ES2217433T3 - Derivados de 5-hidroxitriptofol (5-htol), anticuerpos, inmunoensayos y detencion de consumo reciente de alcohol. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO ESPECIFICO PARA UN COMPUESTO DE 5 - HTOL. SE DESCRIBE ASIMISMO UN GLUCURONIDO CON 5 - HIDROXITRIPTOFOL (5 - HTOL), CARACTERIZADO PORQUE COMPRENDE LA ESTRUCTURA DEL BE - GLUCURONIDO ENTRE EL GRUPO 5 - HID ROXI DEL 5 - HTOL Y EL ACIDO D - GLUCOPIRANOSIDURONICO. SE PRESENTA TAMBIEN UN INMUNOENSAYO Y UN METODO DIAGNOSTICO QUE EMPLEA DICHO INMUNOENSAYO, EN EL CUAL SE DETECTA LA PRESENCIA DE UN COMPUESTO 5 - HIDROXITRIPTOFOL (5 - HTOL), UTILIZANDO UN ANTICUERPO ESPECIFICO PARA DICHO COMPUESTO.

Description

Derivados de 5-hidroxitriptofol(5-HTOL), anticuerpos, inmunoensayos y detención de consumo reciente de alcohol.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo que se puede usar en inmunoensayos de componentes que reflejan los niveles de 5-hidroxitriptofol[5-HTOL = alcohol 2-(5-hidroxi-3-indolil)etílico] en líquidos corporales. El 5-HTOL libre y sus conjugados de glucurónico y sulfato son marcadores conocidos para la ingestión reciente de alcohol en seres humanos. Otros aspectos de la invención son los indicados en el título.

Antecedentes de la técnica

El 5-hidroxitriptofol (5-HTOL) y ácido 5-hidroxiindol-3-acético (5-HIAA) son metabolitos humanos de la serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) a través del producto intermedio común el 5-hidroxiindol-3-acetaldehído (5-HIAL). El 5-HTOL es excretado en la orina donde se encuentra principalmente conjugado con ácido glucurónico (T-5-G (o GHTOL), 75-95%), y en menor grado, en forma libre o conjugado como un sulfato. El 5-HIAA también es excretado en la orina. Después del consumo de alcohol, el nivel de 5-HTOL en diferentes líquidos corporales aumentará a partir de los valores normales que para la orina están en el intervalo de 40-650 nmol/l. La relación de 5-HTOL/5-HIAA aumentará simultáneamente a partir de los valores normales que son < 0,01 (o < 10 si se expresan en picomolar/nanomolar). El aumento tanto del nivel de 5-HTOL como de la relación 5-HTOL/5-HIAA persiste durante varias horas después de que el alcohol ha desaparecido del cuerpo. Estos descubrimientos han hecho al 5-HTOL y la relación 5-HTOL/5-HIAA marcadores del consumo reciente de alcohol en el tratamiento de la dependencia del alcohol y en medicina forense, por ejemplo durante el examen del cuerpo post-mortem. Se ha preferido la medición de la relación, porque los niveles de 5-HTOL, pero no la relación, aumentan también después de la ingestión de comida rica en serotonina, y porque el intervalo de los niveles normales y anormales del 5-HTOL, pero no de las relaciones, se superponen. Como alternativa también se ha usado la relación entre el 5-HTOL urinario y otros productos de excreción urinaria, tales como la creatinina.

El término "5-HTOL" incluye compuestos de 5-HTOL, tales como 5-HTOL libre, su glucurónido (triptofol-5-glucurónido, T-5-G) y su sulfato, si no se especifica lo contrario.

Los niveles altos de compuestos de 5-HTOL después del consumo de alcohol se han detectado hasta ahora en la orina, plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR). Lo más probable es que se puedan detectar compuestos de 5-HTOL también en el suero, líquido lagrimal, sudor, saliva etc. El nivel normal de los compuestos de 5-HTOL y el equilibrio entre el 5-HTOL libre y sus formas conjugadas puede ser diferente entre diferentes tipos de muestras.

Comparado con el 5-HIAA, el 5-HTOL es complicado de medir. Se encuentra en menores concentraciones que el 5-HIAA y las formas conjugadas están en mayor cantidad con un fuerte predominio del glucurónido. El método usado actualmente para medir el 5-HTOL es la cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas (CG/EM), un método que requiere instrumentos caros. Se ha desarrollado un método de cromatografía líquida (HPLC) pero tiene el inconveniente de los "picos falsos", es decir superposición del Rf del 5-HTOL y otros compuestos. Ambos métodos requieren que el glucurónido (T-5-G) sea convertido enzimáticamente en el 5-HTOL libre antes del ensayo. Por lo tanto es necesario un método barato, sencillo y fiable para medir los compuestos de 5-HTOL en diferentes líquidos corporales.

Para artículos anteriores publicados en el campo de la invención, véase la lista separada al final de la parte descriptiva.

