인산화된 Cdh1 단백질 (즉 앞서 설명한 특정 위치의 아미노산 잔기가 인산화된 Cdh1 단백질, 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및/또는 이들의 단편)을 암호화 하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000 bp 예컨대 10 내지 500 bp, 20 내지 200 bp, 또는 50 내지 200 bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100 bp, 예컨대, 5 내지 50 bp, 5 내지 30 bp, 또는 10 내지 25 bp 부위와 결합 가능 또는 혼성화 가능한 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브 또는 압타머는 총 길이가 5 내지 100 bp, 5 내지 50 bp, 5 내지 30 bp, 또는 5 내지 25 bp인 것일 수 있으며, 상기 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 상기 Cdh1 단백질의 40번째 위치의 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 연속하는 5 내지 100 bp, 5 내지 50 bp, 5 내지 30 bp, 또는 5 내지 25 bp의 유전자 단편과 결합 가능 또는 혼성화 가능한 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 '결합 가능'하다 함은 상기 단백질 또는 유전자 부위와 공유결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다.
상기 키트에 포함되는 검출 기기는 통상적인 형광, 발광 및/또는 방사선 검출이 가능한 기기를 의미하며, 특별한 제한은 없다.
상기 조성물, 키트, 또는 방법에 있어서, 상기와 같은 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선이 탐지되는 경우, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 (즉, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자과 특이적으로 상호작용하는 물질)와 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 상호작용이 검출되었다고 결정 (확인 또는 판단)할 수 있다.
상기 암세포 검출용 조성물, 키트, 또는 방법에 있어서, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 (즉, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 특이적으로 상호작용하는 물질)와 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자 간의 상호작용 (즉, 검출 신호)이 검출되는 경우, 시험 대상 시료에 암세포가 존재하는 것으로 결정 (확인 또는 판단)할 수 있다.
따라서, 상기 암세포 검출 방법은, 상기 검출하는 단계 이후에, 인산화된 Cdh1 (단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자)의 검출 가능한 제제 (즉, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 특이적으로 상호작용하는 물질)와 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자 간의 상호작용이 검출되는 경우, 시험 대상 시료에 암세포가 존재하는 것으로 결정 (확인 또는 판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 암 진단용 조성물, 키트, 또는 방법에 있어서, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 (즉, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 특이적으로 상호작용하는 물질)와 인산화된 Cdh1 유전자 및/또는 이를 암호화하는 유전자 간의 상호작용 (즉, 검출 신호)이 검출되는 경우, 시험 대상 시료가 유래한 대상을 암환자로 결정 (확인 또는 판단)할 수 있다.
따라서, 상기 암 진단에 정보를 제공하는 방법은, 상기 검출하는 단계 이후에, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제 (즉, 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 특이적으로 상호작용하는 물질)와 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자 간의 상호작용 (즉, 검출 신호)이 검출되는 경우, 시험 대상 세포 시료가 유래한 대상을 암환자로 결정 (확인 또는 판단)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 물질을 제공한다. 상기 물질은 인산화된 Cdh1 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 올리고뉴클레오타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 인산화된 펩타이드 (인간 Cdh1의 아미노산 서열을 기준으로 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역)인 Ser-Pro-Val-Ser-pSer-Pro-Ser-Lys-His-Gly (서열번호 3) (또는 이에 해당하는 다른 유기체 유래의 Cdh1 단백질의 아미노산 영역) 또는 상기 인산화된 펩타이드를 포함하는 Cdh1 단백질 내 연속하는 10개 이상 또는 15개 이상의 아미노산을 포함하는 단백질 단편, 또는 전장(full-length)의 인산화된 Cdh1 단백질을 항원으로 이용하여 제작한 항체 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 마우스 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체는 하이브리도마로부터 얻어지거나, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.
다른 예는 Cdh1의 인산화 부위의 아미노산이 결실 또는 인산화가 불가능한 아미노산으로 치환된 Cdh1 단백질의 변이체를 제공한다. 상기 Cdh1 단백질 변이체는 인간 Cdh1 단백질 (전장 단백질) 또는 이 중에서 적어도 29번째부터 166번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 Cdh1 단백질 단편에 있어서, 인간 Cdh1단백질을 기준으로, 32 번째 위치의 Thr, 36 번째 위치의 Ser, 40 번째 위치의 Ser, 70 번째 위치의 Ser, 121 번째 위치의 Thr, 138 번째 위치의 Ser, 146 번째 잔기 Ser, 151 번째 잔기 Ser, 및 163 번째 잔기 Ser로 이루어진 군 또는 이에 해당하는 인간 이외의 유기체 유래의 Cdh1 단백질의 아미노산 잔기들 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화 불가능한 아미노산 잔기 (예컨대, Ala 등)으로 치환되거나 결실된 Cdh1 단백질 변이체 또는 상기 하나 이상의 치환되거나 결실된 위치를 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상 (최대값은 (Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수 또는 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수보다 하나 적은 개수임)의 아미노산(예컨대, 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산)을 포함하는 Cdh1 단백질 변이체 단편을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 상기 Cdh1 단백질 변이체는 인간 Cdh1 단백질의 40번째 위치 또는 이에 해당하는 인간 이외의 유기체 유래의 Cdh1 단백질의 아미노산 잔기가 인산화 불가능한 아미노산 잔기 (예컨대, Ala 등)으로 치환되거나 결실된 전장 인간 Cdh1 단백질 (또는 인간 이외의 유기체 유래의 전장 Cdh1 단백질) 또는 상기 치환되거나 결실된 40번째 위치를 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상 (최대값은 (Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수 또는 Cdh1 단백질의 전체 아미노산 개수보다 하나 적은 개수임)의 아미노산 (예컨대, 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 연속하는 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 아미노산)을 포함하는 Cdh1 단백질 변이체 단편을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 Cdh1 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터일 수 있다.
