PT770876E - Processo de varrimento para a identificacao de ligandos para proteinas alvo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Processo de varrimento para a identificação de iigandos para proteínas aívo A presente invenção refere-se a novos processos para o varrimento de elevada produtividade para compostos farmacêuticos, em particular, aqueles que se ligam a proteínas envolvidas na patogenese de doenças ou na regulação de uma função fisiológica.

Enquadramento da invenção

Os produtos farmacêuticos podem ser desenvolvidos a partir de compostos principais que são identificados através de um processo de varrimento aleatório dirigido a um alvo, tal como um receptor. As tentativas de varrimento em larga escala podem ser complicadas devido a vários íãctores. Primeiro, muitos ensaios são trabalhosos ou de realização dispendiosa. Os ensaios podem envolver animais experimentais, linhas de células ou culturas de tecidos que são de difícil ou dispendiosa aquisição ou manutenção. Podem requerer o uso de materiais radioactivos, colocando assim problemas de segurança e de remoção. Estas considerações colocam muitas vezes limitações práticas ao número de compostos que podem ser razoavelmente seleccionados. Assim, os que empregam processos de varrimento aleatórios são frequentemente forçados a limitar a sua pesquisa aos compostos para os quais o conhecimento anterior sugere que os compostos serão, em princípio, efectivos. Esta estratégia limita a gama de compostos testados, podendo ser negligenciados muitos fármacos úteis.

Além disso, a especificidade de muitos ensaios bioquímicos pode excluir uma larga variedade de compostos químicos úteis, uma vez que as interaeções entre o ligando e a proteína receptora estão fora do âmbito do ensaio. Por exemplo, muitas proteínas têm múltiplas funções, enquanto que a maior parte dos ensaios são capazes de monitorizar apenas uma dessas actividades. Com tal ensaio específico, muitos fármacos potenciais podem não ser detectados. ζ ’ Λ·..,,. ff

Finalmente, em muitas tentativas de varrimento bioquímicas existentes para va descoberta de fármacos, tem de ser definida a activrdade da proteína alvo. Tsto requer que o sistema em questão seja bem caracterizado antes de poder iniciar-se o varrimento. Mesmo quando é conhecida uma sequência de proteína, tal como, por exemplo, um gene recentemente clonado, as funções específicas da proteína podem não ser reveladas simplesmente para análise da sua sequência. Consequentemente, o varrimento bioquímico para fármacos terapêuticos direccionado para muitas proteínas alvo tem de esperar uma caracterização bioquímica pormenorizada, um processo que, em geral, requer uma pesquisa extensiva.

Assim, existe a necessidade na técnica de um ensaio de elevada produtividade operacional, rápido e eficaz em termos de custos, que permita a selecção de um grande número de compostos relativamente à sua capacidade de ligarem terapêutica ou ílsiologícamente proteínas relevantes. Além disso, existe a necessidade na técnica de processos de varrimento que sejam independentes da actividade biológica das proteínas alvo e que detectem compostos que ligam regiões das proteínas alvo além de domínios biologicamente activos. A EP 865502 (técnica anterior de acordo com o Artigo 54(3)(4) EPC) descreve um processo para identificar um ligando que se liga a uma proteína alvo predeterminada envolvendo o contacto de combinações de ensaio e de controlo com uma amostra de fluorescência sensível à conformação.

Resumo da invenção A presente invenção proporciona um processo para a identificação de um ligando que liga uma proteína alvo. O processo é levado a cabo, por meio das seguintes fases: (a) se seleccionar como ligandos de ensaio uma pluralidade de compostos não conhecidos por se ligarem à proteína alvo; (b) se incubar cada um dos ligandos de ensaio e a proteína alvo em condições apropriadas para que a proteína alvo se desdobre para uma extensão apropriada, produzindo deste modo uma combinação de ensaio;

(C) se incubar a proteína alvo, tai como na fase (b), mas na ausência de um ligando de ensaio, para produzir uma combinação de controlo; (d) se determinar a extensão em que a proteína alvo ocorre num estado dobrado, num estado desdobrado, ou em ambos, na combinação de ensaio e na combinação de controlo; (e) se comparar a determinação feita na lãse (d) entre as combinações de ensaio e de controlo, em que se a proteína alvo se encontrar presente no estado dobrado, em maior ou menor extensão na combinação de ensaio do que na combinação de controlo, o ligando de ensaio é um ligando que se liga à proteína alvo; e (í) se repetirem as fases (b)-(e)com uma pluralidade dos referidos ligandos de ensaio até ser identificado pelo menos um ligando que se ligue à proteína alvo; com a condição de que as fases de incubação (b) e (c) não compreendam um contacto das referidas combinações de ensaio e de controlo com uma amostra de fluorescência sensível à conformação.

Na prática da presente invenção, pode ser usado qualquer processo para determinar a quantidade de proteína alvo nos estados dobrado e desdobrado, incluindo sem limitação a proteólise, ligação de anticorpos, ligação à superfície, ligação de chaperona molecular, ligação diferencial ao ligando imobilizado e formação diferenciai da proteína agregada.

De acordo com uma forma de realização, a proteína alvo é Hemoglobina S humana (HbS), sendo os ligandos identificados pela sua capacidade em reduzir a susceptibilidade da HbS à proteólise.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra um perfil de gel de poliacrilamida SDS de anidrase carbónica depois da proteólise na ausência e na presença de concentrações crescentes de acetazolamida.

A Figura 2 mostra um perfil de gei de poliacrilamida-SDS de anidrase carbónica depois da proteólise na ausência e na presença de acetazolamida 1,0 mM, na ausência e na presença de um extracto fúngico. A Figura 3 mostra um gráfico que representa uma tituiação da ligação de elastase de neutrófílos humanos radiomarcada para filtros de nitrocelulose depois da proteólise, na ausência e na presença de concentrações crescentes de elastatinal. A Figura 4 mostra um gráfico que representa uma titulação da detecção pelo ELISA de elastase de neutrófílos humanos depois da proteólise, na presença concentrações crescentes de ICI 200,355. A Figura 5 mostra um gráfico que representa a distribuição dos dados para os íigandos de ensaio testados relativamente à ligação à elastase de neutrófílos humanos. A Figura ó mostra um gráfico que representa a titulação de um ligando para a elastase de neutrófílos humanos. A Figura 7 mostra um gráfico que representa a titulação de cinco Íigandos relativamente à sua capacidade em inibirem a actividade enziroática da elastase de neutrófílos humanos. A Figura 8 mostra um gráfico que representa uma titulação da detecção peio ELISA de hemoglobina humana depois da proteólise na presença de concentrações crescentes de 2,3-difosfoglicerato. A Figura 9 mostra um gráfico que representa uma titulação da ligação de hemoglobina humana a filtros de neutrocelulose depois da proteólise na ausência ou na presença de concentrações crescentes de 2,3-difosfoglicerato. A Figura 10 mostra um gráfico que representa a distribuição de dados de ligação para os íigandos de ensaio testados relativamente à ligação à hemoglobina S humana, A Figura 11 mostra um gráfico que representando a tituiação de um ligando para a hemoglobina humana. 5

A Figura 12 mostra as estruturas dos compostos identificados como ligandos para a hemoglobina S humana (HbS) e as suas actividades na inibição da congelação da HbS em relação ao triptofano (Trp). A Figura 13 mostra um gráfico que representa a actividade de ligação do ligando para a hemoglobina humana de bacitracina-Zinco (BacZ), bacitracina livre de zinco (Bac), bacitracina livre de zinco à qual foi adicionada uma concentração equimolar de ZnCh (Bac + Z), ZnCÍ2 e bacitracina-zinco à qual foi adicionado um excesso molar de EDTA (BacZ + ROTA),

Descrição Pormenorizada da invenção Definições

Tal como aqui é usado, o termo “ligando” refere-se a um agente que liga uma proteína alvo, O agente pode ligar a proteína alvo quando a proteína alvo está na sua configuração natural, ou quando está parcial ou totalmente desdobrada ou desnaturada. De acordo com a presente invenção, um ligando não se limita a um agente que liga a uma região funcional reconhecida da proteína alvo, por exemplo, o sítio activo de uma enzima, o sítio de combinação do anti-gene de um anticorpo, o sítio de ligação de hormonas de um receptor, o sítio de ligação do cofactor, e do género. Na prática da presente invenção, um ligando pode ser também um agente que liga quaisquer sequências superficiais ou internas ou domínios de conformação da proteína alvo. Por isso, os ligandos da presente invenção englobam agentes que em si próprios e deles próprios podem não ter qualquer função biológica aparente, para além da sua capacidade em se ligarem à proteína alvo na maneira acima descrita.

Tai como aqui é usado, o termo “ligando de ensaio” refere-se a um agente compreende um composto, uma molécula ou um complexo, que está a ser testado relativamente à sua capacidade em se ligar a uma proteína alvo. Os ligandos de ensaio podem ser viríuaimeníe qualquer agente, incluindo sem limitação metais, péptídos, proteínas, lípidos, poli-sacáridos, ácidos nucleicos, pequenas moléculas orgânicas e suas combinações. Podem também ser testadas as misturas complexas de substâncias, tais como extractos de produtos naturais, que podem incluir mais do que um ligando de ensaio, podendo ser purificado o componente que liga a proteína alvo pode ser purificado a partir da mistura numa fase subsequente.

Tal como aqui é usado, o termo “proteína alvo” refere-se a um péptido, proteína ou complexo de proteínas para o qual se deseja a identificação de um ligando ou de um parceiro de ligação. As proteínas alvo incluem, sem limitação, péptidos ou proteínas conhecidas ou que se crê que estão envolvidas na etiologia de uma dada doença, condição ou estado patofisiológico, ou na regulação da função fisiológica. As proteínas alvo podem ser derivadas de qualquer organismo vivo, tal como um vertebrado, em particular um mamífero e, ainda mais paríicularmente, uma pessoa. Para uso na presente invenção, não é necessário que a função bioquímica da proteína seja especificam ente identificada. As proteínas alvo incluem, sem limitação, receptores, enzimas, produtos oncogénicos, produtos de genes supressores de tumores, proteínas virais e factores de transcrição, quer na forma purificada quer como parte de uma mistura complexa de proteínas e outros compostos. Além disso, as proteínas alvo podem compreender proteínas do tipo natural ou, em alternativa, proteínas mutantes ou variantes, incluindo as proteínas com estabilidade, actividade, ou outras propriedades variantes alterada, ou proteínas híbridas às quais foram adicionadas sequências de amino ácidos estranhos, por exemplo, sequências que facilitam a purificação.

Tal como aqui έ usado, o termo “combinação de ensaio” refere-se à combinação de um ou mais ligandos de ensaio e uma proteína alvo. “Combinação de controlo” refere-se à proteína alvo na ausência de um ligando de ensaio.

Tal como aqui é usado, o termo “estado dobrado” de uma proteína refere-se à forma natural ou desnaturada da proteína, tal como se encontra presente no seu meio ambiente natural, ou depois de isolamento ou purificação, isto é, antes da exposição às condições de desnaturação. Isto inclui as proteínas naturais que podem estar detectavelmente desdobradas em diferentes extensões no seu meio ambiente natural, e cujos padrões de dobragem podem variar durante o seu funcionamento natural. O “estado desdobrado” refere-se a uma situação em que o polipéptido perdeu elementos da sua estrutura secundária e/ou terciária que se encontram presentes no seu “estado dobrado”. Será reconhecido pelos peritos na matéria que é difícil determinar experimentalmente quando um polipéptido se tomou completamente desdobrado, isto é, perdeu todos os elementos 7

da estrutura secundária e terciária. Assim, o termo “estado desdobrado”, tal como aqui é usado, engloba o desdobramento parcial ou total.

Tal como aqui é usado, o termo “fracção detectável” retere-se a uma quantidade que é empiricamente determinada e que poderá variar dependendo do processo usado para distinguir a proteína dobrada da proteína desdobrada. Por exemplo, quando é usada a sensibilidade à protease para monitorizar o desdobramento, são escolhidas condições (por exemplo, por ajustamento da temperatura ou por adição de desnaturantes) para que aproximadamente 80% da proteína alvo se digira dentro de um período de incubação conveniente. Em alternativa, quando são usados anticorpos específicos para o estado dobrado ou desdobrado de uma proteína alvo como processo de detecção, são escolhidas condições para que uma quantidade suficiente de anticorpo fique ligada para dar um sinal detectável. A presente invenção engloba processos de varrimento de elevada produtividade opracional para identificar um ligando que liga uma proteína alvo. Se a proteína alvo ao qual o ligando de ensaio se liga estiver associada com ou for a causa de uma doença ou estado, o ligando pode ser útil para diagnosticar, prevenir ou tratar a doença ou estado. IJm ligando identificado pelo presente processo pode também ser um ligando que é usado num processo de purificação ou separação, tal como um processo que resulta na purificação ou separação da proteína alvo da mistura. A presente invenção refere-se também a ligandos identificados pelo processo presente e a seus usos terapêuticas (para fins de diagnóstico, prevenção ou tratamento) e a usos em processos de purificação e separação.