También se puede hacer referencia a Debadie et al., Synapse 14: 178-183 (1993), lijima et al., Acta Histochem 89: 141-156 (1990), documento US-A-4762781 (Geffard) y documento EP-A-216162 (A/S De Danske Sukkerfabrikker).

Objetivos de la presente invención

El objetivo principal de la invención es proporcionar un método de inmunoensayo para medir un compuesto de 5-HTOL en muestras que contienen 5-HTOL libre junto con sus conjugados sin la hidrólisis previa de los conjugados de 5-HTOL endógenos.

Un segundo objetivo es proporcionar un anticuerpo que permita un inmunoensayo de un compuesto de 5-HTOL.

Un tercer objetivo es proporcionar derivados de T-5-G que se puedan usar como inmunógenos o como análogos de 5-HTOL que mimeticen la estructura del correspondiente compuesto de 5-HTOL nativo en diferentes ensayos, por ejemplo, inmunoensayos competitivos para compuestos de 5-HTOL.

El descubrimiento detrás de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de que se pueden obtener anticuerpos que se unen a un compuesto de 5-HTOL consiguiendo una respuesta inmune humoral en los animales adecuados, usando una forma inmunogénica del \beta-glucurónido del 5-HTOL y ácido D-glucopiranosidurónico (es decir, una forma inmunogénica del ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-O-\beta-D-glucopiranosidurónico) como inmunógeno.

Preparación de anticuerpo de la invención

Así, visto desde un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo específico para el 5-hidroxitriptofol o uno de sus conjugados.

Por el término "específico" se entiende que el anticuerpo durante las condiciones del inmunoensayo se une preferiblemente a un compuesto de 5-HTOL sin alterar la actividad de unión con otras sustancias endógenas en muestras humanas, por ejemplo serotonina (5-HT), 5-HIAA u otras sustancias estructuralmente relacionadas, tales como otros índoles o glucurónidos. En el modo actualmente preferido, la preparación del anticuerpo de la invención se une preferiblemente a T-5-G comparado con otros compuestos de 5-HTOL endógenos. La preparación del anticuerpo tiene una actividad de unión baja aceptable con potenciales sustancias alterantes, tales como otros índoles y glucurónidos, que pueden estar presentes en líquidos corporales. Véase la parte experimental.

Puesto que los niveles de 5-HTOL libre, T-5-G y 5-HTOL sulfatado son todos elevados como consecuencia de la ingestión reciente de alcohol, los anticuerpos útiles pueden reaccionar con uno, dos o todos estos compuestos de 5-HTOL.

El término anticuerpo abarca diferentes preparaciones de anticuerpos que tienen la especificidad antes mencionada, tal como el anticuerpo intacto y diferentes fragmentos activos (fragmentos de unión al antígeno/hapteno), tales como Fab, Fab', Fv, F(ab')_{2} etc. También cubre anticuerpos derivatizados, tales como anticuerpos a los que se han unido covalentemente marcadores, tales como biotina, hapteno, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores, fluoróforos, agentes quimiolumiscentes, cromóforos, isótopos radiactivos, metales, partículas, etc., y moléculas vehículo, tales como polímeros insolubles y solubles.

El anticuerpo de la invención puede ser una preparación policlonal o monoclonal. Puede contener una mezcla de un número definido de monoclonales. Se puede obtener por métodos conocidos comunes, excepto que deben usarse los nuevos derivados (conjugados) T-5-G, por ejemplo como inmunógeno para conseguir anticuerpos policlonales, o como antígeno para el cribado de la respuesta inmune o de líneas celulares (por ejemplo, hibridomas) que segregan el anticuerpo de la invención, o de diferentes bibliotecas de anticuerpos a partir de las cuales se puede aislar cada componente de anticuerpo individual junto con la correspondiente secuencia codificante. Por lo tanto, las técnicas contempladas también abarcan los anticuerpos obtenidos por selección mediante técnicas de presentación de fago. Una vez obtenida, la preparación de anticuerpo de la invención se puede modificar por técnicas recombinantes.

El mejor modo en la fecha de prioridad para obtener la preparación de anticuerpo de la invención se da en la sección experimental, y usa como inmunógeno el conjugado entre hemocianina de lapa californiana (KLH) y T-5-G como se define en el ejemplo 3 de la patente (esquema de reacción 2), y la selección de los clones de hibridoma adecuados como se describe en la sección experimental. Así, el anticuerpo del mejor modo de la invención se une preferiblemente a T-5-G entre diferentes compuestos de 5-HTOL presentes en muestras naturales.

Análogos de 5-HTOL de la invención

Visto desde otro aspecto, la invención proporciona un derivado del ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-O-\beta-D-glucopiranosidurónico, que comprende un marcador unido covalentemente, detectable por medios analíticos.

El ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-O-\beta-D-glucopiranosidurónico se puede derivatizar opcionalmente en uno o más OH en la parte de carbohidrato, es decir, en un grupo hidroxi alcohólico (posiciones 2, 3 y 4) o en el grupo carboxi (posición 6) o en el hidroxilo del 3-hidroxietilo o en el nitrógeno indólico.

La derivatización de la estructura de 5-T-G se hace con el fin de introducir un grupo covalentemente unido detectable por medios analíticos, preferiblemente por el grupo carboxi. El grupo detectable por medios analíticos puede ser del mismo tipo que el discutido para los anticuerpos de la invención, véase antes.

La derivatización en el grupo hidroxi del alcohol se puede llevar a cabo como se hace normalmente para los derivados de glucurónidos, por ejemplo, por alquilación o acilación selectiva en las posiciones 2, 3 y/o 4, antes o después de la formación del glucurónido con el 5-HTOL libre. La derivatización en el grupo carboxi del glucurónido o del ácido glucurónico libre puede conducir a amidas y ésteres en los que el grupo carboxi está adicionalmente derivatizado. Véase la parte experimental.

El T-5-G también se puede derivatizar en el grupo carboxi para que contenga una molécula vehículo unida covalentemente, preferiblemente de naturaleza polímera, por ejemplo, un vehículo de proteína inmunogénico, tal como albúmina de suero humano o bovino, KLH o similares, o un polímero vehículo (soporte) insoluble o insolubilizable del tipo usado como medio de separación en cromatografía e inmunoensayos (por ejemplo, soportes preparados con polímeros sintéticos, tales como poliestirenos, o con polisacáridos tales como agarosa, dextrano, celulosa, almidón y similares).

Los métodos preferidos para sintetizar los compuestos T-5-G de la invención en la fecha de prioridad son evidentes a partir de la parte experimental.

Aspectos del inmunoensayo de la invención

Visto desde todavía un aspecto adicional, la invención proporciona un inmunoensayo para determinar el 5-hidroxitriptofol o sus conjugados, caracterizado porque una muestra que contiene el 5-hidroxitriptofol o sus conjugados se ensaya con un inmunoensayo que usa un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Dicho inmunoensayo se puede usar como un método de diagnóstico para determinar el consumo reciente de alcohol de un individuo, considerándose un nivel elevado de 5-HTOL o sus conjugados, si se encuentra, como un indicio del consumo reciente de alcohol del individuo. El ensayo también puede implicar ensayar otro compuesto en la misma muestra del individuo, por ejemplo, ácido 5-hidroxiindol-acético (5-HIAA) o creatinina, correlacionándose la relación entre los niveles encontrados de dicho compuesto adicional y el 5-hidroxitriptofol o sus conjugados respectivamente, con el consumo reciente de alcohol del individuo.

Por lo tanto, este aspecto de la invención abarca poner en contacto una muestra que contiene un compuesto de 5-HTOL con el anticuerpo de la invención en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunitario que comprende tanto un compuesto de 5-HTOL como el anticuerpo de la invención. Después las condiciones se seleccionan de modo que la cantidad de complejo formado sea una medida de la cantidad de 5-HTOL en la muestra.

La determinación del complejo se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como el propio complejo o como la disminución de la cantidad de anticuerpo de la invención añadido que no forma complejo.

Un tipo general de inmunoensayo que se puede usar, usa un reaccionante inmunitario marcado que puede formar complejos inmunitarios en una cantidad que está relacionada con la cantidad del compuesto de 5-HTOL presente en la muestra. En principio, el marcador puede ser de los mismos tipos generales indicados antes para los análogos de glucurónido de 5-HTOL y los anticuerpos.

Los inmunoensayos que usan marcadores con frecuencia se dividen en ensayos heterogéneos y homogéneos. Las variantes homogéneas no usan etapa de separación del reaccionante marcado unido al complejo del reaccionante marcado que no forma complejo. Esto hace imprescindible usar un marcador que cambie su señal como consecuencia de la formación del complejo. En las variantes de ensayo heterogéneo, el reaccionante marcado que está unido en un inmunocomplejo se separa físicamente del reaccionante marcado que no está unido en el complejo. Por lo tanto, las variantes heterogéneas no requieren marcadores que cambien su señal debido a la formación de complejo, que significa que también se pueden usar marcadores de isótopos radiactivos.

Todavía otra forma de dividir los inmunoensayos es en variantes competitivas y no competitivas (tipo sándwich). En el primer caso, el compuesto de 5-HTOL que se une al anticuerpo de la invención y presente en la muestra se deja que compita con un análogo de T-5-G por una cantidad limitada de los anticuerpos de la invención (el compuesto de 5-HTOL reactivo con el anticuerpo más el análogo de T-5-G), después de lo cual se determina la cantidad de complejo entre el análogo de T-5-G y el anticuerpo de la invención y se relaciona con la cantidad del compuesto de 5-HTOL en la muestra. El análogo de T-5-G en este caso preferiblemente es un derivado de T-5-G marcado o unido a un vehículo como se ha definido antes. En el caso en el que el análogo de T-5-G sea el reaccionante marcado, el anticuerpo anti-5-HTOL de la invención usado puede estar en forma insolubilizada (por ejemplo unido a un soporte) o en forma soluble. Una alternativa es una variante en la que un análogo de T-5-G insoluble compite con un compuesto de 5-HTOL de la muestra por una cantidad limitada del anticuerpo anti-5-HTOL soluble de la invención.