상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스, 레트로바이러스 벡터 등 일수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 폴리뉴클레오타이드 (융합 프로모터)를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예를 들어, 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 Cdh1의 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 Cdh1의 인산화 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 세포 주기 조절용 조성물을 제공한다.
상기 Cdh1의 인산화 저해제는 Cdh1 단백질의 32 번째 잔기 Thr, 36 번째 잔기 Ser, 40 번째 잔기 Ser, 70 번째 잔기 Ser, 121 번째 잔기 Thr, 138 번째 잔기 Ser, 146 번째 잔기 Ser, 151 번째 잔기 Ser, 및 163 번째 잔기 Ser로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 인산화되는 것을 저해하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대, Ser 및/또는 Thr 탈인산화효소 (Ser/Thr phosphatases; EC 3.1.3.16)인 PP1 (Protein Phosphatase 1 (EC 3.1.3.16); multipolymeric enzyme; 예컨대, 알파 서브유닛 (NP_002699.1; EC 3.1.3.16) + 베타 서브유닛 (NP_002700.1; EC 3.1.3.16) + 감마 서브유닛 (NP_002701.1; EC 3.1.3.16)), PP2A (Protein Phosphatase 2A; heterodimeric enzyme; 예컨대, 알파 서브유닛 (NP_002706.1; EC 3.1.3.16) + 베타 서브유닛 (NP_001009552.1; EC 3.1.3.16)), Cdc14B (예컨대, NP_001070649.1, NP_003662.1, NP_201588.1 (이상 인간 유래), NP_001116461.1, NP_766175.3 (이상 마우스 유래) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 Cdh1의 인산화 저해 단계를 포함하는 세포주기 조절 방법을 제공한다. 상기 Cdh1의 인산화 저해 단계는 세포 시료에 Cdh1의 인산화 저해제를 접촉시키거나, Cdh1의 인산화 부위를 결실 또는 인산화 불가능한 아미노산으로 치환하여 Cdh1 변이체를 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 세포 주기 조절은 세포 주기를 정상화하여 무절제 또는 비정상적인 세포 분열 또는 세포 증식을 제어하는 것을 의미할 수 있다.
상기 세포 시료는 원핵 동물 또는 진핵 동물, 예컨대, 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류로부터 얻어진 (분리된) 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 세포 주기 조절을 필요로 하거나, 암에 걸리거나, 암의 위험이 있는 동물로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이의 배양물일 수 있다.
상기 재조합 벡터의 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 (gene bombardment) 등을 사용할 수 있으며, 예를 들어 리포좀-매개 형질감염법 (Lipofector reagent사용)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
다른 예는
Cdh1을 포함하는 세포 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준을 측정하는 단계; 및
상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준과 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준을 비교하는 단계
를 포함하는 세포 주기 조절제 또는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은, 상기 비교하는 단계 이전에, 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 인산화된 Cdh1 수준은 통상적인 인산화 수준 측정 방법 및/또는 인산화된 Cdh1에 특이적으로 결합하는 분자 (예컨대, 항체)를 이용한 통상적인 검출 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 스크리닝 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료 내의 인산화된 Cdh1 수준보다 낮은 경우 상기 후보 화합물을 세포 주기 조절제 또는 암 치료제의 후보 물질로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포 시료는 모든 동물, 예컨대, 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류로부터 얻어진 (분리된) 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다.
상기 후보 화합물은 상 각종 화합물, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 이외의 각종 화학 물질(chemicals), 천연물, 및 천연물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 것이 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 Cdh1의 인산화가 APC/C와 Cdh1과의 결합을 억제하여 정상적인 세포 조절을 저해함을 확인하여, 인산화된 Cdh1의 무절제한 세포 증식과 관련된 세포, 에컨대 암세포의 표지자로서의 용도를 제공하며, 이는 암세포 검출 및/또는 암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 Cdh1 단백질의 29-166 영역 부위 및 이에 해당하는 다른 유기체 유래 Cdh1 단백질 영역 부위의 아미노산 서열 정렬 결과를 보여준다 (Hs: 인간: Ms: 마우스: Xe: 개구리, Sc: 효모).
도 2는 pCS2-HA-hCdh1 플라스미드의 개열지도이다.
도 3은 인간 Cdh1 단백질을 ATP 존재 또는 부재 하에서 배양한 후, Cdh1 항체 및 Ser 40 인산화 특이적 Cdh1 항체를 각각 사용하여 얻어진 면역블롯 결과이다.
도 4는 Cdh1에 대한 siRNA를 처리한 후, Cdh1 항체 및 Ser 40 인산화 특이적 Cdh1 항체를 각각 사용하여 얻어진 면역블롯 결과이다.
도 5는 Cdh1과 APC/C와의 결합을 확인하기 위한 면역침강 결과 얻어진 산물의 면역블롯 결과를 보여주는 이미지이다.