De acordo com a presente invenção, um ligando para um proteína alvo é identificado pela sua capacidade em influenciar a extensão da dobragem ou a taxa de dobragem ou desdobramento da proteína alvo. São escolhidas condições experimentais para que a proteína alvo seja sujeita a desdobramento, quer seja reversível quer sejairreversível. Se o ligando de ensaio se ligar à proteína alvo nestas condições, a quantidade relativa de proteína alvo dobrada.desdobrada ou a taxa de dobragem ou desdobramento da proteína alvo na presença do ligando de ensaio será diferente, isto é, maior ou menor, do que a observada na ausência do ligando de ensaio. Assim, o presente processo engloba a incubação da proteína alvo na presença e na ausência de um ligando de ensaio, em condições em que (na ausência de ligando) a proteína alvo fique parcial ou totalmente 8 ~~Λ. 3 desdobrada. Isto é seguido pela análise das quantidades absolutas ou relativas da proteína alvo dobrada vs. desdobrada ou da taxa de dobragem ou desdobramento da proteína alvo.

Uma característica importante da presente invenção é que detectará qualquer composto que se ligue a qualquer sequência ou domínio da proteína alvo, não apenas a sequências ou domínios que estão intimamente envolvidos numa actividade ou função biológica. A sequência de ligação, região ou domínio pode estar presente na superfície da proteína alvo quando está no seu estado dobrado, ou pode estar enterrada no interior da proteína. Alguns sítios de ligação podem também tomar-se acessíveis à ligação do ligando quando a proteína está parcial ou totalmente desdobrada.

Na prática da presente invenção, o ligando de ensaio é combinado com uma proteína alvo e a mistura é mantida em condições apropriadas e durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação do ligando de ensaio à proteína alvo. As condições experimentais são determinadas empiricamente para cada proteína alvo. Quando se testam os ligandos de ensaio, as condições de incubação são escolhidas de forma a que se espere que a maior parte das interacções do ligando :proteína se processem até estarem completas. Em geral, o ligando de ensaio encontra-se presente num excesso molar em relação à proteína alvo, A proteína alvo pode estar numa forma solúvel ou, em alternativa, pode estar ligada a uma matriz em fase sólida. A matriz pode compreender, sem limitações, esferas, filtros de membranas, superfícies de plástico ou outros suportes sólidos apropriados.

Para cada proteína alvo, são escolhidas as condições experimentais apropriadas, por exemplo, temperatura, tempo, pH, concentração de sal e componentes adicionais, para que uma fracção detectável da proteína se encontre presente numa forma desdobrada na ausência do ligando de ensaio. Para uma proteína alvo que se desdobre irreversivelmente, as condições experimentais preferidas permitem que uma quantidade detectável da proteína se desdobre durante um período de incubação conveniente, na ausência do ligando de ensaio. Para ajustar ou optimizar a proporção de proteína dobrada:desdobrada ou a taxa de dobragem ou desdobramento, podem ser requeridas condições de desnaturação, incluindo o uso de temperaturas elevadas, a adição de caotropos ou desnaturardes, tais como ureia ou sais de guanidínio, tais como tiocianato de guanidínio, detergentes ou suas combinações. Além disso, pode ser usada a 9

introdução de substituições de amino ácidos estabilizantes ou desesíabilizaníes para manipular a proporção dobradas;desdobradas das proteínas alvo. O tempo necessário para a ligação da proteína alvo ao ligando variará dependendo do ligando de ensaio, da proteína alvo e de outras condições usadas. Nalguns casos, a ligação ocorrerá instantaneamente (por exemplo, essencialmente de forma simultânea com a combinação do ligando de ensaio e da proteína alvo), enquanto que noutros, a combinação de ligando de ensaio-proteína alvo é mantida por um maior período de tempo, por exemplo, até 12-16 horas, antes da ligação ser detectada. Quando são empregues muitos ligandos de ensaio, é escolhido um tempo de incubação que seja suficiente para a maior parte das interacções da proteína:!igando. A ligação de um ligando de ensaio à proteína alvo é determinada comparando a quantidade absoluta de proteína alvo dobrada ou desdobrada na ausência e na presença do ligando de ensaio ou, em alternativa, determinando a proporção de proteína alvo dobrada; desdobrada ou a taxa de dobragem ou desdobramento da proteína alvo na ausência e na presença do ligando de ensaio. Se um ligando de ensaio ligar a proteína alvo (isto é, se o ligando de ensaio for um ligando para a proteína alvo), pode haver signiflcativamente mais proteína alvo dobrada e menos desdobrada (e, assim, uma maior proporção de proteína alvo dobrada para desdobrada) do que a que está presente na ausência de um ligando de ensaio. Em alternativa, a ligação do ligando de ensaio pode resultar em signiflcativamente proteína alvo menos dobrada, e mais desdobrada, do que está presente na ausência de um ligando de ensaio. De forma semelhante, a ligação do ligando de ensaio pode fazer com que a taxa de dobragem ou desdobramento da proteína alvo altere signiflcativamente.

Em qualquer dos casos, a determinação das quantidades absolutas de proteína alvo dobrada e desdobrada, a proporção dobrada:desdobrada, ou as taxas de dobragem ou desdobramento, pode ser levada a cabo usando um dos processos conhecidos, tal como se descreve abaixo. Estes processos incluem, sem limitação, a proteóiise da proteína alvo, a ligação da proteína alvo a superfícies apropriadas, a ligação de anticorpos específicos à proteína alvo, a ligação da proteína alvo a chaperonas moleculares, a ligação da proteína alvo a ligandos imobilizados e a medição de agregação da proteína alvo. Podem também ser usadas outras técnicas físico-químicas quer sozinhas quer em combinação com os processos acima; estes incluem, sem limitação, medições de 10

dicroismo circular, espectroscopia de ultravioletas e fluorescência e calorimetria. Uma forma de realização preferida envolve a medição da proteólise relativa de uma proteína alvo a seguir à incubação na ausência e na presença de um ligando de ensaio. Contudo, será reconhecido pelos peritos na matéria que cada proteína alvo pode ter propriedades únicas que tornam um processo de detecção particular mais apropriado para os fins da presente invenção.

Para fins do varrimento de elevada produtividade operacional, ajustam-se as condições experimentais acima descritas a fim de se atingir uma proporção limite de ligandos de ensaio identificados como compostos “positivos” ou ligandos de entre o total de compostos seleccionados. Este limite é estabelecido de acordo com dois critérios. Primeiro, o número de compostos positivos deverá ser controlável em termos práticos. Segundo, o número de compostos positivos deverá reflectir os ligandos com uma afinidade apreciável em relação à proteína alvo. Atinge-se um limite preferido quando 0,1% a 1% do total de ligandos de ensaio revelarem que são ligandos de uma dada proteína alvo. A ligação a uma dada proteína é um pré-requisito para os fármacos destinados a modificar directamente a acção dessa proteína. Assim, se um ligando de ensaio revelar, através do uso do presente processo, que liga uma proteína que reflecte ou afecta a etiologia de um dado estado, pode indicar a capacidade potencial do ligando de ensaio em alterar a função da proteína e ser um fármaco eficaz ou um composto principal para o desenvolvimento desse fármaco. Em alternativa, o ligando pode servir como base para a construção de compostos híbridos contendo um componente adicionai que tem o potencial de alterar a função da proteína. Neste caso, a ligação do ligando à proteína alvo serve para fixar ou orientar o componente adicional de forma a efectuar os seus efeitos farmacêuticos. Por exemplo, um composto conhecido que iniba a actividade de uma família de enzimas relacionadas pode tomar-se específico para um membro da família por conjugação do composto conhecido a um ligando identificado pelos processos da presente invenção, que se ligue especificamente a esse membro num sítio diferente do reconhecido pelo composto conhecido. O facto de o presente processo se basear nas propriedades físico-químicas comuns à maior parte das proteínas dá-lhe uma aplicação ampla. A presente invenção pode ser aplicada a procedimentos sistemáticos em larga escala de elevada produtividade 11 S\; operacional que permitem um varrimento efectivo em termos de custos de muitos milhares de Hgandos de ensaio. Uma vez identificado um ligando pelos processos da presente invenção, pode ainda ser analisado em mais pormenor, usando processos conhecidos específicos da proteína alvo particular usada. Por exemplo, o ligando pode ser testado relativamente à ligação à proteína alvo directamente, por exemplo, por incubação do ligando rádiomarcado com a proteína alvo não marcada, e depois separando o ligando ligado e não ligado à proteína. Além disso, o ligando pode ser testado relativamente à sua capacidade de influenciar, quer positiva quer negativamente, uma actividade biológica conhecida da proteína alvo.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a ligação do ligando de ensaio à proteína alvo é detectada através do uso da proteólise. Este ensaio baseia-se na crescente susceptibilidade de polipéptidos desdobrados, desnaturados à digestão de protease em relação à das proteínas dobradas. Neste caso, a combinação de ligando de ensaio-proteína alvo, e uma combinação de controlo sem o ligando de ensaio, são tratados com uma ou mais proteases que actuam, de preferência, sobre a proteína alvo desdobrada. Depois de um período de incubação apropriado, determina-se o nível de proteína alvo intacta, isto é, de proteína alvo desproteolizada usando um dos processos abaixo descritos, por exemplo, electroforese de gel e/ou ensaio imunológico. Há dois resultados possíveis que indicam que o ligando de ensaio ligou a proteína alvo. Pode observar-se ou uma quantidade absoluta signifícativamente maior, ou significativamente menor, de proteína intacta ou degradada na presença do ligando do que na sua ausência.

As proteases úteis na prática da presente invenção incluem, sem limitação, a tripsina, quimotripsina, protease V8, elastase, earboxipeptidase, proteinase K, termolisina, papaína e subtilisina (todas as quais podem ser obtidas da Sigma Chemical Co., St Louis, MO). O critério mais importante na selecção de uma protease ou proteases para uso na prática da presente invenção é que a(s) protease(s) deve ser capaz de digerir a proteína alvo particular nas condições de incubação escolhidas, e que esta actividade seja preferencialmente dirigida à forma desdobrada da proteína. A fim de evitar resultados “positivos falsos” causados pelos ligandos de ensaio que inibem directamente a protease, podem ser usadas simultaneamente ou em ensaios paralelos, mais do que uma protease, em particular proteases com diferentes mecanismos de acção enzimáticos. 12

Adicionalmente, os co-factores que são requeridos para a actividade da protease ou das proteases são fornecidos em excesso, para evitar resultados positivos falsos devido aos ligandos de ensaio que podem remover estes factores.

Tipicamente, leva-se primeiro uma proteína alvo purificada até uma concentração final de 1-100 pg/mí num tampão contendo Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, DMSO a 10%, NaCI 50 mM, glicerol a 10% e DTT 1,0 mM. Adicionam-se depois individualmente as proteases, tais como, por exemplo, proteinase K ou termolisina (proteases com mecanismos de acção distintos) até uma concentração final de 0,2-10,0 pg/ml. Realizam-se incubações paralelas durante diferentes períodos de tempo, variando entre 5 minutos e uma hora, de preferência 30 minutos, a 4o C, 15° C, 25° C e 35° C. Terminam-se as reacções através da adição de um inibidor de protease apropriado, tal como, por exemplo, cloreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para uma concentração final de 1 mM (para proteases de serina), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) para uma concentração final de 20 mM (para metaloproteases), ou iodoacetamida (para proteases de cisteína). A quantidade de proteína intacta que fica na mistura reaccional no final do período de incubação pode depois ser determinada por qualquer processo, incluindo, sem limitação, a electroforese de gel de poliacrilamida, FJ.TSA, ou a ligação a filtros de nitrocelulose. Deve entender-se que podem realizar-se experiências adicionais empregando uma gama mais limitada de temperaturas, para estabelecer condições apropriadas. O protocolo acima permite a selecção de condições apropriadas (por exemplo, concentração de protease e temperatura de digestão) que resultam na digestão de aproximadamente 70% da proteína alvo dentro de um período de incubação de 30 minutos, o que indica que ocorreu um grau significativo de desdobramento. De preferência, são escolhidas as condições de forma a que a proteólise revele uma dependência da temperatura indicadora de uma transição cooperativa de desdobramento da proteína. Para atingir este íim, podem ajustar-se variáveis adicionais, incluindo, por exemplo, as concentrações de glicerol, de sal, de agentes redutores, BSA ou outras “proteínas veiculares”, de proteína alvo, de desnaturantes e detergentes. Se estiver disponível um ligando conhecido para a proteína alvo, o ligando é incluído na mistura reaccional numa concentração acima do Kd relativamente à sua ligação à proteína alvo e, pelo menos, igual à concentração molar da proteína alvo, repetindo-se a experiência de digestão. Tipicamente, observa-se, peio menos, um aumento ou uma diminuição de 13

duas vezes na extensão da digestão da proteína aivo, indicando que a ligação de um ligando conhecido altera a proporção de proteína alvo dobrada:desdobrada e/ou a taxa de dobragem ou de desdobramento.

Uma vez estabelecidas as condições para o varrimento de elevada produtividade operacional, tal como se descreveu acima, repete-se o protocolo simultaneamente com um grande número de ligandos de ensaio em concentrações variando entre 20 e 200 μΜ. A observação de, pelo menos, duas vezes o aumento ou diminuição na extensão da digestão da proteína alvo significa um composto de impacto “hit”, isto é, um ligando que liga a proteína alvo. As condições preferidas são aquelas em que entre 0,1% e 1% dos ligandos de ensaio são identificados como compostos de impacto “hit” usando este procedimento.

De acordo com outra forma de realização, a quantidade relativa de proteína aivo dobrada e desdobrada na presença e na ausência de ligando de ensaio é determinada medindo a quantidade relativa de proteína alvo que se liga a uma superfície apropriada. Este processo tem a vantagem da maior propensão de proteínas desdobradas em aderir às superfícies, o que é devido ao aumento da área de superfície e decresce mascarando resíduos hidrofóbicos, que resulta do desdobramento. Se um ligando de ensaio ligar uma proteína alvo (isto é, for um ligando da proteína alvo), pode estabilizar a forma dobrada da proteína alvo e diminuir a sua ligação a uma superfície sólida. Em alternativa, um ligando pode estabilizar a forma desdobrada da proteína e aumentar a sua ligação a uma superfície sólida.

Nesta forma de realização, combinam-se a proteína alvo, um ligando de ensaio e uma superfície que liga preferencialmente a proteína desdobrada e mantêm-se em condições apropriadas para a ligação da proteína alvo a um ligando e para a ligação da proteína alvo desdobrada à superfície. Em alternativa, a proteína alvo e o ligando de ensaio podem ser pré-incubados na ausência da superfície para permitir a ligação. As superfícies apropriadas para este fim incluem, sem limitação, placas microtituladoras construídas a partir de uma variedade de plásticos tratados ou não tratados, placas tratadas para a cultura de tecidos ou para ligação elevada de proteínas, filtros de nitrocelulose e filtros de PVDF. A determinação da quantidade de proteína alvo ligada à superfície ou a quantidade de proteína alvo que permanece na solução pode ser realizada usando processos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, a determinação de radioactividade ou ensaio imunológico. Se, de forma significativa, mais ou menos proteína alvo estiver ligada à superfície na presença de um ligando de ensaio do que na ausência do ligando de ensaio, o ligando de ensaio é um ligando da proteína alvo. De forma semelhante, a proporção de proteína alvo ligada à superfície: solúvel será signifícativamente maior ou menor na presença de um ligando de ensaio do que na sua ausência, se um ligando de ensaio for um ligando para a proteína alvo.

De acordo com outra forma de realização, a extensão em que a proteína alvo dobrada e desdobrada se encontra presente na combinação de ensaio é determinada através do uso de anticorpos específicos para o estado dobrado ou para o estado desdobrado da proteína, isto é, anticorpos desnaturados-específicos (“DS-”) ou naturais-específicos (“NS”), respectivamente, (Breyer, 1989,/. Riol. Chem., 264 (5): 13348-13354),

Podem preparar-se anticorpos DS e NS monoclonais e policlonais específicos para proteínas alvo particulares através de processos que são bem conhecidos na técnica (R Harlow & D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1987). Para os anticorpos DS, podem imunizar-se animais com um péptido de uma região da proteína que está enterrada no interior da proteína quando está no seu estado natural. Se a estrutura tridimensional da proteína for desconhecida, são preparados anticorpos contra vários péptidos. Hm alternativa, usa-se como imunogene a proteína alvo totalmente desnaturada (isto é, desdobrada).

Os anticorpos resultantes são varridos relativamente à ligação preferencial ao estado desnaturado, Para os anticorpos monoclonais, varrem-se sobrenadantes de cultura derivados de hibridomas clonados individuais e usam-se clones positivos directamente como fonte de anticorpos DS individuais. Para os anticorpos policlonais, um anti-soro não fraccionado pode exibir uma ligação preferencial ao estado desnaturado. Hm alternativa, podem purificar-se anticorpos DS a partir de um anti-soro policlonal por meio de técnicas de adsorção selectiva bem conhecidas na técnica.

Para anticorpos NS, podem ser usados como imunogene proteína intacía não desnaturada, ou um ou mais péptidos conhecidos por se encontrarem na superfície da proteína natural. Os anticorpos resultantes são varridos tal como se disse acima, reiativameníe à ligação preferencial à proteína natural e purificados para serem usados na presente invenção.

Podem utilizar-se anticorpos DS ou NS para detectar uma mudança provocada pelo ligando no nível da proteína alvo dobrada, da proteína alvo desdobrada, na proporção dobrada.desdobrada ou na taxa de dobragem ou desdobramento.

De acordo com uma aprximação, expõe-se uma combinação de ensaio contendo o anticorpo DS, a proteína alvo e o ligando de ensaio, a um suporte sólido, por exemplo, uma placa de micro-titulação revestida com a proteína alvo desnaturada ou um seu fragmento de péptido, em condições apropriadas para a ligação da proteína alvo com o seu ligando e para a ligação do anticorpo DS à proteína alvo desdobrada, Processa-se da mesma maneira que a solução de ensaio, uma combinação de controlo, que é a mesma que a combinação de ensaio, com excepção de que não contém o ligando de ensaio.Comparando a quantidade de anticorpo ligado à placa ou a quantidade que fica na solução nas combinações de ensaio e de controlo, detecta-se a diferença no desdobramento da proteína alvo. A quantidade de anticorpo ligado à placa ou que permanece na solução pode ser medida como se descreve abaixo.

De acordo com uma segunda aproximação, expõe-se uma combinação de ensaio contendo o anticorpo DS, o ligando de ensaio e a proteína alvo a um suporte sólido revestido com um segundo anticorpo, referido como o anticorpo de fase sólida, que não se pode ligar à proteína alvo simultaneamente com o anticorpo DS e é específico para a proteína alvo, mas é ou específico para o estado dobrado (anticorpo NS) ou incapaz de diferenciar entre os estados natural e desnaturado (anticorpo de “não-diferenciação” ou “ND”). Mantém-se a combinação de ensaio resultante ou a solução em condições apropriadas para a ligação da proteína alvo com um ligando da proteína alvo e para a ligação dos anticorpos às proteínas que reconhecem. Processa-se uma combinação de controlo, que é a mesma que a solução de ensaio, com excepção de não conter ligando de ensaio, da mesma maneira que a solução de ensaio, Fm ambas as combinações, a proteína alvo desnaturada (desdobrada) liga o anticorpo DS e é inibida de ligar o anticorpo de fase sólida. A capacidade do ligando de ensaio de ligar a proteína alvo 16 pode ser aíerida determinando a quantidade de proteína alvo que se 3iga ao anticorpo de fase sólida na solução de ensaio e comparando-a com a extensão em que a proteína alvo se liga ao anticorpo de fase sólida na ausência de ligando de ensaio que, por sua vez, retlecte a quantidade de proteína alvo no estado dobrado. A quantidade de proteína alvo ligada à placa através do segundo anticorpo ou que permanece na solução pode ser detectada pelos processos abaixo descritos. Esta tentativa pode ser usada de maneira comparável com o anticorpo NS como anticorpo solúvel e o anticorpo DS ou ND na fase sólida.

De acordo com uma terceira aproximação, expõe-se uma solução de ensaio contendo a proteína alvo e o ligando de ensaio a um suporte sólido, por exemplo, uma placa de micro-titulação que foi revestida com um anticorpo DS ou NS e mantida em condições apropriadas para a ligação da proteína alvo ao seu ligando e para a ligação do anticorpo à proteína alvo. Em alternativa, o anticorpo pode estar presente nas superfícies de esferas. A capacidade do ligando de ensaio em ligar a proteína alvo é aferida determinando a extensão em que a proteína alvo permanece na solução (não ligada ao anticorpo) ou na superfície sólida (ligada ao anticorpo), ou a proporção das duas, na presença e na ausência de ligando de ensaio. Em alternativa, o anticorpo pode estar presente em solução e a proteína alvo pode estar ligada a uma fase sólida, tal como uma superfície de placa ou uma superfície de esfera.

De acordo com outra forma de realização, são usadas ehaperonas moleculares para determinar os níveis relativos de proteína dobrada e desdobrada numa combinação de ensaio. As ehaperonas englobam proteínas conhecidas que ligam proteínas desdobradas como parte da sua função fisiológica normal. Estão em geral envolvidas na agregação de proteínas oligoméricas, em assegurar que certas proteínas se dobrem correctamente , em facilitar a localização de proteínas e na prevenção da formação de agregados proteináceos durante o stress fisiológico (Hardy, 1991, Science, 251:439-443). Estas proteínas têm a capacidade de interagir com muitas proteínas desdobradas ou parcialmente desnaturadas sem reconhecimento específico de motivos de sequências definidos.

Uma chaperona molecular, descoberta no E. Coli, é uma proteína conhecida como SecR, A SecB demonstrou um envolvimento na exportação de um subconjunto de proteínas diferentemente não relacionadas. Experiências concorrentes revelaram que a 17

SecB se liga firmemente a todas as proteínas desdobradas testadas, incluindo as proteínas fora do seu subconjunto de exportação particular, mas não parecem interagir com a proteína dobrada. Outras chaperonas apropriadas para uso na presente invenção incluem, sem limitação, a proteína de choque ao calor 70s, a proteína de choque ao calor 90s, a GroKT e a GroBS (Gething et a!,, Nature 355:33,1992).

Nesta forma de realização, expõe-se uma combinação de ensaio contendo o ligando de ensaio e o alvo a um suporte sólido, por exemplo, uma placa de microtitulação ou outra superfície apropriada revestida com uma chaperona molecular em condições apropriadas para a ligação da proteína alvo com o seu ligando e para a ligação da chaperona molecular à proteína alvo desdobrada. A proteína alvo desdobrada na solução terá uma maior tendência em se ligar à superfície coberta da chaperona molecular em relação à proteína alvo dobrada estabilizada com o ligando. Assim, a capacidade do ligando de ensaio em ligar a proteína alvo pode ser determinada determinando a quantidade de proteína alvo que permanece não ligada, ou a quantidade ligada à superfície revestida com chaperona.

Em alternativa, pode ser utilizado um ensaio concorrente para a ligação às chaperonas moleculares. Pode expor-se uma combinação de ensaio contendo a proteína alvo purificada, o ligando de ensaio e uma chaperona molecular a um suporte sólido, por exemplo, um poço de micro-titulação revestido com proteína alvo desnaturada (desdobrada) em condições apropriadas para a ligação da proteína alvo com o seu ligando e para a ligação da chaperona molecular à proteína alvo desdobrada. É processada da mesma maneira uma combinação de controlo, que é igual que à combinação de ensaio, com excepção de não conter o ligando de ensaio. A proteína alvo desnaturada em solução ligar-se-á à chaperona e assim inibe a sua ligação à proteína alvo desnaturada ligada ao suporte. A ligação de um ligando de ensaio à proteína alvo resultará numa diferença na quantidade de proteína alvo desdobrada e, assim, ficará disponível mais ou menos chaperona para se ligar à proteína alvo desnaturada em fase sólida do que no caso da ausência de ligação do ligando de ensaio. Assim, a ligação do ligando de ensaio pode ser determinada determinando a chaperona ligada à superfície ou em solução na combinação de ensaio e na combinação de controlo e comparando os resultados. Neste ensaio, as chaperonas não são geralmente íbmecidas em excesso para que possa ser medida a sua concorrência relativamente à sua ligação. 18

Em alternativa, uma combinação de ensaio contendo a proteína alvo, o ligando de ensaio e uma chaperona molecular pode ser exposta a um suporte sólido, por exemplo, um poço de micro-titulação que foi revestido com anti-soro ou um anticorpo monoclonai específico para a proteína alvo dobrada (anticorpo NS) e incapaz de ligar a proteína alvo ligada à chaperona, A proteína alvo desdobrada irá ligar a chaperona em solução e, assim, ser inibida de ligar o anticorpo em fase sólida. Detectando a proteína alvo na solução ou ligada às paredes do poço e comparando a extensão de cada uma ou ambas num controlo apropriado (a mesma combinação sem o ligando de ensaio), pode ser determinada a capacidade do ligando de ensaio em ligar a proteína alvo. Se o ligando de ensaio tbr um ligando para a proteína alvo, ficará ligada mais ou menos proteína alvo ao anti-soro ou anticorpo monoclonai ligado à superfície do recipiente na combinação de ensaio do que na combinação de controlo e, correspondentemente, estará presente mais ou menos proteína alvo não ligada (em solução) na combinação de ensaio do que na combinação de controlo.

De acordo com uma outra forma de realização, é usado um conhecido ligando, cofactor, substracto ou um seu análogo da proteína alvo para testar a presença de proteína alvo dobrada. Quanto maior for a fracção de proteína na forma dobrada, maior será a quantidade de proteína que está disponível para se ligar a um ligando que se liga exclusivamente ao estado dobrado. Consequentemente, se uma proteína tiver um ligando conhecido, é possível aumentar ou diminuir a ligação da proteína ao ligando conhecido, adicionando um ligando de ensaio que liga outro sítio na proteína. Por exemplo, pode ser usada a ligação de di-hidrofolato reductase a metotrexato, um análogo do ácido fólico, para determinar o nível de desdobramento desta enzima.

Nesta aproximação, é imobilizado num substracto sólido o ligando, o cofactor, o substracto ou um seu análogo conhecido por se ligar à proteína alvo. É depois adicionada uma solução contendo a proteína alvo e o ligando de ensaio. Um aumento ou diminuição na quantidade de proteína alvo que se liga ao composto imobilizado relativo a um ensaio idêntico na ausência de ligando de ensaio indica que o ligando de ensaio liga a proteína alvo. A quantidade de proteína alvo ligada ao substracto sólido pode ser determinada por amostragem do substracto sólido ou por amostragem da solução.

De acordo com outra forma de realização, a quantidade de proteína alvo desdobrada numa combinação de ensaio é determinada medindo a agregação de proteínas. Para as 19 proteínas que se desdobram irreversivelmente, a proteína desdobrada muitas vezes forma agregados insolúveis. A extensão de agregação de proteínas pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica incluindo, sem limitação, dispersão de luz, centrifugação e filtração.

Nesta aproximação, a proteína alvo e o ligando de ensaio são incubados e medida a quantidade de agregação de proteínas durante um período de tempo ou depois de um período de tempo de incubação fixo. A extensão de agregação de proteínas na mistura de ensaio é comparada com a mesma medição para um ensaio de controlo na ausência de ligando de ensaio, Se um ligando de ensaio ligar uma proteína alvo, a taxa de desdobramento da proteína alvo será maior ou menor do que na ausência de ligando de ensaio. Para medições durante períodos de tempo, a taxa de aparência de proteína agregada será maior ou menor se o ligando de ensaio for um ligando para a proteína alvo do que se não for. Para as medições num período de tempo fixo, haverá mais ou menos proteína desdobrada e, correspondentemente, mais ou menos proteína agregada se o ligando de ensaio for um ligando para a proteína alvo do que se não for, Assim, a capacidade de um ligando de ensaio em ligar uma proteína alvo pode ser determinada determinando a extensão de agregação de proteínas na presença e na ausência de ligando de ensaio,

Deverá entender-se que os processos da presente invenção podem ser aplicados a fragmentos de proteínas alvo que constituam domínios estruturais estáveis. Tal como aqui é usado, “domínio” refere-se a um fragmento de uma proteína alvo que retém um grau significativo de estrutura natural dobrada depois do isolamento. Nalguns casos, uma proteína natural será clivada por uma protease num ou mais desses domínios quando a digestão proteolítica da proteína natural é realizada, por exemplo, a uma temperatura mais baixa do que aquela em que ocorre a digestão completa da proteína. Neste caso, pode ser vantajoso ensaiar a ligação dos ligandos de ensaio a cada um dos domínios independentemente. Isto pode ser atingido quer por uma ou ambas das seguintes aproximações. Primeiro, pode preparar-se um ou mais domínios individuais de uma proteína alvo para serem usados como alvos nos ensaios acima descritos, quer submetendo-se a proteína intacta a proteólise controlada seguida de purificação dos fragmentos que compreendem o domínio, ou dirigindo a síntese desses fragmentos, quer in vitro quer in vivo, a partir de moléculas de ADN recombinante que codificam fragmentos da proteína que compreendem o domínio. Segundo, pode ser usada a detecção específica de domínios para quantificar o desdobramento numa mistura reaccional em que a proteína intacta serve como alvo. Processos para a detecção específica de domínios incluem, sem limitação, o uso de anticorpos específicos de domínios e processos químicos ou enzimáticos que marcam selectívamente domínios particulares. Podem ser preparados anticorpos específicos de domínios por qualquer processo conhecido na técnica. Por exemplo, podem ser criados anticorpos específicos de domínios policlonais usando como imunogenes quer os domínios purificados quer recombinantes acima descritos ou péptidos sintéticos específicos de domínios. Km alternativa, pode ser preparado um painel de anticorpos monoclonais relativamente à proteína intacta e testados reiativamente à reacção com domínios purificados ou recombinantes.

As formas de realização acima descritas estão sumarizadas na Tabela 1. 21

TABELA 1

DETERMINAÇÃO DA PROTEÍNA ALVO DOBRADA E DESDOBRADA • Proées&o det Monitorização Usado ' Resultado Observado Se o Ligando de Ensaio Liga *· vv _ . „ . ** Ϊ A Proteína Ak» Proteólise É usada proíease que hidroliza preferenelalnieníe proteína alvo desdobrada Mais ou menos proteína alvo intacta na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Lisacão da Superfície É usada uma superfície que ligue preferencialmente uma proteína alvo desdobrada Mais ou menos proteína alvo não ligada (em solução) à superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Lisacão de Anticorpos Anticorpo DS em solução/proteína alvo desdobrada ou seu fragmento de péptido na superfície Mais ou menos anticorpo DS ligado à proteína alvo desdobrada ou seu fragmento de péptido na superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Anticorpo DS em solução/anticorpo que reconhece a proteína alvo dobrada na superfície Mais ou menos proteína alvo ligada a anticorpo na superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Anticorpo NS em solução/anticorpo que reconhece a proteína alvo dobrada na superfície Proteína alvo mais ou menos ligada a anticorpo na superfície em combinação de ensaio do que em combinação de controlo Anticorpo DS na superfície Mais ou menos proteína alvo ligada a anticorpo DS na superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Anticorpo NS na superfície Mais ou menos proteína alvo ligada a anticorpo NS na superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Chaoeronas Moleculares Chaperona na superfície Mais ou menos proteína alvo ligada a chaperona na superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Ensaio Concorrente Proteína alvo desdobrada em fase sólida, proteína alvo em solução Mais ou menos chaperona ligada a proteína alvo desdobrada em fase sólida na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Chaperona em solução/anticorpo que reconhece a proteína alvo dobrada na superfície Mais ou menos proteína alvo ligada a anticorpo ligado à superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Lisacão Diferencial a Lísando Imobilizado Proteína alvo em solução, ligando conhecido da proteína alvo ligado à superfície Mais ou menos proteína alvo ligada a ligando ligado à superfície na combinação de ensaio do que na combinação de controlo Asreeacão de Proteínas Formação de proteínas agregadas por desdobramento irreversível de proteínas Mais ou menos proteína agregada (maior ou menor taxa de formação de proteína agregada) na combinação de ensaio do que na combinação de controlo 22

Processos de Dctcccão de Proteínas

As formas de realização acima descritas requerem uma fase final para detecíar e/ou quantificar o nível de proteína alvo ou dos seus produtos de digestão, ou anticorpos, a fim de quantificar as quantidades relativas de proteína alvo dobrada e desdobrada depois da exposição aos ligandos de ensaio. Na prática da presente invenção, são usados processos conhecidos na técnica para detectar a presença ou a ausência de proteína, pequenos péptidos ou amino ácidos livres. O processo usado será determinado pelo produto (proteínas, péptidos, amino ácidos livres) a ser detectado. Por exemplo, podem ser usadas técnicas para detectar o tamanho da proteína para determinar a extensão de degradação proteolítica da proteína alvo, por exemplo, a electroforese de gel, a electroforese capilar, a cromatografía de exclusão de tamanhos, a cromatografia líquida de elevado rendimento e do género, A medição da radioactividade, fluorescência, ligação de cores (Ciesiolka et al., Anal. Biochem. 168:280, 1988), ligação de ouro coloidal (Bradíbrd, Anal. Biochem. 72:248, 1976), ou a actividade enzimática podem detectar a presença ou a ausência de produtos, quer em solução quer num suporte sólido. Os processos imunológicos incluindo, por exemplo, o ELISA e o ensaio radioimunológico, podem detectar a presença ou ausência de uma proteína alvo conhecida em solução ou num substracto, Os processos acima são descritos, por exemplo, em Harlow, E. e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1988; S. F. Y. Li, Capiílary Electrophoresis, Elsevier Press, 1993; Bidlingmeyer, Practical HPLC Methodology and Applications, John Wiley and Sons, Inc., 1992; e Cantor, C. R. e P. R. Schimmel, Biophysical Chemistry, WH Freeman and Co., 1980.

De acordo com uma forma de realização, é usada a electroforese de gel para detectar a presença ou a ausência da proteína, e pode ainda ser usada para detectar o tamanho da proteína. Este último processo é especialmente útil em conjunção com a proteólise, uma vez que a presença de uma maior ou menor quantidade de proteína alvo não digerida na combinação de ensaio do que na combinação de controlo indica que o ligando de ensaio se ligou à proteína alvo.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção sem a limitarem. 23 \ r ^ ^ * Λ

Exemplo 1;

A Ligação de Metotrexato Protege a Di-Hidroíoiato Rcductasc (DHFR) da Digestão Proteolítiea Pe!a Proteinase K

Incubaram-se os seguintes elementos a 54° C durante 5 minutos: DHFR (100 pg/ml),

Proteinase K (80 .ug/ml), Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 e Metotrexato a 10'10 a 10'4 M.

Removerem-se amostras e quantificou-se a DHFR não digerida por ELISA, tal como se segue: (a) diluíram-se incubações de proíease 50 vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS); (b) transferiram-se amostras diluídas de 50 μΐ para poços de uma placa ELISA e incubaram-se durante 60 minutos, à temperatura ambiente; (c) lavaram-se bem os poços da placa com TBS mais Tween-20 a 0,1% (TBST); (d) adicionou-se a cada poço 50 μΐ de soro de coelho anti-DHFR diluído 250 vezes em TRST mais 5% de leite em pó magro e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente; (e) lavaram-se os poços da placa, tal como se disse em (c) acima; (f) adicionaram-se a cada poço 50μ1 de conjugado de fosfaíase alcalina IgG de cabra anti-coelho diluída 500 vezes em TBST mais 5% de leite e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente; (g) lavaram-se os poços da placa, tal como em (c); e (h) adicionou-se 0,1 ml de 1,0 mg/mi de fosfato de /?-niírofeniio em 0,1% de dietanolamina, O desenvolvimento da cor é proporcional ao conjugado de anticorpo de fosfatase alcalina ligado. A análise ELISA revelou que o metotrexato protege a DHFR da digestão em concentrações de 10"8 M e maiores. Através dos mesmos processos, o nicotinamida 24 adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e o di-hidrofolato em concentrações de 10 M e / ( superiores revelaram inibir a prolcólisc da DHFR cm experiências separadas.

Exemplo 2; A Ligação dc Mcíotrcxato, NADPH c Bi-Hidroíòiaío Protege a Di--Hidrofolato Reductase (DHFR) da Digestão Proteolítica Pela Proteinase K na Presença de Uma Mistura de Amino Ácidos

Combinaram-se os elementos seguintes e íncubaram-se a 54° C durante 5 minutos: DHFR (2,1 pg/mí), Proteinase K (80 pg/ml), Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5), TO'5 M de todos os 20 amino ácidos comuns e ligando ou 0 ou IO 5 M. Os ligandos usados foram o inibidor Metoírexato e os substractos di-hidroíblato e o NADPH.

Removerem-se amostras e quantificou-se a DHFR não digerida por ELISA, tal como se segue: (a) diluíram-se incubações de proíease 50 vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS); (b) transferiram-se amostras diluídas de 50 μΐ para poços de uma placa ELISA e incubaram-se durante 60 minutos, à temperatura ambiente; (c) lavaram-se bem os poços da placa com TBS mais Tween-20 a 0,1% (TBST); (d) adicionou-se a cada poço 50 μΐ de soro de coelho aníi-DHFR diluído 250 vezes em TBST mais 5% de leite em pó magro e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente; (e) lavaram-se os poços da placa, tal como se disse em (c) acima; (í) adicionaram-se a cada poço 50μ1 de conjugado de fostãtase alcalina IgG anti--coelho de cabra diluída 500 vezes em TBST mais 5% de leite e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente; (g) lavaram-se os poços da placa, tal como em (c); e (h) adicionou-se 0,1 ml de 1,0 mg/mi de fosfato de />nitrofenuo em 0,1% de dietanolamina. O desenvolvimento da cor é proporcional ao conjugado de anticorpo de fosfatase alcalina ligado. A análise ELISA revelou que o metotrexato e os substractos protegem a DHFR da digestão em relação à ausência de ligandos que se ligam à DHFR, Assim, pode ser detectada uma ligação específica na presença de uma mistura complexa de compostos que não se ligam à proteína alvo.

Exemplo 3: A Ligação dc Metotrexato Inibe a Ligação da DHFK SS FlSCaS uC

Microtitulação.

Combinaram-se os seguintes elementos num volume de 60 μΐ e incubaram-se numa placa de microtitulação Falcon 3072 “tratada com cultura de tecido” a 20 ou 47° C: 100 mg de DHFR, Tris-Cl 50 MM (pH 7,5) e Metotrexato IO'10 a 10-4 M.

Transferiram-se depois 50 μι de cada amostra para os poços de uma placa ELISA e a DHFR que ficou na solução foi quantificada por FvLTSA, tal como se segue: (a) incubaram-se amostras de 50 μΐ, durante 60 minutos, à temperatura ambiente; (b) lavaram-se bem os poços da placa com TBS mais Tween-20 a 0,1% (TBST); (c) adicionou-se a cada poço 50 μΐ de soro de coelho anti-DHFR diluído 250 vezes em TBST mais 5% de leite em pó magro e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente; (d) lavaram-se os poços da placa, tal como se disse em (c) acima; (e) adicionaram-se a cada poço 50μ1 de conjugado de fosfatase alcalina IgG anti--coelho de cabra diluído 500 vezes em TBST mais 5% de leite e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente; (í) lavaram-se os poços da placa, íai como em (b); e (g) adicionou-se 0,1 ml de 1,0 mg/m! de fosfato de D-nitroíenilo em 0,1% de dietanolamina, O desenvolvimento da cor é proporcional ao conjugado de anticorpo de fosfatase alcalina ligado. A análise ELISA revelou que o metotrexato inibe a ligação da DHFR à placa Faícon 3072 em concentrações de 10' M e superiores.

Exemplo 4: inibição ou Aumento da Ligação dc Anticorpo Desdobrado- -Específico (1) Revestiram-se placas ELISA por incubação, durante 60 minutos, com a seguinte mistura: 4 ,ug/m! de proteína alvo irreversivelmente desnaturada ou seus fragmentos de péptido em solução salina tamponada com Tris (Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,2 M; TBS). (2) Lavaram-se as placas 3 vezes com TBS mais Tween-20 a 0,1% (TBST). (3) Incubou-se a mistura seguinte (volume total de 50 μΐ) nos poços revestidos da placa de microiitro, durante 60 minutos: (a) Anticorpo específico para o estado desdobrado da proteína alvo numa concentração suficiente para dar 50% de ligação máxima (na ausência de proteína alvo concorrente). (b) Proteína alvo numa concentração suficiente para se atingir uma inibição de 90% da ligação do anticorpo à placa. A concentração de proteína alvo apropriada difere para cada proteína alvo. A concentração depende, em parte, da estabilidade da forma dobrada da proteína alvo. Nalguns casos pode ser desejável reduzir a estabilidade da proteína alvo por meio de temperatura elevada, inclusão de agentes químicos de desnaturação da proteína ou introdução de substituições de amino ácidos desestabilizantes na proteína alvo. 27 (c) ligandos de ensaio 10'9 a 10r5 M; (d) 5% de leite em pó magro em TBST. (4) Lavaram-se as placas 3 vezes com TBST. (5) Adicionaram-se 50 μΐ de conjugado de fosfatase alcalina aníi-ígG de cabra numa diluição apropriada, em TBST, mais 5% de leite em pó magro e incubaram-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente. (6) Lavam-se as placas 3 vezes com TBST. (7) Adicionaram-se 0,1 ml de 1,0 mg/ml de fosfato de D-nitroíenilo em 0,1% de dietanolamina e registou-se a quantidade de desenvolvimento de cor por meio de um leitor de placas ELISA. A análise ELISA vai revelar mais ou menos anticorpo ligado à placa quando ocorreu de forma bem sucedida a ligação do ligando de ensaio-proteína alvo, do que na ausência dessa ligação.

Exemplo 5: inibição ou Aumento da Ligação de Chapcrona (1) Revestem-se placas ELISA por incubação, durante várias horas, com 4 pg/mí de cbaperona em TBS. (2) Lavam-se as placas 3 vezes com TBST. (3) Incuba-se depois a mistura seguinte (volume total de 50 μΐ) nos poços revestidos da placa de microtitulação 10, durante 60 minutos: (a) Proteína alvo numa concentração suficiente para saturar cerca de 50% dos sítios de ligação disponíveis presentes nas proteínas de cbaperona. Podem ser usadas condições de desnaturação nos casos em que a forma dobrada da proteína alvo -é, difereníemente, demasiado estável para permitir uma ligação apreciável às chaperonas, (b) ligandõs de ensaio T0'y a IO'5Mem TBST. (4) Transferem-se aliquotas das- soluções dos-poços para poços- de uma-neva piaea FJ JSA e incubam-se durante 60 minutos, à temperatura ambiente. (5) Lavam-se os -poços das-placas-3 vezes com -TBST. (6) Adieionam-se- a cada poço-50 μΐ de-anticorpo específico para a proteína alvo na diluição apropriada em TBST, mais 5% de leite em pó magro, e incubam-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente. (7) Lavam-se os poços das placas -3 vezes com TBS i. (8) Adieionam-se a cada poço -50-μΐ de-conjugado de tbsíatasealcalma IgG anti--coelbo de cabra numa diluição apropriada em TBST mais 5% de leite em pó magro e incubam-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente. (9) Lavam-se os poços das piacas 3 vezes-com TBS i . (10) Adicionam-se--0,1 ml de- 1,0 mg/ml de fosfato de-p-nitrofenilo em 0,1% de dietanolamina. Monitoriza-se o desenvolvimento da cor (proporcional ao conjugado de anticorpo de fosfatase alcalina ligado) com um leitor de placas ELISA. A análise por ELISA vai- revelar proteína alvo na solução numa concentração maior ou menor quando ocorreu a ligação do ligando de ensaio-proteína alvo do que quando não ocorreu. -Exemplo-6: Aumento ou lnibição da Ligação a um Ligando-Conhecido (1) Ineuba-se a mistum-seguinte-ívolume toíaS de-50 μΐ) nos poços- revestidos da-píaca de microtitulação, durante 60 minutos: (a) - Ligando conhecido por se- ligar à proteína- alvo, eovalentemente-ligado a esferas sólidas, tais como Sephadex, Este ligando.pode ser uma pequena molécula ou uma macromolécula. (b) Proteína alvo num poço de concentração abaixo da saturação do ligando e tal que apenas 10% da proteína se liga aos sítios do ligando. As condições de solução são tais que a maior parte da proteína alvo se encontra presente no estado desnaturado ,- (c) ligandos de ensaio 10t9 a Itf5'M; (d) em-TBS-T- maia desnaturantoneeessário,-taleomo ureia. -(2)- Transferem-so aliquotas do-sobrenadante do poço (livre-de-esferas) para poços do uma nova placa ELTSA e incubam-se durante 60 minutos, à temperatura ambiente, (3) Lavam-se os poços da placa 3 vezes eom -TBST. (4) Adicionam-se a cada poço 50 μΐ de- anticorpo específico para a proteína alvo na diluição apropriada em TBST, mais 5% de leite em pó magro, e incubam-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente. (5) Lavam-se os poços da placa 3 vezes com TBST. (6) Adicionam-se a cada poço 50 μΐ de conjugado de fosíãtase alcalina IgG anti--coelho de cabra numa diluição apropriada em TBST, mais 5% de leite, e incubam-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente. (7) Lavam-se os-poços da placa 3 vezes com -TBST. (8) AcSeionam-se- 9,1 ml -de 1,9 mghnl de fosfato de /^ratreferafe- em 9,1% de dietanolamina, Monitoriza-se o desenvolvimento da cor (proporciona! ao conjugado de anticorpo de fosfatase alcalina ligado) com um leitor de placas ELISA. A análise ELISA vai -revelar uma maior ou menor concentração- de proteína alvo na solução quando ocorreu com sucesso a ligação do ligando de ensaio-proteína alvo.

Exemple?: Jtasaio de Baixa Produtividade Operacional para a Proteína Rev

de H!V

As -misturas reaceionais (9,93 ml de volume total) continham 39 μ-g/mi de proteína Rev HTV que tinha sido produzida em R Coli, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, acetato de cálcio 0,01 M, 2,5 pg/ml de proteinase K, 10% de DMSO e quantidades variáveis de tRNA eomo ligando-eonhecido. Ineubarara-seas reaeções em geío-durante 15 minutos. -Depois da adição de PMSF e EDTA, tal como se descreve no Exemplo 8 abaixo, prepararam-se amostras para electroforese de gel e analisaram-se, tal como se descreve no Exemplo 8.

Os resultados revelaram que na ausência de tRNA, a proteína Rev é quase completa mente degradada pela proteinase K nestas condições. Contudo, na presença de tRNA, fica estabilizado um fragmento de baixo peso molecular da proteína, relaíívameníe à proteól-ise. Assim, é detectável a ligação de ura ligando eonhecido à proteína Rev HTV usando os processos da presente invenção.

Exemple 8: Ensaie de Baixa Produtividade Operacional para Ligandos de

Anidrase Carbónica

Testou-se-a-ligação-do-ligande a anidrase-carbónica I-(Sigma)-usando a proteólise-como amostra de dobragem da proteína alvo e usou-se electroforese de gel desnaturante como processo para detectar a proteína intacta que fica depois da digestão com proteases.

Para validar o ensaio; testou-se aeetazolamida, um ligando eonhecido- de anidrase carbónica. Embora a aeetazoiamida seja um inibidor conhecido da actividade da anidrase carbónica, estas experiências não fizeram aso desta propriedade e não mediram a actividade enzimática da proteína, Adicionalmente, examinou-se a sensibilidade do processo para interferência através de um extracto de produto natural.

As misturas r-eaeeionais continham 13,3 pg/nil de anidrase carbónica, Tris-HCl 0,05 H pH 7,5, acetato de cálcio 0,01 M, 2,5 ,ug/m) de proteinase K, DMSO a 10% e acetazolamida (Sigma) em concentrações variando entre 0,0 e 1,0 mM. Incubaram-se as reacções a 54° C, durante 15 minutos, e depois arreíèeeram-se em gelo. Adicionou-se então fluoreto de fenil metil sulfonito (PMSF) de uma solução armazenada de 20 mM em etanol até uma concentração final de 1 mM e adicionou-se EDTA de uma solução armazenada 0,5 M, até uma concentração final de 20 mM. Adicionaram-se 0,01 mi de tampão de carga SDS (10% de dodecil sulfato de sódio (SOS), ditiotreitol 0,5 M, tampão de Tris-HCl 0,4 M, pH 6,8, glicerol a 50%) e aquecerem-se as amostras a 95° C, durante 3 minutos. Analisaram-se as amostras por eleetroíorese de gel de pel-iaerilamida SDS usando um gel gradiente de poliacrilamida (BioRad) de 4-15%, que depois foi manchado com cor Azul Coomassie.

Tal como se mostra na Figura 1, a ligação do ligando conhecido de acetazolamida à anidrase carbónica resultou na estabilização da anidrase carbónica relativamente à proteólise pela proteinase K a acetazolamida 1 x ΙΟ'5 Μ. A constante de dissociação para esta interacção foi registada como sendo de 2,6 x ΚΓ° M (Matsumoto, K. et ai, (1989), Ousou PhamL í?w2,37í1913-1915)l íneiuiu-se nas reaeçoes um extracto fúngico de metanol que era dirèreníemeníe idêntico ao descrito acima, de tal forma que a concentração final de uma pequena molécula adicionada fosse igual à sua concentração na cultura de origem. A presença do extracto nem induziu um falso sinal nem diminuiu a resposta à acetazolamida 1,0 mM (Figura 2\

Exemplo 9: Varrimento de Elevada Produtividade Operacional dos Eigaados para a Anidrase Carbónica Humana

Estabeleceu-se um ensaio de elevada produtividade operacional para a anidrase carbónica T. Cada mistura reaccional (num volume final de 0,05 ml) contém: 3,3 iig de 32 32

anidrase carbónica, Tris-HCí 50 mlví, NaCi 50 mM, €a(GAe)z 1,0 tuM e 0,13 pg de proteinase K, DMSO a 10%, e o composto de ensaio apropriado numa concentração de 20 pm. As reacções de controlo são idênticas, com excepção de ser omitido o composto de ensaio. As misturas são incubadas a 20° C durante 10 minutos, seguidas de incubação a 54° C durante 30 minutos, depois do que são colocadas em gelo. Cada mistura recebe então 200 μΐ de tampão de borato de sódio 50 mM, pH 8,5, contendo EDTA 10 mM e PMSF 1,0 mM. Depois de 20 minutos de incubação em gelo, adicionam-se 7,5 μΐ da mistura a poços da microplaca Dynatech Tmmu!on-4, contendo 92,5 μΐ por poço, do tampão de borato acima descrito. A placa é então incubada a 4o C, durante a noite, para permitir a ligação da anidrase carbónica. A anidrase carbónica ligada é quantificada por ET ISA directo usando o anticorpo de anti-anidrase carbónica T conjugado com HRP numa diluição de 1:2 000 (Biodesign, Kennebunk, ME); cax#K9004óP)e substraetode Pieree (Rockíord, EL) Turbo TMB.

Testaram-se inibidores de anidrase carbónica í (obtidos da Sigma Chemical €o., St. Louis, MO) no ensaio acima sobre uma gama de concentrações do inihidor. A Tabela 2 mostra a concentração que provocou uma inibição de 50% da proteólise no ensaio (Ciso), os valores Ka publicados para os compostos (Matsumotoeí al., Ckem. Pherm. Buli, 37:1913. !98?)) e a proporção destes valores para cada composto. Estes dados mostram uma correlação positiva entre os valores de CI50 e de Ka para cada inibidor.

Tabela 2

Ligando: Ka CÍ50 Proporção (μΜ) (μΜ) CT50;Kd Acetazolamida 2,6 13 5,0 Hidroclorotiazida 23,4 246 10,5 Sulfanilamida 36 350 9,7 33

Exemple 10: Varrimeníe de Elevada Produtividade Operaelonaí de Lígaudos para a Elastase de Neutrófllos Humanos

Na prática da presente invenção, a capacidade de realizar o ensaio de ligação em grande número de compostos é crítica para a sua utilidade na descoberta de compostos com uma utilidade farmacêutica potencial. Foram implementadas com sucesso duas tentativas de aproximação diferentes num modo de varrimento de elevada produtividade operacional, tendo sido cada um destes aplicado a duas proteínas alvo: a elastase de neutrófllos humanos (HNE) e a hemoglobina humana, quer a hemoglobina A (HbA) quer a hemogionina S (HbS) (descritas no Exemplo 11 abaixo).

De notar que estas proteínas alvo diferem uma da outra em vários aspectos importantes: a HbS é uma proteína tetramérica intracelular que contém um grupo prostético crítico para a sua função. Sabe-se que existe em duas conformações com propriedades estruturais e funcionais diferentes. Em contraste, a HNE é monomérica, não tem um grupo prostético e é segregada. A HNE tem uma actividade enzimática (proteólise) e não parece submeter-se a quaisquer mudanças conformacionais globais.

Para o varrimento de elevada produtividade operacional com ambas estas proteínas alvo, é usada a proteólise como amostra de desdobramento de proteína alvo. Os dois modos de elevada produtividade operacional diferem nos processos usados para a detecçao da proteína alvo residual a seguir à proteólise. Os dois processos de detecção são 1) captura de proteína radiomarcada em filtros de neutroeelulose seguida de quantificação da radioactividade ligada e 2) medição da proteína por ensaio imuno--servente ligado à enzima (ELISA). Cada um destes processos foi usado com sucesso quer com a hemoglobina quer com a HNE. A) Ligação a mirocelutese de HNE radiomarcada:

Marcou-se 0,1 mg de HNE (Elasíin Products) pela reacção com lodeío de Sódio 12:,T {Amersbam) na presença de Todogene (Pierce) de acordo com os protocolos do fabricante (Pierce). Prepararam-se misturas reaccionais num volume final de 0,05 ml contendo HNE radiomarcada (20 000 cpm, correspondente a aproximadamente 10 pg), 0,025 mg/ml de Albumina de Soro de Bovino, Tris-HCÍ 50 mM, pH 7,5, acetato de cálcio 10 mM, 2,5 pg/ml de termolisina (Boeringer Mannheim), 2,5 34 pg/ml de proteinase K (Merck), DMSO a 10% e o composto de ensaio numa concentração de 200 μΜ, As misturas de controlo eram idênticas, com excepção de se ter omitido o composto de ensaio.

Incubaram-se as misturas a 20° C, durante 15 minutos, e depois a 60° C, durante 30 minutos, depois do que se colocaram em gelo. Adicionaram-se então a cada mistura 0,12 ml de tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5. Depois de uma incubação adicional de 15 minutos em gelo, fíltraram-se as amostras através de folhas de membrana de nitrocelulose usando o “Minifok!” de Scbieicber e Schuell, Cada poço do aparelho foi depois lavado uma vez com 0,2 ml de tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, e duas vezes com 0,5 ml de fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5, contendo 2,0% de SDS e 1,0% de Triton X-100. Depois de se secar o filtro, determinou-se a radioactividade ligada por contagem de cintilação, usando o aparelho de Wallac MicroBeta.

Para validar o ensaio, íncIuíu-se no ensaio um ligando conhecido para o HNE, elastatinal, em concentrações variando entre 1-5 mM. Tal como se mostra na Figura 3, a inclusão de elastatinal aumentou a retenção de HNE marcado nos filtros de nitrocelulose, indicando que protegeu o HNE da proteólise. B) Quantificação por ELISA ãe HNE:

As misturas reaccíonaís num volume final de 0,05 ml continham 2 pg/ml de HNE, 0,020 mg/ml de Albumina de Soro de Bovino, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, acetato de cálcio 10 mM, 7,5 pg/ml de termolisina (Boeringer Manheim), 7,5 pg/ml de proteinase K (Merck), DMSO a 10% e e o composto de ensaio numa concentração de 20 ou 200 μΜ. As misturas de controlo eram idênticas, com excepção de ter sido omitido o composto de ensaio. Incubaram-se as misturas a 20° C durante 15 minutos, depois a 63° C, durante 30 minutos e depois colocaram-se em gelo.

Adicionaram-se então a cada reacção 0,1 ml de anticorpo de coelha anti HNE (Calbiochem) numa diliução de 1:10000 em TBST (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05%) contendo 5% de leite em pó magro (Camation). Depois de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, transferiram-se as misturas para placas Immulon-4 de 9b poços (Dynatech) que tinham sido

r* revestidos com HNE por incubação durante a noite, com 0,1 ml por poço de 0,2 pg/ml de HNE em tampão de Borato de Sódio 50 mM, pH 8,5, e azida de sódio 3 mM e depois lavaram-se bem com TBST. Incubaram-se depois as placas à temperatura ambiente, durante uma hora, depois do que se lavaram bem com TBST. Adicionou-se a cada poço 0,1 ml de anticorpo TgG de cabra anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina (Calbiochem) diluído em 1:1000 em TBST contendo 5% de leite em pó magro e incubaram-se as placas à temperatura ambiente durante 1-2 horas. T,avaram-se então as placas bem com TBST e, finalmente, com TBST sem Tween. Adicionou-se a cada poço 0,1 ml por ml de fosfato de p-nitrofenilo (0,5 mg/ml) em tampão de substracto de dietanoíamina IX (Pierce). Tncubaram-se as placas à temperatura ambiente até se desenvolver a cor, depois do que se mediu a absorvência de cada poço a 450 nm usando um leitor de micropíacas BioRad 3550-UV.

Para validar o ensaio, incluiu-se no ensaio um ligando conhecido para o HNE, ICI 200,355, em concentrações variando entre 0,01-10 μΜ, Tal como se mostra na Figura 4, a inclusão do ligando causou uma inibição da ligação do anticorpo à placa, indicando um aumento no nível de HNE imunoreactivo nas misturas reacckmais. C) Resultados do Varrimento de Elevada Produtividade Operacional:

Varreram-se 3600 compostos relativamente à interacção com HNE usando proteólise e detecçã© ELISA, tal como acima (Figura 5), Destes, 24 inibiram a proteólise de HNE pela proteinase K numa extensão até 50% ou mais, quando testados numa concentração de 20 μΜ (compostos de impacto “hit” positivos). Descobriu-se que mais 6 compostos aumentavam a extensão da proteólise em, pelo menos, duas vezes quando testados a 20 μΜ (compostos de impacto “hit” negativos). Mediu-se a dependência da concentração dos efeitos dos compostos de impacto “hit”. Os compostos de impacto “hit” revelaram metade dos efeitos máximos em concentrações desde 8 μΜ; mostra-se um exemplo na Figura 6. A inibição máxima foi normalmente, ,mas nem sempre, de aproxímadamente 100%.

Testaram-se os compostos de impacto “hit” relatívamente à sua capacidade em inibir a actividade enzímática do HNE. Uma vez que os compostos identificados 36 36

no ensaio de ligação se podem ligar em qualquer sitio na superfície da proteína, / seria de esperar que apenas uma pequena fracção inibisse a actividade enzimátiea do HNE. Os compostos foram testados como inibidores de proteólise de Suc--(AlaVpNA (Eiastin Products Co., Owensviíle, MT), um substracto cromogénico sintético, de acordo com um processo de Bieth, J, Spiess, B, e Wermutb, C. G. (1974, Biochemical Medicine, 11:350-357). Dois compostos de impacto “hit” positivos e um composto hit negativo inibiram a actividade proteolitica do HNE de forma significativa nestes ensaios (Figura 7). D) Comparação da Actividade de Ligação e da Actividade de Inibição dos inibidores de HNE Conhecidos:

Obtiveram-se da Marion Merreíl Dow, Inc. (Cíncinnatí, OH) três inibidores não--covalentes da actividade catalítica da elastase de neutrófilos humanos. Cada um destes compostos foi testado relativamente à actividade de ligação do HNE numa gama de várias concentrações usando os processos da presente invenção. A actividade de ligação (CT50) é expressa como a concentração necessária para inibir a proteólise em 50%.

Os compostos foram também testados relativamente à potência na inibição da actividade catalítica do HNE. Para este fím, monitorizou-se a clivagem do substracto cromogénico metoxi-succinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida (Eiastin Products Co.). Neste ensaio, prepararam-se reacções de 100 μΐ contendo o substracto cromogénico (1 mM), elastase 100 mM, DMSO 1%, Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, e NaCl 0,5 M. Monitorizou-se a clivagem durante algum tempo, medindo o aumento da absorvêncía das misturas reaccionais a 405 nm.

Os valores de CI50 que reflectem a ligação ao HNE, os valores de CI50 para a inibição da actividade catalítica do HNE e a proporção destes valores são mostrados na Tabela 3. 37 Tabela 3

Composto Ligação3 Inibição da Proporção de (μΜ) Actividade Catalíticab (μΜ) Licacão/Inibicão ΜΟΪ, 1,2 0,22 5,5 101,146 MDL 12 35 0,3 105,373 MDL 1,5 1,4 U 103,900

a expresso como CI50 para a inibição da protcóiisc de HNE b expresso como CI50 para a inibição da actividade do HNE

Estes dados revelam uma estreita correlação a entre a ligação ao HNE (conforme detectada pelos processos da presente invenção) e a inibição da actividade catalítica de HNE para cada um dos inibidores.

Exemplo 11: 'varrimento de Elevada Produtividade Operacional dos Ligandos para a Hemoglobina Humana A) Ligação por Nitroceluiose da Hemoglobina Radiomarcada

Radiomarcaram-se 0,2 mg de HbS ou HbA (Sigma) por reacção com reagente U:l--Bolton-Huntcr 1 mCi (Âmcrsham) cm tampão dc borato dc sódio 100 ΙΤίλ'ί, pH 8,5, em gelo, durante 1 hora. Interrompeu-se a marcação através da adição de tampão de borato contendo glicína 200 mM. Fraccionou-se depois a mistura no tamanho numa coluna de execelulose GF-5 (Pierce) em tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5, contendo 0,25% de gelatina. 38

Para o ensaio de ligação, as misturas reaccionaís num volume Final de 0,05 ml continham hemoglobina radiomarcada (20000 CPM), 0,063 mg/ml de hemoglobina não marcada, 0,034 mg/ml de Albumina de Soro de Bovino, Tris--HC1 50 mM, pH 7,5, acetato de cálcio 10 rnM, 2,5 pg/mí de termoíisina (Boeringer Mannheim), 2,5 pg/ml de proteinase K (Merck), 10% de DMSO e o composto de ensaio. As misturas de controlo eram idênticas, com excepção de o composto do teste ter sido omitido. Incubaram-se as misturas a 20° C durante 15 minutos, depois a 40° C durante 30 minutos e depois colocaram-se em gelo. Adicionou-se então a cada mistura 0,12 ml de tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5. Depois de uma incubação adicional de mais 15 minutos em gelo, filtraram-se as amostras através de folhas de membrana de nitrocelulose usando o Minifold de Schleicher and Schuell. Cada poço do aparelho foi depois lavado uma vez com 0,2 ml de tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, duas vezes com 0,5 ml de tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5, contendo 2,0% de SDS e 1,0% de Triton X-100. Depois de se secar o filtro, determinou-se a radioactividade ligada por contagem de cintilações usando o aparelho de Wallac MicroBeta.

Para validar o ensaio, incluiu-se na mistura reaccíonal um ligando conhecido para a hemoglobina, 2,3-difosfoglicerato, em concentrações variando entre 10'5 e 10_1M. Tal como se mostra na Figura 8, o 2,3-difosfoglicerato aumentou sígnifícativamente a retenção do filtro de hemoglobina. B) Quantificação da Hemoglobina por ELISA:

As misturas reaccionaís num volume final de 0,05 ml continham 0,0ó3 mg/ml de Hemoglobina, 0,034 mg/ml de Albumina de Soro de Bovino, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, acetato de cálcio 10 mM, 7,5 pg/ml de termoíisina (Boeringer Mannheim), 7,5 pghnl de proteinase K (Merck), 10% de DMSO e o composto em ensaio numa concentração de 20 ou 200 μΜ. As reacções de controlo eram idênticas, com excepção de ter sido omitido o composto de ensaio.

As misturas foram incubadas a 20° C durante 15 minutos, depois a 44° C durante 30 minutos e depois colocadas em gelo, A cada mistura adicionou-se 0,05 ml de tampão de borato de sódio 0,1 M contendo EDTA 20 mM e PMSF 1 mM. Depois de 10 minutos de incubação em gelo, transferiram-se as misturas para placas 39 39 \y ímmuuíon-4 com 96 poços não revestidos (Dynatech). Incubaram-se então as placas a 4o C, durante a noite, para permitirem a ligação da proteina à placa. Lavaram-se bem as placas com TBST e adicionou-se a cada poço 0,1 ml de anticorpo de coelho anti hemoglobina humana (Calbiochem) numa diluição de 1 ;500, Incubaram-se as placas à temperatura ambiente, durante uma hora, e depois lavaram-se bem com TBST. Em seguida, adicionou-se a cada poço 0,1 ml de anticorpo IgG de cabra anti coelho conjugado com fosfaíase alcalina (Calbiochem) numa diluição de 1:1000 em TBST mais 5% de leite em pó magro e incubaram-se as placas à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Lavaram-se então as placas bem com TBST e, fínaimente, com TBST sem Tween. Adicionou-se a cada poço 0,1 ml por ml de fosfato de /?-nitrofenilo (0,5 mg/ml) em tampão de substracto de dietanolamina IX (Pierce). Incubaram-se as placas à temperatura ambiente até se desenvolver uma cor e mediu-se a absorvência de cada poço a 405 nm, usando um leitor de microplacas BioRad 3550-UV.

Para validar o ensaio, incluiu-se na reacção um ligando conhecido para a hemoglobina, 2,3-difosfoglicerato. Tal como se mostra na Figura 9, este composto aumentou a detecção da hemoglobina imunoreactiva. C) Resultados do Varrimento de Elevada Produtividade:

Seieccionaram-se 4 000 compostos reiativamente à interacção com a HbS usando proteólise e detecção ELISA, tal como se refere acima (Figura 10), Destes, descobriu-se que 23 inibiam a proteólise numa extensão de 20% ou mais, quando testados numa concentração de 20 μίνί (compostos de impacto “hit” positivos).

Mediu-se a dependência na concentração dos efeitos dos compostos de impacto “hit”, Os compostos de impacto “hit” revelaram metade dos efeitos máximos em concentrações variando desde 2,0 μΜ (veja-se, por exemplo, a Figura 11). 40 Ί

Exemplo 12: Varrimento de Elevada Produtividade Operacional dos Ligandos Relativamente à Met-Hemog!obina S Humana

As experiências descritas abaixo foram realizadas para testar a ligação dos iigandos de ensaio à Hemoglobina S. Nestas experiências, a Hemoglobina S é incluída na sua forma oxidada, met-hemoglobina (met-HbS), em que o ferro heme está no estado férrico.

As misturas reaccíonais (num volume finai de 50 μί) continham 0,32 mg/mi de hemoglobina S, Tris-HC! 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, fèrricianeto de potássio 0,4 mM, 40 pg/ml de proteinase K, DMSO a 10 % e o composto em ensaio numa concentração de 20 μΜ. As reacções de controlo foram idênticas, com excepção de ter sido omitido o composto em ensaio. Antes da adição da proteinase K (0,2 μί) e da DMSO (5 μί) ou da DMSO e do composto em ensaio (5 μί) às misturas reaccionais acima, incubaram-se as misturas de hemoglobina S, Tris-HCI, NaCí e femcianeto de potássio (num volume de 44,8 μ!), durante 60 minutos, em gelo, para permitir a oxidação do ferro heme. Incubaram-se depois as misturas completas a 20° C durante 10 minutos, a 28,3° C durante 30 minutos e depois coíocaram-se em gelo. Cada mistura recebeu então 150 μ! de tampão de borato de sódio 50 mM, pH 8,5, contendo EDTA 10 mM e PMSF 1,0 mM. Depois de 10 minutos de incubação em gelo, adicionaram-se 40 μί da mistura aos poços da micropíaca contendo 160 μί de reagente de ensaio de proteína BioRad®, que tinha sido diluído quatro vezes com água. Depois de se misturar, mediu-se a absorvência a 585 nm para cada poço.

Foram varridas desta forma aproximadamente 40 000 pequenas moléculas a uma taxa de 3 000 a 7 000 ensaios por dia. Destes, desocbriu-se que 108 compostos inibiam a proteólise da met-HbS numa extensão entre 15 e 100%, quando presentes numa concentração de 20 μΜ.

Estes compostos "hit positivos” foram testados a fim de determinar se também inibiam a proteólise de um substracto de péptido eromogénico, a Succinil-AJa-Ala-Ala-p-nitro-anilida. Destes compostos, 51 reduziram a taxa de hidrólise de péptido eromogénico pelo menos duas vezes, indicando que o seu efeito na HbS é não-específico, isto é, através da inibição da protease mais do que pela ligação à HbS. 41

Os restantes 57 compostos foram individualmente testados relativamente aos seus efeitos no espectro de absorvência visível da met-HbS, Isto foi realizado para identificar os compostos cuja aparente ligação reflecte a contaminação com iões de cianeto ou de azida. Ambos os testes de cianeto e azida foram positivos usando o ensaio da presente invenção, o que provavelmente se deve ao facto de cada um se ligar com elevada afinidade ao átomo de ferro férrico da met-HbS e, por isso, aumentar de forma substancial a estabilidade da met-HbS. A ligação destes iões à HbS causa também mudanças características no seu espectro de absorvência visível, Os compostos foram também testados relativamente à sua capacidade de induzir a agregação de met-HbS nas condições de ensaio usadas acima; isto foi monitorizado medindo as mudanças em dispersão de luz da solução de HbS a 595 nm.

Três compostos causaram uma agregação substancial e outros 23 causaram mudanças de espectro características. Trinta e um compostos não causaram nem agregação nem mudanças de espectro que pudessem indicar a contaminação de cianeto ou de azida. Estes compostos representam ligandos de HbS, tal como definidos pelos processos da presente invenção.

Exemplo 13: Actividade dos Ligandos de HbS na Inibição da Polimerização de HbS

Os compostos identificados como ligandos da hemoglobina S (HbS), conforme descritos no Exemplo 12 acima, foram testados relativamente à sua capacidade em influenciar a polimerização in vitro da HbS usando o processo Csat· Neste processo, o efeito dos diferentes agentes na solubilidade de equilíbrio (Csat) da HbS é determinada medindo a congelação da hemoglobina. A. Processos: 1) Purificação da HbS:

Purifícou-se a HbS a partir de sangue de pessoas homozigóticas relativamente a traços das células-foice. Recolheu-se o sangue em tubos de heparina ou de EDTA para impedir a coagulação. Lavaram-se eritrócitos 42 42

com solução salina tamponada com fosfato fria, que tinha sido equilibrada i com CO e lisaram-se com água equilibrada com CO, Desmineralizou-se o lisado muna coluna Sephadex G-25 (Pharmacia) em tampão de fosfato 0,05M equilibrado còm CO, pH 7,0, e ajustou-se a concentração de hemoglobina para 15% de tetramero (g/dl).

Usou-se outra purificação da HbS usando eluição de gradiente pH de DEAE Sephadex para amostras de heterozigotes ou de indivíduos submetidos a tratamento com hidroxiureia (que resulta na produção de HbF). A concentração de tetrâmero foi calculada usando a seguinte fórmula: C% (g/dl) = 64500 x 0,25 x 0,00001 x f x absorvência / G = 1,61 x 250 x absorvência / C, em que f = factor de diluição (normalmente 250), G = coeficientes de extinção: G (HbCO a 570 nm) = 14,2; G (HbCO a 540 nm) = 14,3; G (HbCO a 560 nm) = 12,1; G (HbCO a 630 nm) = 0,20; G (MetHb a 570 nm) = 3,63; G (MetHb a 540 nm) = 5,96; G (MetHb a 560 nm) = 3,72; G (MetHb a 630 nm) = 3,88.

Antes do uso, oxigenou-se durante 2 hòrás 15% (g/dl) de soluções de HbSCO, depois do que se monitorizou espectroscopicamente a extensão de oxigenação (G (Hb02 a 577 nm) = 14,6; G (HbCO a 541 nm) = 13,8). Levaram-se depois as soluções oxigenadas para uma concentração de 35% (g/dl) usando um cone Amicon ou uma concentração CRNTRTCON (0o C, 3500 rpm, 1,5 h). 2) Ensaio de Congelação:

As misturas reaccionais continham 250 μί de HbS02 (35% g'di) e 80 μί ou de tampão, ou de compostos de controlo (L-Phe ou Trp) ou de ligandos de ensaio. Incubaram-se as misturas em gelo durante 10 minutos, depois do que se adicionaram 10 μί de uma solução fria de ditionito de sódio 0,9M em tampão de fosfato purgado com azoto, pH 8,5, e incubaram-se as misturas 43 43 ' ?

em gelo durante mais TO minutos, para converter o oxi- em desoxi-HbS. ..Incuhammrse depois m misturas reacdonais. .a. .3i)° C,. paca. .permitir a congelação da HbS.

Submeteram-se então as misturas reaccionais a centrifugação, a 30 000 rpm, durante 65 minutos, .a-30° jC,-mm..mtcu:...Beckmanli-SW55.TL..Ee&se.-uma. amostragem do sobrenadante de cada mistura em multiplicados e diluiu-se 1:200 em solução Drabkins (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) e mediu--se.. a- absorvência .da.mistura di luída a .540. nm. Calculou-se. a..eoneentração de HbS no sobrenadante, de acordo com a fórmula seguinte:

HbS conc. = 1,61 x 200 x absorvência a 540 nm / 11 = 29,32 x absorvência.

Representaram-se os perfis de solubilidade usando como eixo X a concentração do.....ligando, de ensaia (mM)e. .como. eixo Y. _a, €.§λτ (a concentração de HbS no sobrenadante em g/dl). (A Csat em ligando 0 mM deverá ser de cerca de 16-18%). Obteve-se então a inclinação de cada diagrama (dy/dx g/dl M),..bem_como-a proporçãodajcada .inclinação para os compostos de controlo (L-Phe e Trp). As inclinações são directamente proporcionais à eficácia molar na inibição da congelação. B. Resultados:

Dos 23 compostos identificados usando os processos da presente invenção, 19 compostos-revelaram actividade detectável.na. inibição, da congelação. da HhS. .A Figura 12 mostra as estruturas e as fontes comerciais para estes compostos e indica as suas actividades relativamente ao Trp. Treze destes compostos exibiram uma actividade.de anti^congelação, pelo.menos, igual à da Trp,....

Por exemplo, a bacitrâcina de zinco (designada por ST56 na Figura 12) é 5 vezes tão eficaz quanto a T.-Trp.na inibição, da polimerização da HbS,. Para investigar as propriedades da ligação do ligando da bacitracina de Zinco, testaram-se a Bacitracina e Cloreto de Zinco (ZnCl2), individualmente, no ensaio dé ligação da hemoglobina S descrito no Exemplo 12 (Figura 13), Enquanto que a bacitracina livre de zinco é inactiva, a ZnCh sozinha tem uma actividade equivalente à da bacitracina de zinco. Assim, o Zn^ é um ligando de hemoglobina e a bacitracina 44 livre de zinco não é. O próprio complexo de bacitracina de zinco pode ser um .ligando da hemoglobina ou. .a. jsua. actividada poda diminuir, .somente para a libertação de Zn * do complexo.

Sem querer ficar ligado por teoria, crê-se que a falta de actividade nos restantes oito compostos-poda-ser. davida$..palo. menos em parta.,. à..sua.limitada.sol.uhilidada em concentrações milimolares que são necessárias no ensaio de congelação.

Em resumo, os processos da presente invenção foram bem sucedidos na . identificação-de um número discreto deiigandos .de HhS-de.entre 40.0.0.0. iigandos de ensaio. L“boa· - 4 jul. 2001

Claims (24)

1. r KEIVINPICACÔES ί. Processo para ο varrimento rápido e em larga escala para identificar um ligando que se ii.ga .a uma proteína alvo pré-determinada, que compreende as fases, seguintes: (a) se seíeccionar como ligandos de ensaio uma pluralidade de compostos não conheci dos por se ligarem à proteína alvo; (b) se incubar cada um dos referidos ligandos de ensaio e a proteína alvo para produzir uma combinação de ensaio; (c) se incubar a proteína alvo na ausência de um ligando de ensaio para produzir uma combinação de controlo. (d) se tratarem as combinações de ensaio e de controlo para fazer com que a .proteína alvo na combinação de controlo se desdobre para uma extensão mensurável; (e) se determinar a extensão em que a proteína alvo ocorre no estado dobrado, no estado desdobrado ou em. ambos,, m combinação de ensaio e na combinação de controlo; (f) se comparar a determinação feita na fase (e) entre as combinações de ensaio e de controlo, em. que se a proteína .alvo se encontrar, presente no estado dobrado, em maior extensão na combinação de ensaio do que na combinação de controlo, o ligando de ensaio é um ligando que se liga à proteína alvo; e (g) se repetirem as fases (b) - (í) com uma pluralidade dos referidos ligandos de ensaioatéser. identificado um.ligaodo quese ligue à .proteína uivo; com a condição de que a fase de tratamento (d) não compreenda um contacto das referidas combinações.xlu ensaio e de controlo com. uma. amostra de fluorescência sensível à conformação. 2 2 Η ι
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação i, em que a operação de tratamento compreende, pelo menos, uma operação de alteração da temperatura, de adição de compostos desnaturantes, e suas combinações.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a operação de tratamento compreende a adição de compostos desnaturantes, sendo os compostos desnaturantes seleccionados do grupo que consiste em ureia, guanidínio e seus sais, detergentes, e suas combinações.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a operação de tratamento inclui suhmelerem-se as combinações de ensaio e de controlo a um aumento de temperatura, fazendo deste modo com que uma fracção detectável do referido alvo exista num estado desdobrado.
5. 5. Processo para o varrimento rápido e em larga escala para identificar um ligando que se liga a uma proteína alvo pré-determinada, que compreende as fases seguintes: (a) se seíeccionar como ligandos de ensaio uma pluralidade de compostos não conhecidos por se ligarem à proteína alvo; (b) se incubar cada um dos referidos ligandos de ensaio e a proteína alvo em condições apropriadas, para que a proteína alvo se desdobre para uma extensão mensurável produzindo, deste modo, uma combinação de ensaio; (c) se incubar a proteína alvo tal como na fase (b), mas na ausência de um ligando de ensaio para produzir uma combinação de controlo. (d) se determinar a extensão em que a proteína alvo ocorre no estado dobrado, no estado desdobrado ou em ambos na combinação de ensaio e na combinação de controlo; 3 3 (e)

   se comparar a determinação feita na fase (d) entre as combinações de ensaio e de controlo, em que se a proteína alvo se encontrar presente no estado dobrado em maior extensão na combinação de ensaio do que na combinação de controlo, o ligando de ensaio é um ligando que se iiga à proteína alvo; e (f) se repetirem as fases (b) - (e) com uma pluralidade dos referidos iigandos de ensaio até ser identificado um ligando que se ligue à proteína alvo; com a condição de que as fases de incubação (b) e (c) não compreendam um contacto das referidas combinações de ensaio e de controlo com uma amostra de fluorescência sensível à conformação.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o ligando se liga a resíduos de amino ácidos superficiais ou internos ou a domínios de conformação da proteína alvo.
7. 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, em que a fase de determinação compreende submeterem-se as combinações de ensaio e de controlo a, pelo menos, uma das operações de proteólise; ligação de anticorpos; ligação à superfície; ligação de chaperona molecular; iigação a um ligando conhecido, cofaclor, substracto, ou seu análogo da proteína alvo; espectroseopia de dicroismo circular; espectroseopia de ultravioletas; espectroseopia de fluorescência; calorimetria; e suas combinações.
8. S. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende as fases de; (í) se incubar a proteína alvo, cada um dos referidos iigandos de ensaio e uma ou mais proteases que degradam preferencialmente a proteína alvo no seu estado desdobrado, através do qual a proteína alvo no seu estado desdobrado é preferenciaímente degradada; e (ií) se medir a fracção da proteína aivo degradada ou a fracção da proteína aivo que permanece num estado intacto, em que se a fracção da proteína alvo que permanece no estado intacto na combinação de ensaio for maior do que na combinação de controlo, então o ligando de ensaio é um ligando que se liga à proteína alvo.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende as fases de: (í) se combinar a proteína aivo e cada um dos ligandos de ensaio; (H) se expor a mistura da proteína alvo e do ligando de ensaio a uma superfície que preferencialmente liga a proteína alvo desdobrada, através do qual a proteína alvo desdobrada se liga à superfície; e (iií) se determinar a fracção da proteína aivo ligada à superfície ou a fracção da proteína alvo que permanece não-íigada, em que se a fracção da proteína alvo que permanece não-ligada for maior na combinação de ensaio, do que na combinação de controlo, então o ligando de ensaio é um ligando que se liga à proteína alvo.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende as fases de: (í) se combinar a proteína aivo e cada um dos referidos ligandos de ensaio numa superfície à qual ficou imobilizado um ligando conhecido da proteína alvo; e (ií) se determinar a fracção da proteína alvo ligada à superfície ou a fracção da proteína alvo que permanece não ligada, em que a fracção da proteína alvo ligada à superfície é maior na combinação de ensaio do que na combinação de controlo, o ligando de ensaio é um iigando que se liga à proteína aivo. 5
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende o uso de anticorpos que distinguem entre a forma dobrada e a forma desdobrada da proteína alvo.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação II, em que a fase de determinação compreende as fases de: (í) se revestir uma superfície com um anticorpo específico direccionado contra o estado desnaturado da proteína alvo; (H) se incubar a proteína alvo na presença de cada um dos referidos iigandos de ensaio na superfície; e (iii) se determinar a fracção da proteína aivo ligada ou não ligada à superfície.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação II, em que a fase de determinação compreende as fases de: (í) se revestir uma superfície com um anticorpo capaz de ligar a proteína alvo no seu estado natural ou no seu estado desnaturado; (ií) se incubar a proteína alvo na presença de cada um dos referidos iigandos de ensaio e um anticorpo capaz de ligar a proteína alvo no seu estado dobrado ou no outro dos seus estados natural e desnaturado; e (iii) se determinar a presença da proteína alvo ligada ou que fica não ligada à superfície,
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende determinar a quantidade de proteína alvo ligada a uma proteína de chaperona molecular ou não ligada a uma proteína de chaperona molecular. 6
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a fase de determinação compreende as fases de: (i) se revestir uma superfície com uma proteína de chaperona molecular; (ií) se incubar a proteína alvo e cada um dos referidos Iigandos de ensaio na superfície revestida; e (íii) se determinar a quantidade da proteína alvo ligada ou que fíca não ligada à superfície.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a fase de determinação compreende as fases de: ÍO se revestir uma superfície com a proteína alvo num estado desnaturado; (ii) se incubar uma forma purificada da proteína alvo na presença de cada um dos referidos Iigandos de ensaio e uma proteína de chaperona molecular na superfície; e (iií) se determinar a quantidade de qualquer ou ambas a proteína de chaperona molecular e a proteína alvo que ficam não-ligadas ou que se ligam à superfície.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende determinar a formação diferencial de proteína agregada usando um processo seleccionado do grupo que consiste em: (í) se medir a quantidade de proteína agregada; (ií) se medir a quantidade de proteína solúvel e se medir a taxa de formação de proteína agregada. 7
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a referida ligação a um ligando conhecido, cofactor, substracto, ou seus análogos compreende as fases de: (i) se imobiiizar o conhecido ligando, cofactor, substracto, ou seu análogo num suporte sólido; (ií) se expor o suporte sólido às combinações de ensaio e de controlo, em condições em que a proteína alvo no seu estado dobrado se liga ao suporte; e (iii) se determinar a fracção da proteína alvo ligada ao suporte nas combinações de ensaio e de controlo, sendo o ligando qualquer ligando de ensaio que provoque um aumento ou uma diminuição na referida fracção na combinação de ensaio em relação à referida fracção na combinação de controlo.
19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que as proteases da fase de incubação são seleccionadas do grupo que consiste em proteinaseK, termolisina, e suas combinações.
20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a fase de medição compreende submeterem-se as combinações de ensaio e de controlo a electroforese de gel de poliacrilamida desnaturante.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a fase de determinação compreende as fases de: (í) se revestir uma superfície com um anti-soro capaz de se ligar à proteína alvo dobrada; 8 (Μ) se incubar a proteína alvo na presença de uma chaperona molecular e cada um dos referidos ligandos de ensaio na superfície; e (iii) se determinar a quantidade da proteína alvo que se liga ou que permanece não ligada à superfície.
22. 22. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-21, em que a proteína alvo na combinação de controlo se desdobra irreversivelmente.
23. 23. Processo de acordo com quaiquer das reivindicações 1-21, em que a proteína alvo na combinação de controlo se desdobra reversivelmente.
24. 24. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-23, em que a proteína alvo é seleecionada do grupo que consiste em anidrase carbónica, elastase de neutrófilos humanos, hemoglobina humana, di-hidrofolato reductase e proteína HIVRev. Lisboa, - ^ jyt. 2001