Las variantes de inmunoensayo preferidas en la fecha de prioridad abarcan los inmunoensayos competitivos heterogéneos como se han descrito antes. Véase también la parte experimental.

Entre las variantes de ensayo que usan reaccionantes no marcados se pueden mencionar técnicas de biosensor donde se produce la unión entre el antígeno/hapteno y los anticuerpos en una superficie.

La muestra puede ser suero, plasma, orina, LCR o cualquier otra muestra que contenga uno o más compuestos de 5-HTOL.

Se pueden aplicar las condiciones de temperatura y pH que son normales para los inmunoensayos, es decir, 0-40ºC, con preferencia 15-35ºC, y pH 4-9, con preferencia pH 5-8.

El resultado de los inmunoensayos de la invención se puede usar en métodos de diagnóstico para determinar el consumo reciente de alcohol de un individuo, de la misma forma que la hecha antes para los compuestos de 5-HTOL (véase la parte introductoria). Esto significa que en las variantes preferidas de la invención, los métodos de diagnóstico encuentran niveles de los compuestos de 5-HTOL que se pueden relacionar con algún otro compuesto, por ejemplo, los niveles de 5-HIAA o creatinina. Para inmunoensayos, la cantidad de inmunocomplejo formado o cualquier otra medición de la cantidad de compuestos de 5-HTOL en la muestra, por supuesto, se puede relacionar directamente con el consumo reciente de alcohol igualmente bien que el nivel de un compuesto de 5-HTOL como tal. El método de diagnóstico está particularmente bien adaptado a individuos humanos.

Parte experimental Síntesis Ejemplo 1 Síntesis y purificación del ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosidurónico (I)

Esquema 1

Se añadieron alcohol 2-(5-hidroxi-3-indolil)etílico (151 mg), MgCl_{2} (50 mg), sal triamónica del ácido uridina-5'-difosfoglucurónico (490 mg), uridina-5'-difosfoglucuronil-transferasa (182 mg) (Tipo III de hígado bovino, Sigma) y 40 ml de tampón Tris 0,1 M pH 7,4, a un matraz-E de 200 ml. El matraz se cerró con Parafilm y se incubó en un incubador-agitador a 37ºC y 150 rpm. Se extrajeron muestras pequeñas de la incubación en diferentes puntos de tiempo, y se analizaron después de enfriar, centrifugar, filtrar y acidificar, por PepRPC analítica en un sistema de FPLC, con el fin de seguir la reacción. La concentración de ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosidurónico (I) alcanzó niveles constantes después de 20 h y permaneció a esta nivel durante 7 h más.

La incubación se paró en hielo durante 15 min, seguido de centrifugación a 10000 rpm a 5ºC durante 30 min usando un rotor JA-10 en una centrifugadora Beckman J2-21 M/E. Después el líquido sobrenadante se filtró a través de algodón hidrófilo, y se acidificó por debajo de pH 3 por adición de HCl. Se añadió metanol hasta una concentración final de 2,5%. De esta mezcla se purificó 1/3 cada vez en una columna de Pep-RPC-HR 16/10 en un sistema de agua/metanol. La columna primero se equilibró exhaustivamente con agua. La muestra se aplicó en metanol al 2,5% y se llevó a cabo un gradiente de metanol de 2,5 a 5,5% durante 85 min, y después isocrático durante 60 min, y después un gradiente de metanol de 5,5 a 50% durante 100 min. La velocidad del flujo fue todo el tiempo 3,5 ml/min. El ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-glucopiranosidurónico (I) eluyó en metanol al 5,5%. La mezcla de las fraccione y pureza de las preparaciones se controló por TLC (n-butanol: ácido acético: acetato de etilo: agua, 1:1:1:1). El rendimiento después de purificación fue 65 mg. RMN ^{1}H (D_{2}O) \delta 3,5 (t, 2H), 3,7-3,79 (m, 3H), 3,93 (t, 2H), 4,16 (d, 1H), 5,19 (d, 1H), 7,12 (c, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,44 (d, 1H), 7,45 (d, 1H). J_{1,2} para el H en el ácido glucopiranosidurónico era 7,8 Hz indicando una forma \beta. RMN ^{13}C (D_{2}O) 27, 61, 71, 72, 74, 75, 102, 106, 111, 112, 113, 125, 127, 133, 150, 172. El patrón de los picos de carbono del ácido glucopiranosidurónico está de acuerdo con la forma \beta.

Ejemplo 2 Síntesis del ácido N-(2-piridilditioetil)-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosidurónico (II)

Esquema 1

Se disolvió el ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosidurónico (I) (52 mg, 0,153 mmoles) en 1 ml de DMF (secada con tamices moleculares) en un vial de reacción de 5 ml. Después se añadieron el tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TSTU) (73 mg, 0,243 mmoles) y diisopropiletilamina (84 \mul, 0,456 mmoles). La reacción se llevó a cabo durante 35 min a temperatura ambiente.

Se añadió hidrocloruro de cisteamina-2-piridildisulfuro (72 mg, 0,324 mmoles) a otro vial de reacción seguido de DMF (0,5 ml) y diisopropiletilamina (56 \mul, 0,324 mmoles). A esta solución se añadió el ácido (I) activado con hidroxisuccinimidilo. La reacción se llevó a cabo durante 1 h y después se evaporó a vacío a baja presión dando un aceite. La TLC (n-butanol: acetato de etilo: ácido acético: agua = 1:1:1:1) mostró que la mayor parte del producto (I) había reaccionado. El aceite se disolvió en 3 ml de metanol al 27%, se dividió en tres porciones y se fraccionó en una columna PepRPC-HR 16/10 usando un gradiente de metanol al 25-60% que contenía ácido acético al 0,2%, con un caudal de 3,5 ml/min. El producto deseado (II) eluyó en un gradiente de metanol al 43% que contenía ácido acético al 0,2%. Se juntaron las fracciones con el producto (II) y se concentraron por evaporación a vacío y finalmente se liofilizaron dando 26 mg de (II) en forma de un polvo blanco. RMN ^{1}H (D_{2}O) \delta 2,98 (t, 2H), 3,01-3,12 (m, 2H), 3,54-3,63 (m, 2H), 3,71-3,77 (m, 3H), 3,87 (t, 2H), 3,97-4,01 (m, 1H), 5,22 (d, 1H), 7,14-7,17 (m, 2H), 7,24 (s, 1H), 7,42 (t, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,48 (s, 2H), 8,3 (d, 1H).

Ejemplo 3 Síntesis del conjugado de KLH (III)

Esquema 2

Se disolvió hemocianina de lapa californiana (KLH) (73,5 mg) en 6,5 ml de tampón de borato 0,1 M manteniendo el pH a 9,5. Se separó la sustancia sin disolver por filtración y se analizó el contenido de proteína de la solución por análisis de aminoácidos, siendo 37 mg/ml de proteína. A esta solución helada de KLH se añadieron 0,8 ml de una solución de un anhídrido mixto del ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosidurónico (0,025 mmoles). Este compuesto se preparó disolviendo ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosidurónico (I) (10,6 mg, 0,0312 mmoles) en 1 ml de tetrahidrofurano en un vial de reacción de 5 ml. Se introdujo nitrógeno gaseoso en el vial y éste se puso en un baño de hielo. Después de 15 min, se añadieron cloroformiato de isobutilo (4,1 \mul, 0,0312 mmoles) y trietilamina (4,3 \mul, 0,0312), y la reacción del ácido (I) y el cloroformiato de isobutilo se había completado en 30 min a 0ºC. La reacción entre el KLH y el anhídrido se llevó a cabo durante 20 min a 0ºC, y después se puso en un frigorífico toda la noche. El tetrahidrofurano se separó en un evaporador a vacío y la solución de la reacción (4,8 ml) se separó en dos columnas Sephadex G25 M PD-10, que se equilibraron con tampón de fosfato 2 mM pH 7,5. El conjugado se eluyó con 3,2 ml de tampón. El volumen total eran 6,4 ml. Se determinó que el contenido de proteína era 3,04 mg/ml por análisis de aminoácidos. El grado de sustitución se determinó que era 270 compuestos (I) por KLH, por espectroscópia UV (PM calculado 3.000.000).

Ejemplo 4 Síntesis del conjugado de HSA (IV)

Esquema 3

Se disolvió albúmina de suero humano (HSA) (28,5 mg, 0,425 \mumoles) en 1,73 ml de tampón de fosfato 0,2 M manteniendo el pH a 8,5. A esta solución se añadió 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (2,0 mg, 6,38 \mumoles) en 0,178 ml de etanol. La reacción se llevó a cabo durante 15 min y después el pH se ajustó a 4,35 con ácido acético concentrado 2 M. Se añadió ditiotreitol (5,7 mg) para reducir el enlace disulfuro. La reacción se llevó a cabo durante 10 min y después la solución de la reacción se desaló en una columna Sephadex G25 M PD-10. La proteína se eluyó con 2,4 ml de tampón de fosfato 5 mM manteniendo el pH a 4,5 y que contenía cloruro sódico 0,3 M. El conjugado de HSA se analizó y contenía 6,7 SH/HSA y el contenido de proteína era 10,34 mg/ml.

A esta solución de conjugado de HSA (2,48 \mumoles de grupos SH) se añadió N-(2-piridilditioetil)-3-(2-hidroxietil)indol-5-il-O-\beta-D-glucopiranosiduronamida (II) (1,9 mg, 3,72 \mumoles) disuelta en 0,216 ml de acetonitrílo. El pH se ajustó a 8,45. La reacción se llevó a cabo durante 24 h a temperatura ambiente y después se fraccionó en dos columnas Sephadex G25 M PD-10 equilibradas con tampón de fosfato 50 mM, pH 7,4. El conjugado se eluyó con 3,9 ml de tampón.

Ejemplo 5 Marcaje con ^{125}I del conjugado de HSA IV

El marcaje con ^{125}I se llevó a cabo con el método de la cloramina-T (Greenwood F.C. et al., Biochem. J. 89 (1963) 114-123).

Anticuerpos Inmunógenos

Tipo 1: Se obtuvo reduciendo el compuesto II con NaBH_{4} y después haciendo reaccionar el derivado reducido con [17-((yodoacetil)amino)-3,6,9,12,12-pentaoxaheptadecanoil]amino-KLH o [17-((yodoacetil)amino)-3,6,9,12,12-pentaoxaheptadecanoil]amino-HSA (Akerblom et al., Bioconjugate Chemistry 4 (1993) 455-466) para dar el Conjugado A y B respectivamente.

Tipo 2: El Conjugado C es el conjugado de HSA IV.

Tipo 3: El conjugado D y el conjugado E corresponden al conjugado III con KLH (270 T-5-G por mol de KLH) y HSA (2,5 grupos de T-5-G por mol de HSA), respectivamente.

Inmunizaciones

Tipo 1: Se cebaron cinco ratones Balb/C con 50 \mug de inmunógeno (conjugado A) en adyuvante completo de Freund (FCA). Las inyecciones posteriores se dieron cada cuatro semanas sin adyuvante (4 x 50 \mug).

Tipo 2: Se cebaron dos ratones Balb/c con 25 \mug de inmunógeno (conjugado C) en adyuvante completo de Freund (FCA) y se reforzaron cada cuatro semanas sin adyuvante (4 x 50 \mug).

Tipo 3: Se cebaron tres grupos de tres ratones Balb/c en cada grupo con 50 \mug de inmunógeno (conjugado D) en FCA y se reforzaron después de cuatro semanas con 50 \mug sin adyuvante, y con 50 \mug de conjugado D después de cuatro semanas adicionales.

Respuesta inmune: Ésta se ensayó por ELISA (véase a continuación) e inhibición de ELISA (véase a continuación, especificidad). Los dieciséis ratones dieron una valoración alta en ELISA, pero sólo se pudo inhibir la unión al derivado T-5-G revestido en las paredes de los pocillos de microvaloración con T-5-G en cuatro ratones (todos inmunizados de acuerdo con el Tipo 3). Estos cuatro ratones se reforzaron (3 x 25 \mug) el día uno, día dos y día tres y se llevó a cabo la fusión el día cuatro.

Fusiones

Las fusiones se llevaron a cabo con ayuda de polietilenglicol (PEG) y con células de mieloma SP2/0 como pareja de fusión. La suspensión de células se sembró en placas de microvaloración de 96 pocillos y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal al 15% y se seleccionaron con HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). Se usaron macrófagos peritoneales como células abastecedoras. Los líquidos sobrenadantes se cribaron por ELISA (véase a continuación). Los hibridomas positivos se ensayaron en la inhibición de ELISA (véase a continuación) con T-5-G como inhibidor. Las cuatro fusiones dieron como resultado 37 hibridomas y basándose en los resultados de la inhibición de ELISA, se escogieron doce de ellos para clonación.

Clonación y cribado

Clonación: Se sembraron 0,8 células/pocillo en placas de 96 pocillos con macrófagos peritoneales como células abastecedoras. Los pocillos con una célula se observaron el día cinco y se ensayaron de la misma forma que los hibridomas y en la inhibición de ELISA el día siete.

ELISA: Los pocillos de las placas de microvaloración ELISA de 96 pocillos se revistieron con conjugado B para inmunizaciones de tipo 1, y con conjugado E para inmunizaciones de tipo 2 y 3 en carbonato-Na 0,1 M pH 9,5, toda la noche a temperatura ambiente, y después se lavaron 3 veces con NaCl al 0,9% que contenía Tween® 20 al 0,02%. Después se añadieron los líquidos sobrenadantes del cultivo diluidos 1:5 en PBS sin Ca^{2+}/Mg^{2+} que contenía Tween 20 al 0,05%, y las placas se incubaron durante 2 h a 37ºC. Las placas se lavaron otra vez como se ha descrito antes. La unión del anticuerpo se detectó con conjugado de IgFc anti-ratón de conejo Fab'-\beta-galactosidasa y o-nitro-fenil-\beta-galactosidasa como sustrato de la enzima, con 30 min de incubación del sustrato.

Inhibición de ELISA: Esta se llevó a cabo como se ha descrito para ELISA, excepto que los líquidos sobrenadantes de los cultivos se incubaron con T-5-G (1 \mug/pocillo) antes de añadirlos a los pocillos.

Resultados

Seis clones produjeron anticuerpos que se mostró en experimentos de inhibición que eran reactivos contra T-5-G. Uno de éstos, después se estudió más en reactividad cruzada.

Reactividades cruzadas

Se midió la reactividad cruzada para diferentes sustancias en el método de inmunoensayo descrito a continuación con diluciones (en el diluyente) de la sustancia ensayada usada en lugar de orina o patrón. El intervalo de concentraciones ensayado para cada sustancia cubría tres magnitudes y era hasta o por encima de una magnitud que era el valor más alto anotado en la bibliografía.

El límite de tolerancia para alterar las actividades de unión de las otras sustancias se mide como inhibición de la reacción entre el conjugado de proteína IV y el anticuerpo de la invención (reactividad cruzada) y se da en relación con la concentración de T-5-G en el límite de detección. Los límites de inhibición aceptables para diferentes sustancias en la orina son evidentes a partir de la Tabla 1 para un límite de detección 50 nM del T-5-G.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1 Orina

Sustancias potencialmente alterantes, sus concentraciones más altas y máxima reactividad cruzada permitida.

1

El anticuerpo ensayado para la reactividad cruzada cumple los criterios expuestos en la tabla 1.

Inmunoensayo

Materiales: El ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-O-\beta-D-glucopiranosidurónico, conjugado de T-5-G-HSA marcado con ^{125}I (conjugado IV, esquema 3) y anticuerpo anti-5-HTOL monoclonal de ratón conseguido contra un conjugado de T-5-G-KLH (conjugado III, Esquema 2), se han descrito todos antes. El diluyente era tampón de fosfato sódico 0,05 M, pH 7,0, que contenía EDTA 0,01 M, Tween® al 0,1%, y BSA al 1%. La solución de decantación era suspensión de decantación de Pharmacia sin suspensión de anticuerpo añadida (Pharmacia Diagnostics AB). \mu-Partículas de agarosa llevaban unido covalentemente anticuerpo anti-ratón de oveja.

Ensayo principal: Competición entre muestra de T-5-G y el conjugado IV marcado, por una cantidad limitada de anticuerpo anti-5-HTOL de ratón con posterior precipitación por adición de anticuerpo anti-ratón de oveja unido a \mu-partículas de agarosa.

Procedimiento de ensayo: Se pipetea en un tubo de ensayo 50 \mul de orina o patrón, 50 \mul de solución trazadora, 50 \mul de solución de anticuerpo (uno de los seis clones seleccionados antes mencionados, 5 \mug/ml), se mezcla en un agitador \sim 600 rpm durante \sim 1 min, se deja reposar durante 1,5 h a temperatura ambiente, se mezclan como antes 50 \mul de la suspensión de anti-ratón de oveja en micro-agarosa (\sim 100 mg/ml), y se deja reposar durante otras 0,5 h, después se añaden 2 ml de solución de decantación, se centrifuga 10 min a 3000 rpm con tubos en rejillas de decantación de Pharmacia, en la rejilla del Rotor JR-3.2 en una centrifugadora Beckman J-6B. A los 5 min después de completar la centrifugación se decanta el líquido sobrenadante y se deja la rejilla de tubos reposar invertida en tejido absorbente durante 2 min. Finalmente la radiactividad que queda en los tubos se mide en un contador gamma. Se hace una curva patrón con T-5-G en el diluyente con 10, 100, 1000 y 10000 nmol/l.

Como ejemplo, en la Tabla 2A se muestran los resultados de un ensayo con autoinformes de voluntarios de consumo de alcohol por la mañana en la orina. Las muestras de orina se mantuvieron congeladas a -70ºC hasta su uso, después de descongelar las muestras, se centrifugaron brevemente antes del análisis, todas las muestras se analizaron por duplicado. Los análisis de creatinina se hicieron de acuerdo con Jaffé.

TABLA 2A Ingestión de alcohol frente a la relación de GHTO nM/creatinina nM en la orina. Hombres.

2

Referencias Publicaciones de los autores de la invención

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2. Beck et al., Concentration of serotonin metabolites in the cerebrospinal fluid from alcoholics before and during disulfiram therapy. Acta Pharmacol. Toxicol. 47 (1980) 305-307.

3. Beck et al., 5-Hydroxytryptophol in the cerebrospinal fluid and urine of alcoholics and healthy subjects. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 321 (1982) 293-297.

4. Beck et al., 5-Hydroxyindoleacetic acid and 5-hydroxytryptophol levels in rat brain: effects of ethanol, pyrazole, cyanamide and disulfiram treatment. Drug and Alcohol Dependence 16 (1986) 303-308.

5. Helander et al., Effects of ethanol, acetaldehyde and disulfiram on the metabolism of biogenic aldehydes in isolated human blood cells and platelets. Biochem. Pharmacol. 36 (1987) 3981-3985.

6. Helander et al., Determination of urinary 5-hydroxyindole-3-acetic acid by high-performance liquid chromatography with electro detection and direct sample injection. Anal. Biochem.196 (1991) 170-173.

7. Borg et al., Carbohydrate deficient transferrin and 5-hydroxytryptophol: two new markers of high alcohol consumption. In: Measuring Alcohol Consumption (Eds. Litten et al), 149-159 (1992) Humana Press Inc, Clifton, NJ.

8. Helander et al., Urinary excretion of 5-hydroxyindole-3-acetic acid and 5-hydroxytryptophol after oral loading with serotonin. Life Sciences 50 (1992) 1207-1213.

9. Helander et al., Determination of elevated 5-hydroxytryptophol levels in urine using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chrom. Biomed. Appl. 579 (1992) 340-345.

10. Helander et al., Urinary 5HTOL/5HIAA as biochemical marker of postmortem ethanol synthesis (Letter). Lancet 340 (1992) 1159.

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12. Helander et al., Time course of ethanol-induced changes in serotonin metabolism. Life Sciences 53 (1993) 847-855.

13. Voltaire-Carlsson et al., Detection of relapses in alcohol-dependent patients: comparison of carbohydrate-deficient transferrin in serum, 5-hydroxytryptophol in urine, and self-reports. Alcoholism: Clin. Exp. Res. 17 (1993) 703-708.

14. Helander et al., Influence of genetic variation in alcohol and aldehyde dehydrogenase on serotonin metabolism. Life Sciences 55 (1994) 359-366.

15. Helander et al., The use of 5-hydroxytryptophol as an alcohol intake marker. Alcohol & Alcoholism 2 (suppl) (1994) 497-502.

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17. Borg et al., New markers of alcohol consumption: CDT and 5HTOL. Advances in Neuroscience (Proceedings of the IX World Congress of Psychiatry) (Ed. Beigel) 1:3-7 (1995).

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19. Helander et al., Distinguishing ingested ethanol from microbial formation by analyzing urinary 5-hydroxytryptophol and 5-hydroxyindole acetic acid. J. For. Sci. 40 (1995) 95-98.

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21. Helander et al., Determination of 5-hydroxytryptophol in urine by high-performance liquid chromatography: application of a new post-column derivatization method with fluorometric detection. J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 13 (1995) 651-654.

22. Helander et al., Longitudal comparison of carbohydrate-deficient transferrin and \gamma-glutamyltransferase: complementary markers of excessive alcohol consumption. Alcohol & Alcoholism 31 (1996) 101-107.

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24. Helander et al., Laboratory testing for recent alcohol consumption: comparison of ethanol, methanol, and 5-hydroxytryptophol. Clin. Chem. 42 (1996) in press.

Publicaciones de posible interés

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28. Yoshimoto et al., Occurrence in vivo of 5-hydroxytryptophol in the brain of rats treated with ethanol. Alcohol & Alcoholism 27 (1992) 131-136.

Artículos de revisión

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30. Conigrave et al., Diagnostic tests for alcohol consumption. Alcohol & Alcoholism 30 (1995) 13-26.

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Claims (12)

1. Un anticuerpo específico para el 5-hidroxitriptofol o uno de sus conjugados.

2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, específico para un conjugado de glucurónido o sulfato de 5-hidroxitriptofol.

3. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que se une preferiblemente a un conjugado de glucurónido de 5-hidroxitriptofol comparado con el 5-hidroxitriptofol libre u otros conjugados de 5-hidroxitriptofol presentes en la orina.

4. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que no tiene actividad de unión significativa con respecto a otros indoles o glucurónidos presentes en muestras humanas.

5. Un derivado de ácido 3-(2-hidroxietil)indol-5-O-\beta-D-glucopiranosidurónico que comprende un marcador covalentemente unido detectable por medios analíticos.

6. Un derivado según la reivindicación 5, en el que dicho marcador está unido al grupo carboxi.

7. Un inmunoensayo para determinar el 5-hidroxitriptofol o sus conjugados, caracterizado porque una muestra que contiene 5-hidroxitriptofol o sus conjugados, se ensaya con un inmunoensayo que usa un anticuerpo como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Un inmunoensayo según la reivindicación 7, en el que dicha muestra es orina.

9. Un inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, que es un ensayo competitivo.

10. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que se lleva a cabo en una muestra obtenida de un individuo, y en el que un nivel elevado de 5-hidroxitriptofol o sus conjugados ensayados, si se encuentra, se considera indicio del consumo reciente de alcohol del individuo.

11. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que se lleva a cabo en una muestra obtenida de un individuo, en el que se ensaya un compuesto adicional en la misma muestra, y en el que la relación entre los niveles encontrados de dicho compuesto adicional y el 5-hidroxitriptofol o sus conjugados respectivamente, se correlaciona con el consumo reciente de alcohol del individuo.

12. Un inmunoensayo según la reivindicación 11, en el que dicho compuesto adicional se selecciona de ácido 5-hidroxiindol-acético (5-HIAA) y creatinina.