도 6은 상기 도 5의 결과를 정량화하여 보여주는 그래프이다.
도 7은 야생형 Cdh1 및 변이 Cdh1 (S40A 및 S40D) 처리시의 세포 분열 관련 단백질 Cyclin B, Aurora A, 및 Polo-like kinase 1 (Plk1)의 발현 정도를 보여주는 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Cdh1의 보존된 서열 확인
다양한 종으로부터 유래하는 Cdh1의 일부 영역이 서로 보존되어 있음을 확인하기 위하여, 아미노산 서열 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&DATABASE=n/a&QUERY=&SUBJECTS=)dp 의하여 다양한 종 유래의 Cdh1의 아미노산 서열을 정렬하여 비교하였다. 사용된 Cdh1의 유래종 및 단백질 및 이의 코딩 유전자 (mRNA)의 NCBI accession number를 아래의 표 1에 정리하였다:
Cdh1 단백질 및 유전자 NCBI accession number
유래종 뉴클레오타이드 (mRNA) accession number 단백질 accession number
인간 (Homo sapiens; Hs) NM_001136198.1
(서열번호 1)		 NP_001129670.1
(서열번호 2)
마우스 (Mus musculus; Ms) NM_019757.1 NP_062731.1
개구리 (Xenopus laevis; Xe) Y14163 CAA74576.1
효모 (Saccharomyces cerevisiae; Sc) NM_001180868.1 NP_011512.1
상기 정렬 결과 Cdh1 단백질 중 인간 Cdh1 단백질의 29번째부터 166번째까지의 영역 및 이에 해당하는 다른 종 유래의 Cdh1 단백질 영역 부근의 아미노산 서열이 유래종과 무관하게 고도로 보존되어 있음을 확인하여 이 영역의 아미노산 서열 정렬 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 균류 (효모) 및 척추 동물 유래의 Cdh1 단백질의 29번째부터 166번째까지의 영역 부근의 아미노산 서열이 종과 무관하게 잘 보존되어 있으며, 9개의 인산화 위치 (즉, 32 번째 잔기 Thr, 36 번째 잔기 Ser, 40 번째 잔기 Ser, 70 번째 잔기 Ser, 121 번째 잔기 Thr, 138 번째 잔기 Ser, 146 번째 잔기 Ser, 151 번째 잔기 Ser, 및 163 번째 잔기 Ser)도 종과 무관하게 보존되어 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2: Cdh1의 Ser40이 치환된 변이체 제조
상기 실시예 1에서 확인된 9개의 보존된 인산화 위치가 실제로 Cdh1 단백질의 인산화에 중요한 위치임을 확인하기 위하여, 각 위치를 코딩하는 코돈에 점돌연변이를 유도하여 인산화가 불가능한 아미노산을 발현하도록 하였다.
대표적으로, 인간 Cdh1의 40번째 잔기인 Ser이 Ala (인산화 불가능; S40A로 표시) 또는 Asp (인산화 모방; S40D로 표시)으로 치환된 Cdh1을 발현하는 플라스미드를 제작하였다. 이를 위하여 pCS2-HA-hCdh1 (from Dr. Fang G at Stanford, HA: hemagglutinin, 도 2 (개열지도) 참조)를 주형으로 하고, QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies)를 사용하여, S40A를 포함하는 Cdh1 변이체 발현을 위한 pCS2-HA-Cdh1 (S40A) 및 S40D를 포함하는 Cdh1 변이체 발현을 위한 pCS2-HA-Cdh1 (S40D)를 각각 제조하였다.
실시예 3: Ser40이 인산화된 Cdh1에 대한 항체 제작
Keyhole limpet hemocyanin으로 표지된 인간 Cdh1의 36번째부터 45번째까지 아미노산을 포함하고, 40번째 아미노산인 Ser (이하, 'Ser 40'으로 표시)이 인산화된 포스포펩타이드 (phosphopeptide; SPVSpSPSKHG; 서열번호 3; pS: 인산화된 세린을 의미함)를 토끼에게 주사하여 면역화시킴으로써 폴리클로날 항체를 얻었다. 상기 항체는 Abfrontier (https://www.abfrontier.com)에 의뢰하여 제작하였다.
상기 얻어진 항체 중, Ser 40이 인산화되지 않은 펩타이드를 인식하는 항체는 인산화되지 않은 펩타이드가 결합된 친화도 수지 (affinity resin)를 사용하여 혈청으로부터 제거하였다. 그 후, Ser 40이 인산화된 펩타이드가 결합된 수지를 사용하여 항체를 더욱 정제하였다. 보다 구체적으로, N-hydroxysuccinimide (NHS)-activated agarose (Thermo Scientific)에 SPVSSPSKHG 펩타이드를 공유 결합시킨 친화도 수지 column에 면역화된 토끼 혈청을 통과시켜 비인산화 특이적 항체를 제거하고, 통과된 혈청을 SPVSpSPSKHG 펩타이드를 공유결합시킨 친화도 수지 column에 인산화 특이적 항체를 결합시킨 후, 산성 pH의 elution 완충액으로 결합을 떨어뜨린 후에 중화시켜, 인간 Cdh1 단백질의 Ser 40 인산화 특이적 항체를 분리 및 정제하였다.
