KR101130786B1 - ４０２번 프롤린 잔기가 수산화된 ＨＩＦ－１α 펩티드를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 402번 프롤린 잔기가 수산화된 저산소유발인자-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)를 특이적으로 인식하는 단일클론항체에 관한 것으로, 구체적으로 프롤린 잔기가 수산화된 펩티드를 이용하여 제조된 단일클론항체는 프롤릴 하이드록실라아제 2(prolyl hydroxylase2, PHD2)에 의해 402번 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α 펩티드에 반응성이 있지만 402번 프롤린 잔기가 수산화되지 않은 HIF-1α 펩티드에 대해서는 반응이 없으므로, PHD2 효소 활성 측정 및 억제제 탐색에 유용하게 사용할 수 있다.

저산소유발인자-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α), 프롤릴 하이드록실라아제(prolyl hydroxylase), 단일클론항체.

Description

４０２번 프롤린 잔기가 수산화된 ＨＩＦ－１α 펩티드를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 용도{A Monoclonal antibody for detection of hydroxylated proline ４０２ of HIF－１α peptide and its usage}

본 발명은 402번 프롤린이 수산화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 이를 이용한 프롤린 수산화효소 억제제 탐색 방법에 관한 것이다.

생체 세포 내 산소 농도는 세포 생존에 매우 필수적인 요소이나, 산소 농도가 높은 경우 산소 스트레스에 의해 활성 산소가 과다하게 발생하므로 세포사멸을 유발하고, 정상적으로 산소가 공급되고 있는 상태(normoxia)에서는 PHD(proline hydroxylases) 및 FIH(Factor inhibiting HIF-1)의 효소 활성에 의하여, 혈관 생성 및 조직의 에너지 공급에 중요한 저산소유발인자-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)의 활성이 억제된다. 낮은 산소 농도(hypoxia)에서는 산소를 기질로 사용하는 PHD들 및 FIH의 활성이 억제되어 HIF-1α가 활성화되어 HIF-1β와 결합하여 핵으로 이동하여, 300/CBP 등의 단백질과 결합한 후, HRE 프로모터에 결합하여 혈관 생성 및 세포 내 에너지 공급에 필수적인 단백질들의 발현을 증가시킨다(Nathali 등, Biochem. Pharmacol., 68, 971-980, 2004). 그러나 산소공급이 원활하지 않을 경우에도 PHD 및 FIH의 활성이 억제되지 않으면 HIF-1α의 활성이 억제되어, 혈관 생성이 억제되거나 적혈구 생성이 억제되어 허혈 세포의 손상이 유발된다.

프롤릴 하이드록실라아제 2(prolyl hydroxylase2, PHD2)는 HIF-1α 활성을 조절하는 주된 효소(Schofield 및 Ratcliffe, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 343-354, 2004; Takeda등, Mol. Cell. Biol. 26, 8336-8346, 2006)로 최근 HIF-1α 결합 구조를 포함한 3차 구조가 밝혀졌다(Cockman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 14767-14772, 2006; Chowdhury 등, Structure, 17, 981-989, 2009). PHD2도 FIH와 마찬가지로 Fe²⁺를 보조인자(cofactor)로 사용하고, 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate, 2OG), 산소(O₂)를 기질로 사용하여 HIF-1α의 402 및 564 프롤린 잔기를 수산화시키는 것이 밝혀졌다(Jaakkola등, Science 292, 468◎72, 2001; Schofield 및 Ratcliffe, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 343-354, 2004). 상기 효소는 상업적으로도 유용한 약물 개발 표적이다. 현재 미국 Fibrogen사는 HIF-1α의 안정화하는 물질을 대상으로, 허혈성 질환 치료시 생기는 재관류(repurfusion) 세포 손상 방지 및 빈혈을 치료하는 약제들을 개발하고 있으며, 영국 ReOx LTD도 HIF를 대상으로 하는 약물을 개발하고 있다.

PHD2 활성을 측정하는 방법은 FIH 할성을 측정하는 방법과 유사하게 효소 반 응 산물인 이산화탄소(CO₂) 발생을 측정하거나(Koivunen 등, J. Biol. Chem., 279, 9899-9904, 2004; Chowdhury 등, Structure, 17, 981-989, 2009), 기질인 2OG와 오르토-페닐렌디아민(o-phenylendiamine) 간의 형광결합체를 분석하는 방법으로 2OG의 소모를 측정하여 효소의 활성을 측정하는 방법이다(McNeill등, Anal, Biochem, 336, 125-131, 2005). 그러나 이산화탄소 발생을 측정하기 위해서는 특정 장치 및 방사선 동위원소를 사용하여 수천 종 이상의 시료의 고속측정(high throughput screening, HTS)이 용이하지 않으며, 2OG 소모를 측정하는 방법은 강산 및 높은 온도반응 과정등 일반적인 HTS 시스템 개발에는 부적합한 단점이 있다. 또한 이들 방법들은 직접 HIF-1α의 수산화를 측정하지 않는 방법으로, 다른 이유에 의한 2OG 소모를 배재할 수 없으며, 실제로 이들 방법들은 HIF-1α 기질이 없는 상태에서도 일정 수준의 2OG가 분해되는 현상이 밝혀졌다(McNeill 등, Anal, Biochem, 336, 125-131, 2005). 반면에, 수산화 특이 항체를 이용하여 직접적으로 HIF-1α의 수산화를 측정하는 방법은 위와 같은 문제점들을 배재할 수 있고, HTS가 가능한 방법임을 FIH를 대상으로 이미 밝힌 바 있다(대한민국 특허등록 10-759389; Lee등, J. Biomol. Screen. 13: 494-503, 2008).

이에, 본 발명자들은 PHD2의 억제제의 고효율 탐색(high through screening, HTS)에 이용할 수 있는 항체를 제조하고자 시도하였으며, 그 결과, 402번 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 개발함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 402번 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 402 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 생산하는 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 제작을 위한 프롤린 잔기가 수화된 항원 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 PHD2(prolyl hydroxylase2) 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체 생산용 펩티드(402A(OH))는 수산화 펩티드 특이성이 높은 항체를 생산하는데 이용할 수 있으며, 상기 항원에 의해 얻어진 단일클론항체(An402(OH))는 PHD2에 의하여 수산화된 HIF-1α 펩티드(b402(OH))에 대한 반응성이 높지만, 수산화되지 않은 펩티드에 대해서는 반응성이 전혀 없으므로 PHD2의 활 성 측정 뿐만 아니라, 허혈성질환 및 빈혈치료제 약물로 개발될 수 있는 PHD2 억제제 탐색에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 402 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 제작을 위한 프롤린 잔기가 수화된 항원 펩티드를 제공한다.

본 발명에 따른, 단일클론항체는 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 생산되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) HIF-1α의 활성부분으로부터 유래된 단편으로 HIF-1α의 402번 잔기가 수산화된 프롤린을 포함하는 펩티드를 준비하는 단계;

2) 상기 펩티드를 이용하여 생쥐에 면역하는 단계;

3) 생쥐의 비장세포를 골수종 세포주와 융합하고 단계 1)의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 및

4) 단계 3)의 세포주로부터 단일클론항체를 분리 정제하는 단계.

본 발명에 있어서, 단계 1)에서 사용되는 펩티드는 HIF-1α의 프롤린 잔기가 수산화되는 활성화 부분에서 유래한 것으로서, 프롤린 잔기가 수산화된 CGKKPDKALTLLAP(OH)AAG(서열번호: 1)로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩타이드 서열에서 HIF-1α에서 유래된 서열은 3-17번이며, 1-2번 CG는 운반단백질 결합을 위하여 도입하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 펩티드 서열은 아미노산 말단에 항체 생산력을 높이거나 운반 단백질을 결합시키기 위해 다른 아미노산 및 화학물질이 결합될 수 있으며, 본 발명에서는 운반 단백질로서 BSA 또는 OVA를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩티드는 9- Fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)기를 Na-아미노 보호기로 사용하는 고상 합성법에 의하여 합성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 상기 펩티드 합성은 DCC(decyclohexylcarbodiimide) 및 HOBt(N-hydroxyboenzotriazole)를 사용하는 방법으로 합성하였으며, 각각의 합성 펩티드를 HPLC로 정제하여 MALDI-TOF 분석으로 확인하였다(도 2 참조). 상기 펩티드의 합성 방법 및 분리 방법은 당 업계에서 잘 알려져 있으며, 특별히 제한되는 것이 아니다. 상기 합성한 펩티드 항원들은 GMBS(N--maleimidobutyryloxylsuccinimide ester)를 사용하여 운반단백질 BSA 또는 OVA에 결합시켰다.

본 발명에 있어서, 단계 2)에서는 각각의 펩티드 항원을 생쥐에 투여하여 펩티드에 대한 항체를 유도할 수 있다. 상기 펩티드의 투여 방법 및 사용 방법은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 특별히 제한되는 것이 아니다. 상기 펩티드는 면역보조제(adjuvant)와 조합되어 투여할 수 있다. 본 발명에서는 펩티드-단백질 결합체 를 Freund's 면역보조제에 이멀젼화시켜 Balb/c 생쥐(mouse)의 복강에 주사하여 항체 형성을 유도하였다.

본 발명에 있어서, 단계 3)에서는 펩티드 항원으로 면역화된 생쥐의 비장세포를 적출한 후 골아종 세포주와 융합하고, 수산화된 펩티드에 대하여 특이성이 높은 항체를 생산하는 세포주를 선별할 수 있다. 선별된 세포주에서 생산한 단일클론항체는 'An402(OH)'라 명명하였으며, 이소타입결정(isotyping) 결과 상기 단일클론항체는 IgG2b이며, 가벼운 사슬이 κ임을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 단계 4)에서는 상기 제작된 단일클론항체를 분리 및 정제는 당업자에게 보편적으로 알려진 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 402 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α펩티드를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 생산하는 세포주를 제공한다.

본 발명의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 상기 제조방법의 단계 3)의 과정 중에 제조될 수 있으며, 선별된 세포주로서 2009년 11월 24일자로 대한민국 소재 한국생명공학연구원 생명자원센터에 수탁번호 KCTC 11605BP로 기탁되었다.

또한, 본 발명은 본 발명의 402 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 이용하여 PHD2(prolyl hydroxylase2) 활성 측정 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 402번 프롤린 잔기가 수산화되지 않은 HIF-1α 펩티드 (b402)에 PHD2를 처리하여 반응시키는 단계;

2) 단계 1)의 반응 펩티드를 ELISA 플레이트에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합시키는 단계;

3) 단계 2) 펩티드에 본 발명의 단일클론항체를 첨가하는 단계; 및

4) 단계 3)의 단일클론항체와 HIF-1α펩티드의 결합 수준을 측정하는 단계.

본 발명에 따른 단일클론항체는 PHD2에 의해 402번 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α 펩티드에 반응성이 있지만 402번 프롤린 잔기가 수산화되지 않은 HIF-1α 펩티드에 대해서는 반응이 없으므로, PHD2에 의한 HIF-1α 기질펩티드의 수산화 정도를 본 발명의 단일클론항체를 이용하여 측정함으로써, PHD2 활성 정도를 측정할 수 있다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 402 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α 펩티드를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 이용하여 PHD2 억제제를 탐색하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 402번 프롤린 잔기가 수산화되지 않은 HIF-1α 펩티드 (b402)에 PHD2 및 후보물질을 처리하여 반응시키는 단계;

2) 단계 1)의 반응 펩티드를 ELISA 플레이트에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합시키는 단계;

3) 단계 2) 펩티드에 본 발명의 단일클론항체를 첨가하는 단계;

4) 단계 3)의 단일클론항체와 HIF-1α펩티드의 결합 수준을 측정하는 단계; 및

5) 단계 4)의 결합수준을 감소시키는 후보물질을 PHD2 억제제로 판정하는 단계.

PHD2는 허혈성 세포에 산소 및 영양분이 필요한 경우나, 적혈구 생성이 필요한 경우 표적이 되는 효소이므로 PHD2 활성 억제제는 허혈성 및 빈혈 치료제의 후보물질이다. PHD2 억제제를 스크리닝하는 방법은 PHD2 활성 억제 후보물질을 투여시 HIF-1α 기질펩티드의 수산화 억제 활성을 본 발명의 단일클론항체를 이용하여 측정함으로써, 투여된 후보물질이 PHD2 활성억제 효과를 갖는지를 직접적으로 측정할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 수산화 프롤린이 포함된 펩티드 항원 및 항체 분석용 펩티드 제작

면역화를 위한 펩티드 항원 및 항체 분석용 펩티드의 합성은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)기를 Na-아미노 보호기로 사용하는 고상합성법에 의하여 수행하였다(Merrifield, Science, 232, 341, 1986). Fmoc-아미노산들 및 Fmoc-아미노산이 붙은 레진들은 Novabiochem사(스위스)에서 구입하여 사용하였다. 합성은 DCC(dicyclohexylcarbodiimide) 및 HOBt(N-hydroxybenzotriazole)를 사용하는 방법을 이용하여 합성하였으며, 최종 합성이 끝난 다음, Fmoc 보호기를 피페리딘(piperidine)으로 제거하고, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) : 물(water) : 에탄디씨올(ethandithiol) : 트리이소프로필실란(triisopropylsilane)이 95 : 2.5 : 2.5 : 1로 들어있는 용액으로 2시간 동안 처리하여 크루드(crude) 펩티드를 얻었으며, HPLC로 정제한 다음 분자량을 MALDI-TOF 분석에 의하여 확인하였다(도 1 참조).

<실시예 2> 펩티드-단백질 결합체 제조

상기 <실시예 1>에서 합성된 펩티드 항원들을 생쥐에 면역시키기 위하여 펩티드-단백질 결합체를 제조하였다. 이때 운반 단백질로는 BSA(bovine serum albuimin) 또는 OVA(ovalbumin)를 사용하였다.

구체적으로, 모든 펩티드들을 단백질에 결합시키기 위해 사용한 시료로 GMBS(N-[-maleimidobutyryloxy]succinimide ester)를 사용하였다. 먼저, 2 mg BSA 또는 OVA 단백질을 200 ㎕ 결합완충액[0.083 M 인산나트륨(sodium phosphate), 0.9 M 염화 나트륨(sodium chloride) 및 0.1 M 에틸렌디아민디하이드로클로라이드(ethylenediaminedihydrochloride), pH 7.2]에 녹이고, 상기 반응물에 10 ㎎/㎖ 농도로 디메틸 설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹아 있는 GMBS 20 ㎕를 첨가하고, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응액은 결합완충액으로 평형시킨 Sephadex G50 컬럼에 통과시켜 GMBS로 활성화된 단백질을 얻었으며, 1 ㎎의 펩티드 분말을 첨가하여 녹인 다음, 2시간 동안 반응시켰다. 최종 반응액은 분자량 10,000 이하를 투과시키는 투석막을 이용하여 PBS로 투석시켜, 단백질 정량 후 냉동 보관하였다.

상기 형성된 펩티드-단백질 결합체는 하기와 같은 SDS-PAGE 방법으로 확인하였다. 먼저, 단백질-펩티드 결합체 3 ~ 5 ㎍을 5 ㎕의 시료완충액[50 mM Tris-HCl, 2% SDS, 15% 글리세롤(glycerol), 5% 2-멀캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 0.024% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)]과 혼합하여 95℃에서 2분간 가열한 다음, 10% SDS-PAGE에 로딩한 후 젤 당 20 mA에서 1시간 30분간 전기영동을 수행하였으며, 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 염색액(0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 50% 메탄올, 10% 초산)에 30% 메탄올, 10% 초산이 들어 있는 용액에 탈색시켜 염색된 단백질을 관찰하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 활성화된 단백질(OVA-ME 또는 BSA-ME)과 비교하여 펩티드 결합시 분자량의 증가를 나타냄으로써 효과적으로 펩티드가 단백질에 결합되어 있음을 확인하였다(도 2).

<실시예 3> 항 펩티드 항체의 생산 및 단일클론 항체의 제조

상기 <실시예 2>에서 획득된 각각의 펩티드-단백질 결합체는 30 ㎍/100 ㎕ 농도로 PBS에 희석하고, 희석액 100 ㎕를 CFA(Complete Freund's Adjuvant) 100 ㎕과 혼합하여 이멀젼화시키고, Balb/c 마우의 복강에 주사하였다. 이후, 2주 간격으로 30 ㎍/100 ㎕ 농도로 PBS에 희석한 펩티드-단백질 결합체 100 ㎕를 IFA(incomplete Freund,s adjuvant) 100 ㎕과 혼합하여 이멀젼화하고, 복강에 3회 주사하였다. 최종 복강 주사 일주일 후 혈청을 채취하여 항체 분석용 펩티드에 대한 면역활성을 분석한 후 면역이 잘된 마우스에 30 ㎍/100 ㎕ 농도의 펩티드-단백질 결합체 100 ㎕를 꼬리 정맥에 주사하였다. 3일 후, 마우스에서 비장(spleen)을 적출한 후, 비장세포를 분리하고 무혈청 RPMI1640 배지로 세척하고, 동일 배지로 세척한 P3/NS1/1-Ag4-1 골수종(myeloma) 세포와 평균 분자량 1450의 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 1 ㎖를 1분간 가하여 주고, 10 ㎖의 무혈청 RPMI1640 배지를 서서히 첨가해 주면서 5분간 방치하여 융합시켰다. 융합시킨 세포는 동일 배지로 세척한 다음, 10% 태아 소혈청이 포함된 RPMI1640 배지를 비장 1개당 30 ~ 40 ㎖를 첨가하여 현탁하였다. 이후, 96-웰 플레이트(well plate)에 100 ㎕씩 분주하였다. 3시간 동안 배양한 후, 2 × HAT(hypoxanthine-aminopterine-thymidine)이 포함된 RPMI1640 배지 100 ㎕를 가한 후 5% 이산화탄소, 37℃ 조건으로 세포 배양기에서 7 ~ 10일간 배양한 다음, 100 ㎕의 배지로 수산화된 HIF-1α 펩티드(402hyd) 결합을 ELISA 방법에 의해 조사하였다. 이중 수산화된 402hyd 펩티드에 특이성이 높은 항체를 생산하는 세포들은 웰 당 2/3 세포가 들어가도록 희 석한 다음, 최종적으로 수산화 펩티드에 특이성이 매우 높은 항체를 생산하는 세포주를 선별하였다. 상기 세포주는 402A(OH)-BSA로 면역시킨 마우스로부터 단일클론항체를 얻었으며 이를 'An402(OH)'라 명명하였다. 상기 항체는 402hyd에는 결합력이 매우 높으나 수산화가 않된 402wt 펩티드에는 거의 결합하지 않는 특이성을 나타냈으며(도 3), 이소타이핑(isotyping) 결과, 중쇄 불변지역은 IgG2b로 밝혀졌고, 경쇄 불변영역은 카파(κ) 이소타입을 가지는 것으로 확인되었다.

<실시예 4> HIF-1α 펩티드의 프롤린 잔기를 수산화시키기 위한 PHD2의 분리정제

인간 뇌세포 cDNA에서 PHD2(179-426) 서열을 증폭시킨 다음, pET-28a 벡터에 삽입한 재조합 pET-PHD2 유전자를 대장균[E. coli BL21(DE3)] 세포에 주입한 후, 항생제[50 ㎍/㎖ 카나마이신(kanamycine)]가 첨가된 LB(Luria-Bertani) 아가 플레이트에서 콜로니(colony)를 선별하였고, 이를 LB 배지에서 600 nm 흡광도가 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이후 0.5 mM IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 18℃에서 16 ~ 20 시간 6 × His 테그된 PHD2의 발현을 유도하였고, 6,000 rpm에서 5분간 원심분리를 수행하여 PHD2를 발현하는 대장균을 수거하였다. 이후 대장균을 완충액 A(20 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaCl, 1 mM PMSF 및 5% 글리세롤)에 현탁시키고 초음파 분쇄법으로 세포를 파괴한 다음, 16,500 rpm에서 30분간 원심분리를 수행하여 상등액을 수거하였다. 상등액은 글리세롤이 첨가되지 않은 완충액 A로 평형시킨 Ni-NTA-아가로즈(Invitrogen, USA)에 첨가한 다음, 같은 완충액 100 ㎖로 젤을 세척하고 완충액 B(20mM Tris-HCl pH7.5, 300mM imidazole, 1mM PMSF)를 0 ~ 90% 농도 기울기(gradient)로 흘려주어 PHD2를 용출하였다. 용출된 PHD2에 50 유닛(unit)의 트롬빈(trombin)을 가하고 투석 방법을 이용하여 완충액 C(50 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)로 평형시키면서 6 × His 테그를 제거한 다음, EDTA가 없는 완충액 C로 평형시킨 7 ㎖ 농도 기울기(gradient)의 SP-Sepharose(Pharmacia amersham, Sweden)에 얹은 다음, 완충액 50 ㎖로 세척하고, 완충액 D(50 mM Tris-HCl pH7.5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF)를 0 ~ 100% 농도 기울기(gradient)로 흘려주면서 PHD2를 정제하였다. 도 4는 정제 전 및 정제 후 PHD2를 12% 젤을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하여 염색한 그림이다(도 4). 95% 이상 정제된 단백질은 50 mM Tris-HCl, pH7.5, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF용액으로 3번 투석하였으며, 보관용 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 50% 글리세롤)에 투석하여 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 5> 단일클론항체 An402(OH)의 수산화 HIF-1α 펩티드에 대한 특이적 인식 검증

실제 생체 내 환경을 모방하기 위해, 비오틴(biotin)기를 N-말단에 결합시킨 상기 <실시예 1>에서 제조한 펩티드들인 b402 및 b564를 PHD2로 37℃에서 1시간 수산화시켰고, 수산화된 펩티드는 각각 'b402(OH)' 및 'b564(OH)'라고 명명하였다. 이때, 45 ㎕ 반응용액[50 mM Tris-HCl, 4 mM 아스코빈산, 2 mM DTT, 0.6 mM 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate, 2OG) 및 0.1 mM 과황산 암모늄(ammonium ferrous sulfate)]에는 15 ㎍ PHD2, 15 ㎍ b402 또는 b564 펩티드, 20 ㎍ 카탈레이스(catalase)가 포함되었다. 수산화되지 않은 펩티드를 얻고자할 때는 위 반응액에서 2OG가 제거된 상태로 반응시켰다. 이후 반응액을 95℃로 2분간 효소를 변성시킨 후, 10,000 rpm에서 2분 원심분리를 수행하였다. 이후 상등액을 MALDI 분자량 분석에 의하여 펩티드의 수산화를 분석한 결과, 2OG가 존재할 경우 펩티드의 분자량이 16 가량 증가하였으나, 2OG가 없을 경우 전혀 분자량의 증가가 없었다(도 5). 이를 통해 b402 및 b564 펩티드가 생체내에서처럼 수산화됨을 확인하였다.

An402(OH)의 수산화 펩티드 특이적 인식은 ELISA 방법으로 검사하였다. 먼저 50 ng/웰의 농도로 스트렙타비딘(streptoavidin)을 ELISA 플레이트에 흡착시킨 다음, 50 ng의 b402(OH) 또는 b402 펩티드를 TBSS[20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 nM 염화나트륨(sodium chloride), 1% 탈지분유(skim milk)]에 희석하여 스트렙타비딘에 결합시키고 1시간 반응시킨 후 TBST(20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM 염화나트륨, 0.1% tween 20)로 3회 세척하였다. 그런 다음, An402(OH) 항체를 다양한 농도로 TBSS로 희석하여 1시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였다. 이후 TBSS에 1/10,000으로 희석된 호르세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 항 마우스 IgG 염소항체를 첨가하여 1시간 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하고, 결합된 항체를 오르토-페닐렌디아민(o-phenylenediamine) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)를 기질로 발색시켜 490 nm에서 흡광도를 분석하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 An402(OH)는 수산화된 b402(OH) 펩티드에 매우 높은 반응성을 보였으나, 수산화되지 않은 b402에 대해서는 고농도 항체 존재 하에서도 반응성을 나타내지 않았다(도 6).

<실시예 6> 단일클론항체 An402(OH)를 이용한 PHD2 억제제 검출

단일클론항체 An402(OH)가 PHD2 억제제 탐색에 유용한가를 알아보기 위하여, 1차적으로 2OG와 경쟁하여 PHD2의 활성을 억제한다고 알려진 NOG(N-oxalylglycine) 및 금속이온 킬레이터(chelator)로 알려진 DFO(desferoxamine)를 이용하여 An402(OH)의 PHD2 억제제 탐색 유용성을 확인하였다.

먼저, NOG를 DMSO에 다양한 희석하여 2 ㎕를 취한 다음, 10 ㎕ 효소용액[50 mM Tris, pH 7.5, 2 mM DTT, 0.44 μM PHD2, 220 ㎍/ml 카탈라제(catalase), 11 μM 황산철 암모늄(ammonium ferrous sulfate)]을 가하고 37℃에서 10분간 반응시킨 다음, 10 ㎕의 기질용액[50 mM Tris, pH 7.5, 2 mM DTT, 2.2 μM b402, 55 μM 2OG, 1.1 mM 아스코르빈산(ascorbic acid)]을 가하여 37℃에서 20분간 더 반응시켰다. 상기 반응은 5 mM의 EDTA 용액 78 ㎕를 넣어 중지시킨 다음, 50 ng의 스트렙토아비딘이 코팅된 플레이트에 반응액 10 ㎕를 TBST 90 ㎕에 희석하여 첨가하여 분석하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, PHD2 억제제인 NOG 및 DFO 농도에 따른 항체-펩티드 결합 억제가 나타났으며(도 7), 이를 바탕으로 약물들의 50% 억제농도(IC₅₀)을 계산하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, NOG는 IC₅₀가 26 μM으로 이전에 보고된 FIH에 대한 IC₅₀ 3.41 μM(Lee 등, J Biomol Screen, 13, 494-503, 2008)에 비해 억 제 활성이 낮게 나타났으나, 금속이온 킬레이터(chelator)로 작용하는 DFO, 대부분의 쿼르세틴(quercetin) 및 대부분의 유도체들에 대해서는 높은 억제 활성을 나타내었다(도 8). 또한, FIH에 대한 억제활성은 높으나 PHD2에 대한 활성이 거의 없다고 보고된 NOdF(N-oxalyl-d-phenylalanine)(McDonough 등, J. Am Chem. Soc, 127, 7680-7681) 에 대해서는 500 μM 농도에서도 전혀 활성을 나타내지 않았다

따라서 단일클론항체 An402(OH)는 PHD2 억제제 탐색에 매우 유용하다는 것을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 402번 프롤린이 수산화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 허혈성질환 및 빈혈치료제 약물로 개발될 수 있는 PHD2 억제제 탐색에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 연구에서 사용된 펩티드의 서열을 표시한 것이다.

도 2는 항원 펩티드와 BSA 및 OVA 단백질을 결합시킨 결과를 나타내는 그림이다: M은 마커를, 1은 402A(OH)-BSA, 2는 402A(OH)-OVA, 3은 402B(OH)-BSA, 4는 402B(OH)-OVA, 5는 402wt-BSA, 6은 402wt-OVA, 7은 402hyd-BSA 및 8은 M402hyd-OVA를 나타낸다.

도 3은 면역효소 분석법(ELISA)에 의하여 본 발명의 단일클론항체 An402(OH)와 프롤린이 수산화된 402hyd 및 수산화되지 않은 402wt 결합을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 4는 PHD2(proline hydroxylase domain protein 179-426)을 정제한 결과를 나타내는 그림으로 lane 1은 IPTG로 발현을 유도하지 않은 대장균, lane 2는 IPTG로 발현을 유도한 대장균, lane 3은 Ni-NTA-agarose 크로마토그라피에 의해 정제된 단백질, lane 4는 thrombine 절단후 SP-Sepharose로 정제한 단백질을 나타낸 그림이다.

도 5는 PHD2에 의하여 프롤린 잔기가 수산화된 b402 및 b564 펩티드들의 분자량 증가를 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 6은 면역효소 분석법(ELISA)에 의하여 PHD2에 의해 수산화된 b402(OH)펩티드 및 비수산화 b402 펩티드들과 An402OH의 결합을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 7은 본 발명의 402 프롤린 수산화 특이 단일클론항체를 이용하여 항체 기반 PHD2 억제제 활성 분석시 유용성을 보여주는 그림으로, PHD2 억제제에 대한 DFO(desferoxamine) 및 NOG(N-oxalylglycine) 처리시 PHD2의 활성이 억제제 농도 의존적으로 감소한다는 결과를 나타내는 그림이다.

