DK175191B1 - Monoklonalt og polyklonalt antistof mod HbA1C - Google Patents

Description

DK 175191 B1

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt og et polyklonalt antistof mod HbA,c.

* Hæmoglobin, der bevirker transporten af indåndet oxygen og COj, 5 og som er lokaliseret i de røde blodlegemer, består af fire kæder, hvoraf hver to har samme struktur. Overvejende består det af to α-kæder og to β-kæder. Hæmoglobin foreligger i blodet med mere end 90% som denne form, der betegnes HbAg.

Glycosyleret hæmoglobin fremkommer in vivo ved en ikke-enzyma-10 tisk reaktion mellem hæmoglobin og glucose. Glycosyler i ngen forløber over dannelsen af en Schiffsk base mellem glucosens aldehydgruppe og hæmoglobinets aminogruppe. Det dannede aldi-min omlejres ved en Amador i-omlejring til en N-(1-desoxy-D-fructos-l-yl)-rest. I denne omlejrede form er det glycosylere-de hæmoglobin stabilt.

15

De glycosylerede hæmoglobiner betegnes med HbAj og det vigtigste i denne gruppe betegnes HbAic. HbAjc fremkommer ved glyco-sylering af den frie aminogruppe i valin-resten, der befinder sig i aminoenden af hæmoglobins β-kæde. Derved fremkommer en N-(1-desoxy-D-fructos-1-yl)-L-valin-rest, der i det følgende 20 betegnes "fructose-valin".

Koncentrationen af HbAjc i blod afhænger af blodets sukkerkoncentration. Andelen af HbAj i forhold til den samlede mængde hæmoglobin ligger hos voksne normalt i området fra 3 til 6%.

Ved forhøjet blodsukkerniveau tiltager andelen af glycosyle-25 rede hæmoglobiner i forhold til det samlede hæmoglobin, og den kan stige op til 15%. Bestemmelsen af HbAic-andelen er derfor en pålidelig parameter til kontrol af sukkerstofskiftet. Da en erythrocyt og med denne det stabile HbA^ gennemsnitligt bliver 120 dage gammel, giver bestemmelsen af andelen af glycosylere-de hæmoglobiner i blod således en god parameter til at kon-30 trollere carbonhydratstofskiftet, hvilket er særligt vigtigt for diabetespatienter. Denne parameter er uafhængig af en kortvarig forhøjelse af blodsukkerniveauet efter et carbonhy-dratrigt måltid og tjener således som en 1angtidsparameter.

I DK 175191 B1 I

I i

I Det er derfor til diagnose af diabetes og til overvågning af I I diabetespatienter vigtigt at bestemme andelen af HbAjc speci- I I fikt i blod. I

I 5 Til analysen af glycosylerede hæmoglob i ner findes der en række , I I af fremgangsmåder. De mest velkendte metoder beror på tabet af I I positive ladninger i hæmoglobinmolekylet, når de frie amino- I I grupper i Ø-kæderne omsættes med glucose. Frem for alt anven- I I des søj1ekromatografiske og elektroforetiske metoder. Andre I

10 metoder forsøger kolorimetrisk at bestemme det indbyggede glu- I I cosemolekyle eventuelt fructosemolekylet efter Amador i-omlej- I I ringen (thiobarbitursyremetoden). I

I De tidligere kendte metoder er dels yderst tidsrøvende og om- I I 15 stændige og dels heller ikke tilstrækkeligt specifikke for det I I glycosylerede hæmoglobin. I

I Der bestod således et behov for en simpel bestemmelsesmetode, I I der på yderst specifik måde registrerer denne glycolyserede I I 20 andel af det samlede hæmoglobin. I

I Sådanne enkelte fremgangsmåder er de for fagfolk velkendte I I forskellige varianter af immunbestemmelser. Ved homogene kom- I I petitive immunbestemmelser konkurrerer f.eks. et mærket HbAjc- I I 25 derivat med HbAjc fra den prøve, der skal måles, om antistof- I I ferne. Som mærket HbAjc-deri vat kan anvendes et kort syntetisk I I peptid, der udgør en epitop af HbA}C, og som er bundet til en I I markør. For at man nu skal kunne gennemføre bestemmelsen re- * I

producerbart med nøjagtige resultater, må der anvendes et an- I I 30 tistof, der binder det mærkede peptid og HbAic fra prøven med I

tilnærmelsesvis lige høj affinitet for faktisk at muliggøre en I I konkurrencereaktion. Til gennemføring af immunbestemmelser må I I der derfor tilvejebringes antistoffer, der meget specifikt I I genkender HbAjc, dvs. som specifikt binder til den glycosyle- I

35 rede N-terminale ende af HbAjc-p-kæden, men som ikke binder I I til den tilsvarende ikke-glycosylerede N-terminale ende af I I HbAg-Ø-kæden. I

3 DK 175191 B1

En yderligere variant af konkurrerende eller koropetetitiv immunbestemmelse gennemføres i heterogen fase. Herved konkurrerer f.eks. et fastfasebundet syntetiseret peptid, der indeholder en HbAic-epitop, med HbA^c fra prøven om de specifikke * 5 antistoffer. Det fastfasebundne peptid kan f.eks. være et kon- jugat af okseserumalbumin og et syntetisk glycosyleret peptid, der har sekvensen fra en epitop af HbA|C. Også til gennemføring af denne variant skal antistoffet binde peptidet og HbAic fra prøven med tilnærmelsesvis lige høj affinitet.

10

For nu at kunne gennemføre en følsom og specifik fremgangsmåde til påvisning af HbAjc var det væsentligt at opnå et antistof, der specifikt binder HbAjc men ikke HbAg* 15 Der kendes allerede fremgangsmåder til påvisning af HbAic ligesom egnede antistoffer til fremgangsmåden, f.eks. fra EP* A 185.870. Alle kendte antistoffer lider imidlertid under den ulempe, at de udviser en meget ringe affinitet for HbAic-mole-kylet. Som regel må der derfor før gennemføringen af en be-20 stemmelse foretages en denaturering for at frigøre de antigene determinanter af HbAj i så vidt omfang, at antistofferne kan blive bundet i tilstrækkeligt omfang. En sådan fremgangsmåde er omstændelig.

25 De ved fremgangsmåden ifølge EP-A 185.870 anvendte immunogener har desuden den ulempe, at de kun fremkalder en lidet specifik immunreaktion. Således kunne der ifølge den der beskrevne fremgangsmåde kun udvindes polyklonale fåre- og nuse-sera, der ikke har nogen målelig specificitet med hensyn til adskille!- “ 30 sen mellem HbAjc og HbAg.

Fra DE offentliggørelsesskrift nr. 34 39 610 kendes en fremgangsmåde til udvinding af antistoffer mod HbAjc, hvor der som immunogen anvendes et konjugat af en sukkerart, en peptidrest 35 af Ø-kæden fra hæmoglobin og en immunogen bærer. De ved denne fremgangsmåde opnåede antistoffer udviser imidlertid ingen ti 1 strækkeligt selektivitet og deres relative affinitet er ringe.

I DK 175191 B1 I

I I

I Det var således formålet med den foreliggende opfindelse ud fra denne kendte teknik at I

I tilvejebringe højspecifikke polyklonale og monoklonale antistoffer mod HbA)c med høj I

I affinitet. I

I 5 Det var endvidere formålet med den foreliggende opfindelse at I

I tilvejebringe antistoffer, der over for det naturlige HbAic- I

I molekyle og et peptid, der udviser den N-terminale sekvens af I

I hæmoglobins β-kæde, udviser molære relative affiniteter, der I

I adskiller sig med en så lille faktor som muligt fra hinanden. I

I 10 I

I Dette opnås med et monoklont eller et polyklont antistof mod HbAlc, der er ejendom- I

I meligt ved, at det udviser en høj affinitet til HbA|C, ikke binder til HbAo og er opnåeligt I

I ved at et immunogen med den almene formel I I

/. · , I

I 15 H/i—o A. O I

I 0^ί^Η\ΝΛγΝΗ^^ΝΗ^Ν^Α^.Α^.Τ 1 I

0H H. 0 Sn»0 Aoh L· I

I \ HN—/ I hvor m betyder 1 til et tal, der svarer til 25 vægt% hapten-afstandsstykke-grupper i for-

I 20 hold til bærerproteinets vægt, T betyder et bærerprotein og A et afstandsstykke, der har I

I en kædelængde på 10 til 20 atomer og har følgende formel II I

I -HN-CH-(CH2)n-X-B- 11 I

I COOH I

I Det er på overraskende måde blevet fastslået, at der ved anvendelse af de omhandlede I

I 30 immunogener kan opnås højspecifikke antistoffer, hvis selektivitet og affinitet langt

I overgår de hidtil kendte HbA)c-antistoffer. I

25 hvor X betyder S eller NH, n betyder 1 til 4 og B betyder en organisk rest, der indehol- I

I der en succinimidgruppe, indsprøjtes i en organisme, der er i stand til at danne antistof- I

I fer, hvorefter antistofferne udvindes fra organismen. I

5 DK 175191 B1

Immunogenet ifølge opfindelsen består af tre dele - en hapten-del, der svarer til HbAic-proteinets N-terminale ende, et afstandsstykke og et immunogent protein. Haptendelen i immunogenet ifølge opfindelsen indeholder de første 4 aminosyrer fra 5 hæmoglobins Ø-kædes N-terminale ende og desuden et fructose-molekyle. Som i det naturlige HbAj-protein er fructosemoleky-lets Cj-atom i immunogenet ifølge opfindelsen bundet til ami-nosyrerne valin, histidin, leucin og threonin.