상기 분리 및 정제된 인간 Cdh1 단백질의 Ser 40 인산화 특이적 항체의 특이성을 시험하였다. Cdk1/cyclin B 단백질 (New England Biolabs, Inc.) 존재 하에서, 인간 Cdh1 단백질을 ATP가 없는 경우 (-ATP)와 ATP가 있는 경우 (+ATP)에 각각 1시간 동안 배양시켰다. 그 후, 인간 Cdh1 단백질을 10, 20, 또는 50 ng의 양으로 각각 SDS-PAGE 로 전개시킨 후, Cdh1 항체 (mouse monoclonal anti-Cdh1 antibody (Ab-2); EMD Millipore)와 상기 분리 및 정제된 Ser 40 인산화 특이적 Cdh1 항체를 각각 사용하여 면역 블롯을 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 'Cdh1'은 Cdh1 항체를 사용한 면역블롯 결과, 'pCdh1'는 Ser 40 인산화 특이적 Cdh1 항체를 사용한 면역 블롯 결과를 각각 보여준다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, Ser 40 인산화 특이적 Cdh1 항체는 인산화된 Cdh1 만 (+ATP)을 탐지한 반면, 인산화되지 않은 Cdh1 (-ATP)을 탐지하지 못하였으며, 이러한 결과는 상기 정제된 Ser 40 인산화 특이적 Cdh1 항체가 인산화 특이적 반응을 나타냄을 보여주는 것이다.
또한, Cdh1에 대한 siRNA를 처리하고 상기 도 3과 동일한 시험을 의 결과를 얻은 시험과 동일한 시험을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
이 때 사용된 siRNA의 sense 서열은 다음과 같다:
siCdh1-1: 5'-GGAACACGCTGACAGGACA-3' (서열번호 4)
siCdh1-2: 5'-GAAGAAGGGTCTGTTCACG-3' (서열번호 5)
GFP siRNA (siGFP; 대조군): 5'-GTTCAGCGTGTCCGGCGAGTT-3' (서열번호 6)
도 4에 나타난 바와 같이, siRNA Cdh1 (siCdh1-1 및 siCdh1-2)를 처리하여 Cdh1을 제거한 경우, Ser 40 인산화 Cdh1 밴드가 관찰되지 않으며, 이러한 결과는 Ser 40 인산화 특이적 Cdh 항체가 Cdh1를 특이적으로 탐지함을 보여주는 것이다.
실시예 4: HeLa 세포에서 APC/C 복합체에 Cdh1의 결합 시험
상기 실시예 2에서 제작된 HA가 표지 된 야생형 또는 변이형 (S40D 또는 S40A) 인간 Cdh1을 발현하는 발현벡터를 HeLa 세포 (from ATCC, USA)에 Effectene 형질전환 시약 (from Qiagen) 또는 FuGENE 9 (from Roche) 시약을 이용하여 도입하였다.
이와 같이 얻어진 야생형 또는 변이형 인간 Cdh1를 발현하는 HeLa 세포들 (3x106개)에 2mM 타이미딘 과 100ng/ml 노코다졸 (Sigma-Aldrich)을 처리하여 세포들을 전중기 (prometaphase)에 동기화시켰다. 그리고 나서, 세포들을 50 mM Tris-HCl, pH 7.7, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, a proteinase inhibitor cocktail, 50 mM NaF, 및 0.5uM(micromole) OA를 포함하는 용액 1 mL 에서 초음파를 처리하여 분해하고, 얻어진 세포 용출액을 15,000 x g 속도 및 4℃ 온도 조건에서 30분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액 800uL(microliter)을 APC 성분 중 하나인 Cdc27 (cell division cycle protein 27)에 대한 항체 (H-300; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 10ug(microgram)으로 코팅된 protein A-겹합 비드 10uL와 함께 4℃ 온도 조건에서 4시간 동안 배양하여 면역침강(immuneprecipitation)을 수행하였다. 그리고 나서, 상기 비드를 500 mM NaCl를 포함하는 세포 용해 버퍼로 5번 세척하고, 원래의 용해 버퍼 (lysis buffer; 50 mM Tris-HCl, pH 7.7, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, a proteinase inhibitor cocktail, 50 mM NaF, 및 0.5 uM OA를 포함)로 2번 세척하였다. 그 후 비드에 결합된 단백질들은 SDS 샘플 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% beta-mercaptoethanol, 0.02% bromophenol blue)로 용출시켰으며, 얻어진 용출액은 Cdc27 (즉 APC/C)와 결합한 야생형 또는 변이형 인간 Cdh1을 포함한다.
상기 면역침강으로 얻어진 단백질 (IP)에 대하여 항 Cdc27 항체 (H-300; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 항 HA 항체 (F-7; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 사용하여 면역블롯을 수행하였다. 비교를 위하여 항 Cdc27 항체를 사용한 면역침강을 수행하지 않은 세포 분해물 (whole cell lysate; WCL)에 대해서도 면역블롯을 수행하였다.
