KR100759389B1 - 803번 아스파라진 잔기가 수화된 ＨＩＦ-1α를 특이적으로인식하는 단일클론항체 및 항원 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 항원에 관한 것으로, 아스파라진 잔기가 수화된 펩티드를 사용하여 단일클론항체를 제조하였다. 본 발명의 단일클론항체는 FIH-1에 의해 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α에 대하여 반응성이 있지만 803번 아스파라진 잔기가 수화되지 않은 HIF-1α에 대해서는 반응이 없으므로, FIH-1 효소 활성 측정 및 억제제 탐색에 유용하게 사용할 수 있다.
Hypoxia inducible factor 1α

Description

803번 아스파라진 잔기가 수화된 ＨＩＦ-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 항원 펩티드{A Monoclonal antibody for detection of hydroxylated asparagine 803 of HIF-1α and antigen peptide}
도 1은 수화된 아스파라진 잔기 도입을 위한 (2S,3R)-L-threo-FmocNH-β-OTBDMS-Asn-OH[Fmoc-Asn(βO-TBDMS)]의 구조이고,
도 2는 항체 제조를 위해 사용된 펩티드의 서열 및 분자량 분석 결과이고,
도 3은 항원 펩티드와 BSA 및 OVA 단백질을 결합시킨 결과로서, M은 마커를, 1은 EVN(OH)-BSA, EVN(OH)-OVA, GGL(OH)-BSA 및 GGL(OH)-OVA를 나타내고,
도 4는 항체 역가 분석을 위하여 사용한 HIF-1α의 C-말단 펩티드 서열 및 분자량 분석 결과이고,
도 5는 FIH-1(Factor inhibiting HIF-1α)을 정제한 결과이고,
도 6은 FIH-1에 의하여 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α의 C-말단 펩티드들의 구조 및 분자량을 분석한 결과이고,
도 7은 면역효소 분석법(ELISA)에 의하여 수화 펩티드 및 비수화 펩티드를 단일 클론 항체와 결합시킨 결과로서, A는 수화 펩티드 및 비수화 펩티드와 단일클론항체(SHN-HIF1α) 농도에 따른 반응 결과이고, B는 수화 펩티드 및 비수화 펩티 드 항원 농도에 따른 단일클론항체의 반응 결과로, ○,△ 및 □는 비수화 펩티드를, ●, ▲ 및 ■는 수화 펩티드를 나타낸 것이고,
도 8은 FIH-1 억제제 활성 측정시 항체 유용성을 측정한 것으로서, A는 수화된 펩티드 양을 조절하여 반응성을 확인한 결과이고, ○는 0% 수화, ●는 20% 수화, ▲는 40% 수화, ■는 70% 수화, ◆는 100% 수화를 나타내고, B는 FIH-1 활성 억제제인 NOG(N-oxyalylglycine)의 농도에 따른 수화 펩티드의 생성을 SHN-HIF-1α로 분석한 결과이고, ■는 0.2mM NOG, ◆는 0.4mM NOG, ▲는 1mM NOG, ●는 5mM NOG를 나타낸다.
본 발명은 FIH-1에 의해 803번 아스파라진이 수화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 생산하기 위한 항원 펩티드에 관한 것이다.
생체 세포 내 산소 농도는 세포 생존에 매우 필수적인 요소이나, 산소 농도가 높은 경우 산소 스트레스에 의해 활성 산소가 과다하게 발생하므로 세포사멸을 유발하고, 정상적으로 산소가 공급되고 있는 상태(normoxia)에서는 PHD(proline hydroxylase) 및 FIH-1(Hypoxia-inducible factor HIF inhibitor-1)에 의하여, 혈관 생성 및 조직의 에너지 공급에 중요한 HIF-1α의 활성이 억제된다. 낮은 산소 농도(hypoxia)에서는 산소를 기질로 사용하는 PHD 및 FIH-1의 활성이 억제되어 HIF-1α가 활성화되어 HIF-1β와 결합하여 핵으로 이동하여, 300/CBP 등의 단백질과 결합한 후, HRE 프로모터에 결합하여 혈관 생성 및 세포 내 에너지 공급에 필수적인 단백질들의 발현을 증가시킨다(Nathali 등, Biochem. Pharmacol., 68, 971-980, 2004). 그러나 산소공급이 원활하지 않을 경우에도 PHD 및 FIH-1의 활성이 억제되지 않아 HIF-1α의 활성이 억제되면서 혈관 생성이 억제되어 뇌세포의 괴사가 일어나 뇌졸증을 유발한다.
FIH-1은 최근 발견되어 그 활성이 알려진 효소로 그 3차 구조가 밝혀졌다 (Lee 등, J. Biol . Chem, 278, 7558-7563, 2003; Elkins 등, J. Biol . Chem , 278, 1802-1806, 2003). FIH-1도 PHD와 마찬가지로 Fe2 +를 보조인자(cofactor)로 사용하고, 2-옥소글루타레이트(oxoglutarate), 산소(O2)를 기질로 사용하여 HIF-1α의 803 아스파라진 잔기를 수화시키는 것이 밝혀졌다(Lando 등, Science, 295, 858-865, 2002). 상기 효소는 PHD보다 2-옥소글루타레이트 및 산소에 대한 Km 값이 2배 이상 낮아, PHD가 작용할 수 없는 산소 분압에서도 일부 기능을 할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Koivunen 등, J. Biol . Chem ., 279, 9899-9904, 2004). 뇌졸증 발병시 세포내 산소 분압이 낮아지는데 이때 FIH-1이 계속 기능을 하면, 산소공급을 위한 새로운 혈관 형성이 계속 억제되어 많은 뇌세포가 괴사될 가능성이 높아진다. 그러므로 FIH-1의 억제제는 새로운 뇌졸중 치료제로서 사용될 수 있는 가능성이 높다.
FIH-1 활성을 측정하는 방법으로는 효소 반응 산물인 이산화탄소(CO2) 발생을 측정하거나(Koivunen 등, J. Biol . Chem., 279, 9899-9904, 2004), 펩티드 기질을 이용한 질량 증가(산소원자 첨가로 16 증가) 측정법(Lando 등, Science, 295, 858-865, 2002) 및 p300과 HIF-1α결합이 HIF-1α의 수화에 의하여 억제된다는 점을 이용하여, HIF-1α/p300 결합 억제를 측정하는 방법(Freedman 등, Nature Struct . Biol., 10, 505-512, 2003)등이 사용될 수 있다. 그러나 이산화탄소 발생을 측정하기 위해서는 특정 장치 및 방사선 동위원소를 사용하여 수천 종 이상의 시료의 고속측정(high throughput screening; HTS)이 용이하지 않으며, FIH-1에 의해 수화된 펩티드가 p300과 결합 억제를 측정하는 방법은 펩티드 농도 조절 등 검색조건이 까다로운 단점이 있다. 또한 질량 분석에 의한 FIH-1 활성 측정 방법은 HIF-1α 펩티드 기질 농도가 높아야 하므로, 효소가 많이 소비되고 정량적이지 않아 HTS에 사용할 수 없다. 그러므로 수화된 HIF-1α 펩티드에 특이성이 높은 단일클론항체 개발이 필요하다.
본 발명의 발명자들은 FIH-1 억제제의 HTS에 이용할 수 있고, 나아가서 세포생물학 분야에서 아스파라진이 수화된 HIF-1α 연구에 이용될 수 있는 항체를 제조하고자 시도하였으며, 그 결과, 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 개발함으로서 본 발명을 완성하였다. .
본 발명의 주된 목적은 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 803 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 제공한다.
또한 상기 단일클론항체를 생산하는 세포주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항체 제작을 위한 아스파라진 잔기가 수화된 항원 펩티드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항체를 이용하여 FIH 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 단일클론항체는 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하며, 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 생산된다.
1) HIF-1α의 활성부분으로부터 유래된 단편으로 HIF-1α의 803번 잔기가 수화된 아스파라진을 포함하는 펩티드를 준비하는 단계;
2) 상기 펩티드를 이용하여 생쥐에 면역하는 단계;
3) 생쥐의 비장세포를 골수종 세포주와 융합하고 단계 1)의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 및
4) 단계 3)의 세포주로부터 단일클론항체를 분리 정제하는 단계.