10 Fremstillingen af hapetendelen sker på i og for sig kendt måde. Fastfasesyntese (en oversigt gives af G. Barany og R. W. Merrifield i Gross, Meienhofer, The Peptides, bind 2, side 3 -285, New York, 1978) har vist sig som værende særligt egnet.

Til dette beskyttes α-aminogrupperne hensigtsmæssigt med N-ct-15 fluorenylmethoxycarbonylgrupper. Sidekædefunktionerne beskyttes som tert-butylether, tert-butylester eller som tert-buto-xycarbonylgruppe. Disse beskyttelsesgrupper bliver også fjernet ved den acidolytiske spaltning af det færdige syntetiserede peptid fra bæreren. N-(1-desoxy-D-fructos-l-yl)-resten ind-20 føres på i og for sig kendt måde ved omsætning af peptidet med glucose.

Ved efterfølgende Amador i-omlejring (jvf. K. Heyns og H. Paulsen, J. Liebigs Ann. Chem. 627 (1959), side 160 - 174 og H.

25 Rdper et al., Carbohydrates. 116 (1963), side 183 - 195) opnår man det ønskede N-(1-desoxy-D-fructos-l-yl)-peptid.

En yderligere for opfindelsen væsentlig bestanddel af det immunogene konjugat er afstandsstykket, der forbinder haptenet 30 med det immunogene protein. Afstandsstykket udviser ifølge opfindelsen en kædelængde på 10 til 20 atomer, idet kæden kan være dannet carbonatomer, oxygenatomer, nitrogenatomer og/eller svovlatomer. Til kædelængden tælles kun de atomer, der danner kæden, og ikke hydrogenatomerne eller sidegruppe-35 atomerne.

Afstandsstykket bindes til threonins carboxyl gruppe.

I DK 175191 B1

Afstandsstykket udviser følgende almene formel: I

-NH-CH-(CH2)n-X-B-

I COOH

5

hvor X betyder S eller NH og n er et helt tal fra 1 til 4. I

Fortrinsvis har X betydningen S og η 1 eller X er NH og n 4. I

Gruppen Bi den almene formel står for et i sig selv kendt I

^q afstandsmolekyle, der indeholder en succinimidylgruppe. Opbyg- I

ningen af gruppen B er ikke i sig selv kritisk, men den må dog I

indeholde så mange kædemolekyler, at den sammen med den øvrige I

del af afstandsstykket giver en kædelængde på 10 til 20 ato- I

mer. Fortrinsvis anvendes en succinimidylhexanoylgruppe, som H 15 gruppen B.

Afstandsstykket indføres på i og for sig kendt måde. Det inde- holder en aminosyre, der målrettet kan bindes til peptidets ΟΙ terminale ende og som bærer en gruppe NH2 eller SH. Over denne 20 aminogruppe eller mercaptogruppe kan succinimidylgruppen, der formidler bindingen med bærerproteinet, indføres. Fortrinsvis anvendes der som aminosyre cystein, homocystein, lysin eller ornithin. Hvis afstandsstykket som aminosyre indeholder cyste- in eller homocystein, kan man som startaminosyre til fastfase- 2g syntese af peptidet først anvende cystein eller homocystein med beskyttet mercaptogruppe, idet der som beskyttelsesgruppe fortrinsvis anvendes en tert-butylsulfenylgruppe. Derefter om- sætter man bærerproteinet med en bifunktionel kobler, der lefl verer succinimidylgruppen, som f.eks. maleiroidohexanoyl-N-hy- I 3q droxysuccinimid, og kobler derefter afstandsstykke-bærerpro- I tein-konjugatet til cysteins eller homocysteins frigjort SH- H gruppe. Hvis afstandsstykket som aminosyre indeholder lysin H eller ornithin anvender man fortrinsvis først aminosyren med beskyttet a-amingruppe som startaminosyre til fastfasesynte- I 35 sen af peptidet, idet der som beskyttelsesgruppe fortrinsvis I anvendes en carbobenzoxygruppe, og derefter omsættes peptidets I frigjort α-aminogruppe med den bifunktionelle kobler. Peptid- I aminosyre-afstandsstykke-konjugatet kobles derefter til bærer- 7 DK 175191 B1 proteinet, idet bindingen sker over bærerproteinets SH-grup-per.

^ Som bærerprotein kan anvendes i sig selv kende proteiner. Eg-- nede er f.eks. albuminer, såsom okseserumalbum in og ovalbumin, hæmocyaniner såsom Keyhole limpet hemocyanine, polyaminosyrer såsom poly-L-Lys og poly-L-{Lys:Glu) eller enzymer såsom ga-lactosidase. Fortrinsvis anvendes som bærerprotein edestin eller galtactosidase.

1°

Til bærerproteinets bindes fortrinsvis flere hapten-afstands-stykke-grupper. Antallet af bundne grupper afhænger af bærerproteinets størrelse. Som regel kan der højst bindes hapten-afstandsstykke-grupper svarende til 25% af bærerproteinets vægt. Dersom der anvendes edestin som protein bindes fortrins-vis 10 til 30 hapten-afstandsstykke-grupper.

Med de omhandlede immunogener opnås højaktive, specifikke antistoffer mod HbAic.

Disse antistoffer udviser meget ringe krydsreaktivitet med HbAo· 20

Antistofferne ifølge opfindelsen kan opnås ved en fremgangsmåde til udvinding af antistoffer rettet mod HbAlc. Ved denne injiceres immunogenet ifølge opfindelsen flere gange i en egnet organisme, hvorefter antistoffet på i sig selv kendt måde udvindes. Til udvinding af antistoffer immuniseres som regel pattedyr. Egnede er f.eks. mus, får, ka-25 niner, rotter eller marsvin. Immunogenet indsprøjtes i værtsdyret, fortrinsvis opløst i en puffer og under tilsætning af et sædvanligt hjælpestof, f.eks. Freund's adjuvans. For at opnå en høj antistoftiter gentages indsprøjtningen med regelmæssige mellemrum, f.eks. hver anden til hver fjerde uge. Ud fra værtsdyrets blod udvindes på sædvanlig måde antisera, der indeholder de polyklonale antistoffer.