상기 얻어진 면역블롯 이미지를 도 5에 나타내고, 이 중에서 면역침강(IP) 결과 얻어진 HA-Cdh1 밴드의 면역블랏 강도를 각각 대응하는 Cdc27 밴드의 면역블랏 강도에 의하여 normalization한 결과를 도 6에 나타내었다 (정량 수치는 3번 시험의 평균 ± 표준편차로 표현; *: P<0.05 (Student's t test). 도 5 및 도 6에서 확인되는 바와 같이, 면역침전 된 S40D(Ser40의 인산화 모방의 변이체) Cdh1의 양은 야생형 Cdh1의 약 30% 이하 수준이었고, S40A(Ser40의 인산화불가능 변이체) Cdh1과 비교해서는 약 20% 이하의 수준이었다. 이러한 결과는 Ser40 인산화가 Cdh1이 APC/C에 결합하는 것을 저해함을 나타낸다. APC/C와 Cdh1의 결합에 의하여 활성화된 APC/C는 cyclin B, Polo-like kinase 등과 같은 세포분열기 조절자를 분해시켜 세포분열기 제어 기능을 가지므로, Cdh1의 Ser40 인산화는 Cdh1과 APC/C와의 결합을 저해하여 세포 분열 제어 기능을 방해함을 입증할 수 있다.
실시예 5: Cdh1 변형 ( S40A 도입)에 의한 세포의 분열이 정지 시험
상기 실시예 2에서 제작된 HA가 표지 된 야생형 인간 Cdh1을 발현하는 발현벡터를 HeLa 세포 (from ATCC, USA)에 도입하여 야생형 Cdh1을 발현시킨 HeLa 세포와 Ser 40이 Ala으로 치환(S40A) 또는 Asp로 치환(S40D)된 인산화 모방 변이 Cdh1을 발현시킨 HeLa 세포에서 세포분열기에 중요한 Cyclin B, Aurora A, 및 Polo-like kinase 1 (Plk1)의 단백질 발현을 면역 블롯으로 측정하고 블롯 강도를 통계적으로 정량 분석하였다. 상기 면역 블롯에 사용된 항체들은 모두 Cell Signaling Technology로부터 구입하였다.
상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다 (정량 수치는 3번 시험의 평균 ± 표준편차로 표현; *: P<0.05 (Student's t test). 도 7에 보여지는 바와 같이, 야생형 발현 세포에서의 각 단백질의 발현을 100%로 기준할 때, Ser 40을 Asp로 치환(S40D)된 인산화 모방 변이 Cdh1를 발현시킨 HeLa 세포의 경우 단백질들의 발현량이 크게 차이가 없는 반면, Ser 40을 Ala으로 치환한 인산화불가 변이 Cdh1을 발현시킨 HeLa 세포에서의 Cyclin B 단백질 양은 약 48%로, Aurora A 발현은 약 58%로, Plk1 발현은 약 54%로 모두 유의미하게 감소하였다. 이는 Ser 40번 인산화가 되지 않는 Cdh1이 세포분열기로의 진행을 억제함을 나타낸다. 즉 Cdh1의 Ser 40번의 인산화 및 이를 통한 APC/C 활성 억제가 세포분열기 진행에 중요함을 보여주는 결과이다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Phosphor-Cdh1 peptide biomarker for detecting cancer cell <130> DPP20154297KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Cdh1 gene wherein CDS is from 35 to 1525 positions <400> 1 gctaaccttg ccgcgggccg agccctgcct cgccatggac caggactatg agcggcgcct 60 gcttcgccag atcgtcatcc agaatgagaa cacgatgcca cgcgtcacag agatgcggcg 120 gaccctgacg cctgccagct ccccagtgtc ctcgcccagc aagcacggag accgcttcat 180 cccctccaga gccggagcca actggagcgt gaacttccac aggattaacg agaatgagaa 240 gtctcccagt cagaaccgga aagccaagga cgccacctca gacaacggca aagacggcct 300 ggcctactct gccctgctca agaatgagct gctgggtgcc ggcatcgaga aggtgcagga 360 cccgcagact gaggaccgca ggctgcagcc ctccacgcct gagaagaagg gtctgttcac 420 gtattccctt agcaccaagc gctccagccc cgatgacggc aacgatgtgt ctccctactc 480 cctgtctccc gtcagcaaca agagccagaa gctgctccgg tccccccgga aacccacccg 540 caagatctcc aagatcccct tcaaggtgct ggacgcgccc gagctgcagg acgacttcta 600 cctcaatctg gtggactggt cgtccctcaa tgtgctcagc gtggggctag gcacctgcgt 660 gtacctgtgg agtgcctgta ccagccaggt gacgcggctc tgtgacctct cagtggaagg 720 ggactcagtg acctccgtgg gctggtctga gcgggggaac ctggtggcgg tgggcacaca 780 caagggcttc gtgcagatct gggacgcagc cgcagggaag aagctgtcca tgttggaggg 840 ccacacggca cgcgtcgggg cgctggcctg gaatgctgag cagctgtcgt ccgggagccg 900 cgaccgcatg atcctgcaga gggacatccg caccccgcca ctgcagtcgg agcggcggct 960 gcagggccac cggcaggagg tgtgcgggct caagtggtcc acagaccacc agctcctcgc 1020 ctcggggggc aacgacaaca agctgctggt ctggaatcac tcgagcctga gccccgtgca 1080 gcagtacacg gagcacctgg cggccgtgaa ggccatcgcc tggtccccac atcagcacgg 1140 gctgctggcc tcggggggcg gcacagctga ccgctgtatc cgcttctgga acacgctgac 1200 aggacaacca ctgcagtgta tcgacacggg ctcccaagtg tgcaatctgg cctggtccaa 1260 gcacgccaac gagctggtga gcacgcacgg ctactcacag aaccagatcc ttgtctggaa 1320 gtacccctcc ctgacccagg tggccaagct gaccgggcac tcctaccgcg tgctgtacct 1380 ggcaatgtcc cctgatgggg aggccatcgt cactggtgct ggagacgaga ccctgaggtt 1440 ctggaacgtc tttagcaaaa cccgttcgac aaaggtaaag tgggagtctg tgtctgtgct 1500 caacctcttc accaggatcc ggtaaacctg ccgggcagga ccgtgccaca ccagctgtcc 1560 agagtcggag gaccccagct cctcagcttg catggactct gccttcccag cgcttgtccc 1620 ccgaggaagg cggctgggcg ggcggggagc tgggcctgga ggatcctgga gtctcattaa 1680 atgcctgatt gtgaaccatg tccaccagta tctggggtgg gcacgtggtc ggggaccctc 1740 agcagcaggg gctctgtctc ccttcccaaa gggcgagaac cacattggac ggtcccggct 1800 cagaccgtct gtactcagag cgacggatgc cccctgggac cctcactgcc tccgtctgtt 1860 catcacctgc ccaccggagc cgcatgctct