KR100372557B1 - 신경펩타이드 유로코틴에 대한 단일클론 항체, 이를분비하는 세포주 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마우스에서 생산된 신경펩타이드 유로코틴에 대한 단일클론 항체, 이를 분비하는 세포주 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 유로코틴의 C-말단 항원에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론 항체 Aurora-7 및 유로코틴 펩타이드 항원의 유전자를 포함하는 발현벡터, 그리고 상기 발현벡터의 대장균 형질전환체로부터 생산된 유로코틴 재조합 단백질을 이용한 항-유로코틴 항체 분비 융합세포주의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 항-유로코틴 단일클론항체는 마우스, 랫트 및 사람의 유로코틴에 모두 특이적으로 반응하며, 높은 역가로 제조되어 생체내 유로코틴 신경 펩타이드의 발현 탐색 및 검사용 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신경펩타이드 유로코틴에 대한 단일클론 항체, 이를 분비하는 세포주 및 그의 제조방법{Monoclonal antibody specific for the neuropeptide urocortin, the hybridoma cell line secreting this antibody and the preparation method thereof}

본 발명은 마우스에서 생산된 신경펩타이드 유로코틴에 대한 단일클론 항체, 이를 분비하는 세포주 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 마우스, 랫트 및 사람의 유로코틴에 특이적으로 반응하며, 높은 역가로 제조되어 유로코틴의 발현 탐색 및 검사를 위한 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있는 유로코틴의 C-말단 항원에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론 항체 Aurora-7 및 유로코틴 펩타이드 항원의 유전자를 포함하는 발현벡터, 그리고 상기 발현벡터의 대장균 형질전환체로부터 생산된 유로코틴 융합단백질을 이용한 항-유로코틴 항체 분비 하이브리도마 세포주의 제조방법에 관한 것이다.

유로코틴(Urocortin)은 40개의 아미노산으로 이루어진 CRF(corticotropin- releasing factor) 군에 속하는 신경 펩타이드로서(Vaughanet al., Nature, 378, 287-292, 1995) 중뇌(mid brain)의 시상하부(hypothalamus)에서 주로 분비되어 뇌하수체(pituitary)에 작용하는 것으로 알려져 있다. 유로코틴의 발현은 신체적인 혹은 심리적인 스트레스 요인에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 시상하부-뇌하수체-부신으로 연결되는 축(HPA-축)을 통해, 불안증(anxiety) 및 식육부진(anorexia) 등의 전반적인 스트레스 증상을 가져오는 것으로 보고되었다(Spinaet al., Science, 273, 1561-1564, 1996).

이와 같이, 스트레스 관련 신경 펩타이드로서 유로코틴의 역할이 점차 밝혀지고 있으나, 현재까지는 이의 탐색 및 중화작용 실험 등에 사용될 수 있는 시약이 절대 부족한 실정이다. 특히, 현재까지 유로코틴의 발현과 분포에 대한 연구를 위해 사용된 항-유로코틴 항체로서는 화학적 방법을 이용해 합성한 펩타이드를 항원으로 하여 토끼에 면역화하여 얻은 폴리클론 항체가 유일하였는데(Morin et al., Neuroscience, 92, 281-291, 1999; Watanabeet al., Peptides, 20, 205-209, 1999), 이는 폴리클론 항체라는 특성 때문에 교차 반응성의 문제, 제조된 개체 동물마다의 다른 역가 및 정제도(purity)의 문제가 있어 정확하고 재현성 있는 실험을 위한 단일클론항체의 개발이 시급히 요구되고 있다.

현재까지 알려진 바에 의하면 마우스와 랫트의 유로코틴 아미노산 서열은100% 일치하며, 사람의 유로코틴과는 40 개의 아미노산 중 2 개가 틀린 95%의 높은 유사성을 지니고 있다. CRF 펩타이드와는 45%의 상동성을 보이나, N-말단쪽이 특히 높은 유사성을 보인다. 또한, C-말단쪽이 아미드화(amdiation) 되어 있어 유로코틴의 항체 생산 역가에 중요한 부분으로 알려져 있다. 이러한 랫트와 마우스, 그리고 사람 유로코틴의 높은 유사성 때문에 유로코틴의 탐색 및 검사를 위한 진단시약이나 중화항체로서 마우스에서 유래된 단일클론항체가 가장 이상적인 해결책으로 제시되고 있으나, 성공한 사례는 전무하다. 이는 랫트의 유로코틴에 대한 단일클론항체를 얻기 위하여 마우스를 랫트 유로코틴 펩타이드로 면역화할 때, 그 아미노산 서열이 마우스의 것과 동일하여 자가면역항원으로 인식함으로써, 항체 반응이 잘 일어나지 않기 때문으로 밝혀졌다(Turnbull and Rivier, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 215, 1-10, 1997).

본 발명에서는 이러한 제한점을 극복하고자 랫트, 마우스 및 사람의 유로코틴에 특이적으로 반응하는 단일클론항체 및 이를 분비하는 융합세포주를 제조하기 위하여, 40개의 아미노산으로 이루어진 유로코틴 유전자를 포함한 발현벡터 및 이의 형질 전환체로부터 유로코틴 항원을 다량 생산하고, 이를 이용하여 항-유로코틴 항체를 분비하는 마우스의 융합세포주를 제조하여, 생산된 항-유로코틴 항체가 유로코틴의 C-말단 아미노산에 특이적으로 결합하는 IgG1 타입의 역가가 높은 항체임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 마우스, 랫트 및 사람의 유로코틴에 특이적으로 반응하며, 높은 역가로 제조되어 유로코틴의 발현 탐색 및 검사를 위한 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있는 마우스의 단일클론 항체와 상기의 항-유로코틴 항체를 분비하는 마우스 유래 융합 세포주 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 CRF(corticotropin-releasing factor) 군에 속하는 신경펩타이드간의 아미노산 서열을 비교한 것이고,

도 2는 유로코틴의 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 제조된 발현벡터 pGEX-rUCN의 유전자 지도를 나타낸 것이고,

GST : 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(glutathione S-transferase)

uro : 유로코틴

도 3은 발현벡터 pGEX-rUCN로 형질전환된 대장균 형질전환체를 이용하여 발현 정제된 GST-유로코틴 융합단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이고, M : 분자량 마커

1 : IPTG 유도전 세포추출액

2 : IPTG 유도후 세포추출액

3 : IPTG 유도후 세포추출액의 상등액

4 : IPTG 유도후 세포추출액의 침전물

5 : 정제 후의 GST-유로코틴 융합단백질

도 4는 마우스의 면역화 및 단일클론 항체 생성 융합세포주의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이고,

도 5는 단일클론 항체 Aurora-7의 면역글로불린 타입의 결정을 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이고,

도 6은 ELISA를 이용한 항-유로코틴 단일클론 항체 Aurora-7의 항원 특이성을 나타내는 그래프이고,

■ : 랫트/마우스의 유로코틴

● : 사람의 유로코틴

○ : 랫트/사람의 CRF

도 7은 SDS-PAGE에 유로코틴 재조합 단백질을 전기영동한 후(A), 이를 웨스턴 블러팅하여 항-유로코틴 단일클론 항체 Aurora-7의 항원 특이성을 확인한 결과이고(B),

M : 분자량 마커

1 : MBP(maltose binding protein)-유로코틴 융합단백질

2 : MBP-베타 갈락토시다아제 알파 펩타이드 융합단백질

도 8은 Aurora-7의 상세 항원인식부위(epitope)의 규명을 위해 제조한 MBP-유로코틴 융합 단백질의 결실 변형체를 구체적인 서열부위로 나타낸 것이고,

도 9는 Aurora-7에 의한 유로코틴의 상세 항원인식부위를 밝히기 위하여, 유로코틴 결실변형체 단백질 및 양성 대조군으로 사용된 유로코틴 전체 단백질의 말토스 결합단백질과의 융합단백질을 발현 정제한 SDS-PAGE 전기영동 결과(A) 및 이의 웨스턴 블러팅 결과(B)를 나타낸 것이다.

M : 분자량 마커

1 : MBP-유로코틴 결실변형체(아미노산서열 1번-30번 포함)

2 : MBP-유로코틴 결실변형체(아미노산서열 11번-30번 포함)

3 : MBP-유로코틴 결실변형체(아미노산서열 11번-40번 포함)

4 : MBP-유로코틴

5 : MBP-베타 갈락토시다아제 알파-펩타이드

본 발명은 스트레스 관련 신경 펩타이드인 유로코틴의 탐색 및 중화에 사용될 수 있는 항-유로코틴 항체로서, 특이성 및 역가가 높은 마우스의 단일클론 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 유로코틴 펩타이드 항원의 유전자를 포함하는 발현벡터, 그리고 상기 발현벡터의 대장균 형질전환체로부터 생산된 유로코틴 재조합 단백질을 이용한 마우스의 항-유로코틴 항체 분비 융합세포주 및 이의 제조방법을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기로부터 생산된 항-유로코틴 단일클론 항체를 이용한 생체내 유로코틴 신경 펩타이드의 발현 탐색 및 검사용 진단시약을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 마우스의 유로코틴 펩타이드의 아미노산 서열과 동일한 랫트의 유로코틴 유전자로부터 항원 재조합 단백질을 제조하고 이를 이용하여 마우스를 면역화시켜 항-유로코틴 단일항체를 분비하는 융합세포주를 제공한다.