30

I DK 175191 B1 I

I I

I Med immunogeneme kan der også udvindes højspecifikke monoklonale antistoffer un- I

I der anvendelse af den kendte hybridiseringsfremgangsmåde ifølge G. Kohier og C. Mil- I

I Stein, der f.eks. er beskrevet i Nature 266, (1977), side 495 I

I og Science 208, (1980), side 692 ff. Ved denne metode isolerer I

I 5 man efter immunisering af værtsorganismen B-lymfocytter fra I

I det immuniserede dyrs milt, der fusioneres med myelomceller og I

I de dannede hybridomceller klones. Ud fra de dannede kloner I

I isoleres derefter de cellelinier, der producerer antistoffer, I

I der reagerer specifikt med HbAic og som praktisk talt ikke ud- I

I viser krydsreaktion med andre molekyler. Isoleringen af disse I

I 10 cellelinier er simpel, da en meget stor andel af klonerne pro- I

I ducerer specifikke antistoffer. Oisse cellelinier dyrkes vide- I

I re og deraf kan man derefter udvinde de ønskede monoklonale I

I antistoffer. Anti stofakt ivi teten bestemmes på i og for sig I

I kendt måde i serum eller hybridomsupernatanten, sædvanligvis I

I under anvendelse af en enzym-immunbestemmelse. I

I 15 I

I Antistofferne ifølge opfindelsen udmærker sig ved en høj specificitet og høj affinitet I

I mod HbA)e. Krydsreaktionen med ikke-glycosyleret hæmoglobin og med andre i le- I

I gemsvæskeme tilstedeværende proteiner er lille og ubetydelig. Antistofferne egner sig I

I 20 derfor på fremragende måde til anvendelse ved metoder til bestemmelse af HbAlc i le- I

I gemsvæsker. I

I Særligt egnede monoklonale antistoffer er MAK 3.609.325, I

I 3.51.56 og 3.230.140. De tilsvarende hybridom-celleli nier er I

I deponeret under accessionsnumrene ECACC 87120801, ECACC I

I 88122302 og ECACC 88122301 hos European Collection of Animal I

I Cell Cultures, Proton Down, GB, og er omfattet af den forelig- I

I gende opfindelse. I

I Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af følgende figurer og I

I eksempler. I

I Fig. 1 viser en standardkurve for aktiviteten mod HbAjc hos I

I monoklonale anti-HbAjc-anti stoffer (MAK 3.609.325). I

I F i g . 2 viser titerbestemme1 se (dobbeltbestemmelse) for det I

I Ifølge eksempel 14 opnåede antiserum. I

9 DK 175191 B1

Fig. 3 viser et diagram over antistoffets relative affiniteter mod peptider og hæmoglobin.

Eksempel 1 5

Peptidet fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys-OH syntetiseredes. Fast-fasesyntese gennemførtes i en halvautomatisk peptidsyntesizer fra Firmaet Labortec, Bubendorf (Schweiz).

10 Som Ν-α-aminobeskyttelsesgruppe anvendtes en Fmoc-gruppe (flu-orenylmethoxycarbonylgruppe). En beskrivelse af pept idsyntese-metoden findes i J. Meyenhofer et al., Int. J. Peptid Protein Res. 13, 35-42 (1979).

15 Den C-terminale Fmoc-aminosyre kobledes som beskrevet af Meyenhofer til p-alkyloxybenzylalkohol-harpiks (Firmaet Bachem, Bubendorf, Schweiz).

Synteseplan for en syntesecyklus: 20

Trin_Tid_Reaqen/opløsn i ngsm iddel_ 1 2x1 min OMF (dimethylformamid) 2 1x3 min piperidin/DMF 1:4 3 1x7 min piperidin/DMF 1:4

4 4 x % min DMF

5 2 x % min isopropanol 25 6 stop ninhydrinprøve

7 2x1 min DMF

8 stop tilsætning af næste Fmoc-aminosyre

og HOBt (1-hydroxybenzotriazol) i DMF

9 2 min omrystning 10 stop tilsætning af DCC (dicyklohexylcar- 30 bodiimid) i DCM (dichlormethan) 11 90 min kobling

12 3x1 min DMF

13 2x1 min isopropanol 14 stop ninhydrinprøve

Til koblingen ifølge trin 8 til 11 anvendes Fraoc-aminosyrerne 35 og DCC hver i den tredobbelte molære mængde regnet på det, der er bundet til udgangsharpiksen. HoBt anvendes i den 4,5-fol-dige molære mængde.

I DK 175191 B1 I

I I

I Efter kobling af den sidste N-terminale Fmoc-aminosyre gennem- I

I løbes trinnene 1 til 5 af syntescyk1ussen til fraspaltning af

I Fmoc-beskyttelsesgruppen. Derefter omrystes harpiksen i det I

I 15-foldige rumfang dichlormethan (DCM)/trif1uoreddikesyre I

I 5 (TFA) l:l i to timer ved stuetemperatur. Der filtreres, har- I

I piksen vaskes yderligere to gange med DCM/TFA 4:1, alle fil- I

I trater forenes og inddampes under vakuum og under toluentil- I

I sætning ved 25°C. Der sættes diethylether til remanensen. Det I

I faste stof filtreres fra og tørres. I

I 10 I

I Ifølge det ovennævnte skema syntetiseredes peptidet fructose- I

I Va 1-His-leu-Thr-Cys(StBu)OH. Som udgangsharpiks anvendtes 10 g I

I Fmoc-Cys(StBu)p-alkoxybenzylalkoholharpiks ladet med 0,6 mMol/ I

I g. Ved syntesecyklussen anvendtes følgende Fmoc-aminosyrer

I 15 efter hinanden: I

I 1. 6,2 g Fmoc-Thr(tBu) I

I 2. 6,4 g Fmoc-Leu I

I 3. 11 g Fmoc-His(Trt) I

I 20 4. 6,1 g Fmoc-Val. I

I Der anvendes følgende forkortelser: I

I t Bu: tert-butylether

I 25 Trt: trityl I

I StBu:tert-butylthioether I

I 0tBu: tert-butylester I

I Z: benzyloxycarbony1 I

I -Cys(StBu): tert-butylsulfenylcysteiη I

I 30 I

I Det rå udbytte efter fraspaltning af harpiks var 3,29 g Η-Val- I

I His-Leu-Thr-Cys(StBu)-OH. Tyndt 1agskromatografi (TLC); (kisel-

I gel HPTLC Merck, elueringsmiddel: ethanol/iseddike/vand 6:2:2) I

I Rf = 0,62. Efter besprøjtning med ninhydrin 0,1% (Merck) og I

I 35 fremkaldelse ved 120eC i 5 minutter fremkom der en rødviolet I

I farvning. Ved besprøjtning med en blanding af 200 ml 0,4% me- I

I thanolisk resorcinopløsning og 40 ml 5 N svovlsyre (resorcin- I

I svovlsyre) og fremkaldelse ved 120°C i 5 til 10 minutter frem- I

I kom der ingen farvning. I

11 DK 175191 B1

Til 1 g af det rå peptid sattes 540 mg glucose og 50 ml pyri-din/iseddike og der omrørtes i 5 dage ved stuetemperatur. Derefter inddampedes der ved stuetemperatur under vakuum, hvorefter remanensen yderligere 3 gange blev optaget i 50 ml vand og 5 igen inddampet til tørhed. Remanensen blev optaget i 50 ml vand, påførtes en kolonne med Dowex 50 WX8 (H+-form, 50 x 3,5 cm) og vaskedes med vand, indtil den samlede mængde glucose var elueret. Derefter elueredes produktet med 1 N ammoniak og lyofi 1iseredes. Der blev opnået 810 mg. Lyofilisatet blev op-10 taget i 0,1 M triethy1ammoniumacetatpuffer, pH 8,5, og vaskedes på en kolonne med Affigel 601 (Biorad, 5 x 26 cm) med 2 1 0,1 M triethylammoniumacetatpuffer, pH 8,5, og derefter med 2 1 vand. Produktet elueredes derefter med 0,1% myresyre og lyo-filiseredes. Det således opnåede lyofilisat kromatograferedes 15 på Polygosil C18, 5μ (Macherey og Nagel) (gradient 0,1% TFA i vand til 95% isopropanol i vand, 0,1% TFA). Der opnåedes 283 mg fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys(StBu)-OH. TLC: (Kiselgel, elueringsmiddel som ovenfor): Rf = 0,58. Farvning med ninhy- drin: brunlig. Farvning med resorcin-svovl syre: rødbrun. Fab-20 MS (Fast Atom Bombardment MS) (positiv): MH+ = 822.

Til fraspaltning af cysteinbeskyttelsesgruppen opløstes det ovenfor opnåede peptid i 130 ml 0,1 M kaliumphosphatpuffer, pH 8,5, afgassedes flere gange og beluftedes påny med nitrogen.

25 Til opløsningen sattes derefter 778 mg dithiotretiol og der henstilledes i 24 timer under nitrogen. Derefter syrnedes med HC1 til pH 5 og rensedes ved kromatografer ing på Polygosil C18 (gradient som ovenfor).

30 Oer opnåedes 178 mg fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys-OH FabMS; positiv: MH+ = 734.

Eksempel 2 35 Ifølge det i eksempel 1 viste synteseskeam syntetiseredes pep-tidet fructose-Val-His-Leu-Thr-Lys-OH. Som udgangsharpiks anvendtes 10 mg Fmoc-Lys(Z)-p-alkoxybenzylalkohol-harpiks ladet med 0,48 mmol/g. Ved syntesecyklussen anvendtes følgende Fmoc-aminosyrer efter hinanden:

I DK 175191 B1 I

I 12 I

I 1. 5 g Fmoc-Thr(tBu) I

I 2. 5,1 g Fmoc-Leu I

I 3. 8,9 g Fmoc-His(Trt) I

I 4. 4,9 g Fmoc-Val, I

I 5 i

I Råudbytte efter fraspaltning fra harpiksen: 3,2 g. I

I TLC: (kiselgel HPTLC, elueringsmiddel se eksempel 1.3): Rf = I

I 0,58. I

I 10 I

I Det rå peptid omrørtes med 1,6 g glucose ved stuetemperatur i I

I 150 ml pyridin/iseddike 1:1. Reaktionsopløsningen inddampedes I

I og remanensen rensedes som beskrevet i eksempel 1.3 på Oowex I

I 50WX8 H+ og Affigel 601. I

I 15 I

I Der opnåedes 1,7 g fructose-Va1-His-Leu-Thr-Lys(Z)-OH. I

I TLC: (kiselgel HPTLC, elueringsmiddel se eksempel 1): Rf = I

I 0,58; farvning med svovlsyre-sprøjtereagens: rødbrun. I

I I

I 1h-NMR (300 Mhz, Dz0): 6 = 0,85 (d, 0 = 5,1 Hz, 3H) ; 0,89 (d, I

I J = 4,9 Hz, 3H); 0,96 (d, J = 7,l Hz, 3H); 1,04 (d, J = 6,8 Hz, 3H); I

I 1,20 (d, J = 1,20, 3 H) ; 1,3-1,9 (m, 9H); 2,3 (m, 2H); 3,0-3,3 I

I (m, 6H) j 3,63-4,1 (m, 5H); 4,1-4,29 (m, 4H); 4,32 (d, J = 5,4 I

I 25 HZ, IH); 4,45 (m, IH); 4,48 (m, 2H); 5,09 (s, 2H); 7,32 (S, I

I IH); 7,4 ("s", 5H); 8,63 ppm (s, IH). I

I 400 mg af det ovenfor vundne produkt hydrogeneredes i 50 ml I

I methanol/vand 5:1 med pal 1 adium-aktivt kul. Katalysatoren fil- I

30 treredes fra og der inddampedes og kromatograferedes på Poly- I

I gosil C18. I

I Udbytte: 300 mg. I

35 TLC (kiselgel HPTLC, elueringsmiddel se eksempel 1): Rf = I

0,09. Farvning med svolsyre-sprøjtereagens: rødbrun. I

Eksempel 3 DK 175191 B1 13 10 mg fructose-Val-His-Leu-Thr-Lys-OH fra eksempel 2 blev optaget i 1 ml 0,1 M ka1 iumphosphatpuffer pH 7. Der tilsattes 5 6,2 mg maleimidohexansyre-N-hydroxysuccinimidester i 2 ml ethanol. Reaktionsopløsningen omrørtes i 14 timer ved stuetemperatur og rensedes på Polygosil C18. Efter lyofi 1isering af de rene fraktioner opnåedes 4,3 mg fructose-Val-His-Leu-Thr-Lys-(maleimidohexanoyl) - OH.

10 FA8-MS, positiv;· MH+ = 952.

Ih-NMR (300 MHz, DMSO (D6)/CD30D): = 0,83 - 1,06 (m, 12H; Leu-CH3, Va1-CH3); 1,04 (d, J=6,5 Hz, 3H; Thr-CH3); 2,01 (t, J=6,5 15 Hz, 2H; MH-C0-CH2) og 6,92 ppm (s, 2H; MH-CH=CH). |

Eksempel 4 5 g edestin fra hampefrø (Roth) omrørtes i 500 ml 0,1 M kali-20 umphosphatpuffer, pH 7,0, og der tilsattes en opløsning af 500 mg maleimidohexansyre-N-hydroxysuccinimidester i 100 ml ethanol. Opløsningen omrørtes i 90 minutter ved stuetemperatur, det faste stof afsugedes, der vaskedes to gange med hver gang 100 ml vand, fire gange med 100 ml éthanol og yderligere to 25 gange med 100 ml vand. Det faste stof opslsmmedes i 150 ml vand og 1yofi 1 i seredes.

Udbytte: 4,34 g 30 Maleinimidogrupper/mol edestin: 17

Antallet af maleinimidogrupper bestemtes på følgende måde:

Opløsning A: 1 mM cystein, 0,5 mM EDTA i vand.

Opløsning B: 10 mM 5,5*-dithiobis-(2-nitrobenzoat) (Ellmann's reagens) i 0,1 M ka1 iumphosphatpuffer, pH 8,0.

35

I DK 175191 B1 I

i 14 I

I Opløsning C: 1 M tris, HC1 pH 8,2. I

I 8 mg maleimidohexanoyl-edestin optages i 39 ml 0,05 M kalium- I

I phosphatpuffer og behandles i 15 minutter i et ultralydbad. I

I 5 I

I Derefter tilsættes 1 ml opløsning A og der inkuberes i 10 mi- I

I nutter ved 25°C. I

I Med 3,2 ml opløsning C omrøreres i 2 minutter ved 25°C og der- I

I 10 efter tilsættes 200 μΐ opløsning B, og der inkuberes i 10 mi- I

I nutter ved 37®C. Ved 25eC centrifugeres prøven i 15 minutter. I

I I den ovenstående væske måler man ekstinktionen ved 405 nm. I

I Blindværdien opnås ved at gå frem på analog måde uden anven- I

I 15 delse af maleimidohexanoyl-edesti n-prøven. Antallet af male- I

I imidogrupper i nmol er AETmEl » 43,4, hvor ΔΕ er ekstinktions- I

I 13,3 I

I differensen mellem blindværdien og prøven. Den molære mængde I

I edestin får man ved den nøjagtige indvejning og edestins rela- I

I 20 tive molmasse på 310.000: mg prøve = nmol edestin. I

I 0,31 I

I 250 mg af det således opnåede maleimidohexanoyl-edestin fik I

I under argonatmosfære tilsat 20 ml 0,1 M kaliumphosphatpuffer, I

I 25 pH 6,5. Der tilsattes ligeledes under udelukkelse af oxygen 34 I

I mg fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys-0H opnået ifølge eksempel 1 og I

I omrørtes i 29 timer ved stuetemperatur. Opløsningen centrifu- I

I geredes, bundfaldet vaskedes 3 gange med vand og blev hver I

I gang påny centrifugeret. Den faste remanens opslæmmedes i 10 I

I 30 ml vand og 1 yof i 1 iseredes. Der opnåedes 175 mg konjugat af I

I fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys-OH og maleimidohexanoyl-edestin, I

I der betegnes som immunogen 1. I

I Som beskrevet ovenfor bestemtes de endnu frie maleimidogrup- I

I 35 per. Ud fra differensen i forhold til den oprindelige ladning I

I fremgår det, at immunogenet indeholder 14,6 mol peptid pr. mol I

I edestin. I

15 DK 175191 B1

Eksempel 5 48 mg Ø-galactosidase (EIA-kvalitet, Boehringer Mannheim GmbH) opløstes under argonatmosfære i 2 ml med argon begasset 0,1 M 5 kaliumphosphatpuffer pH 7,0. Der tilsattes under udelukkelse af oxygen 5 mg fructose-Va1-Hi s-Leu-Thr-Lys(MH)-OH som var opnået ifølge eksempel 3, og der omrørtes 1 time ved stuetemperatur .

10 En AcA 202-kolonne (2 x 24 cm) ækvi1ibreredes med argon-mættet 0,9% NaCl. Den samlede reaktionsopløsning påførtes på denne kolonne. Der elueredes med argon-mættet 0,9% NaCl og protein-fraktionen opsamledes. Der opnåedes 15 ml immunogen-opløsn i ng, c=3,l mg/ml. Ladningen med immunogen kan derefter bestemmes 15 ved omsætning af en prøve med Ellmann's reagens: pr. mol SH-grupper frigøres 1 mol carboxynitrothiopyridon (Xmax = 412 nm, ε = 13.600 ved pH 8,0).

Ø-galactosidase EIA-kvalitet indeholder 14 SH-grupper pr. mo-20 lekyle. Efter reaktionen med peptidet findes der to frie SH-grupper, dvs. ladningen er på 12 mol peptid pr. mol Ø-galactosidase .

Det opnåede konjugat af fructose-Va1-His-Leu-Thr-Lys{MH)-OH og 25 Ø-galactos i dase betegnes som immunogen 2.

Eksempel 6

Til sammenligning fremstilledes et immunogen, som udviser en 30 længere peptidkæde. Til dette fremstilledes først peptidet Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Cys-OH ved at følge det i eksempel 1 beskrevne synteseskema.

Ud fra synteseskemaet i eksempel 1 fremstilledes peptidet H-35 Va1-His-Leu-Thr-Pro-G1u-G1u-Cys(StBu)-OH. Som startharpiks anvendtes 10 g Fmoc-Cys(StBu)-p-alkoxybenzylalkoxyharpiks med en ladning på 0,5 mmol/g. I syntesecyklussen anvendtes følgende ami nosyrer: I DK 175191 B1

I I

I 1. 6,4 g Fmoc-Glu(OtBu) I

I 2. 6,4 g Fmoc-Glu(OtBu) I

3, 5,1 g Fmoc-Pro I

4. 6 g Fmoc-Thr(tBu) I

55. 5,3 g Fmoc-Leu I

6. 9,3 g Fmoc-Hi s (Trt) I

7. 5,1 g Fmoc-Val; koblingen blev gentaget en gang. I

I Råudbytte efter fraspaltn ing af harpiksen: 4,2 g. Det rå pro- I

10 dukt blev kromatograferet på Polygosil C18 på den i eksempel 1 I

I beskrevne måde. Udbyttet udgjorde 880 mg H-Val-His-Leu-Thr- I

Pro-G1u-Glu-Cys(StBu)-OH; TLC (kiselgel, elueringsmiddel som i I

eksempel 1): Rf = 0,53. 800 mg af dette peptid blev derefter I

I på den i eksempel 1 beskrevne måde omsat med glucose og opren- I

15 sedes på Dowex 50WX8 H+-form og derefter Affigel 601. Efter I

I kroroatografering på Polygosil 018 opnåedes 150 g produkt. I

FabMS, positiv: MH+ = 1177. Analogt med eksempel 1 fraspal- I

I tedes cysteinbeskytte 1 sesgrupperne derefter ved tilsætning af I

I dithiothretiol. Der opnåedes 78 mg fructose-Val-His-leu-Thr- I

I 20 Pro-Glu-Glu-Cys-OH. FabMS positiv: MH+ = 1087. I

I Det således opnåede peptid omsættes med 322 mg maleidohexano- I

I yledestin som beskrevet i eksempel 4. På denne måde opnås 200 I

I mg immunogen, der anvendes som sammenligningsimmunogen VI. I

I 25 I

I Eksempel 7 I

Som yderligere sammenligningsimmunogen fremstilledes et konju- I

I gat af fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys og pyridyldithiopropionyl- I

I 30 edestin. Peptidet fremstilledes som i eksempel 2. I

Til fremstilling af pyri dy1dithiopropiony1edestin blev 1 g I

I edestin fra hampefrø optaget i 150 ml 0,1 M kaliumphosphatpuf- I

I fer, pH 7,5. Til denne opløsning sattes under omrøring 10 mg I

35 succini mi dy 1-3-(2-pyri dyldithio)-propionat opløst i 12,5 ml I

ethanol. Der omrørtes i 2 timer, derefter afsugedes det faste I

stof, og der vaskedes 3 gange med 100 ml vand hver gang, 1 I

I gang med 100 ml ethanol og yderligere l gang med 100 ml vand. I

I Det faste stof blev optaget i 100 ml vand og 1yofi 1 i seredes . I

17 DK 175191 B1 352 mg af det således opnåede pyridyldithiopropionyledestin fik under argonatmosfære tilsat 100 ml 0,05 M ka1 iumphosphat-puffer, pH 6,0. Der tilsattes ligeledes under udelukkelse af oxygen 49,5 mg af peptidet fructose-Va1-His-Leu-Thr-Cys og der 5 omrørtes i 23 timer ved stuetemperatur. Derefter centrifugeredes, bundfaldet vaskedes 3 gange med 50 ml vand hver gang, 2 gange med 50 ml ethanol hver gang og nok 1 gang med vand og der blev liver gang igen fracentrifugeret. Den faste remanens blev optaget i 50 ml vand og 1 yofi 1 i seret. Til bestemmelse af 10 1adn i ngen måltes det frigjorte thiopyridon i den ovenstående væske fra den første centrifugering. Der opnåedes 300 mg af det som sammen 1igningsimmunogen V2 betegnede konjugat af fruc-tose-Val-Hi s-Leu-Thr-Cys og pyridyldithiopropionyledestin. Ladningen udgjorde 39 mol peptid pr. mol edestin.

15

Eksempel 8

Til gennemføring af sorteringsprøver på anti-HAjc-antistof fremstilles po1yhaptener. Polyhapten 1 fremstilles ud fra H-20 Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Cys-OH og pyridyldithiopropionyl-okseserumalbumin.

1 g okseserumalbumin opløstes i 30 ml 0,1 M kaliumphosphatpuf-fer, pH 7,5. Til denne opløsning sattes 226 mg succinimidylpy-25 ridyldithiopropionat opløst i 15 ml ethanol. Der omrørtes i 40 minutter ved stuetemperatur og den samlede reaktionsopløsning kromatograferedes over ACA 202 (31 x 3 cm); eluat 0,1 M kali-umphosphatpuffer pH 6,0. Der opnåedes 152 ml proteinopløsning, c= 6,6 mg/ml. Til opløsningen sattes 280,5 mg dithiothretiol 30 og der opfyldtes med 0,1 M kali umphosphatpuffer, pH 7,5, til 10 ml. Der fortyndedes med en faktor på 6. Koncentrationen af frigjort thiopyridon svarede til koncentrationen af de anvendte dithiopyridylgrupper. Ud fra ekstinktionskoefficienten for thiopyridon ved 340 nm på 8.080 og edestins relative molmasse 35 på 310.000 kan ladningen bestemmes. Den er 36 mol/mol protein.

10,5 ml af den opnåede opløsning af pyridyldithiopropionyl-ok-seserumalbumin og 47 mg H-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Cys-OH,

I DK 175191 B1 I

I 18 I

I opnået ifølge eksempel 6, omrørtes under argon (oxygenudeluk- I

I kelse) i 1 dag. Ladningen beregnedes ved bestemmelse af det I

I frigjorte thiopyridon til at være 33 mol peptid/mol protein. I

I Tilbageværende reaktionsdygtige grupper afmættedes ved til- I

I 5 sætning af 1,7 mg cyste in. Den samlede reaktionsopløsning I

I kromatograferedes over en ACA 202-kolonne (31 x 3 cm), prote- I

I infraktionen dialyseredes natten over mod H2O og lyofilisere- I

I des. Det opnåede produkt betegnes som polyhapten 1. I

I 10 Udbytte: 85 mg. I

I Eksempel 9 I

I Til fremstilling af polyhapten 2 (jvf. eksempel 8) anvendes 7 I 15 ml pyridyldithiopropionyl-okseserumalbumin-opløsning opnået I som beskrevet i eksempel 6. Som peptidkomponent anvendes 7,8 I mg af det ifølge eksempel 6 fremstillede peptid som på amino- I syren Val bærer en fructosedel. Til dette omsættes 800 mg af

I det ifølge eksempel 6 opnåede peptid Η-Val-His-Leu-Thr-Pro- I

I 20 GIu-Glu-Cys-OH som beskrevet i eksempel 1 med glucose og op- I

I renses på Dowex 50WX H-form og derefter på Affigel 600. Efter I

I kromatografer ing på Polygosil C18 opnås 150 mg af det glycosy- I

I lerede peptid. FabMS positiv, HH+ = 1177. Efter fraspaltning I

I af cyste i nbeskyttel sesgruppen med dithiothretiol opnås ud fra I

I 25 100 mg af det glycosylerede peptid 78 mg af det ønskede pro-

I dukt. FabMS positiv MH+ = 1089. Det således opnåede produkt I

I betegnes som polyhapten 2. I

I Eksempel 10 I

I 30 i

I For at erkende tilstedeværelsen og specificiteten hos anti- I

I stoffer mod HbAjc i serum fra immuniserede mus eller i den I

I ovenstående kulturvæske fra hybridceller eller ascites anvend- I

I tes en Elisa-metode som prøveprincip: I

I 35 I

I Mi rot iterplader blev belagt med 10 pg polyhapten 2 eller 10 pg I

I polyhapten 1/ml belægningspuffer (0,2 M natriumcarbonat/-bi- I

I carbonat, pH 9,3 til 9,5) ved stuetemperatur i 1 time under I

19 DK 175191 B1 rystning. Derpå efterbehandledes der i 10 minutter med 0,9% natriumchloridopløsning og 1% albuminopløsning. Efterfølgende vaskedes med 0,9% natriumchloridopløsning. Oerefter inkuberedes ved stuetemperatur i ca. 1 time med 100 μΐ prøve, og der 5 vaskedes påny med 0,9% natri urnehl or idopi øsning. Der efterfulgte en yderligere inkubation i 1 time med 200 U/ml af et fåre-Fab-anti-muse-Fcy-peroxidase-konjugat. Efter et nyt vasketrin med 0,9% natriumchlorid bestemmes peroxidaseaktiviteten på sædvanlig måde, idet man omsætter i 15 minutter ved stuetempe-10 ratur med ABTS. Derefter bestemmes ekstinktionsdifferensen, forskel mE, ved 405 nm.

De antisera, der blev opnået efter immunisering med det ifølge opfindelsen anviste, ifølge eksempel 4 opnåede immunogen 1 15 gav hos alle 100 immuniserede mus en binding med polyhapten 2 og ingen eller kun en svag binding til polyhapten 1. Der opnåedes således antistoffer, der binder selektivt til polyhapten 2 .

20 Blandt antisera, der blev opnået efter immunisering med det ifølge opfindelsen anviste, ifølge eksempel 6 fremstilledes immunogen 2, reagerede 6 af 18 af de fra immuniserede mus opnåede sera med polyhapten 2 og ikke med polyhapten 1. Bindingen til polyhapten 2 var her lige så god som med immunogen 1.

25 Også her blev der således opnået selektive antistoffer.

Ved den til sammenligning gennemførte immunisering med sammenli gningsimmunogen VI blev der fra 100 mus opnået en antiserum, der med præference reagerede med polyhapten 2, idet alle 99 30 andre antisera reagerede lige godt med begge po1yhaptener. Her kunne der således ikke opnås et antistof, der binder selektivt ti 1 polyhapten 2.

Ved immunisering med sammenligningsimmunogen V2 kunne ingen 35 differentierende muse-anti sera opnås. Alle de fra 100 mus opnåede antisera reagerede lige godt med begge polyhaptener. Bindingen til polyhaptenerne var her svagere med en faktor på 10 i forhold til de med de ifølge opfindelsen anviste immuno-gener 1 og 2 opnåede sera.

I DK 175191 B1 I

I 20 I

I Eksempel 11 I

I Balb/c-mus og B10.D2-mus, 8 til 12 uger gamle, immuniseredes I

I først med 100 pg HbA^c (β 1*4 Cys, MHS)-edestin (immunogen 1) I

5 i komplet Freund's adjuvans (CFA) intraperi tonealt (i.p.)· Ef- I

I ter 6 uger og 10 uger gennemførtes 2 yderligere immuniserin- I

I ger. Herved blev der indgivet 100 μ g immunogen i ufuldstændigt I

I Freund's adjuvans (IFA). 10 dage efter den sidste immunisering I

I blev musene tappet for blod for at bestemme antistoftiteren i I

I 10 serumen. 4 dage og 3 dage før fusion blev musene påny immuni- I

I seret intravenøst hver gang med 100 pg immunogen i puffer. I

Til fusion blev i analogi med Qalfré, Methods in Enzymology, I

I 73 (1981), side 3, 1 x 10® miltceller fra en immuniseret mus I

I 25 blandet med 2 x 107 myelomceller (P3 x 63 Ag8-653, ATCC-CRL I

I 8275) og efterfølgende cent i fugeret i 10 minutter (300 g, I

I 4®C). Cellerne vaskedes påny med BSS (= balanced salt soluti- I

I on) og centrifugeret ved 400 g i et 50 ml spidsrør. Den oven- I

stående væske fjernedes. Cellesedimentet løsnédes og der til- I

I 20 sattes 1 ml 60% PEG-opløsning (MG 4000, Merck). Efter 1 minut I

I i vandbad blev der ved stutemperatur tildryppet 5 ml RPMI I

I 1640-medium (RPM = Rosewell Parker Memory Institut) uden kal- I

vefosterserum (FKS) i et tidsrum på 4 til 5 minutter, der gen- I

I nemblandedes, fyldtes op med medium til 50 ml og derefter een- I

I 25 trifugeredes der i 10 minutter ved 400 g, 4°C. De sedimentere- I

I de celler blev optaget i RPMI 1640-medium med 10% FKS. Hver I

10® miltceller blev indpodet på 24-brønds-cellekul turplader I

I (Firma Nunc). Til hver kultur sattes 5 x 10* peritoneal-ekssu- I

dat-celler som foderceller. Den følgende dag tilsattes hypo- I

I 30 xanthin-azaserin-selektionsmedium (100 mM hypoxanthin, 1 pg/ml I

I azaserin). I

Efter ca. 7 til 10 dage kunne der allerede ses flere kloner. I

I Den ovenstående væske fra primærkulturerne afprøvedes efter en I

I 35 i eksempel 10 beskrevet ELISA-fremgangsmåde. Primærkulturer, I

I der kun viste en ringe eller slet ingen krydsreaktion med HbAg I

I klonedes videre ved hjælp af en fluorescensaktiverende celle- I

I sorter (FACS) på 96-brønds-celleku 1 turpi ader (Firma Nunc). Som I

21 DK 175191 B1 foderceller tjente 1 x 104 per i toneal-ekssudat-celler pr. brønd.

På denne måde kunne man f.eks. isolere de hybridom-cel1 el ini -5 er, der er blevet deponeret hos European Collection of Animal Cell Cultures under accessionsnumrene (1.) ECACC 87120801, (2.) ECACC 88122302 og (3.) ECACC 88122301. Ud fra disse cellelinier kunne der opnås de monoklonale antistoffer (1) 3.609.

325, (2) 3.51.56 og (3) 3.203.140.

10

Til opnåelse af ascites blev mus sprøjtet intraperi tonealt med 5 x 10® hybridceller, som forud var blevet forbehandlet 1 til 2 gange med 0,5 ml Pristan. 1 til 3 uger senere kunne der ud fra musene udvindes ase i tes-væske med en IgG-koncentration på 15 5 til 20 mg/ml. Herfra kunne antistofferne isoleres på sædvan lig måde. Disse monklonale antistoffer er rettet specifikt mod HbAic og viser ingen eller kun ringe krydsaktivitet med HbAo-

Eksempel 12 20

Materialer

Mi krot i terplader : A: NUNC 4-42404 II

B: NUNC 2-69620 25 12-kanal-pipette: Dynatech, katalog nr. 77-887-00

Pladeryster: Flow Laboratories, Titertek, katalog nr. 77-471-00

Afdækningsfolier: Dynatech Plate Sealers, katalog nr. M

30 30 ELISA-aflæser: Dynatech MR 700

Belægningspuffer: 50 mM natriumcarbonat, pH 9,6

Prøvepuffer: 10 mM natriumphosphat, pH 7,4, 0,9%

MaCl, 0,1% Tween 20, 1% crotein C Vaskepuffer: 0,9% NaCl, 0,1% Tween 20 35 Antistof-enzym-konjugat: konjugat af peroxidase og Fab-frag- mentet af et polyklonalt antistof fra får, der er rettet mod Fcy-delen af muse-IgG, 25 mU/ml i prøvepuffer

I DK 175191 B1 I

I I

I Substrat: 100 mmol/1 phosphat-citrat-puffer pH I

I 4,4 I

I 3,2 mmol/1 natriumperborat I

I 1,9 mmol/1 A8TS (2,2'-azino-di-[3- I

I 5 ethyl-benzthiazoli n-sul fon- I

I syre{6)]-diammoniumsa1t) I

I Antistof: MAK 3.609.325 (ECACC 87120801) I

I Polyhapten: Polyhapten 1 ifølge eksempel 8 I

I Polyhapten 2 ifølge eksempel 9 I

I 10 Antigen: HbA^c naturligt I

I HbAo naturligt. I

I Ved et forforsøg bestemtes de anti stofmængder, der skulle an- I

I vendes ved de egentlige specificitetsforsøg.

I 15 I

I Til dette blev mikrotiterplader belagt med henholdsvis poly- I

I hapten 1 eller polyhapten 2. I 100 ml skåle blev 1 pg polyhap- I

I ten pr. ml belægningspuffer inkuberet i 1 time ved stuetempe- I

I ratur. Derefter afsugedes opløsningen og vaskedes 3 gange med I

I 20 vaskepuffer. I

I Derefter sattes der til det fastfasebundne polyhapten fortyn- I

I dingsrækker af antistof 3.609.325 (ascites), idet fortyndingen I

I skete med prøvepuffer fra 1:100 i firertrin. Der inkuberedes I

I 25 hver gang med 100 μΐ/skål i 1 time ved stuetemperatur og va- I

I skedes efterfølgende. I

I Det til polyhaptenet bundne antistof bestemtes ved tilsætning I

I af et konjugat af peroxidase og Fab-fragmentet fra et polyklo- I

I 30 nalt antistof fra får, som er rettet mod Fcy-delen af muse- I

I IgG, ud fra reaktionen mellem peroxidase og tilsat substrat.

I Der tilsattes 100 μΊ konugat/skål og inkuberedes i 1 time ved I

I stuetemperatur. Eftervisningsreaktionen startedes ved tilsæt- I

I ning af 100 μΐ substrat/skål til alle skåle. Målingen skete I

I 35 med en ELISA-aflæser ved 405 nm (referencebølgelængde 490 nm). I

I Som titer defineredes den antistoffortynding, hvor der sker en I

I halvmaksimal binding. Denne anti stofmængde anvendtes i de ef- I

I terfølgende forsøg. I

DK 175191 B1 23

De monoklonale antistoffers specificitet undersøgtes. Til dette sammenlignedes de enkelte antistoffers reaktivitet med forskellige i opløsning værende komponenter.

5 I med 1% crotein C forudbelagte mikrotiterplader pipetteredes og blandedes 50 μ-l opløsning af monoklonalt antistof i dobbelt titerkoncentrati on og 50 μΐ antigenopløsning (fortyndingsrække, se nedenfor) og der inkuberedes i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev portioner på 100 μΐ af blandingen over-10 ført til de med polyhapten belagte mi krot iterplader.

Fortyndingsrækker :

Fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys(StBu)-OH fra 5 pg/ml (ifølge eksempel 1) prøvepuffer

Fructose-Val-Hi s-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu- med prøve- 15 Cys(StBu)-0H (ifølge eksempel 6) puffer i

Fructose-Valin firertrin H-Va1-His-Leu-Thr-Pro-G1u-G1u-Cys(StBu)-OH fra 100 pg/ml (ifølge eksempel 6) prøvepuffer

HbAir i firertrin

HbA0 20

Den koncentration i mol/1, der giver halvmaksimal binding, af et stof der skal bestemmes defineres som molær relativ affinitet .

2 5

Ti 1 sammen 1igning af et monoklonalt antistofs reaktivitet med forskellige bestanddele sættes den relative affinitet hos det monoklonale antistof for komponenten fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Cys(StBu)-OH lig 100%. Reaktiviteterne, der også betegnes som krydsreaktioner, med andre komponenter fremkommer 3 0 derefter ud fra kvotienten for de relative affiniteter på følgende måde: . . . ^rel.aff. f ructose-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Cys(StBu)-OH^ ^ x 100

Krydsreaktion = -τ~ττ\— -- 35 crel. aff. x(nM) 0e for de enkelte komponenter opnåede værdier fremgår af følgende tabel 1.

I DK 175191 B1 I

I 24 I

I Derved bedømtes også de resultater, der blev opnået med for- I

I skellige, på analog måde opnåede antistoffer. I

I Tabellen viser, at der med immunogenet ifølge opfindelsen kan I

I 5 fremstilles mangfoldige monoklonale antistoffer, der meget I

I specifikt binder HbA|C men ikke HbAg. Ved sammenligning med I

I antistoffer, der er opnået under anvendelse af sammenlignings-

I immunogen VI eller med de fra EPA 185.870 kendte antistoffer, I

I erkender de ifølge opfindelsen opnåede antistoffer HbA|C uden I

I 10 særlig denaturering med væsentligt højere affinitet. De er I

I derfor yderst egnede til konkurrerende immunbestemmelser. I

I 15 I

I 20 I

I 25 I

I 30 I

I 35 I

25 DK 175191 B1

t“ O ΓΗ r—1 CO

+ © - Ι-Ί «-<

ϋ «-< C— O -Q

< V · 10 O

Σ C v r-t o w

(O o · .Ω o - (O

+ o o o a f V c v >— < tb Σ O.

o · . «3 e m · .O .O CM C~ tb cm o o ·· * * tn

CO O »3· C C O LO -4C

• + τ-i v V tb V cn < O 10 Σ <D !_ M-

CO

• · ^ H

in o n o o *-* > . . . - - «3 sé O m c c o «-* c < + O CM V V f— 4) Στ-* ni σ>

T-* CM Q. O

τ» ri O CO EC

«3 - - I tb 3

O O O O π (AE

SÉ + O «3 V VV ^ E

< H <1) 'r- Σ tn te cn t- to c c co - *η T-* o >*- το o - * c + o cm o o to c cn x < «-· v vv οι·- o Σ σι»- i Οστό c tb σ τί o o 3 e tu (Μ H » . .Q .O ro m Ε E 4-> · o o cm · · o ot e tutni

O 4- O (SI n c c - - -f tn —- O

< co π o o tn i Σ CM V V Ό "O >—» • tb tb o σ co ε E i co σ *->

• + -Μ I— CO

C. (O φ tb C3 — tb rHU) COi—I ri- I n C · -O ri CO I— I— 3 >« 0 i^«-· om - i σ π o ·-«- i— o

I— < LO + o T—4 O - » C~ +j 4-> O I

Μ Σ · «-i v o o co tn tn i σ 1 CO V V · E E O r- — m a> ai c. o

O CO CO L LO. I

r-H »-I t|_ *|_ I 3 < OT u — O H < ·· · X β Z T3 CO r-* O. lO Hi

— O 0-0 O «3 LU CM I O

Σ + οσι-ι - * co 3 u *t- IC ri O O O · · tb Q-

(0 V V V O O —II

CM Σ O 1 U

t- * to tn j= tb ot .·ι-(— tn π o to c co x i I— *3 CM om 4» I 3 a> o o - - - in s«c i—oi

σι Σ + O T3 O I O CO r < IJ J

ta IC r—* V VV V Σ > I

tn λ- v c t tn t- φ ε σ> σι aj ·»- tb tb tb o tn z Ό Ό 4-> -4-» *> O · c tu σι c tn v m -*->·- σ e t -r σι α> .o t- υ to tn CM «— >— Π -r- .O ^ 3 >

4-> 4J t_ (0 i— Ό < inC !_ I

«·· tue 3>c t_ σ οι σ < u- x 4-> t_ *<0) 4-> I 41 3 ^ Ε Σ •r- tb - <j <t to ai+jfio 4-> ac i— ·· o +- > cl etna. to s_ -r dx co

ri ·<- «J — (0 Ό O (0 X» c tb -t-ι O

M- 4-* +» -C ·- υ 4-> X -I- || c Ό TJ

I— **— r- JC >. 4-> ri O >» 4-> O O Π t& -r -i—

ai υ 3 CO i Cl < 3-— Q-< - r- 4T V

ja σ tn tbo tb x e o tu 43 λ ^ ^ o. a.

(0 0.0 CCQ.Q.XU.Q.O.X *<<0)01 «- W OC ___ c + Σ Σ Cl o.

I DK 175191 B1 I

i 26 I

I Eksempel 13 I

I Som beskrevet i eksempel 12 pipetteres der til med 1% crotein I

I C forud belagte mikrotiterplader hver 50 μΐ af en opløsning af I

5 MAK 3.609.325 i dobbelt titerkoncentration og 50 μΐ HbAic-op- I

I løsning, der blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 30 mi- I

I nutter. Der anvendes forskellige koncentrationer af HbAjc. I

I Derefter overføres portioner på 100 μΐ af blandingen til med I

I 10 polyhapten 2 belagte mi krot iterplader. Det til polyhapten 2 I

bundne antistof eftervises som beskrevet i eksempel 12 ved I

I hjælp af et konjugat af peroxidase og Fab-fragmentet fra et I

I polyklonalt antistof fra får, som er rettet mod Fcy-delen af I

I muse-IgG. I

I 15 I

I Jo mere HbAjc der er til stede i prøveopløsningen desto mindre I

I antistof binder til polhaptenet, dvs. desto lavere er den mål- I

I te ekstinktion. På fig. 1 vises den ved bestemmelsen af HbA^c I

I opnåede kurve. I

I I

I Eksempel 14 I

10 får immuniseredes med immunogen 1 eller 2 ifølge opfindel- I

I sen i komplet Freund's adjuvans. Dosen udgjorde i hvert til- I

I 25 fælde 200 pg immunogen pr. dyr for den første og hver følgende I

I immunisering. Immuniseringerne fulgte med månedlige afstande. I

I De opnåede sera undersøgtes som beskrevet i eksempel 12 med I

I hensyn til tilstedeværelse og specificitet af antistoffer mod I

I 30 HbA^c. Hertil blev mikrotiterplader belagt med 0,04 pg/ml po- I

I lyhapten 2. Som anti stof-enzym-konjugat anvendtes et konjugat I

I af peroxidase og et kanin-antifåre-immunoglobin. Anvendelses- I

I koncentrationen af dette konjugat udgjorde 150 mU/ml . Som I

antigener anvendtes naturligt HbAjc og HbAg, som peptider Η- I

I 35 Val-His-Leu-Thr-Pro-G1u-Glu-Cys-0H og fructose-Val-His-Leu- I

I Thr-Pro-Glu-Glu-Cys-OH. I

I Fremgangsmåden gennemførtes som beskrevet i eksempel 12. I

27 DK 175191 B1

Der undersøgtes følgende prøver:

Sammensætning 1: Blanding af portioner af serumprøver fra alle 10 dyr, der var blevet behandlet med det 5 ifølge opfindelsen anviste immunogen fra ek sempel 4 (blodprøveudtagning 45 dage efter første immunisering).

Sammensætning 2: Blanding af portioner af serumprøver fra al- 10 le 10 dyr, der var blevet behandlet med det ifølge opfindelsen anviste immunogen 2 fra eksempel 5 (blodprøveudtagning 45 dage efter første immunisering).

15 Prøve a: Serumprøve fra får 3227, der var blevet behandlet med det ifølge opfindelsen anviste immunogen 1 fra eksempel 4 (blodprøveudtagning 165 dage efter den første immunisering).

20 Prøve b: Serumprøve fra får 3233, der var blevet behandlet med det ifølge opfindelsen anviste immunogen 1 fra eksempel 4 (blodprøveudtagning 165 dage efter den første immunisering).

25 Prøve c: Serumprøve fra får 3272, der var blevet behandlet med det ifølge opfindelsen anviste immunogen 2 fra eksempel 5 (blodprøveudtagning 75 dage efter den første immuni sering).

30 Titerbestemmelsen gav følgende resultater:

Sammensætning 1: 1:5.400 Sammensætning 2: 1:8.400 Prøve a: 1:3.700 35 Prøve b: 1:3.600

Prøve c: 1:2.600

Fig. 2 viser et eksempel på ekstinktionsforløbet i afhængighed af antiserumkoncentrationen.

I DK 175191 B1 I

I 28 I

I Eksempel 15 I

I Som beskrevet i eksempel 14 bestemtes affiniteterne og speci- I

I ficiteterne hos antistoffer til glycosylerede og ikke-glycosy- I

I 5 lerede antigener. Resultaterne fremgår af tabel 2 og 3 samt I

I fig. 3. I

I På fig. 3 betyder: I

I 10 Kurve Antigen Maksimal anvendelseskoncentration I

I _(nmol /1)_ I

I 1 Peptid A 5340 I

I 2 Peptid B 16000 I

I 3 HbAlc 2670 I

I 15 4 HbA0 2670 I

I Tabellen viser, at der med immunogenerne ifølge opfindelsen I

I kan fremstilles højspecifikke polyklonale antistoffer, der I

I 20 binder sig meget specifikt til HbA^c men ikke til HbAg. Det I

I ses også, at de polyklonale antistoffer erkender HbA}C uden I

denaturering med højere affinitet. Desuden fremgår det ud fra I

resultaterne fra de forskellige sammensætninger, der udgør en I

I blanding af polyklonale antistoffer opnået ud fra hver 10 får I

25 efter behandling med immunogenet ifølge opfindelsen, at en I

meget stor procentdel af de immuniserede dyr producerer egne- I

de antistoffer ved anvendelse af immunogenerne ifølge opfin- I

I delsen. I

I 30 I

I 35 I

DK 175191 B1 29

Tabel 2

Antistoffers affinitet til glycosylerede og ikke-glycosylerede antigener 5

Relativ affinitet (ninol/1) Krydsreaktion

Prøve_Peptid A* Peptid B** HbAjC HbAp_HbAp/HbAjc_

Sammen- 10 sætning 1 21 >>16000 30 >>2670 <<1,1%

Prøve a 33 >>16000 115 >>2670 <<4,3%

Sammensætning 2 15 >>16000 18 >>2670 <<0,7%

Prøve c 21 >>16000 134 >>2670 <<5,0% 15 _

* Peptid A: Fructose-Va1-His-Leu-Thr-Pro-G1u-Glu-Cys(StBu)-OH ** Peptid B: H-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Cys(StBu)-OH

20 25 30 35

I DK 175191 B1 I

I 30 I

I Tabel 3 I

I Specificitetsundersøgelser af polvklonale antistoffer mod I

I HbAlc I

I 5 I

I Resultater: I

I Reaktivitet med + Sammensæt- Prøve Sammen- Prøve I

I _;_ni no 1_a_sætning 2_c_ I

I 10 Polyhapten 2 + + + + I

I Peptid A 100 100 100 100 I

I BhAjc natruligt 70 28,6 83,3 15,7 I

I 15 Polyhapten 1 - I

I Peptid B <<0,13 <<0,2 <<0,09 <<0,13 I

I HbA0 naturligt <<0,8 <<1,2 <<0,5 <<0,8 I

I 20 + Sammensætning l, prøve a: fremstillet ud fra immunogen 1 fra I

I eksempel 4 I

I Sammensætning 2, prøve c: fremstillet ud fra immunogen 2 fra I

I eksempel 5. I

I 25 I

I 30 I

I 35 I

Claims (5)

1. Monoklonalt antistof mod HbAic, kendetegnet ved, at det udviser en høj affini-5 tet til HbAlc, ikke binder til HbAo og er opnåeligt ved at et immunogen med den almene formel I I- i \ h/h o o \ °H H ° V);° ^0H L hvor m betyder 1 til et tal, der svarer til 25 vægt% hapten-afstandsstykke-grupper i for-15 hold til bærerproteinets vægt, T betyder et bærerprotein og A et afstandsstykke, der har en kædelængde på 10 til 20 atomer og har følgende formel II -HN-CH-(CH2)n-X-B“ 11 C00H 20 hvor X betyder S eller NH, n betyder 1 til 4 og B betyder en organisk rest, der indeholder en succinimidgruppe, indsprøjtes i en organisme, der er i stand til at danne antistoffer, hvorefter antistofferne udvindes fra organismen.

2. Polyklonalt antistof mod HbAlc, kendetegnet ved, at det udviser en høj affinitet til HbAic, ikke binder til HbAo og er opnåeligt ved at et immunogen med den almene formel I Lo l \ H/H \OH 0 o 1 0HH 0 0 i \ hn y ; I DK 175191 B1 I I 32 I I hvor m betyder 1 til et tal, der svarer til 25 vægt% hapten-afstandsstykke-grupper i for- I I hold til bærerproteinets vægt, T betyder et bærerprotein og A et afstandsstykke, der har I I en kædelængde på 10 til 20 atomer og har følgende formel II I I 5 -HN-CH-(CH2)n“X-B“ II * I I COOH I I hvor X betyder S eller NH, n betyder 1 til 4 og B betyder en organisk rest, der indehol- I I der en succinimidgruppe, indsprøjtes i en organisme, der er i stand til at danne antistof- I I fer, hvorefter antistofferne udvindes ffa organismen. I I 10 I

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er dannet af hybri- I I doma-cellelinje ECACC 87120801. I

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er dannet af hybri- I I 15 doma-cellelinje ECACC 88122302. I

5. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er dannet af hybri- I I doma-cellelinje ECACC 88122301. I I 20 I