tcctggaact gcccacgtct gcacagaaca 1920 gaccaccaga cgccagggct gattggtggg ggcctgagac cccggttgcc cattcatggc 1980 tgcaccccac catgtcaaac ccaagaccag ccccaaggcc agaccaaggc atgtaggcct 2040 gggcaggtgg ctcggggcca ctggcggagc cagcctgtgg atccaagaga cagtccccac 2100 ctgggcttca cggcatcctt gcagccacct ctgctgtcac tgctcgaagc agcagtctct 2160 ctggaagcat ctgtgtcatg gccatcgccc ggcggtcagt gggcttcaga tgggcctgtg 2220 catcctggcc aagcgtcacc ctcacactgg aggaggatgt ctgctctgga cttatcaccc 2280 caggagaact gaacccggac ctgctcactg ccctggctgg agaggagcac aacagatgcc 2340 acgtcttcgt gcattcgcca acacgtgccc tcacagggcc agcgtcctcc ttccctgcgc 2400 aagacttgcg tcccccatgc ctgctgggtg gctgggtcct gtggaggcca gcagcggtgt 2460 ggcccccgcc cccaggctgc ctgtgtcttc acctgtcctg tccaccagcg ccaacagccg 2520 tggggaagcc aaggagaccc aaggggtcca ggaggtgggc gccctccatc cttcgagaag 2580 cttcccaggc tcctctgctt ctctgtctca tgctcccagg ctgcacagca ggcagggagg 2640 gaggcaaggc aggggagtgg ggcctgagct gagcactgcc ccctcacccc cccaccaccc 2700 cttcccattt catcggtggg gacgtggaga gggtggggcg ggctggggtt ggagggtccc 2760 acccaccacc ctgctgtgct tgggaacccc cactccccac tccccacatc ccaacatcct 2820 ggtgtctgtc cccagtgggg ttggcgtgca tgtgtacata tgtatttgtg acttttcttt 2880 ggatttgttt tgtgtttttg ttgactagtc ctggaaatgt ttgaggctag acggggaggg 2940 gccaggaccc acccactgct cctgggggat gaggtcctgg ttttaaagcc ccgtcatttc 3000 aagcgggtcg atcttccaca ttcactggag agactctccc cacctctgtc tgggtggggc 3060 gcggacccct cactgtgcgc ctgtgcaggg ggtgctggtg cacgtggcag tgtggatttc 3120 cagtggtcac ggtcttactg tttcaaggtt tttaaataag aaaaccaacc ctgccttcgc 3180 ccatgcccgc ccctgcccgc agttgccaaa gagccgcctt gtcgctgtgg gcgtcagggc 3240 ttggctggct cagtgcacaa cccacagtgg ccttcagagg ctcctcctgg gactgggaac 3300 cgccgcaggg ccaggcggac ggcgtgaggt ttgtgttggg gctggttctg cccatgctag 3360 ggggtggggg agctcccagg acagaccagc cttgtttctc atgtaatgca gtgacgctgt 3420 cattaaacac gtggattcat gtgtgg 3446 <210> 2 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human Cdh1 protein <400> 2 Met Asp Gln Asp Tyr Glu Arg Arg Leu Leu Arg Gln Ile Val Ile Gln 1 5 10 15 Asn Glu Asn Thr Met Pro Arg Val Thr Glu Met Arg Arg Thr Leu Thr 20 25 30 Pro Ala Ser Ser Pro Val Ser Ser Pro Ser Lys His Gly Asp Arg Phe 35 40 45 Ile Pro Ser Arg Ala Gly Ala Asn Trp Ser Val Asn Phe His Arg Ile 50 55 60 Asn Glu Asn Glu Lys Ser Pro Ser Gln Asn Arg Lys Ala Lys Asp Ala 65 70 75 80 Thr Ser Asp Asn Gly Lys Asp Gly Leu Ala Tyr Ser Ala Leu Leu Lys 85 90 95 Asn Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Glu Lys Val Gln Asp Pro Gln Thr 100 105 110 Glu Asp Arg Arg Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Lys Lys Gly Leu Phe 115 120 125 Thr Tyr Ser Leu Ser Thr Lys Arg Ser Ser Pro Asp Asp Gly Asn Asp 130 135 140 Val Ser Pro Tyr Ser Leu Ser Pro Val Ser Asn Lys Ser Gln Lys Leu 145 150 155 160 Leu Arg Ser Pro Arg Lys Pro Thr Arg Lys Ile Ser Lys Ile Pro Phe 165 170 175 Lys Val Leu Asp Ala Pro Glu Leu Gln Asp Asp Phe Tyr Leu Asn Leu 180 185 190 Val Asp Trp Ser Ser Leu Asn Val Leu Ser Val Gly Leu Gly Thr Cys 195 200 205 Val Tyr Leu Trp Ser Ala Cys Thr Ser Gln Val Thr Arg Leu Cys Asp 210 215 220 Leu Ser Val Glu Gly Asp Ser Val Thr Ser Val Gly Trp Ser Glu Arg 225 230 235 240 Gly Asn Leu Val Ala Val Gly Thr His Lys Gly Phe Val Gln Ile Trp 245 250 255 Asp Ala Ala Ala Gly Lys Lys Leu Ser Met Leu Glu Gly His Thr Ala 260 265 270 Arg Val Gly Ala Leu Ala Trp Asn Ala Glu Gln Leu Ser Ser Gly Ser 275 280 285 Arg Asp Arg Met Ile Leu Gln Arg Asp Ile Arg Thr Pro Pro Leu Gln 290 295 300 Ser Glu Arg Arg Leu Gln Gly His Arg Gln Glu Val Cys Gly Leu Lys 305 310 315 320 Trp Ser Thr Asp His Gln Leu Leu Ala Ser Gly Gly Asn Asp Asn Lys 325 330 335 Leu Leu Val Trp Asn His Ser Ser Leu Ser Pro Val Gln Gln Tyr Thr 340 345 350 Glu His Leu Ala Ala Val Lys Ala Ile Ala Trp Ser Pro His Gln His 355 360 365 Gly Leu Leu Ala Ser Gly Gly Gly Thr Ala Asp Arg Cys Ile Arg Phe 370 375 380 Trp Asn Thr Leu Thr Gly Gln Pro Leu Gln Cys Ile Asp Thr Gly Ser 385 390 395 400 Gln Val Cys