WO1992001807A1 - Moyens pour le diagnostic d'acide thioctique et d'anticorps anti-acide thioctique et applications biologiques - Google Patents

Moyens pour le diagnostic d'acide thioctique et d'anticorps anti-acide thioctique et applications biologiques Download PDF

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WO1992001807A1
WO1992001807A1 PCT/FR1991/000602 FR9100602W WO9201807A1 WO 1992001807 A1 WO1992001807 A1 WO 1992001807A1 FR 9100602 W FR9100602 W FR 9100602W WO 9201807 A1 WO9201807 A1 WO 9201807A1
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monoclonal antibodies
monoclonal
antibody
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Application number
PCT/FR1991/000602
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Inventor
Stéphane LECASTELOIS
Vincent Thomas
Gérard Quash
Original Assignee
Lecastelois Stephane
Vincent Thomas
Quash Gerard
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Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids

Definitions

  • BIOLOGICAL The invention relates to means for the diagnosis of thioctic acid (hereinafter referred to as TA) and anti-TA antibodies. It relates more particularly to polyclonal antibodies and anti-TA monoclonal antibodies as well as to derivatives of TA and anti-TA monoclonal antibodies, covalently attached to insoluble supports.
  • thioctic acid also called lipoic acid
  • lipoic acid is a growth factor for many bacteria and protozoa and constitutes a coenzyme or a substrate in plants, microorganisms and animal tissues.
  • TA level varies in particular in the case of abnormalities of fatty acid metabolism in bacteria, or during embryonic life, or even in the case of pathologies in humans such as diabetes or cancer where the metabolism of oxacids is impaired.
  • the latter technique which is the most generally used, comprises: hydrolysis of the material, to release TA bound to proteins, by heating in the presence of 6 M HCl, at 110 ° C. for 11 h,
  • the inventors' search for a way to measure TA with great specificity but under non-destructive conditions has led them to an immunological approach to the problem.
  • the work carried out focused on the development of diagnostic means making it possible to determine, in a biological sample, qualitatively and quantitatively either TA, or anti-TA antibodies, by simple reaction of antigen-antibody type.
  • Obtaining anti-TA antibodies, in particular anti-TA monoclonal antibodies, makes it possible to have high specificity means for determining the variations in the TA level, for example in a given pathological condition and facilitates new investigations.
  • the object of the invention is therefore to provide new means for the diagnosis of AT made up of anti-TA monoclonal antibodies and anti-TA polyclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies of the invention are characterized in that they are capable of reacting specifically with TA either free or present in a biological constituent, in oxidized form, giving rise to a complex of the antigen-antibody type.
  • Their specificity vis-à-vis oxidized TA is such that under the conditions of an immunoassay as reported in Example 3, the antibodies only react with oxidized TA.
  • Monoclonal antibodies of the invention are capable of recognizing the R enantiomeric form of oxidized TA.
  • monoclonal antibodies are capable of forming an antigen-antibody complex with TA oxidized in S form, which could make it possible to determine the proportion of S enantiomer after synthesis.
  • the monoclonal antibodies of the invention are further characterized in that they react by forming an antigen-antibody type complex with double-stranded DNA, but do not react, under the same conditions, with DNA single-stranded.
  • the whole monoclonal antibodies of the invention are further characterized in that: - they belong to the class of IgM, IgG or IgA,
  • the invention also relates to the fragments of these monoclonal antibodies.
  • fragments such as obtained by enzymatic digestion or by peptide synthesis, constituted by the Fab part (antibody binding fragment or binding fragment of the antibody).
  • the invention further relates to any fragment as isolated from the Fab fragment when it is capable of interacting specifically with oxidized TA.
  • the anti-TA monoclonal antibodies of the invention are of the type of monoclonal antibodies capable of being induced by a process comprising the steps: - of fusion of cells producing antibodies directed against oxidized TA with cells of mouse myeloma,
  • the cells producing anti-oxidized TA antibodies are obtained for example from an animal immunized according to conventional techniques, with TA advantageously coupled to an immunogenic substance.
  • the immunization is advantageously carried out according to the technique described by Köhler and Milstein (1975), Nature, vol 256, p.495.
  • TA used for immunization is usually coupled to an immunogenic substance, for example to proteins, glycoproteins, amino sugars and polysaccharides and administered mixed or not with an adjuvant such as the complete adjuvant of Freund.
  • an immunogenic substance for example to proteins, glycoproteins, amino sugars and polysaccharides and administered mixed or not with an adjuvant such as the complete adjuvant of Freund.
  • the spleens of animals having the highest anti-TA antibody titer are advantageously selected.
  • the fusion between the splenocytes and the cells of a non-secreting myeloma line is carried out according to the usual protocol described by Kohler and Milstein, in the above reference.
  • the hybridomas obtained are cultured and cloned, advantageously according to the conventional limit dilution technique.
  • the clones which produce the most antibodies for large-scale culture are selected according to the technique described in the examples. This selection is carried out by determining the anti-TA antibody titer of the culture supernatants, and this advantageously using the method of the invention which will be described below.