본 발명에 있어서, 1) 단계에서 사용되는 펩티드는 HIF-1α의 아스파라진 잔기가 수화되는 활성화 부분에서 유래한 것으로서 아스파라진 잔기가 수화된 서열번호 5으로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항원 펩티드는 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩티드 서열은 아미노산 말단 및 카르복시 말단에 항체 생산력을 높이거나 운반 단백질을 결합시키기 위해 다른 아미노산 및 화학물질이 결합될 수 있으며, 본 발명에서는 운반 단백질로서 BSA 또는 OVA를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 항원 펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가진 펩티드는 3번 아스파라진이 수화된 것이 바람직하며, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가진 펩티드는 11번 아스파라진이 수화된 것이 바람직하다. 상기 펩티드는 9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)기를 Nα-아미노 보호기로 사용하는 고상 합성법에 의하여 합성될 수 있다. 수화 아스파라진 잔기 도입을 위해 본 발명자들은 펩티드 항원 합성시 Fmoc-Asn(βO-TBDMS)(도 1)을 이용하였다. 상기 펩티드 합성은 decyclohexylcarbodiimide(DCC) 및 N-hydroxyboenzotriazole(HOBt)를 사용하는 방법으로 합성하였으며, 각각의 합성 펩티드를 HPLC로 정제하여 MALDI-TOF 분석으로 확인하고 각각 EVN(OH), GGL(OH)로 명명하였다(도 2 참조). 상기 합성한 펩티드 항원들은 운반 단백질 BSA 또는 OVA에 결합시켰다. EVN(OH)-BSA 및 EVN(OH)- OVA는 GMBS(N-γ-maleimidobutyryloxylsuccinimide ester)를 사용하여 결합시키고, GGL(OH)-BSA 및 GGL(OH)-OVA는 GA(glutaraldehyde)를 사용하여 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 2) 단계에서는 각각의 펩티드 항원을 생쥐(mouse)에 투여하여 펩티드에 대한 항체를 유도한다. 상기 펩티드의 투여 방법 및 사용 방법은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 특별히 제한되는 것이 아니다. 상기 펩티드는 보조제(adjuvant)와 조합되어 투여할 수 있다. 본 발명에서는 펩티드를 Balb/c 생쥐의 복강에 주사하여 항체 형성을 유도하였다.
본 발명에 있어서, 3)단계에서는 펩티드 항원으로 면역화된 생쥐의 비장세포를 적출한 후 골아종 세포주와 융합하고, 수화된 펩티드에 대하여 특이성이 높은 항체를 생산하는 세포주를 선별하였다. 선별된 세포주에서 생산한 단일클론항체는 SHN-HIF1α라 명명하였으며, 이소타입결정(isotyping) 결과 상기 단일클론항체는 IgG2b이며, κ가벼운 사슬임을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 4) 단계에서는 상기 제작된 단일클론항체를 분리 및 정제는 당업자에게 보편적으로 알려진 방법으로 수행하였다.
본 발명의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 상기 제조방법의 단계 3의 과정 중에 제조되고 선별된 세포주로서 2005년 9월 26일자로 대한민국 소재 한국생명공학연구원 생명자원센터에 수탁번호 KCTC10850BP로 기탁되었다.
본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 FIH-1 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. FIH-1은 뇌졸증 등 세포에 산소 및 영양분이 필요한 경우 표적이 되는 효소이므로 FIH-1 활성 억제제는 뇌졸증 치료제의 후보물질이다. 그러므로 FIH-1 활성 억제 후보물질을 투여하고 본 발명의 단일클론항체를 이용하여 HIF-1α의 활성 정도를 측정함으로, 투여된 후보물질이 FIH-1 활성억제 효과를 갖는지를 간접적으로 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정하는 것은 아니다.
< 실시예 1> 수화 아스파라진이 포함된 펩티드 항원 및 항체 분석용 펩티드 제작
면역화를 위한 펩티드 항원(도 2 참조) 및 항체 분석용 펩티드(도 4 참조)의 합성은 9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)기를 Nα-아미노 보호기로 사용하는 고상합성법에 의하여 수행하였다(Merrifield, Science, 232, 341, 1986). 수화 아스파라진 잔기 도입을 위해 본 발명자들이 합성한 Fmoc-Asn(βO-TBDMS)(도 1 참조)를 제외한 다른 Fmoc-아미노산들 및 Fmoc-아미노산이 붙은 레진들은 Novabiochem사(Swiss)에서 구입하여 사용하였다. 합성은 dicyclohexylcarbodiimide(DCC) 및 N-hydroxybenzotriazole(HOBt)를 사용하는 방법을 이용하여 합성하였으며, 최종 합성이 끝난 다음, Fmoc 보호기를 piperidine으로 제거하고, trifluoroacetic acid:water:ethandithiol:triisopropylsilane이 95:2.5:2.5:1로 들어있는 용액으로 2시간 동안 처리하여 크루드(crude) 펩티드를 얻었으며, HPLC로 정제한 다음 분자량을 MALDI-TOF 분석에 의하여 확인하고 펩티드 항원은 EVN, GGL로, 바이오틴으로 표지된 항체 분석용 펩티드는 bDES35 및 bSMD로 각각 명명하였고 서열번호 1,2,3, 및 4로 기재되는 아미노산 서열을 가졌다 (도 2 및 4 참조).
< 실시예 2> 펩티드-단백질 결합체 제조
실시예 1에서 합성된 펩티드 항원들을 생쥐에 면역시키기 위하여 펩티드-단백질 결합체를 제조하였다. 이때 운반 단백질로는 BSA(bovine serum albuimin) 또는 OVA(ovalbumin)를 사용하였다.
EVA(OH) 펩티드(도 2 참조)를 단백질에 결합시키기 위해 사용한 시료로 GMBS(N-[γ-maleimidobutyryloxy]succinimide ester)를 사용하였다. 먼저 2mg BSA 또는 OVA 단백질을 200㎕ 결합완충액(0.083M sodium phosphate, 0.9M sodium chloride 및 0.1M ethylenediaminedihydrochloride, pH 7.2)에 녹이고, 상기 반응물에 10㎎/㎖ 농도로 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹아 있는 GMBS 20㎕를 첨가하고, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응액은 결합완충액으로 평형시킨 Sephadex G50 culumn에 통과시켜 GMBS로 활성화된 단백질을 얻었으며, 1㎎의 펩티드 분말을 첨가하여 녹인 다음 2시간 동안 반응시켰다. 최종 반응액은 분자량 10,000 이하를 투과시키는 투석막을 이용하여 PBS로 투석시켜, 단백질 정량 후 냉동 보관하였다. 펩티드-단백질 결합체는 EVN(OH)-BSA 또는 EVN(OH)-OVA라 명명하였다.
GGL(OH) 펩티드(도 2 참조)와 단백질 결합은 glutaraldehyde(GA)를 이용하여 수행하였다. 먼저 1㎎ BSA 또는 OVA 단백질과 0.5㎎의 펩티드를 PBS에 녹이고, 이 용액에 2㎕의 25% glutaraldehyde를 첨가하고 1시간 동안 반응시키고, 다시 2㎕의 25% glutaraldehyde를 더 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 GA 및 펩티드는 실시예 1의 방법같이 투석시켜 제거하여 냉동보관하였다. 펩티드-단백질 결합체는 GGL(OH)-BSA 또는 GGL(OH)-OVA라 명명하였다.
상기 형성된 EVN(OH)-BSA, EVN(OH)-OVA, GGL(OH)-BSA 또는 GGL(OH)-OVA 결합체를 하기와 같은 SDS-PAGE 방법으로 확인하였다. 먼저 단백질-펩티드 결합체 3-5㎍을 5㎕의 시료완충액(50 mM Tris-HCl, 2% SDS, 15% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.024% bromophenol blue)과 혼합하여 95℃에서 2분간 가열한 다음, 10% SDS-PAGE에 로딩한 후 젤 당 20 mA에서 1시간 30분간 전기영동을 수행하였으며, 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 염색액(0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 50% 메탄올, 10% 초산)에 30% 메탄올, 10% 초산이 들어 있는 용액에 탈색시켜 염색된 단백질을 관찰한 결과, 단백질이 펩타이드와 잘 결합되어 있음을 확인하였다 (도 3 참조).
< 실시예 3> 항 펩티드 항체 생산 및 단일클론 항체 제조
실시예 2 방법으로 얻어진 각각의 펩티드-단백질 결합체는 30㎍/100㎕ 농도로 PBS에 희석하고, 희석액 100㎕를 complete Freund's adjuvant 100㎕와 혼합하여 이멀젼화시키고, Balb/c 생쥐의 복강에 주사하였다. 이후 2주 간격으로 30㎍/100 ㎕ 농도로 PBS에 희석한 펩티드-단백질 결합체 100㎕를 incomplete Freund's adjuvant 100㎕와 혼합하여 이멀젼화하고, 복강에 3회 주사한 후 최종 주사였다. 일주일 혈청으로 펩티드에 대한 면역활성을 분석한 후 면역이 잘된 생쥐에 30㎍/100㎕ 농도의 펩티드-단백질 결합체 100㎕를 꼬리 정맥에 주사하였다. 3일 후 생쥐에서 비장(spleen)을 적출한 후, 비장세포를 분리하고 무혈청 RPMI1640 배지로 세척하고, 동일 배지로 세척한 P3/NS1/1-Ag4-1 골수종(myeloma) 세포와 평균 분자량 1450의 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 1㎖을 1분간 가하여 주고, 10㎖의 무혈청 RPMI1640 배지를 서서히 첨가해 주면서 5분간 방치하여 융합시켰다. 융합시킨 세포는 동일 배지로 세척한 다음, 10% 태아 소혈청이 포함된 RPMI1640 배지를 비장 1개당 30-40㎖ 첨가하여 현탁하였다. 이후 96 웰 플레이트(well plate)에 100㎕씩 분주하였다. 3시간 동안 배양한 후 2 × HAT(hypoxanthine-amin㎖opterine-thymidine)이 포함된 RPMI1640 배지 100㎕를 가한 후 5% 이산화탄소, 37℃ 조건으로 세포 배양기에서 7-10일간 배양한 다음, 100㎕의 배지로 수화된 HIF-1α 펩티드 특이 활성을 도 3과 같은 방법에 조사하였다. 이중 특이성이 높은 항체를 생산하는 세포들은 웰 당 2/3 세포가 들어가도록 희석한 다음, 최종적으로 수화 펩티드에 특이성이 매우 높은 항체를 생산하는 세포주를 선별하였다. 상기 세포주는 EVA(OH)-OVA로 면역시킨 생쥐로부터 단일클론항체를 얻었으며 이를 SHN-HIF1α라 명명하였으며, 이소타입결정 결과 중쇄 불변지역은 IgG2b로 밝혀졌고, 경쇄 불변영역은 카파(κ) 이소타입을 가지는 것으로 확인되었다.
< 실시예 4> HIF -1α 펩티드를 수화시키기 위한 FIH -1의 분리정제
pET-28a 벡터에 삽입한 재조합 pET-FIH-1 유전자를 대장균[E. coli BL21(DE3)]에 삽입한 다음, 항생제(50㎍/㎖ kanamycine)가 첨가된 LB(Luria-Bertani) 아가 플레이트에서 콜로니(colony)를 선별하였고, 이를 LB 배지에서 600 nm 흡광도가 0.6-0.8 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이후 0.5mM IPTG (isopropyl－β－thiogalactoside)를 첨가하여 18℃에서 16-20 시간 동안 배양하여 6×His 테그된 FIH-1의 발현을 유도하였고, 6,000RPM에서 5분간 원심분리를 수행하여 FIH-1을 발현하는 대장균을 수거하였다. 이후 대장균을 완충액(buffer) A(20mM Tris-HCl (pH7.5), 300mM NaCl, 1mM PMSF 및 5% glycerol)에 2g/㎖ 농도로 현탁시키고 초음파분쇄법으로 세포를 파괴한 다음, 16,500rpm에서 30분간 원심분리를 수행하여 상등액을 수거하였다. 상등액 중 20㎖은 글리세롤(glycerol)이 첨가되지 않은 완충액 A로 평형시킨 5㎖ Ni-NTA-agarose(Invitrogen, USA)에 첨가한 다음 같은 완충액 100㎖로 젤을 세척하고 완충액 B(20mM Tris-HCl pH7.5, 300mM imidazole, 1mM PMSF)를 10-90% 농도 기울기(gradient)로 흘려주어 FIH-1을 용출하였다. 용출된 FIH1-1에 50unit의 트롬빈(trombin)을 가하고 투석 방법을 이용하여 완충액 C(50mM Tris-HCl pH7.5, 1mM DTT, 1mM PMSF)로 평형시키면서 6×His 테그를 제거한 다음, 완충액 C로 평형시킨 7㎖ 농도 기울기(gradient)의 Q-Sepharose(Pharmacia amersham, Sweden)에 얹은 다음, 완충액 50㎖로 세척하고, 완충액 D(50mM Tris-HCl pH7.5, 500mM NaCl, 0.1mM DTT, 1mM PMSF)를 0-100% 농도 기울기(gradient)로 흘려주면서 FIH-1를 정제하였다. 도 5는 정제된 FIH-1 5㎍을 10% 젤을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하여 염색한 그림이다.
< 실시예 5> 단일클론항체 SHI - HIF1 α의 수화 HIF -1α 펩티드에 대한 특이적 인식 검증
실제 생체 내 환경을 모방하기 위해, 바이오틴기를 N-말단에 결합시킨 실시예 1에서 제조한 펩티드인 bSMD41 및 bDES35를 FIH-1로 37℃에서 1시간 수화시켰고 수화된 펩티드는 bDES35(OH) 및 bSMD41(OH)라 명명하였다. 이때 45㎕ 반응용액(50 mM Tris-HCl, 4 mM 아스코빈산, 2 mM dithiothreitol, 0.6 mM 2-oxoglutarate (2OG) 및 0.1 mM ammonium ferrous sulfate)에는 15㎍ FIH-1, 15㎍ bDES35 또는 bSMD41 펩티드, 20㎍ 카탈레이스(catalase)가 포함되어 있다. 수화되지 않은 펩티드를 얻고자 할 때는 위 반응액에서 2OG가 제거된 상태로 반응시켰다. 이후 반응액을 95℃로 2분간 효소를 변성시킨 후, 10,000rpm에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 상등액을 MALDI 분자량 분석에 의하여 펩티드의 수화를 분석한 결과, 2OG가 존재할 경우 펩티드 분자량이 16 가량 증가하였으나, 2OG가 없을 경우 분자량의 증가가 없었다 (도 6 참조). 이를 통해 bSMD41 및 bDES35 펩티드가 생체내에서처럼 수화됨을 확인하였다.
SHN-HIF1α의 수화 펩티드 특이적 인식은 ELISA 방법으로 검사하였다. 먼저 100ng/웰의 농도로 스트렙토아비딘(streptoavidin)을 ELISA 플레이트에 흡착시킨 다음, 50ng(도 7A 참조) 또는 다양한 농도(도 7B 참조, 100ng부터 1/5로 순차적 희석)의 상기에서 얻어진 100% 내지 0% FIH-1으로 반응시킨 펩티드를 TBSS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150nM sodium chloride, 1% skim milk)와 결합시키고 1시간 반응시킨 후 TBST(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM sodium chloride, 0.1% tween 20)로 3회 세척하였다. 다음 TBSS로 희석된 SHN-HIF1α항체를 다양한 농도(도 7A 참조, 60-70% 포화되게 자란 SHN-HIF1α세포 배양액 희석을 표시함) 또는 1/20 희석 배양액(도 7B 참조)을 가하여 1시간 동안 반응시킨 다음 TBST로 3회 세척하였다. 이후 TBSS에 1/10,000으로 희석된 horseradish peroxidase가 결합된 항 마우스 IgG 염소항체를 첨가하여 1시간 반응시킨 다음 TBST로 3회 세척하고, 결합된 항체를 o-phenylene diamine 및 hydrogen peroxide를 기질로 발색시켜 490nm에서 흡광도를 분석하였다. 도 7에서 보듯이 SHN-HIF1α는 수화된 HIF-1α 펩티드에 매우 높은 특이성을 갖는 것으로 나타났다
< 실시예 6> 단일클론항체를 이용한 FIH -1 억제제 검출
본 발명자들은 단일클론항체가 bSMD41 수화 비율에 따른 반응성을 알아보기 위하여 도 8A와 같이 수화된 bSMD41(OH)와 수화되지 않은 bSMD41을 혼합하여 사용하였다. 먼저 스트렙토아비딘 50ng을 ELISA 플레이트에 코팅하고, bSMD41(OH)가 0, 20, 40, 70 및 100%가 되도록 준비된 펩티드들을 TBSS에 5ng/웰의 펩티드 농도부터 1/5씩 순차적 희석을 하여 첨가하였다. 다음 단일클론항체 SHN-HIF1α가 들어있는 실시예 5에서 사용한 배양 배지를 TBSS에 1/20로 희석하여 가하고, 그 다음부터는 실시예 5와 같은 방법으로 수행하였다. 도 8A에서 보듯이 단일클론항체 SHN-HIF1α가 펩티드의 아스파라진 잔기가 수화 정도에 따른 결합을 한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 FIH-1 억제제 탐색에 유용한가를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 2OG와 경쟁하여 FIH-1의 활성을 억제한다고 알려진 N-oxalylglycine(NOG) (Koivunen 등, J. Biol . Chem., 279, 9899-9904, 2004)을 이용하여 SHN-HIF1α의 억제제 탐색 유용성을 확인하였다. 9㎕ FIH-1 반응액(반응조건은 실시예 2와 같으나 FIH-1 농도는 1/20, bSMD41 농도는 1/40로 사용하였다)에 DMSO에 녹아있는 다양한 농도로 녹아 있는 NOG 억제제 1㎕를 첨가하여 30분간 반응시킨 다음, 50ng의 스트렙토아비딘이 코팅된 플레이트에 반응액 2㎕를 TBSS 100㎕에 희석하여 첨가하고 1/5씩 순차적인 희석을 한 후 실시예 5와 같은 방법으로 분석하였다. 도 8B에서 보듯이 억제제인 NOG 농도에 따른 항체-펩티드 결합 억제가 나타나는데, 0.2mM에서는 활성이 일부 저해되었으며, 1mM NOG는 펩티드의 수화를 강력하게 억제하였으며, 5mM NOG는 완벽하게 활성을 저해하였다.