Asn Leu Ala Trp Ser Lys His Ala Asn Glu Leu Val Ser 405 410 415 Thr His Gly Tyr Ser Gln Asn Gln Ile Leu Val Trp Lys Tyr Pro Ser 420 425 430 Leu Thr Gln Val Ala Lys Leu Thr Gly His Ser Tyr Arg Val Leu Tyr 435 440 445 Leu Ala Met Ser Pro Asp Gly Glu Ala Ile Val Thr Gly Ala Gly Asp 450 455 460 Glu Thr Leu Arg Phe Trp Asn Val Phe Ser Lys Thr Arg Ser Thr Lys 465 470 475 480 Val Lys Trp Glu Ser Val Ser Val Leu Asn Leu Phe Thr Arg Ile Arg 485 490 495 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phosphorylated human Cdh1 peptide from 36 to 45 positions of human Cdh1 protein, wherein the 5th residue is phosphorylated <400> 3 Ser Pro Val Ser Ser Pro Ser Lys His Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siCdh1-1 <400> 4 ggaacacgct gacaggaca 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siCdh1-2 <400> 5 gaagaagggt ctgttcacg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siGFP <400> 6 gttcagcgtg tccggcgagt t 21

Claims (20)

  1. 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제를 포함하는, 암세포 검출용 조성물로서,
    상기 인산화된 Cdh1 단백질은,
    (1) 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40번째 잔기 Ser 아미노산이 인산화된 Cdh1 단백질,
    (2) 상기 인산화된 Cdh1 단백질 (1) 중의 상기 인산화된 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 인산화된 Cdh1 단백질 단편,
    (3) 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40번째 아미노산 영역에 위치하는 아미노산 잔기 Ser이 Asp 또는 Glu로 치환된 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및
    (4) 상기 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 (3) 중의 상기 치환된 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 단편
    으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암세포 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Cdh1 단백질은 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 Cdh1 단편인, 암세포 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Cdh1 단편은 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 적어도 29번째부터 166번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 Cdh1 단편인, 암세포 검출용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제는 상기 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용 가능한 화합물, 펩타이드, 단백질 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암세포 검출용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인산화된 Cdh1 단백질의 검출 가능한 제제는 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40번째 잔기 Ser의 인산화에 특이적인 항체인, 암세포 검출용 조성물.
  8. 포유동물로부터 분리된 세포 시료에 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제를 접촉시키는 단계, 및 상기 제제와 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와의 상호작용에 의한 검출 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 암세포 검출 방법으로서,
    상기 인산화된 Cdh1 단백질은,
    (1) 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40번째 잔기 Ser 아미노산이 인산화된 Cdh1 단백질,
    (2) 상기 인산화된 Cdh1 단백질 (1) 중의 상기 인산화된 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 인산화된 Cdh1 단백질 단편,
    (3) 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40번째 아미노산 영역에 위치하는 아미노산 잔기 Ser이 Asp 또는 Glu로 치환된 인산화된 Cdh1 단백질 유사체, 및
    (4) 상기 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 (3) 중의 상기 치환된 아미노산을 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 인산화된 Cdh1 단백질 유사체 단편
    으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암세포 검출방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 Cdh1 단백질은 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 적어도 36번째부터 45번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 Cdh1 단편인, 암세포 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Cdh1 단편은 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 적어도 29번째부터 166번째까지의 아미노산 영역을 포함하는 Cdh1 단편인, 암세포 검출 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 가능한 제제는 상기 인산화된 Cdh1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용 가능한 화합물, 펩타이드, 단백질 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암세포 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 인산화된 Cdh1의 검출 가능한 제제는 서열번호 2의 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 40번째 잔기 Ser의 인산화에 특이적인 항체인, 암세포 검출 방법.