현재까지 알려진 바에 의하면 마우스와 랫트의 유로코틴 아미노산 서열은 100% 일치하며, 사람의 유로코틴과는 40 개의 아미노산 중 2 개가 틀린 95%의 높은 상동성을 지니고 있다. 유사한 구조를 갖는 것으로 알려진 신경펩타이드의 일종인 CRF 펩타이드와는 45%의 상동성을 나타내며, 특히 N-말단쪽이 높은 유사성을 지니고 있는 것으로 알려져 있다(도 1참조).

먼저, 마우스의 면역화를 위한 항원으로 사용될 유로코틴 재조합 단백질를 생산하기 위하여, 랫트의 유로코틴 유전자를 분리한다. 구체적으로 본 발명에서는 랫트의 중뇌(mid brain)로부터 추출한 전체 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고,서열번호 1의 URO-up 프라이머와서열번호 2의 URO-down 프라이머를 이용하여 랫트 유로코틴의 전체 코딩부위를 포함하는 cDNA만을 분리하여, 이를 pGEM-T 벡터에 클로닝한 재조합 플라스미드 'pGEM-rUCN'를 제조하였다. 유로코틴은 전구체(precursor)로부터 일련의 프로세싱(processing) 과정을 거쳐 최종적으로 형성된 cDNA에 의하여 단백질로 발현되는 특성이 있는 유전자이므로, 최종의 유로코틴 cDNA 염기서열(mature urocortin cDNA)은 상기의 재조합 플라스미드 pGEM-rUCN를 주형으로서열번호 3및서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 유로코틴의 cDNA 유전자는 pGEM-T 벡터에 다시 클로닝하여 'pGEM-rUCN-mature'이라 명명하였다.

재조합 유로코틴 단백질을 생산하는 발현벡터는 상기 유로코틴의 cDNA 유전자가 클로닝된 pGEM-rUCN-mature벡터를 이용하여 제조하였다. 구체적으로 pGEM-rUCN-mature벡터로부터 유로코틴의 cDNA를 분리하고 pGEX-4T-3 벡터의BamHI 및SalⅠ 위치에 클로닝하였으며, 이를 'pGEX-rUCN'으로 명명하고 대장균 JM109 균주에 형질전환시켰다(도 2 참조).

상기 형질전환된 대장균 균주로부터 발현된 유로코틴 재조합 단백질은 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(GST)가 결합된 융합단백질로 발현되는데, 이는 유로코틴 재조합 단백질을 생산하기 위하여 사용된 시발벡터가 pGEX-4T-3 벡터로서 외부 단백질의 발현시 N-말단에 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 융합된 형태로서 발현되도록 하기 때문이다. 이와 같은 융합 단백질은 높은 용해성(high solubility)을 가지므로 외부 단백질의 활성화된 구조가 보존되어 발현될 수 있도록 하며, 상기 융합단백질과 친화력이 높은 글루타치온 세파로오스-4B 친화 컬럼을 이용하면 정제하기에 매우 용이하다. 상기와 같은 방법에 의하여 발현 및 정제된 유로코틴 재조합 단백질은 SDS-PAGE를 수행하여 순도를 확인하였다(도 3 참조).

단일클론 항체를 생산하는 융합세포주는 상기의 GST-유로코틴 재조합 단백질을 이용한 마우스의 면역화 작업을 수행하고, 면역화된 마우스로부터 추출한 비장세포를 마우스 골수종(myeloma) 세포주와 혼합함으로써 제조한다(도 4 참조). 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 양성클론 선별은 합성 유로코틴 펩타이드를 항원으로 하여 민감도가 높은 효소-매개 면역측정법(Enzyme-linked immunoassay, ELISA)을 이용하며, 선택된 양성 클론으로부터 단일클론을 분리해내기 위해서는 제한희석법(Limiting dilution)을 실시한다. 최종적으로 항-유로코틴 특이성이 검증된 단일클론항체는 'Aurora-7'이라 명명하였으며, 이를 분비하는 마우스의 B-세포 융합 세포주는 1999년 11월 17일자로 생명공학연구소 유전자 은행에기탁되었다(수탁번호 : KCTC 0695BP).

상기 융합세포주로부터 생산되는 본 발명의 단일클론 항체 Aurora-7은 역가가 높은 IgG1 타입의 카파 라이트 체인(kappa light chain)으로 사람, 랫트 및 마우스의 유로코틴에 대하여 높은 특이성을 가지며, 특히 랫트 및 마우스의 유로코틴에 대하여 특이성이 높다. 또한, 구조적으로 유사한 다른 신경펩타이드와는 교차 반응성이 나타나지 않으므로, 기존의 토끼로부터 유래한 폴리클론 항체들에 비해 특이성이 뛰어난 우수한 항체이다.