이로부터 본 발명의 단일클론항체는 FIH-1 억제제 탐색에 매우 유용하다는 것을 증명하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명 항체 생산용 펩티드(EVN(OH) 및 GGL(OH))는 수화 펩티드 특이성이 높은 항체를 생산하며, 상기 항원에 의해 얻어진 단일클론항체(SHN-HIF1α)는 FIH-1에 의하여 수화된 HIF-1α 펩티드에 대하여 반응성이 높지만, 수화되지 않은 펩티드에 대해서는 반응성이 거의 없으므로 상기 단일 클론항체는 FIH-1에 의하여 수화된 HIF-1α 검출에 매우 유용하며, FIH-1 억제제 탐색에 유용하게 사용할 수 있다.
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  3. 803번째 위치의 아스파라진 잔기가 수화된 저산소증유발인자-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)를 특이적으로 인지하는 단일클론 항체 제작용 항원 펩티드로서, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열내의 EVNAPIQG로 기재되는 아미노산 서열의 아스파라진 잔기는 수화되어 있는 것을 특징으로 하는 항원 펩티드.
  4. 제 3항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항원 펩티드.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 수화된 아스파라진 잔기는 도. 1의 화학구조식으로 표시되는 (2S, 3R)-L-thero-FmocNH-β-O-TBDMS-Asn-OH를 이용하여 도입되는 것을 특징으로 하는 항원 펩티드.
  6. 1) 제 3항의 항원 펩티드를 준비하는 단계;
    2) 상기 펩티드를 이용하여 생쥐에 면역하는 단계;
    3) 생쥐의 비장세포를 골수종 세포주와 융합하고 단계 1)의 항원 펩티드를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 및
    4) 단계 3)의 세포주로부터 단일클론항체를 분리정제하는 단계를 포함하는 단일클론항체 제조공정으로부터 제조되는 803번째 위치의 아스파라진 잔기가 수화된 저산소증유발인자-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)를 특이적으로 인지하는 단일클론항체"
  7. 제 6항에 있어서, 단계 3)의 하이브리도마 세포주는 수탁번호 KCTC10850BP로 기탁된 세포주인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  8. 803번째 위치의 아스파라진 잔기가 수화된 저산소증유발인자-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)를 특이적으로 인지하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC10850BP로 기탁된 하이브리도마 세포주.
  9. 제 8항의 하이브리도마 세포주에서 생산되는 단일클론항체를 이용하여 저산소증유발인자-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)의 활성 정도를 측정하여 FIH-1(hypoxia-inducible factor HIF inhibitor-1) 활성 억제 억제제를 스크리닝하는 방법.
  10. 도. 1의 화학구조식으로 표시되는 (2S, 3R)-L-thero-FmocNH-β-O-TBDMS-Asn-OH를 이용하여 수산화된 아스파라진 잔기를 도입하는 단계를 포함하는 제 3항의 항원 펩티드의 제조방법.
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