도 8은 본 발명의 402 프롤린 수산화 특이 단일클론항체(An402(OH))및 이전에 본 연구자들이 발명한 803 아스파라진 수산화 특이 단일클론항체(SHN-HIF1α; 대한민국 특허등록 10-759389)를 이용하여 측정한, PHD2 및 FIH에 각각 대한 다양한 억제제들의 50% 활성 억제농도(IC₅₀)를 나타내는 그림이다.

도 9는 도 8에 사용된 이중 케르세틴(quercetin) 유도체의 구조를 나타낸 그림이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Cellulosimicrobium funkei HY-13 strain and xylanase produced from it <130> 9P-03-11 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1385 <212> DNA <213> Cellulosimicrobium funkei HY-13's 16S rDNA <400> 3 tgcaagtcga acgatgatgc ccagcttgct gggtggatta gtggcgaacg ggtgagtaac 60 acgtgagtaa cctgcccttg acttcgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120 atgagccgtc ctcgcatggg ggtggttgga aagtttttcg gtcagggatg ggctcgcggc 180 ctatcagctt gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240 gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300 ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgaaggcct 360 tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgcaagt gacggtacct gcagaagaag 420 cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttgtccggaa 480 ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtc tgtcgcgtct ggtgtgaaaa ctcgaggctc 540 aacctcgagc ttgcatcggg tacgggcaga ctagagtgcg gtaggggaga ctggaattcc 600 tggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcaggtctct 660 gggccgcaac tgacgctgag gagcgaaagc atggggagcg aacaggatta gataccctgg 720 tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg tgtggggctc attccacgag ttccgtgccg 780 cagcaaacgc attaagtgcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840 attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa 900 ccttaccaag gcttgacatg cacgggaagc caccagagat ggtggtctct ttggacactc 960 gtgcacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020 caacgagcgc aaccctcgtc ccatgttgcc agcgggttat gccggggact catgggagac 1080 tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtct 1140 tgggcttcac gcatgctaca atggccggta caaagggctg cgataccgta aggtggagcg 1200 aatcccaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg 1260 agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320 accgcccgtc aagtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc catggcccaa ccgttcgcgg 1380 gggga 1385 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> N-terminal of Cellulosimicrobium funkei HY-13's xylanase <400> 4 Ala Pro Ser Thr Leu Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10

Claims (6)

1. 삭제
2. 프롤린 수산화효소 2(PHD2)에 의해 402번째 위치의 프롤린 잔기가 수산화된 저산소증유발인자-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 펩티드를 특이적으로 인지하여 PHD2 억제제 탐색에 유용한, 수탁번호 KCTC 11605BP로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 생산된 단일클론항체.
3. 제 2항의 단일클론항체를 포함하는, PHD2 억제제 탐색용 키트.
4. 402번째 위치의 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1a 펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 11605BP로 기탁된 하이브리도마 세포주.
5. 1) 402번 프롤린 잔기가 수산화되지 않은 HIF-1α 펩티드에 HIF-1α 프롤린 수산화효소2(PHD2) 처리하여 반응시키는 단계;

   2) 단계 1)에서 반응된 HIF-1α 펩티드를 ELISA 플레이트에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합시키는 단계;

   3) 단계 2)에서 스트렙타비딘에 결합된 HIF-1α 펩티드에, 수탁번호 KCTC 11605BP로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 생산된 402번째 위치의 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 첨가하는 단계; 및

   4) 단계 3)의 단일클론항체와 HIF-1α 펩티드의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하는, PHD2 활성 측정 방법.
6. 1) 402번 프롤린 잔기가 수산화되지 않은 HIF-1α 펩티드에 PHD2 및 PHD2 억제제 후보물질을 처리하여 반응시키는 단계;

   2) 단계 1)에서 반응된 HIF-1α 펩티드를 ELISA 플레이트에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합시키는 단계;

   3) 단계 2)에서 스트렙타비딘에 결합된 HIF-1α 펩티드에, 수탁번호 KCTC 11605BP로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 생산된 402번째 위치의 프롤린 잔기가 수산화된 HIF-1α를 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 첨가하는 단계;

   4) 단계 3)의 단일클론항체와 HIF-1α 펩티드의 결합 수준을 측정하는 단계;

   5) 단계 4)의 결과로부터 결합수준을 감소시키는 후보물질을 PHD2 억제제로 판정하는 단계를 포함하는, PHD2 억제제 탐색 방법.

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