MBP-유로코틴 결실 변형체 융합 단백질을 이용하여 규명한 단일항체 Aurora-7의 상세 항원인식부위는, N-말단의 1번-30번 아미노산 서열을 포함하는 결실변형체 및 11번-30번 아미노산 서열을 포함하는 결실변형체 단백질이 Aurora-7에 의하여 전혀 인식되지 않는 반면, C-말단 쪽을 발현시킨 11번-40번 아미노산 서열을 포함하는 결실변형체 단백질은 MBP-유로코틴 전체 단백질과 동일하게 인식됨을 근거로, C-말단 쪽에 집중되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 유로코틴 역시 대부분의 신경펩타이드와 마찬가지로 아미드화(amidation) 되어있는 C-말단 부분이 항체 인식에 주요한 부위이며, 이에 따라 본 발명의 Aurora-7 단일항체가 유로코틴의 신경펩타이드로서의 활성 부위가 집중되어 있는 C-말단에 작용함으로써, 유로코틴의 활성을 저하시키는 중화항체로서의 이용 가능성이 있음을 시사한다.

또한, 본 발명은 상기로부터 생산된 항-유로코틴 단일클론 항체를 이용한 생체내 유로코틴 신경 펩타이드의 발현 탐색 및 검사용 진단시약을 제공한다.

본 발명의 진단 시약은 1차 항체로서 항-유로코틴 단일클론 항체, 2차 항체로서 고추냉이 과산화효소 등의 표시체를 접합시켜 제작된 IgG, 그리고 상기 표시체와의 반응으로 발색을 유도하는 물질을 포함하는 기질 용액으로 구성된다.

상기의 진단시약은 랫트, 마우스 또는 사람의 유로코틴 신경 펩타이드를 모두 검출할 수 있는 특이성이 높은 진단시약이며, 이를 이용하면 스트레스와 관련된 신경 펩타이드로서의 유로코틴의 생체내 발현정도를 탐색하여 검사할 수 있다.

2차 항원 접합체로 이용하는 IgG는 표시체가 접합되어 있으며, 표시체로는 고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼라인 인산화효소(Alkaline phophatase) 등이 사용될 수 있는데, 상기 2차 항원 접합체는 항체의 변이가 거의 없는 부분인 Fc(fragment crystallizable)에 결합하므로써 항체의 존재를 측정할 수 있게 한다.

상기 2차 항원 접합체의 표시체와 반응하여 발색을 유발하는 기질용액은 테트라메틸벤지딘, 4-클로로-1-나프톨, 과산화수소수 등의 발색제와 완충용액으로 구성된다. 기질용액은 IgG에 접합된 표시체를 분해하여 발색시키고 그 정도를 측정함으로써 항원의 존재 및 양을 확인할 수 있게 한다.

궁극적으로는 조직절편(tissue section)이나 혈청, 또는 세포나 조직파쇄액등을 샘플상태 그대로, 혹은 ELISA나 웨스턴블랏, 혹은 면역침전법등을 이용하여, 유로코틴의 발현, 조절여부를 상기 진단 시약을 통해 정량, 정성적으로 분석할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 랫트의 유로코틴 항원 재조합 단백질의 제조

<1-1> 유로코틴 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조

랫트의 신경펩타이드 유로코틴 유전자를 클로닝하기 위하여, 6 내지 8주령의 Lewis 랫트에서 중뇌(mid brain)를 분리하여 전체 RNA를 guanidium/acidic phenol 방법(Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159,1997)으로 추출한 뒤, 정제한 RNA로부터 oligo-dT(15) 프라이머(Promega사)와 Superscript Ⅱ+ 역전사 효소(Life Technologies Inc.사)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 때, 반응조건은 공급자가 제시한 방법에 따랐다. 상기 합성된 cDNA로부터 랫트 유로코틴의 전체 코딩부위를 포함하는 cDNA만을 분리하기 위하여,서열번호 1의 URO-up 프라이머와서열번호 2의 URO-down 프라이머를 이용하여 중합연쇄효소반응(PCR)을 수행하였으며, 생성된 PCR 산물은 1.5% 아가오로스 젤 상에서 분리하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 클로닝 하고, 'pGEM-rUCN'이라 명명하였다(Naet al., Mol. Cells, 9, 587-595, 1999).

전구체(precursor)로부터 일련의 프로세싱(processing)작업을 거쳐 최종적으로 단백질로 발현되는 유로코틴 cDNA 유전자(mature urocortin cDNA)는 상기의 재조합 벡터 pGEM-rUCN를 주형으로서열번호 3및서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 산물은 pGEM-T 벡터에 다시 클로닝하여 'pGEM-rUCN-mature'이라 명명하였다.

유로코틴 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현벡터를 제조하기 위하여, 상기의 pGEM-rUCN-mature벡터를BglⅡ 및SalⅠ 제한효소로 처리한 뒤, 유로코틴의 cDNA(mature urocortin cDNA)를 분리하고 pGEX-4T-3 벡터(Amersham Pharmacia Biotech사)의BamHI 및SalⅠ 위치에 클로닝하였으며, 이를 'pGEX-rUCN'으로 명명하고 대장균 JM109 균주에 형질전환시켰다(도 2).

<1-2> 유로코틴 재조합 단백질의 발현 및 정제

유로코닌 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위하여, 먼저 상기의 대장균 형질전환체를 배양하여 최적성장시 IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside)를 최종농도가 0.3 mM이 되도록 첨가하여, 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(GST)-유로코틴 융합 단백질의 발현은 유도하였다. 발현이 유도된 세포는 배양액의 1/15 부피의 STE 완충용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 현탁시켜 6000rpm에서 10분간 원심분리한 뒤, 침전물을 배양액의 1/25 부피의 0.1 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme)과 0.2 mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride)가 포함된 STE 완충용액에 녹여 15분간 얼음속에 방치하였다. 상기의 세포 현탁액에 5 mM DTT와 1.5% 살코실(sarcosyl)을 첨가하여 세포벽을 초음파로 파쇄시킨 뒤, 4℃에서 13000 rpm으로 20분간 원심분리하여 그 상등액을 글루타치온 세파로오스-4B 친화 컬럼(glutathione Sepharose-4B affinity column; Pharmacia사)에 통과시켜 발현된단백질만을 컬럼에 결합시켰다. 상기 컬럼을 인산염 완충용액(PBS)으로 세척한 뒤, 용출완충용액(1mM EDTA, 0.02% Triton X-100, 50mM Tris-HCl pH8.0)에 10 mM 환원 글루타치온(Amrnesco사)을 첨가하여 융합 단백질을 용출시키고, SDS-PAGE를 수행하여 GST-유로코틴 융합 단백질의 발현 및 순도를 확인하였다(도 3).

<실시예 2> 신경펩타이드 유로코틴에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 제조

단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 제조를 위하여, 8주된 실험용 암컷 마우스(BALB/c mouse)를 이용하여도 4와 같이 면역화 작업을 수행하였다. 우선 150 ㎕의 완전 보조항원(Complete Freund's Adjuvant; Sigma사)에 상기실시예 1에서 발현 정제한 GST-유로코틴 융합 단백질 50 ㎍을 동일 부피로 섞어 유상화한 다음, 복강주사 하였다. 첫 주사후, 10일 간격으로 첫번째, 두번째 주사시에는 동일량의 GST-유로코틴 융합단백질을 불완전 보조항원(Incomplete Freund's Adjuvant, Sigma사)에 유상화하여 재차 복강 주사하고, 세 번째와 네 번째 복강 주사시에는 특이적 면역반응의 증폭을 위하여, 20 ㎍ GST-유로코틴 융합 단백질과 20 ㎍의 합성 유로코틴 펩타이드(Sigma사)를 혼합하여 주사하였다. 최종적으로 융합세포주 제작 3일 전 꼬리정맥에 20 ㎍의 합성 유로코틴 펩타이드를 주사하였다. 융합세포주 제작을 위하여는 상기 면역화한 마우스로부터 비장세포를 추출하여 마우스 골수종(myeloma) 세포주인 P3X63-Ag8.653(미국 ATCC사)의 세포수가 5:1의 비율이 되도록 혼합하였다. 이후, 혼합세포액을 원심 분리하여 상등액을 제거한 후에 플라스틱 파스퇴르 피펫을 이용하여 PEG-1500(polyethylene glycol-1500, Boehringer Mannheim사) 1 ㎖을 첨가하여 1분간 잘 혼합하고, 혈청이 포함되지 않은 RPMI-1640 배양액(Gibco사) 15 ㎖을 10분에 걸쳐 천천히 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 같은 부피의 10% 소 태아혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지를 첨가하고서, 37℃에서 30분간 방치하였다. 상기의 세포 현탁액을 원심 분리하여 침전된 세포를 10% 소 태아혈청이 포함된 RPMI-1640 배지에 다시 첨가한 뒤, 이를 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하여, 37℃ 및 5% 의 CO2 대기 조건하에서 하루동안 배양하였다. 하루 뒤에는 2X HAT 배지(Gibco BRL사)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 배양했고, 콜로니가 형성된 후 합성 유로코틴 펩타이드를 항원으로 하여 효소-매개 면역측정법(Enzyme-linked immunoassay, ELISA)을 수행하여 양성클론을 선별하였다.

구체적으로, 재조합 단백질로 발현된 GST-유로코틴 및 음성대조군으로서 단독발현된 GST단백질을 표면처리 완충액(0.1M Na-carbonate, pH 9.5)에 잘 혼합하여, 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc사)의 각 웰당 각기 1 ㎍ 씩 되도록 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음 날, 각 웰들을 TBS(Tris-buffered saline) 완충용액으로 세척한 후 블로킹 완충용액(blocking buffer, 3% 카제인/TBS)를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이 후 상기 용액을 제거하고, 융합 세포주들의 배양액을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 37℃에서 추가로 2시간 반응시킨 후, 반응하지 않은 과량의 항체를 제거하고, 고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)가 결합된 토끼유래 항-마우스 IgG 항체(Sigma사)와 HRP의 기질인 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphtol; Sigma사)및H2O2를 차례로 첨가하여 특이적으로 결합된 항체의 존재 유무를 확인하였다. 그 결과, GST-유로토틴 융합 단백질과는 반응성을 나타내지만, 음성대조군인 GST단백질에 대해서는 반응하지 않는 하이브리도마 클론들을 유로코틴 인식항체를 분비하는 양성클론으로 선별하였다.

상기 과정에서 선택된 양성 클론으로부터 단일클론을 분리해내기 위해서는 제한희석법 (Limiting dilution)을 실시하였다.

이를 위하여, 먼저 한 개의 양성클론 하이브리도마를 지정하여 96-웰 상에 들어 있는 세포주를 모두 취하여 현탁하여 그 세포수를 정확하게 측정한 후, 96-웰 플레이트의 각 웰당 평균 0.3개의 세포가 들어가도록 세포를 분주하고, 다음으로는 각기 웰당 평균 3개의 세포를, 그리고 이어 30개, 300개의 세포 순으로 96-웰 플레이트 한 개씩을 만들었다. 여기에서 가장 작은 세포수로 분주한 플레이트에서 자란 클론을 다시 지정하여 이를 증식시킨 후, 위의 과정을 재차 반복하였다. 여기에서 최종적으로 가장 희석된 세포농도의 플레이트로부터 자란 클론을 단일클론으로 간주하였다.

상기한 과정을 거쳐, 최종적으로 항-유로코틴 특이성이 검증된 단일클론항체는 Aurora-7이라 명명하였으며, 이를 분비하는 마우스 B-세포 융합세포주는 1999년 11월 17일자로 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 0695BP).

<실시예 3> 단일클론 항체 Aurora-7의 특성결정

단일클론 항체 Aurora-7의 면역글로불린 항체 타입을 결정하기 위해서는 마우스 면역글로불린 타입결정 킷트(Pharmingen사)를 이용하였다. 상기 킷트는 단일클론항체에 근거한 킷트로서, ELISA 플레이트의 웰에 먼저 각 타입의 특이한 단일클론항체를 코팅시킨 후, 샘플을 첨가하고, 이어 정상적인 ELISA를 수행하여 특이적으로 반응한 웰에서의 반응을 항-마우스 면역글로불린 항체로 검색하게 된다. 그 결과,도 4에서 보듯이 상기 단일클론 항체 Aurora-7은 IgG1의 카파 라이트 체인(kappa light chain)으로 확인되었다.도 4에서 좌측열에 나타난 8 개의 웰은 양성대조군의 실험 결과이고, 우측열에 나타난 8개의 웰은 Aurora-7을 샘플로 첨가하여, 각각의 타입을 분석한 결과이다.

<실시예 4> Aurora-7의 항원 특이성 검증.

<4-1> 효소 매개 면역 측정법(Enzyme-linked immunoassay)을 이용한 Aurora-7의 항원 특이성

단일클론항체 Aurora-7의 항원 특이성을 확인하기 위하여 먼저 효소 매개 면역 측정법을 수행하였다. 이를 위하여, 화학적 합성법에 의해 제조된 랫트의 유로코틴 펩타이드를 표면처리 완충액(0.1M Na-carbonate, pH 9.5)에 잘 혼합하여 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc사)의 각 웰 당 1 ㎍ 씩 되도록 첨가한 후 4℃에서 하루동안 반응시켰다. 상기 항체의 특이성을 검증하고자 랫트의 유로코틴과 아미노산의 길이가 41개로 유사하고, 구조가 동일한 사람 및 랫트의 CRF(corticotropin-releasing factor) 펩타이드를 음성 대조군으로 이용하였으며,사람의 유로코틴에 대한 특이성 조사를 위하여, 화학적으로 합성한 사람의 유로코틴 펩타이드를 항원으로 이용하여 상기 반응을 수행하였다. 항원을 코팅시킨 후, 각 웰들을 TBS(Tris-buffered saline) 완충용액으로 세척한 후 블로킹 완충용액(blocking buffer, 3% 카제인/TBS)를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이 후 상기 용액을 제거하고, 융합 세포주들의 배양액을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 37℃에서 추가로 2시간 반응시킨 후, 반응하지 않은 과량의 항체를 제거하고, 고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)가 결합된 토끼유래 항-마우스 IgG 항체(Sigma사)와 HRP의 기질인 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphtol; Sigma사)과 H2O2를 차례로 첨가하여 특이적으로 결합된 항체의 존재 유무를 확인하였다. 그 결과, 음성대조군인 사람/랫트 CRF로 표면처리된 웰에서는 전혀 반응이 일어나지 않았으며, 사람 및 랫트/마우스 유로코틴에 대하여는 높은 반응성을 나타냄을 확인하였으며, 이로써 본 발명의 단일클론 항체는 상대적으로 사람보다는 랫트/마우스 유로코틴에 대하여 높은 반응성을 지닌 단일클론 항체이며, 그 외의 구조적으로 유사한 다른 신경펩타이드와는 교차 반응성이 없는 기존의 토끼유래 폴리클론 항체들에 비해 우수한 항체임을 확인할 수 있었다(도 6).

<4-2> 웨스턴 블러팅(Western blotting)을 이용한 Aurora-7의 항원 특이성

Aurora-7의 항원특이성을 검증하기 위해서, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)에 유로코틴 혹은 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase)의 알파-펩타이드(alpha-peptide)가 융합된 형태의 단백질(New England Biolabs사)을 SDS-PAGE 상에서 전기영동시킨 다음 트리스-메탄올 완충액내에서 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane; Schleicher & Schuell사)으로 이동시켜 블러팅하였다. MBP-유로코틴 융합단백질은 하기실시예 5에 기재된 방법으로 제조하였다.

비특이적인 반응을 제거하기 위해서 상기 나이트로셀룰로오스 막을 상온에서 2시간 동안 3% 카제인(casein)으로 블로킹한 뒤, 항-유로코틴 특이 항체인 Aurora-7을 적정량으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤 트윈-20(Tween-20)이 0.05%로 포함된 TBS 완충용액으로 세척한 후, 고추냉이 과산화효소(HRP)가 결합된 항-마우스 IgG 항체(Sigma사)를 1:2500으로 희석하여 1시간 동안 반응시키고, 시약을 다시 상기와 동일한 TBS 완충용액으로 씻어낸 후, 4-클로로-1-나프톨과 H2O2로 발색 반응하였다. 그 결과, 유전자 재조합에 의해 말토스 결합 단백질에 융합된 형태의 유로코틴은 Aurora-7에 의해 특이적으로 인식이 되었으나, 음성대조군으로 사용된 MBP-베타-갈락토시다아제 알파-펩타이드와는 전혀 반응하지 않았다(도 7).

<실시예 5> Aurora-7의 상세 항원인식 부위(fine epitope)의 규명

<5-1> 유로코틴의 결실 변이체 단백질의 제조

총 40개의 아미노산으로 이루어진 유로코틴 서열중 Aurora-7이 항원으로 특이하게 인식하는 부위를 조사하기 위하여, 유로코틴의 40개 아미노산에 해당하는 cDNA(mature cDNA) 및 상기 40개 아미노산을 3개 부위로 나눈 cDNA 각각을 PCR로 증폭시켜, pMAL-c2 벡터에 클로닝하였다(도 7). pMAL-c2 벡터는 대장균내에서외부의 cDNA를 유전자 재조합에 의해 발현하기 위해 사용되는 플라스미드로서, 외부 단백질이 말토스 결합 단백질과의 융합된 형태로서 발현되어 정제가 용이한 벡터이다. 이와 같은 융합 단백질은 높은 용해성(high solubility)을 가진 말토스 결합 단백질의 특성을 갖게 되며, 아밀로스(amylose)에 대한 친화력을 바탕으로 하여, 아밀로스 수지(amylose resin)을 이용하여 한 번의 과정으로 정제할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 구체적인 클로닝은 하기와 같이 수행되었다

상세 항원인식부위 규명을 위한 유로코틴 결실 변형체 단백질의 cDNA 클론들은 각기 상기실시예 1에서 제조한 pGEM-rUCN-mature 벡터를 주형으로,서열번호 5, 6, 7및8의 프라이머 조합을 이용하여 증폭한 DNA를 pMAL-c2의BamHI 및SalI부위에 클로닝 함으로써 제조하였다. 구체적으로, 유로코틴의 전체 아미노산을 코딩하는 cDNA는서열번호 5및6의 프라이머를, 1번-30번까지의 아미노산을 코딩하는 cDNA는서열번호 5및7의 프라이머를, 11번-30번 아미노산을 코딩하는 cDNA는서열번호 7및8의 프라이머를, 11번-40번 아미노산을 코딩하는 cDNA는서열번호 6및8의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 유로코틴의 전체 cDNA가 클로닝된 발현벡터는 'pMAL-rUCN'이라 명명하였다. 상기 클론들은 각각 대장균 JM109 균주로 형질전환시킨 후, 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 발현유도는실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