  15. 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로, 40 번째 잔기 Ser이 Ala로 치환된 Cdh1 단백질 또는 상기 치환된 40번째 아미노산 잔기를 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 Cdh1 단백질 단편으로 이루어진, Cdh1 단백질 변이체.
  16. 삭제
  17. 인간 Cdh1 단백질의 아미노산 서열을 기준으로, 40 번째 잔기 Ser이 Asp 또는 Glu로 치환된 Cdh1 단백질 또는 상기 치환된 40번째 아미노산 잔기를 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 Cdh1 단백질 단편으로 이루어진, Cdh1 단백질 변이체.
  18. 삭제
  19. 제15항의 Cdh1의 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 Cdh1의 인산화 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 Cdh1의 인산화 저해제는 Ser 또는 Thr의 탈인산화효소 (EC 3.1.3.16)인, 세포 주기 조절용 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Ser 또는 Thr의 탈인산화효소는 Cdc14B, PP1 (Protein Phosphatase 1), PP2A (Protein Phosphatase 2A), 또는 이들의 조합인, 세포 주기 조절용 조성물.
KR1020160084889A 2016-07-05 2016-07-05 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커 KR101910168B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160084889A KR101910168B1 (ko) 2016-07-05 2016-07-05 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160084889A KR101910168B1 (ko) 2016-07-05 2016-07-05 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180005023A KR20180005023A (ko) 2018-01-15
KR101910168B1 true KR101910168B1 (ko) 2018-10-19

Family

ID=61001281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160084889A KR101910168B1 (ko) 2016-07-05 2016-07-05 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101910168B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150141262A1 (en) 2012-06-13 2015-05-21 King Abdullah University Of Science And Technology Methylation biomarkers for breast cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150141262A1 (en) 2012-06-13 2015-05-21 King Abdullah University Of Science And Technology Methylation biomarkers for breast cancer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mark C Hall et al., Multi-kinase Phosphorylation of the APC/C Activator Cdh1 Revealed by Mass Spectrometry, Cell Cycle(2004), vol.3(10): e38-e44.
Qinghua Xi et al, Tumor Biol (2015), vol. 36, pp. 4939-4948.
Takeo Fujita et al, Int J Cancer (2009), vol. 125, pp. 826-836.
임정미, Local accumulation of hydrogen peroxide in centrosome through peroxiredoxin I phosphorylation by cdk1 is required formitotic entry (2012), 이화여자대학교 대학원 생명 · 약학부 박사학위 청구논문, pp 1-141.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180005023A (ko) 2018-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duda et al. Structure of a glomulin-RBX1-CUL1 complex: inhibition of a RING E3 ligase through masking of its E2-binding surface
Levkowitz et al. Ubiquitin ligase activity and tyrosine phosphorylation underlie suppression of growth factor signaling by c-Cbl/Sli-1
KR100331363B1 (ko) 사이클린복합체재배열및그것과관련된용도
US7947468B2 (en) Methods
Kim et al. Phosphorylation and transactivation of Pax6 by homeodomain-interacting protein kinase 2
CN101080638A (zh) Cop1分子及其用途
EP2534258B1 (en) Dual activity kinase domains and uses thereof
AU2001265947B9 (en) Enzymatic assays for screening anti-cancer agents
US7138236B1 (en) Interactions of ATM, ATR or DAN-PK with p53
KR101910168B1 (ko) 암세포 검출용 인산화 Cdh1 펩타이드 바이오마커
AU2001265947A1 (en) Enzymatic assays for screening anti-cancer agents
US20120213801A1 (en) Phosphorylated Twist1 and cancer
WO2001038527A1 (fr) Nouvelle proteine tab2
JP4895808B2 (ja) Ｃｏｐｄキナーゼ（ｒｃキナーゼ）において制御される、キナーゼの制御
AU2018322286B2 (en) Fusion protein of DCTN1 protein with RET protein
US7790843B2 (en) Cypin polypeptide and fragments thereof
JP2007282628A (ja) 抗癌剤のスクリーニング方法
US7901906B2 (en) Targeting of MKRN1 for identifying cancer treatment agents
US20050112709A1 (en) Histone h3methyltransferase polypeptide
US20100297623A1 (en) NOVEL HUMAN ssDNA BINDING PROTEINS AND METHODS OF CANCER DIAGNOSIS
US20070031927A1 (en) Biological system and assay for identifying inhibitors of tubulin glutamylases
JP2006512048A (ja) 有糸分裂の阻害剤の同定
KR20190076324A (ko) 세포 내 침투능을 갖는 항 stat3 이중특이 항체
Abshire et al. https://www. jbc. org/cgi/doi/10.1074/jbc. RA120. 012618 The latest version is at
JP2005245274A (ja) 細胞増殖促進剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant