FR2664904A1 - Moyens pour le diagnostic d'acide thioctique et d'anticorps anti-acide thioctique et applications biologiques. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec l'acide thioctique sous forme oxydée en donnant lieu à un complexe du type antigène-anticorps et des produits de couplage, soit d'anticorps monoclonaux anti-acide thioctique, soit de l'acide thioctique, fixé directement ou indirectement sur un support insoluble. Ces produits de couplage sont utiles pour le diagnostic respectivement de la présence d'acide thioctique ou d'anticorps anti-thioctique.

Description

MOYENS POUR LE DIAGNOSTIC D'ACIDE THIOCTIQUE ET
D'ANTICORPS ANTI-ACIDE THIOCTIQUE ET APPLICATIONS
BIOLOGIQUES
L'invention concerne des moyens pour le diagnostic d'acide thioctique (désigné ci-après par TA) et d'anticorps anti-TA. Elle se rapporte plus spécialement à des anticorps polyclonaux et à des anticorps monoclonaux anti-TA ainsi qu'à des dérivés de TA et d'anticorps monoclonaux anti-TA, fixés par covalence sur des supports insolubles.

Elle vise également des méthodes d'obtention de ces dérivés et dés anticorps ainsi que leurs applications biologiques, plus spécialement diagnostiques et thérapeutiques.

On sait que l'acide thioctique, également appelé acide lipoïque, est un facteur de croissance pour de nombreuses bactéries et protozoaires et constitue un coenzyme ou un substrat chez les plantes, les microorganismes et les tissus animaux. Compte tenu de son rôle majeur dans le métabolisme des êtres vivants, on conçoit l'intérêt de le localiser dans les tissus ou les constituants cellulaires et de déterminer sa teneur.

On a constaté que le taux en TA varie notamment dans le cas d'anomalies du métabolisme des acides gras chez les bacteries, ou durant la vie embryonnaire, ou encore dans le cas de pathologies chez 1'homme telles que le diabète ou le cancer où le métabolisme des oxacides est altéré.

Les techniques proposées à ce jour pour déterminer le taux de TA dans un échantillon biologique ou dans les bactéries sont toutefois d'une grande complexité et donc inappropriées pour effectuer des dosages de routine.

I1 s'agit de méthodes de dosage microbiologiques (brevet US 3049549) ou par chromatographie en phase gazeuse (article de White dans Analytical Biochemistry, 110, 89-92, 1981) ou encore de chromatographie en phase gazeuse suivie d'une étude par spectrométrie de masse (article de Pratt et al dans Biochem. J., 258, 749-754, 1989).

Cette dernière technique, qui est le plus généralement utilisée, comprend - l'hydrolyse du matériau, pour libérer TA lié aux protéines, par chauffage en présence de HC1 6 M, à 110 0C pendant 11 h, - l'extraction sélective dans le benzène, - l'isolement de TA extrait par chromatographie sur du gamma-aminophényl arsénoxyde-agarose, - la transformation du thioctate libéré en ester méthylique, - la séparation et la détermination quantitative du thioctate de méthyle par chromatographie en phase gazeuse et spectométrie de masse.

Cette méthode présente au moins deux inconvénients majeurs. D'une part, elle nécessite de grandes quantités de matériau ; d'autre part, pour fournir des indications sur la localisaiton tissulaire de TA, une étape de purification préalable est nécessaire.

Or, cette localisation est importante étant donné le rôle attribué à TA dans le métabolisme d'oxoacide de certaines pathologies comme indiqué ci-dessus.

En ce qui concerne la localisation sub-cellulaire, on a décrit la présence de déshydrogénase lipoamide noncomplexé sur les membranes de Thermoplasma acidophilum et sur celles de Trypanosoma brucci. Mais la présence de TA sur cette enzyme n'a pu être vérifiée en raison de l'effet destructeur de l'étape d'hydrolyse.

La recherche par les inventeurs d'une voie permettant de doser TA avec une grande spécificité mais dans des conditions non destructrices les a conduits à une approche immunologique du problème.

Les travaux effectués ont porté sur l'élaboration de moyens de diagnostic permettant de déterminer qualitativement et quantitativement soit TA, soit des anticorps anti-TA, dans un échantillon biologique par simple réaction de type antigène-anticorps.

L'obtention en particulier d'anticorps monoclonaux anti-TA permet de disposer de moyens de haute spécificité pour déterminer les variations du taux de TA, par exemple dans un état pathologique donné et facilite de nouvelles investigations.

Ces travaux ont également permis de développer des moyens pour la mise en évidence dans le sérum d'anticorps anti-TA et la mesure de la teneur en anticorps.

La détection de la présence d'anticorps anti-TA revêt en effet également un grand intérêt. En poursuivant leurs recherches dans ce domaine, les inventeurs ont constaté que des supports insolubles sur lesquels TA est fixé par covalence constituent des outils de diagnostic particulièrement performants.

On a déjà décrit des produits de couplage de TA fixé par covalence à des supports insolubles tels que
SéphadexR, SépharoseR, cellulose, polyacrylamide et polystyrène (voir Methods in Enzymology, vol. 62, Part D, 1979).

De tels produits sont utilisés en vue de la réduction de liaisons S-S.

Dans Methods of Enzymology, vol. 62, 326, 1979, on rapporte l'utilisation de lipoyl-SépharoseR pour absorber des anticorps liant de la biotine.

En revanche, il n'avait jamais été envisagé d'utiliser de tels produits de couplage pour le diagnostic qualitatif et quantitatif d'anticorps anti-TA, puisque l'existence d'anticorps anti-TA n'avait pas été décrite.

L'étude de produits de ce type en vue de l'élaboration de moyens pour le diagnostic d'anticorps anti-TA a conduit à développer de nouveaux produits de couplage dans lesquels TA est fixé par covalence au support par l'intermédiaire d'un composé tel qu'une protéine, une glycoprotéine, un glycolipide ou un polysaccharide. L'utilisation d'une protéine (PDH.E2) d'origine bactérienne, contenant naturellement TA, pour détecter d'éventuels anticorps anti-mitochondries a déjà été décrite par FUSSEY et la (PNAS, 1990, vol 87, p.3987-3991). Cependant, il s'agit d'une protéine présentant une activité enzymatique. De plus, son utilisation nécessite d'importantes étapes de purification, d'où un coût élevé. Dans cette publication, le PDH.E2 est adsorbé au support de polystyrène et non couplé.

L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens pour le diagnostic de TA constitués par des anticorps monoclonaux anti-TA et des anticorps polyclonaux anti-TA.

Elle a également pour but de fournir des moyens pour le diagnostic d'anticorps polyclonaux anti-TA comprenant
TA fixé sur un support insoluble.

Elle vise également à fournir, en tant que produits nouveaux, des anticorps monoclonaux anti-TA fixés sur des supports insolubles, des dérivés de TA fixés sur des supports insolubles par l'intermédiaire d'un composé ne présentant pas d'activité enzymatique choisi parmi ceux mentionnés ci-dessus et des anticorps anti-TA polyclonaux et monoclonaux.

Les anticorps monoclonaux de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de réagir spécifiquement avec TA soit libre, soit présent dans un constituant biologique sous forme oxydée en donnant lieu à un complexe du type antigène-anticorps.

Leur spécificité vis-à-vis de TA oxydé est telle que dans les conditions d'un immunoessai tel que rapporté dans l'exemple 3, les anticorps ne donnent de réaction qu'avec TA oxydé.

Des anticorps monoclonaux de l'invention sont capables de reconnaître la forme énantiomère R de TA oxydé.

D'autres anticorps monoclonaux sont capables de former un complexe antigène-anticorps avec TA oxydé sous forme S, ce qui pourra permettre de déterminer la proportion d'énantiomère S après synthèse.

D'autres anticorps monoclonaux encore reconnaissent les deux formes R et S de TA oxydé.

Les anticorps monoclonaux entiers de l'invention sont encore caractérisés en ce que - ils appartiennent à la classe des IgM, des IgG ou des
IgA - ils possèdent un PN d'environ 160000 pour les IgG, de l'ordre de 800 à 900000 pour les IgM, et de 160 à 320000 pour les IgA.

L'invention vise également les fragments de ces anticorps monoclonaux.

Elle vise plus spécialement les fragments tels qu'obtenus par digestion enzymatique ou par synthèse peptidique / constitués par la partie Fab (fragment antibody binding ou fragment de liaison de l'anticorps).

L'invention vise en outre tout fragment tel qu'isolé à partir du fragment Fab dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec TA oxydé.

Selon un autre aspect, les anticorps monoclonaux anti-TA de l'invention sont du type des anticorps monoclonaux susceptibles d'être induits par un procédé comprenant les étapes - d'immunisation d'un animal, selon les techniques classiques, avec du TA avantageusement couplé à une substance immunogène, - de fusion de cellules de l'animal productrices d'anticorps dirigés contre TA oxydé avec des cellules de myélome de souris, - de sélection des hybridomes capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis de TA oxydé, - de clonage de ces hybridomes, et - de purification des anticorps monoclonaux tels que produits à partir de liquides d'ascites de souris ou de milieux de culture.

L'immunisation est avantageusement réalisée selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975), Nature, vol 256, p.495.

TA utilisé pour l'immunisation est de manière habituelle couplé à une substance immunogène, par exemple à des protéines, des glycoprotéines, des sucres aminés et des polysaccharides et administré mélangé ou non à un adjuvant tel que l'adjuvant complet de Freund.

Pour l'étape de fusion, on sélectionne avantageusement les rates des animaux présentant le titre en anticorps anti-TA le plus élevé.

La fusion entre les splénocytes et les cellules d'une lignée de myélome non secrétante est effectuée selon le protocole habituel décrit par Kôhler et
Milstein, Nature, 256,495 (1975).

Après l'étape de fusion, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clonés, avantageusement selon la technique classique de dilution limite. On sélectionne selon la technique décrite dans les exemples les clones qui produisent le plus d'anticorps aux fins de culture à grande échelle.

Cette sélection est réalisée en déterminant le titre en anticorps anti-TA des surnageants de culture, et ce en mettant avantageusement en oeuvre la méthode de l'invention qui sera décrite plus loin.

Les cellules hybrides sélectionnées sont récupérées des cultures par exemple par centrifugation et injectées à des animaux, par raison de commodité de préférence à des souris, pour produire des ascites, ou sont mises en culture en fermenteur.

Les anticorps monoclonaux récupérés sont purifiés par chromatographie d'affinité. Des résultats satisfaisants sont obtenus en utilisant une colonne de
Protéine A-SépharoseR.

L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux produits par les clones llB6G5 et 13C5B6 et 22D3D7.

En variante, les anticorps polyclonaux ou monoclonaux sans restriction de l'espèce préparés selon l'invention, sont sélectionnés à l'aide de TA fixé, àpartir d'un pool hétérogène d'immunoglobulines ou encore à partir d'une population hétérogène de lymphocytes sécrétant ces anticorps. Ces lymphocytes sécréteurs peuvent être immortalisés par fusion avec un virus tel que EBV.

L'invention concerne également les souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux définis ci-dessus.

Ces hybridomes sont caractérisés en ce qu'ils sont formés de cellules hybrides résultant de la fusion des cellules de myélome de souris avec une cellule de souris produisant des anticorps, après immunisation de la souris avec TA couplé à la substance immunogène, lesdites cellules hybrides étant capables de produire des anticorps spécifiques anti-TA.

Les clones des hybridomes producteurs d'anticorps présentent l'avantage d'être homogènes sur le plan cellulaire et d'une grande stabilité.

La préparation de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention et comprend les étapes de fusion et de sélection, définies ci-dessus en rapport avec les anticorps monoclonaux.

L'étape d'immunisation d'animaux avec TA avantageusement couplé à une substance immunogène, évoquée ci-dessus pour la préparation d'anticorps monoclonaux, permet d'induire la formation d'anticorps polyclonaux anti-TA.

L'invention vise également les anticorps polyclonaux anti-TA en tant que produits nouveaux.

Ces anticorps sont caractérisés en ce qu'ils sont formés d'une population d'anticorps réagissant spécifiquement avec TA oxydé en donnant lieu à des complexes du type antigène-anticorps.

Outre la voie d'induction expérimentale par injection à un animal d'un immunogène artificiel défini, comportant TA fixé, suivie d'une caractérisation des anticorps à l'aide de TA fixé, les anticorps polyclonaux peuvent être produits par induction naturelle à partir d'immunogènes naturels renfermant TA tel que le complexe
PDH, E2.

L'invention vise encore des lymphocytes secréteurs d'anticorps polyclonaux anti-TA immortalisés par exemple avec un virus tel que EBV.

Les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments tels que définis ci-dessus constituent des outils de grande spécificité pour le diagnostic qualitatif et quantitatif de TA dans les fluides et échantillons biologiques.

L'invention vise donc l'application de ces anticorps monoclonaux ou de leurs fragments pour détecter in vitro la présence de TA dans un échantillon biologique.

Le terme AcM tel qu'utilisé ci-après désigne aussi bien les anticorps monoclonaux anti-TA entiers que leurs fragments tels que définis plus haut.

Dans cette application, l'AcM peut être libre ou immobilisé sur un support
Les produits de couplage comprenant des AcM fixé par covalence à des supports insolubles sont des produits nouveaux et en tant que tels entrent également dans le cadre de l'invention.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'AcM est couplé directement par liaison covalente au support insoluble. On opère avantageusement selon la technique de
QUASH et al, J. Immunol. Nethods, 1978, vol 22, p.165-174.

Selon un autre mode de réalisation, l'AcM est couplé au support insoluble par l'intermédiaire d'un composé, polyfonctionnel, jouant le rôle d'un bras de couplage de longueur appropriée pour maintenir la réactivité de la molécule d'AcM fixée. Le composé intermédiaire est lié par covalence au support et à l'AcM.

Parmi les composés polyfonctionnels préférés, on citera les agents homo ou hétéro bifonctionnels tels que
MBS ou SPDP ; les protéines, y compris les anticorps dirigés contre cet AcM, les polysaccharides, les glycoprotéines ou encore les glycolipides.

Des protéines appropriées comprennent entre autres la gélatine, la sérum albumine et les immunoglobulines.

Le couplage des composés bifonctionnels sur les supports insolubles est avantageusement réalisé selon la technique décrite dans le brevet FR 2331567.

Le composé jouant le rôle de bras peut être le cas échéant adsorbé sur le support insoluble.

Des supports insolubles appropriés pour élaborer les produits de couplage de l'invention comprennent des matériaux macromoléculaires substitués par des groupes fonctionnels susceptibles de réagir avec l'AcM, ou le composé bifonctionnel lorsqu'il est présent.

Comme matériaux macromoléculaires supports utilisables selon l'invention, on citera du polystyrène, du polychlorure de vinylé, du polypropylène, de l'agarose, du polyamide, de l'acide polyacrylique ou méthacrylique et leurs esters, de la cellulose, de noyaux magnétiques ou paramagnétiques enrobés de matériaux macromoléculaires tels que le polystyrène ou des méthacrylates. Ces supports se présentent sous une forme quelconque. Le plus généralement, il s'agit de plaques ou de billes.

Des groupes fonctionnels appropriés pour ces matériaux comportent soit un groupe amine libre, soit un
COOH, soit un OH, soit un SH, soit un phénol.

Le composé bifonctionnel évoqué ci-dessus est le cas échéant adsorbé sur le matériau du support insoluble, jouant le rôle de site d'ancrage.

La détection de TA selon l'invention comprend - la mise en contact de l'échantillon à tester avec une préparation d'AcM immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et - la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre TA et llAcM.

Pour cette mise en évidence, on utilise aux fins de compétition du TA comportant un groupe marqueur. Ce groupe est par exemple une enzyme, un groupe fluorescent un groupe radioactif, ou tout autre groupe utilisable pour un marquage pouvant être révélé.

Le groupe marqueur, conformément à une autre disposition de l'invention est porté par une protéine ou une glycoprotéine liée à TA. Ainsi, la protéine ou la glycoprotéine peut être biotinylée.

Dans ce cas, la présence de TA dans l'échantillon à tester est mise en évidence par une diminution du signal dû au marqueur lié au TA.

Le plus généralement, l'échantillon biologique est mis en contact avec les anticorps immobilisés. Après un temps de contact approprié, les plaques sont lavées pour éliminer les molécules qui n'ont pas réagi. On met ensuite à réagir TA marqué. La détermination des molécules de marqueurs permet de quantifier TA fixé à l'AcM.

Cette méthode de détection de l'invention avec utilisation de l'AcM libre ou immobilisé permet de révéler avec une grande sensibilité la présence de TA dans un échantillon biologique, en particulier de localiser et de quantifier TA lié dans des cellules sur des biopsies de tissus normaux ou pathologiques.

Outre ces applications immunohistologiques, les AcM de l'invention, libres ou immobilisés sont utilisables pour réaliser des diagnostics dans des pathologies ou l'évolution de la maladie modifie le taux de TA, spécialement en cancérologie, virologie et dans les maladies auto-immunes.

L'invention vise également un kit pour le diagnostic in vitro de la présence de TA dans un échantillon biologique.

Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'AcM libre ou immobilisé comme défini ci-dessus, - une préparation de TA avec un groupe marqueur, - un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

Les AcM radiomarqués sont avantageusement utilisés pour détecter TA présent dans les tissus in vivo, ce qui présente un intérêt majeur dans les pathologies évoquées ci-dessus.

Les AcM de l'invention constituent également des agents thérapeutiques de grand intérêt et peuvent jouer le rôle de vecteurs d'enzymes ou de médicaments.

Ils sont ainsi particulièrement utiles pour traiter des patients atteints d'un cancer.

Dans cette application, l'AcM est lié le cas échéant à un agent chimiothérapeutique ou radioactif.

Les formes d'administration et les doses correspondent à celles utilisées de manière classique pour un tel traitement.

Selon encore un autre aspect de l'invention, les anticorps monoclonaux de l'invention sont utilisés pour détecter des anticorps anti-idiotype dans les sérums.

L'invention fournit donc les moyens de disposer d'anticorps anti-idiotypes anti-TA.

Ces anticorps anti-idotypes anti-TA sont nouveaux et en tant que tels font donc également l'objet de l'invention. Ils sont caractérisés par leur capacité à réagir spécifiquement avec les anticorps monoclonaux de l'invention.

Outre leurs applications comme agents de diagnostic ou comme agents thérapeutiques, les AcM de l'invention sont utilisables comme réactifs de laboratoire à des fins de recherche.

L'invention fournit également les moyens de détecter des anticorps anti-TA à l'aide de TA immobilisé sur un support insoluble.

Ces moyens sont caractérisés en ce qu'il s'agit de produits de couplage comprenant TA lié par covalence à un support insoluble.

Ces produits de couplage sont du même type que ceux définis plus haut comportant AcM.

I1 s'agit donc de produits de couplage dans lesquels
TA est fixé indirectement au support insoluble.

Les produits de couplage dans lesquels TA est fixé par covalence au support insoluble par l'intermédiaire d'un composé polyfonctionnel ne présentant pas d'activité enzymatique tel que choisi notamment parmi les composés évoqués plus haut sont des produits nouveaux qui entrent dans le cadre de l'invention.

L'invention vise également les produits de couplage dans lesquels TA est fixé par covalence sur le compose intermédiaire dépourvu d'activité enzymatique ci-dessus, lui-même adsorbé sur le support insoluble.

Des produits avantageux comprennent de la gélatine comme protéine intermédiaire.

Ces produits de couplage comprenant TA immobilisé directement ou indirectement sur un suppport insoluble sont avantageusement mis en oeuvre selon l'invention pour déterminer la présence d'anticorps anti-TA dans un échantillon biologique et pour évaluer le titre en anticorps.

La méthode de détection in vitro d'anticorps anti-TA selon l'invention comprend - la mise en contact d'un échantillon biologique avec un produit de couplage tel que défini ci-dessus sur lequel est couplé TA, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe de type antigène-anticorps, et - la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre les anticorps anti-TA présents dans l'échantillon biologique et le complexe comportant TA.

Pour mettre en évidence la formation d'un complexe et pour le quantifier, on utilise avantageusement un sérum renfermant des anticorps anti-IgG ou anti-IgM avec un marqueur.

De tels produits de couplage permettent de mesurer le taux d'anticorps anti-TA libres et de complexes immuns circulants contenant des anticorps anti-TA dans différents fluides biologiques.

Cette application revêt un intérêt tout particulier dans les pathologies ou le titre en anticorps anti-TA varie selon l'évolution de la maladie.

Des essais réalisés ont ainsi montré que dans le cas de tumeurs cancéreuses, le titre en anticorps anti-TA augmente dans le sérum des patients présentant ces tumeurs lorsque la croissance de la tumeur est faible, et au contraire, diminue lorsque la croissance de la tumeur est très rapide.

Les produits de couplage de l'invention comportant
TA lié par covalence sont donc particulièrement utiles pour déterminer le titre en anticorps anti-TA chez des patients susceptibles d'être atteints d'un cancer. Ils s'avèrent également d'un grand intérêt dans le cas de patients souffrant de maladies auto-immunes telles que l'arthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé,
HIV, l'hépatite B, l'herpès zonas, l'herpès simplex,la cirrhose biliaire primaire, et d'autres désordres immunologiques.

L'invention vise en outre un kit pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps anti-TA dans un échantillon biologique.

Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation de TA couplé tel que défini ci-dessus fixé, - une préparation d'un autre anticorps marqué réagissant avec les Ig à mettre en évidence, - un système de détection spécifique de l'anticorps marqué, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en-se reportant aux figures 1 à 6 - la figure 1 représetnant la variation des titres en anticorps anti-TA chez des souris immunisées et chez des souris non immunisées, - les figures 2a et 2b les variations de taux en IgG anti-TA et en IgM anti-TA de 2 sérums humains, - la figure 3, l'évolution des titres en anticorps anti
TA durant la croissance d'une tumeur greffée, - les figures 4 et 5, les variations des titres en anticorps anti-TA par rapport à l'évolution de tumeurs, - la figure 6, l'inhibition de la réactivité des AcM anti-TA par des composés souffrés.

EXEMPLE 1 : PREPARATION DE PLAQUES DE POLYSTYRENE AVEC TA
LIE PAR COVALENCE 1.1 Modification chimique des plaques de polystyrène
On génère tout d'abord des groupements nitro sur des plaques de polystyrène en utilisant un mélange de 47/53 (v/v) d'acide nitrique et d'acide sulfurique concentrés, pendant 5 mn à 4C (CHIN et LANKS, 1977, Anal. Biochem., 1977, vol 83, p.709-719).

On lave ensuite intensivement les plaques de polynitrostyrène avec de l'eau désionisée puis on transforme le polynitrostyrène en polyaminostyrène par réduction sous vide, durant 6 h à 60 C à l'aide de dithionite de sodium à 6% dans une solution de KOH 2M.

On vérifie le degré de substitution en groupes amino en faisant réagir les plaques avec de l'acide picryl sulfonique et en mesurant la densité optique à 405 nm. On obtient des valeurs moyennes de densité optique de 0,258 - 0,033 sur 12 puits distribués au hasard sur une plaque.

Ces valeurs sont de 0,225 -0,033 en opérant sur 6 lots différents (QUASH et al, dans Quash and Rodwell (EDS), M.

DEKKER, N.Y. (1989), p.155.

1.2 Couplage de TA au polyaminostyrène
On ajoute dans chaque puits 200 p1 de NaHC03 à 2,5%, pH 8, contenant 2 nmoles d'acide thioctique et 10 nmoles d'un carbodiimide hydrosoluble.

Les plaques sont ensuite incubées 16h à température ambiante, lavées intensivement avec la solution de bicarbonate, de l'eau distillée, séchées et stockées dans un dessicateur sous azote.

EXEMPLE 2 : PREPARATION DE PLAQUES DE POLYSTYRENE AVEC TA
LIE PAR COVALENCE PAR L'INTERMEDIAIRE DE GELATINE FIXEE
DE MANIERE COVALENTE AU POLYAMINOSTYEENE 2.1 Modification chimique des plaques de polystyrène
On opère comme indiqué ci-dessus.

2.2 Couplage de la gélatine au support polyaminostyrène
On ajoute dans chaque puits 100 g de tampon A défini dans l'exemple 2 et contenant 10 pg/ml de gélatine et 10 mg/ml de carbodiimide hydrosoluble (éthyl-3(3diméthylaminopropyl) carbodiimide. Ces plaques sont incubées 5 heures à 370C sous agitation. Elels sont ensuite lavées intensivement avec le tampon B défini ciaprès.

2.3 Couplage de TA sur la gélatine fixée au polyaminostyrène
On ajoute dans les puits des colonnes 1 à 6 100il de
NaHCO3 à 2,5%, pH 8, contenant 2 moles par puits de TA et 10 pmoles d'un carbodiimide hydrosolubble.

On ajoute dans les puits des colonnes 7 à 12 1001li de NaHCO3 2,5%, pH 8, ne contenant ni TA ni carbodiimide hydrosoluble.

Les plaques sont incubées 16 heures à T = + 4"C puis lavées intensivement avec le tampon B, puis avec de l'eau distillée, séchées et stockées sous azote.

EXEMPLE 3 : PREPARATION DE PLAQUES DE POLYSTYRENE AVEC TA
LIE PAR COVALENCE PAR L' INTERMEDIAIRE DE GELATINE
ADSORBEE AUX SUPPORTS POLYSTYRENE OU POLYAMINOSTYRENE 3.1 Adsorption de la gélatine aux supports polystyrène ou aminopolystyrène
On dépose dans chaque puits 100 p1 d'une solution de
NaHCO3 0,1 M, pH 9, contenant 10 yg/ml de gélatine. Ces plaques sont incubées 5 heures à 370C sous agitation, puis lavées intensivement avec le tampon B.

3.2 Couplage de TA sur la gélatine adsorbée aux supports polystyrène ou polyaminostyrène
On opère comme indiqué ci-dessus dans 1.2.

EXEMPLE 4 : COUPLAGE DE TA SUR DES PLAQUES DEJA
FONCTIONNALISEES PAR L'INTERMEDIAIRE DE GELATINE COUPLEE
DE MANIERE COVALENTE AU SUPPORT 4.1 Couplage de la gélatine au support fonctionnalisé
Exemple de plaques fonctionnalisées - Primaria (Becton Dickinson) - Covalink (Nunc)
On opère comme indiqué dans l'exemple 1.2.

4.2 Couplage de TA à la gélatine couplée de manière covalente aux plaques déjà fonctionnalisées
On opère comme indiqué dans l'exemple 1.2.

EXEMPLE 5 : DETERMINATION IMMUNOENZYMATIQUE DU TITRE EN
ANTICORPS ANTI-TA AVEC ANTIGENE LIEE PAR COVALENCE (CELIA) 5.1 Anticorps anti-TA murin
On utilise les tampons A et B de compositions suivantes
Tampon A
NaCl 0,14 M Na2HPO4 0,01 M > KH2PO4 0,01 M } pH 7,2
Tween 20 0,1% p/v
Tampon B (TCT)
NaCl 0,14 M
Tween 20 0,1% p/v
Tris 0,05 M ajusté à pH 8,1 avec de l'acide citrique
On détermine la présence d'anticorps anti-TA dans des sérums de souris immunisées et dans des fluides de cultures d'hybridomes obtenus à partir de clones sécrétant des immunoglobulines, en opérant comme suit - les sérums sont dilués dans le tampon A à raison de 1/100 à 1/3200.

- le fluide de culture est utilisé soit pur, soit dilué de 1/2 à 1/256 dans le tampon A.

On utilise des plaques de gélatine-TA du type de celles préparées selon les exemples 2, 3 ou 4.

Seuls les puits des colonnes 1 à 6 comportent du TA lié par covalence.

On ajoute 100 1 de chaque dilution dans les puits des colonnes 1 à 5 avec TA lié par covalence ou aux puits témoins 7 à 11.

Les puits des colonnes 7 à 12 servent de témoin et ne reçoivent, lors de l'étape de couplage de TA, que du
NaHCO3, à raison de 200 1.

Dans les colonnes 6 et 12, on n'ajoute que le tampon
A.

Après 1 h à 37"C, la plaque est lavée trois fois avec le tampon B.

On ajoute alors à chaque puits 100 Ag d'un conjugué constitué par un sérum de chèvre anti IgG de souris (HTL) marqué à l'aide de phosphatase alcaline, dilué à 1/2000 dans le tampon A.

Après 30 minutes d'incubation, les plaques sont lavées une fois avec le TCT, puis on ajoute à chaque puits 100 p1 d'une solution contenant 10 mM de p nitrophénylphosphate (substrat d'enzyme PNPP), 0,5 mM de MgCl2 dans 1 M de diéthanolamine pH 9,8. Les densités optiques sont mesurées à intervalles réguliers.

5.2 Anticorps anti-TA humain
On opère comme indiqué ci-dessus mais lorsqu'on teste des sera humains, on remplace le conjugué ci-dessus par du sérum de mouton anti IgG humain (FC spécifique) ou anti-IgM humain (spécifique de la chaîne ) marqué avec de la phosphatase alcaline, dilué dans le tampon A.

Sur la figure 1, on rapporte la variation de la
DO/mn x 10 en fonction de la dilution (valeurs 1/dilution) obtenue avec un sérum de souris immunisées () et de souris non immunisées (S3). On constate que le sérum des souris non immunisées possède un titre faible mais significatif en anticorps anti-TA.

Les résultats obtenus sur deux sérums humains concernant le taux en IgG anti-TA

et en IgM anti-TA

sont rapportés sur les figures 2a et 2b.

EXEMPLE 6 : DETERMINATION DE LA SPECIFICITE DES ANTICORPS
ANTI-TA MURIONS
Etude de l'inhibition de la réactivité de AcM anti
TA par des composés soufrés
On ajoute divers composés renfermant du soufre à un fluide de culture d'hybridome dilué à 1/10 dans le tampon
A. Ces concentrations varient de 0,1 à 1,2 mM.

Le témoin Ab est un fluide de culture, dilué à 1/10 auquel on a seulement ajouté du tampon A.

Après incubation à 37"C pendant lh, on ajoute 100 1 de chaque mélange aux puits avec du TA lié par covalence ou aux puits témoins sans TA.

Les plaques sont incubées à 37"C pendant 1 heure puis la présence d'anticorps liés est déterminée comme décrit ci-dessus. Les résultats sont présentés sur la figure 6.

EXEMPLE 7 : DETERMINATION DE LA TENEUR EN TA DE FLUIDES
BIOLOGIQUES 7.1 Préparation de microplaques de titrage avec un anticorps monoclonal (IgM) anti-TA lié par covalence
On isole des IgM d'un milieu de culture d'un clone secrétant un anticorps par dialyse intensive contre de l'eau distillée (GARCIA-GONZALEZ et al, dans J. Immunol.

Methods (1988), vol 111, p.17-23). Leur pureté, déterminée par électrophorèse sur gel de poyamide (PAGE), est supérieure à 90%.

Les IgM purifiées sont couplées comme décrit dans (QUASH et al, Advances in polyamine Research, ed. by R.A.

Campbell et al, Raven Press, N.Y., vol 2, 1978, p. 85-92) par leur résidus glucidiques oxydés à des microplaques de tiration polyhydrazido fonctionnalisées.

7.2 Préparation de TA marqué par une enzyme
TA est tout d'abord transformé en une forme activée en utilisant du N-OH succinimide (NHS) et du dicyclohexyl carbodiimide en solution dans du dioxane.

On ajoute 1 mole de TA dissoute dans du dioxane à 1 mole de DCC et 1 mole de NHS. Après 16 h à température ambiante, on élimine le précipité formé par filtration et le filtrat clair contenant TA-NHS est porté à siccité à l'aide d'un évaporateur rotatif.

On recristallise TA-NHS dans de l'éther.

On effectue le couplage de TA-NHS à de la peroxydase. On utilise la peroxydase en solution dans 0,01 M de phosphate pH 7,2. On l'ajoute à TA-NHS dans un rapport molaire POD/TA-NHS de 1/10. On laisse la réaction s'effectuer durant 16 h à 40C puis on élimine par dialyse le TA qui ne s'est pas couplé et les produits de la réaction de faible poids moléculaire. La dialyse est effectuée contre un tampon phosphate 0,01 M, pH 8,1.

7.3 Préparation de TA lié à des protéines marquées par de la biotine
On opère comme indiqué ci-dessus pour coupler TA-NHS à de la peroxydase mais en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA) prémarquée avec de la biotine.

7.4 Préparation de TA lié à des résidus sucres de la fétuine
On transforme tout d'abord TA-NHS en hydrazide d'acide par réaction avec de l'hydrazine, selon un rapport molaire TA-NHS/hydrazine de 10/1.

Le TA-hydrazide (TA/Hz) est séparé de l'hydrazine n'ayant pas réagi par chromatographie sur une colonne de gel de silice.

On ajoute TA-Hz à 10 mg de fétuine avec ses résidus sucres oxydés, en solution dans 0,01 M de phosphate, pH 5,0. Le rapport molaire fétuine/TA-hydrazide est de 2/1.

On laisse la réaction s'effectuer pendant 16 h à 4 C, puis on élimine le TA-Hz libre par dialyse.

7.5 Préparation de TA lié à des agents colorants
On fait réagir TA-NHS, selon un rapport molaire de 1/1 avec de l'hexaméthylène de diamine (HMD). TA-HMD est séparé du TA ou du HMD qui n'a pas réagi sur une colonne de chromatographie de gel de silice.

On effectue le couplage de TA-HMD à de l'isothiocyanate de fluorescéine selon un rapport molaire de 1/1 en utilisant un tampon bicarbonate de pH 8,5.

7.6 Détermination de TA
TA libre : On ajoute du TA en solution dans un tampon de bicarbonate à des concentrations de 0,1 à 0,2 mM à des plaques de polystyrène avec des anticorps anti
TA liés.

Les plaques sont incubées à 37"C, 1 h, puis rinsées avec du TCT. On ajoute à chaque puits le complexe TA-POD puis les plaques sont incubées une autre heure à 37"C.

Elles sont alors lavées et l'activité POD est mesurée par l'addition de 0,08% de H2O2, de O-phénylène diamine à 1 mg/ml dans un tampon citrate à pH 4,5.

TA lié : On opère comme décrit ci-dessus pour le TA libre mais on utilise du TA lié à de la BSA.

8. DETECTION DE TA LIE DANS LES CELLULES
On utilise des cellules Hela et des cellules MARCS en culture.

Les cellules sont ensuite fixées dans de l'acétone froide à 80% et lavées 4 fois dans du PBS. L'activité endogène de la POD est bloquée par un traitement de 10 min. avec 3% de HzOz dans PBS. Après 3 autres lavages dans PBS, les plaques sont incubées 1 h à température ambiante avec un milieu de culture dérivé du clone llB6G5 dilué à 1/5 ou 1/10 dans PBS contenant 0,2% de BSA et 10% de sérum normal de mouton (tampon A).

Les plaques sont alors lavées avec le tampon A puis sont incubées 30 min. à température ambiante avec un sérum de mouton biotinylé anti-Ig (HTL) de souris dilué à 1/200 dans PBS contenant 0,2% de BSA (tampon B).

On effectue ensuite 4 lavages avec du tampon B, puis on ajoute un complexe peroxydase streptavidine-biotine dilué à 1/100 dans le tampon B. On incube 30 min. à température ambiante puis on effectue 4 lavages dans PBS.

On révèle l'activité POD avec une solution contenant 1,5 mg de 3-amino-9-éthyl carbazole, 360 il de N N' diméthyl formamide, 15 p1 de H202 (30%) ajouté extemporanément dans 7,2 ml d'acétate de sodium 0,1 M ajusté à pH 5,2 avec de l'acide acétique.

On laisse la réaction se poursuivre 20 min. à température ambiante puis les lames sont lavées dans de l'eau désionisée contre colorées avec de l'hématoxyline et montées dans de l'alcool polyvinylique.

9. PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-ACIDE
THIOCTIQUE 9.1 Préparation de l'inunogène
On ajoute 10 mg de l'acide thioctique D,L à 1 mg d'hémocyanine. On ajoute au mélange 2 mg de 1 éthyl-3(3diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et on incube le mélange réactionnel avec agitation douce pendant 16 h, à température ambiante. On dialyse alors intensivement le contenu contre un tampon phosphate 50 mM pH 7,2.

La préparation est diluée jusqu'à une concentration finale de 0,5 mg/ml et filtrée sur des filtres 0,20 Zm.

Une partie est mélangée avec un égal volume d'adjuvant complet de Freund (échantillon A).

Une deuxième partie est mélangée avec un volume égal d'adjuvant de Freund incomplet (échantillon B).

Une troisième partie est diluée 2 fois avec un tampon phosphate (échantillon C).

9.2 Immunisation de souris
On utilise des souris femelles Balb C de 6 semaines de IFFA Credo France. Une première injection par voie intrapéritonéale est effectuée avec 0,2 ml d'échantillon
A au jour 0. Une deuxième injection est ensuite effectuée avec 0,2 ml d'échantillon B au 12e jour et une troisième injection avec 0,15 ml d'échantillon C au 24e jour.

9.3 Contrôle du titre anti-TA des sérums avant fusion
Les souris sont saignées au 23e jour par ponction rétro-orbitale. On détermine le titre en anticorps anti
TA des sérums des souris par un test immunoenzymatique avec TA lié par covalence et on prélève aux fins de fusion la rate des souris dont le sérum montre un titre en anticorps anti-TA élevé, par exemple DO par minute x 10 supérieur à 5 à la dilution de 1/100.

9.4 Protocole de fusion
3 jours après la dernière injection, la rate de la souris immunisée est prélevée et les splénocytes sont lavés deux fois avec 108 cellules d'une lignée cellulaire de myélome non secrétante Sp2 0/agi4 (ATCC CRL 1581) dans du sérum dépourvu de RPMI 1640. Le mélange cellulaire est centrifugé à 1500 tours/mn pendant 5 min. On ajoute lentement au culot 0,8 ml d'une solution de polyéthylène glycol 4000 à 50% (p/v) produit commercialisé par Sigma
Chemical Co.

La suspension est centrifugée à 1000 tours/mn pendant 15 min. pour éliminer le polyéthylène glycol. Les cellules sont remises en suspension dans des milieux sélectifs (RPMI 1640 supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, de l'hypoxanthine 13,6 x 10'3gel et
Azaserine 1,73 x 10~3gel et mis en culture dans des plaques de culture à 24 puits à une dilution de 105 cellules/puits.

9.5 Méthode de criblage
Les surnageants de culture provenant de puits avec une croissance d'hybride sont criblés pour leur capacité de réagir avec TA couplé par covalence aux protéines fixées sur les plaques de polystyrène chimiquement modifiées ayant 96 puits. Les anticorps liés sont détectés avec un sérum de lapin ayant des anticorps anti-IgG (H+L) de souris marqués avec une phosphatase alcaline.

Le développement d'une couleur est quantifié à 415nm. Les surnageants qui donnent une densité optique allant jusqu'à 0,2 après 20 mn d'incubation sont choisis.

La détermination de la classe et de la sous-classe des anticorps correspondants est réalisée en utilisant des anticorps conjugués avec la biotine.

EXEMPLE 10 : DETERMINATION DE8 TITRES EN ANTICORPS ANTI
TA ET UTILISATION DE CES 8 TITRES COMME INDICE D'UNE
EVOLUTION TUMORALE CHEZ DES 80URI8 GREFFEES AVEC UNE
TUMEUR
On détermine les titre en anticorps anti-TA chez des souris sur lesquelles on a greffé des tumeurs. Sur la figure 3, on a représenté l'évolution du titre en anticorps anti-TA durant la croissance d'une tumeur L1210
On rapporte sur cette figure la variation de la DO/mn x 10 en fonction de différentes dilutions (1/dilution) avant la greffe de la tumeur , un jour après la greffe de la tumeur et un jour après la mort de la souris v
Au 6e jour après la greffe de la tumeur, ce titre diminue fortement (un jour avant la mort).

Lorsqu'on détermine les titres en anticorps anti-TA en fonction de la croissance de la tumeur (en utilisant une leucémie L1210), on trouve que les titres anti-TA sont plus bas chez les souris avec la croissance de la tumeur la plus rapide et sont plus élevés chez les souris avec la croissance de la tumeur moins rapide (figure 4).

Ces résultats sérologiques sont confirmés dans une autre expérience dans laquelle on utilise la tumeur B16.

Sur la figure 5, on a représenté la variation de la
DO (à 405 nm) en fonction de la dilution (1/dilution) avec des souris avant la greffe de la tumeur ( O), avec des souris ne développant pas de tumeurs après 30 jours li et avec des souris ayant des tumeurs au 26e jour, juste avant leur mort. On a utilisé des souris B6D2F1.

DETERMINATION DE LA SPECIFICITE D'ANTICORPS MONOCLONAUX
ANTI-TA EN UTILISANT UN TEST IMMUNOENZYMATIQUE AVEC TA
LIE PAR COVALENCE.

On étudie la réactivité de trois anticorps monoclonaux, produits respectivement par les clones 11B6G5, 13C5B6 et 22D3D7 par rapport à différents composés souffrés. Les titres en anticorps anti-TA R exprimés en D.O. à 405 nm après 30 min. d'incubation (surnageant de culture pur) sont respectivement de 1,5, 0,9 et 0,65. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 6 qui donne la réactivité vis-à-vis de - R-TA, ( - S-TA , - composés disulfures tels que gluthatione oxydé (-o , acide dithiopropionique, (H'-) - composé hétérocyclique soufré tel que la biotine (.

Il ressort de la figure 6 que seuls llB6G5 et 13C5B6 (tous deux IgM) satisfont le caractère de la spécificité vis-à-vis de TA. Au regard de la stéréospécificité, la réactivité de 13C5B6 est inhibée de la même manière avec
R-TA et S-TA tandis qu'à de faibles concentrations en énantiomères, llB6G5 apparaît présenter une plus forte affinité pour l'énantiomère R que pour le S.

D'autres composés contenant du soufre examinés possédant tous des groupes sulphydryle libres réduits
BAL, ss mercaptoéthanol, DTT et TA réduits. Tous ces composés abolissent complètement la réactivité de TA lié par covalence pour les anticorps lorsque ces anticorps seuls ou la plaque seule sont incubés avec eux.

Cependant, dans le cas de plaques traitées avec ces produits souffrés, étant donné qu'une étape de lavage est introduite après le traitement avec ces composés SH, il semble raisonnable de conclure que l'intégrité de la liaison -S-S- dans TA est une nécessité pour son immunoréactivité.

En d'autres termes, les anticorps anti-TA choisis réagissent avec TA oxydé et non avec TA réduit. Cette conclusion est confirmée par le fait que TA lié par covalence, traité ave NaBH4 n'est plus reconnu par l'anticorps monoclonal anti-TA.

Compte tenu de la spécificité montrée par 11B6G5, cet anticorps monoclonal est utilisé pour les études immunohistologiques.

DETERMINATION DE LA REACTIVITE DE8 ANTICORPS MONOCLONAUX llB6G5 ET 13C5B6 AVEC DE8 CELLULES NORMALES MRC5 ET DES
CELLULES HeLa TRANSPORMEES EN CULTURES
Les cellules HeLa et les cellules MRC5 sont cultivées pendant 3 jours. A la fin de cette période, les cellules sont lavées et les études immunohistologiques sont effectuées.

Les résultats présentés sur le tableau 1 montrent que ces deux anticorps monoclonaux interagissent fortement avec les composés nucléaires dans les cellules
HeLa mais faiblement avec les constituants cytoplasmiques.

Avec les cellules MRC5, la réaction avec les anticorps monoclonaux est limitée aux composants nucléaires.

TABLEAU 1

<tb> <SEP> INTENSITE <SEP> DU <SEP> MARQUAGE
<tb> IE <SEP> sur: <SEP> AcM <SEP> 11B6G5 <SEP> ACM <SEP> 13C5B6 <SEP>
<tb> MRC5 <SEP> ng <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> <SEP> cut <SEP>
<tb> HeLa <SEP> ny. <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> <SEP> cyt. <SEP> + <SEP> +
<tb>
EXEMPLE 11 : APPLICATION DU KIT DE DIAGNOSTIC POUR
DETERMINER LES TITRES ANTI-TA CHEZ DES PATIENTS AVEC UN
LUPUS ERYTHENATEUX DISSEMIfl (LED)
On détermine le titre en anticorps anti-TA dans les sérums de 10 patients atteints de lupus érythémateux disséminé et dans 20 sérums de patients normaux.

On rapporte dans le tableau 2 les titres en IgG et
IgM, les titres en anticorps antinucléaires (ACAN) et ceux en anticorps anti-ADN (FARR).

TABLEAU 2
SERUM TITRE IgG TITRE IgM IF ACAN FARR
LED 231433 2032 6549 256 0
LED 233534 3078 705 64 14
LED 236172 92 12347 1024 24
LED 239477 3330 4096 87
LED 340352 928 5292 1024 74
LED 240706 1243 1157 256 35
LED 242295 1615 1435 1024 26
LED 242535 22832 2758 256
LED 242544 1069 i608 64 9
LED 242679 2598 321 1024 18
S3 40 233
S4 628 573
S5 285 38
S7 185 142
S8 460 1359
S12 186 226
S14 1267 480
S15 941 370
S16 648 290
517 255 - 953
S18 1158 235
S19 343 60
S20 2182 680
S21 2730 508
S22 328 85
S23 572 39
S25 441 543
S26 767 257
S27 657 0
S28 744 15
S29 1442 91
On constate que les titres en TA pour IgG et IgM sont plus élevés pour la majorité des sérums provenant de patients LEDpar rapport aux sujets normaux.

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont capables de réagir spécifiquement avec TA sous forme oxydée en donnant lieu à un complexe du type antigèneanticorps.

2. Anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils forment un complexe de type antigène-anticorps avec TA oxydé, sous forme R et/ou sous forme S.

3. Anticorps monoclonaux selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que - ils appartiennent à la classe des IgM,des IgG ou des

IgA, - ils possèdent un PM d'environ 160000 pour les IgG, de l'ordre de 800 à 900000 pour les IgM et de l'ordre de 160 à 320000 pour les IgA,

4. Fragments des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, en particulier fragments constitués par la partie Fab ou encore tels qu'isolés à partir de la partie Fab dès lors qu'ils sont capables d'interagir spécifiquement avec TA oxydé.

5. Anticorps monoclonaux anti-TA du type des anticorps monoclonaux susceptibles d'être induits par un procédé comprenant les étapes - d'immunisation d'un animal, selon les techniques classiques, avec du TA avantageusement couplé à une substance immunogène, - de fusion de cellules de l'animal productrices d'anticorps dirigés contre TA oxydé avec des cellules de myélome de souris, - de sélection des hybridomes capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis de TA oxydé, - de clonage de ces hybridomes, et - de purification des anticorps monoclonaux tels que produits à partir de liquides d'ascites de souris ou de milieux de culture.

6. Anticorps monoclonaux produits respectivement par les clones llB6G5, 13C5B6 et 22D3D7 de l'exemple 10.

7. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-TA, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés à partir d'un pool hétérogène d'immunoglobulines ou encore à partir d'une population hétérogène de lymphocytes sécrétant ces anticorps, ces lymphocytes sécréteurs étant le cas échéant immortalisés par un virus tel que EBV.

8. Souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 7.

9. Souches d'hybridomes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion des cellules de myélome de souris avec une cellule de souris produisant des anticorps, après immunisation de la souris avec TA couplé à la substance immunogène, lesdites cellules hybrides étant capables de produire des anticorps spécifiques anti-TA.

10. Anticorps polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont formés d'une population d'anticorps réagissant spécifiquement avec TA oxydé en donnant lieu à des complexes du type antigène-anticorps.

11. Procédé d'obtention d'anticorps polyclonaux selon la revendication 10 par induction expérimentale par injection à un animal d'un immunogène artificiel comportant TA fixé.

12. Lymphocytes secréteurs d'anticorps anti-TA immortalisés par exemple avec un virus tel que EBV par indùction naturelle à partir d'immunogènes naturels renfermant TA tel que le complex PDH, E2.

13. Produits de couplage comprenant des anticorps monoclonaux anti-TA entiers ou leurs fragments liés par covalence à un support insoluble, de forme quelconque, notamment sous forme de plaques ou de billes.

14. Produits de couplage selon la revendication 13, caractérisés en ce que les anticorps monoclonaux ou leurs fragements sont fixés directement au support insoluble ou en variante sont fixés à ce support par l'intermédiaire d'un composé bifonctionnel jouant le rôle d'un bras de couplage de longueur appropriée pour maintenir la réactivité de la molécule fixée, le composé bifonctionnel étant notamment une protéine, un polysaccharide, une glycoprotéine ou encore un glycolipide, ou selon une autre variante, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, et le cas échéant le composé bifonctionnel lorsqu'il est présent, sont adsorbés sur le support insoluble.

15. Produits de couplage selon la revendication 13 ou 14, caractérisés en ce que le support insoluble est un matériau macromoléculaire substitué, par des groupes fonctionnels susceptibles de réagir avec l'AcM, ou le composé bifonctionnel lorsqu'il est présent.

16. Produits de couplage comprenant TA fixé par covalence à un support insoluble selon la revendication 14 ou 15, par l'intermédiaire d'un composé polyfonctionnel ne présentant pas d'activité enzymatique choisi notamment parmi une protéine, une glycoprotéine, un glycolipide ou un polysaccharide, ce composé polyfonctionnel étant couplé de manière covalente au support insoluble ou étant adsorbé sur ce support.

17. Produit de couplage selon la revendication 16, comprenant TA couplé à un support insoluble par l'intermédiaire d'une protéine telle que la gélatine, cette dernière étant le cas échéant adsorbée sur le support.

18. Méthode de détection in vitro de TA dans un échantillon biologique, caractérisée par - la mise en contact de l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux ou de leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, le cas échéant sous forme d'un produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et - la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre TA et l'AcM, cette mise en évidence étant réalisée en particulier en utilisant aux fins de compétition TA marqué par exemple par un groupe fluorescent, radioactif, ou une enzyme, ou tout autre groupe pouvant être révélé, ce groupe étant le cas échéant porté par une protéine ou une glycoprotéine liée à TA.

19. Kit pour le diagnostic in vitro de la présence de TA dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'AcM libre ou immobilisé comme défini ci-dessus, - une préparation de TA avec un groupe marqueur, - un système de détection spécifique du marqueur, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

20. Utilisation des anticorps monoclonaux ou de leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme vecteurs d'enzymes ou comme vecteurs de médicaments, en particulier lié à un agent chimiothérapeutique ou radioactif.

21. Anticorps monoclonaux et leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 radiomarqués.

22. Utilisation des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 7 pour la détection d'anticorps anti-idiotypes dans les sérums.

23. Anticorps anti-idiotypes anti-TA, caractérisés par leur capacité à réagir spécifiquement avec les anticorps monoclonaux anti-TA selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 7.

24. Application des anticorps monoclonaux anti-TA et de leurs fragments selon l'une quelconque des revendicaitons 1 à 7 en tant que réactifs de laboratoire.

25. Méthode de détection in vitro d'anticorps anti

TA dans un échantillon biologique, caractérisée par l'utilisation de TA lié sur un support insoluble tel que défini dans les revendications 13 à 15, et comprenant plus particulièrement - la mise en contact d'un échantillon biologique avec un produit de couplage tel que défini ci-dessus sur lequel est couplé TA, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe de type antigene-anticorps, et - la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre les anticorps anti-TA présents dans l'échantillon biologique et le complexe comportant TA.

26. Kit pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps anti-TA dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation de TA couplé tel que défini ci-dessus fixé, - une préparation d'un autre anticorps marqué réagissant avec les Ig à mettre en évidence, - un système de détection spécifique de l'anticorps marqué, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

27. Application des méthodes et/ou kits selon l'une quelconque des revendications 18, 19, 25, et 26 en cancérologie, virologie, dans les pathologies de maladies auto-immunes.