IPTG를 이용하여 발현을 유도한 각각의 대장균 형질전환체는 원심분리로 회수하였으며, 다시 이를 배양액의 1/20 부피의 컬럼 완충용액(20 mM Tris-HCl; pH 7.4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 현탁시킨 후 초음파 분쇄하였다. 상기 파쇄액을 원심분리한 후, 상등액을 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통과시켜 불순물을 걸러내고, 다시 아밀로스 수지(amylose resin; New England Biolabs사)에 통과시켜 세포질 내에 용해되어 있는 상태의 MBP-유로코틴 결실 변형체 융합단백질만을 분리하였다. 아밀로스는 말토스의 중합체(polymer)의 일종으로, 말토스 결합 단백질과 높은 친화력을 지닌 것으로 알려져 있다. 상기 수지에 비특이적으로 결합된 단백질은 과량의 컬럼 완충용액으로 세척하여 제거하고, 컬럼 완충용액에 20 mM 말토스 (Sigma사)가 포함된 용출용액을 통과시켜 원하는 단백질을 분리해 내었다. 상기 각 단백질의 발현및 정제도는 SDS-PAGE를 수행함으로써 확인하였다(도 9의 A).

<5-2> Aurora-7의 상세 항원인식 부위의 확인

상기실시예 5-1에서 얻은 유로코틴 결실 변형체 단백질을 이용하여 Aurora-7의 상세 항원인식 부위를 확인하기 위하여, 웨스턴 블러팅을 실시하였다. 동량의 MBP-유로코틴 융합단백질 및 이의 결실 변형체들을 SDS-PAGE에 전기영동하여, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시킨 후,실시예 4-2와 동일한 방법으로 Aurora-7을 이용하여 웨스턴 블러팅을 수행하였다. 그 결과도 9의 B에서 보듯이, MBP-유로코틴 전체 단백질은 단일항체 Aurora-7에 의하여 확실히 인식되었으나, N-말단 쪽을 발현시킨 1번-30번 아미노산 서열을 포함하는 결실변형체 및 11번-30번 아미노산 서열을 포함하는 결실변형체 단백질은 전혀 인식되지 않는 것으로 나타났다. 반면, C-말단 쪽을 발현시킨 11번-40번 아미노산 서열을 포함하는 결실변형체 단백질은MBP-유로코틴 전체 단백질과 동일하게 인식되는 것으로 나타나, Aurora-7의 항원특이성이 C-말단 쪽에 집중되어 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 유로코틴 역시 대부분의 신경펩타이드와 동일하게 아미드화(amidation) 되어있는 C-말단 부분이 항체 인식에 주요한 영향을 미치며, 본 발명의 Aurora-7 단일항체는 유로코틴의 활성 부위가 집중되어 있는 C-말단에 작용함으로써 중화항체로서의 이용 가능성이 있음을 시사한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항-유로코틴 단일 클론항체는 IgG1 타입의 카파 라이트 체인(kappa light chain)으로 마우스, 랫트 및 사람의 유로코틴에 모두 특이적으로 반응하며, 구조적으로 유사한 다른 신경펩타이드와는 교차 반응성이 나타나지 않으므로, 기존의 토끼로부터 유래한 폴리클론 항체들에 비해 우수한 항체이다. 본 발명의 단일클론항체는 높은 역가로 제조되어 유로코틴의 발현 탐색 및 검사를 위한 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 유로코틴의 신경펩타이드로서의 활성 부위가 집중되어 있는 C-말단 부분이 주요 항원 인식부위이므로, 유로코틴의 활성을 저하시키는 중화항체로서 이용될 수 있다.

Claims (7)

1. 랫트, 마우스 및 사람의 신경펩타이드 유로코틴(urocortin)에 특이적으로 반응하는 마우스 단일클론 항체.
2. 제 1항에 있어서, 유로코틴의 아미노산 서열 중 31 내지 40번의 아미노산을 포함하는 상세항원 부위를 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론항체 Aurora-7.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항의 단일클론 항체를 생산하는 마우스 B-세포 융합세포주(수탁번호 : KCTC 0695 BP).
6. ⅰ) 레트의 유로코틴 항원 재조합 단백질을 제조하는 단계;

   ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 단백질을 이용하여 마우스를 면역화하는 단계; 및,

   ⅲ) 면역화된 마우스로부터 적출한 비장세포를 골수종(myeloma) 세포와 융합하여 제 1항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하는 단계로 구성되는 제 5항의 융합세포주의 제조방법.
7. 제 1항의 단일클론 항체를 이용한 생체내 유로코틴 신경펩타이드의 발현 탐색 및 검사용 진단시약.