  • the selected hybrid cells are recovered from the cultures, for example by centrifugation and injected into animals, for the sake of convenience. preferably mice, to produce ascites, or are cultured in a fermenter.
  • the recovered monoclonal antibodies are purified by affinity chromatography. Satisfactory results are obtained using a column of Protein A- Sepharose (R).
  • the invention relates especially to the monoclonal antibodies produced by clones 11B6G5 and 13C5B6 and 22D3D7 of the examples.
  • the monoclonal antibodies without restriction of the species are selected using fixed TA, from a heterogeneous pool of immunoglobulins or from a heterogeneous population of lymphocytes secreting these antibodies.
  • These secretory lymphocytes can be immortalized by fusion with a virus such as EBV.
  • the invention also relates to the hybridoma strains producing the monoclonal antibodies defined above.
  • hybridomas are characterized in that they are formed from hybrid cells resulting from the fusion of mouse myeloma cells with a mouse cell producing antibodies, after immunization of the mouse with TA coupled to the immunogenic substance, said hybrid cells being capable of producing specific anti-TA antibodies.
  • the clones of antibody-producing hybridomas have the advantage of being homogeneous on the cellular level and of great stability.
  • the preparation of these hybridomas also falls within the scope of the invention and includes the steps of fusion and selection, defined above in relation to monoclonal antibodies.
  • the step of immunizing animals with TA advantageously coupled to an immunogenic substance, mentioned above for the preparation of monoclonal antibodies, makes it possible to induce the formation of polyclonal antiTA antibodies.
  • the invention also relates to polyclonal anti-TA antibodies as new products.
  • These antibodies are characterized in that they are formed from a population of antibodies reacting specifically with oxidized TA giving rise to complexes of the antigen-antibody type.
  • polyclonal antibodies can be produced by natural induction from natural immunogens containing TA such as the PDH complex, E2.
  • the invention also relates to lymphocytes secreting anti-TA polyclonal antibodies immortalized for example with a virus such as EBV.
  • the monoclonal antibodies of the invention or their fragments as defined above, as well as the polyclonal anti-TA antibodies, constitute highly specific tools for the qualitative and quantitative diagnosis of TA in biological fluids and samples.
  • the invention therefore relates to the application of these monoclonal antibodies or their fragments to detect in vitro the presence of TA in a biological sample.
  • the term mAb as used below designates both the whole anti-TA monoclonal antibodies and their fragments as defined above.
  • the AcM can be free or immobilized on a support.
  • Coupling products comprising mAbs covalently attached to insoluble supports are new products and as such also fall within the scope of the invention.
  • the mAb is directly coupled by covalent bond to the insoluble support.
  • the mAb is coupled to the insoluble support via a compound, polyfunctional, playing the role of a coupling arm of appropriate length to maintain the reactivity of the bound mAb molecule.
  • the intermediate compound is covalently linked to the support and to the mAb.
  • polysaccharides examples include polysaccharides, glycoproteins or even glycolipids.
  • Suitable proteins include among others gelatin, serum albumin and immunoglobulins. Coupling of bifunctional compounds on supports insoluble is advantageously produced according to the technique described in patent FR 2331567.
  • the compound playing the role of arm can be optionally adsorbed on the insoluble support.
  • Insoluble supports suitable for preparing the coupling products of the invention include macromolecular materials, substituted by functional groups capable of reacting with mAb, or the bifunctional compound when it is present.
  • macromolecular materials of the supports which can be used according to the invention, mention will be made of polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene, agarose, polyamide, polyacrylic or methacrylic acid and their esters, cellulose, magnetic cores or paramagnetic coated with macromolecular materials such as polystyrene or methacrylates.
  • These supports are in any form. Most generally, these are plates or balls.
  • Functional groups suitable for these materials include either a free amino group, a COOH, an OH, an SH, or a phenol.
  • the bifunctional compound mentioned above is optionally adsorbed on the insoluble support material, playing the role of anchoring site.
  • the detection according to the invention of free TA or linked to a biological molecule, such as glycoproteins, glycolipids, lipids or polysaccharides comprises:
  • test sample into contact with a preparation of mAb immobilized on a solid support, in suitable conditions for the production of an antigen-antibody complex, and the demonstration of the possible immunological reaction between TA and mAb.
  • TA is used for competition purposes comprising a marker group.
  • This group is for example an enzyme, a fluorescent group, a radioactive group, or any other group which can be used for labeling, which can be revealed.
  • the marker group in accordance with another provision of the invention, is carried by a protein or a glycoprotein linked to TA.
  • the protein or glycoprotein can be biotinylated.
  • the presence of TA in the sample to be tested is demonstrated by a reduction in the signal due to the marker linked to TA.
  • the biological sample is brought into contact with the immobilized antibodies. After an appropriate contact time, the plates are washed to remove unreacted molecules. Then marked TA is reacted. The determination of the marker molecules makes it possible to quantify TA bound to the mAb.
  • This detection method of the invention with the use of free or immobilized mAb makes it possible to reveal with great sensitivity the presence of TA in a biological sample, in particular to locate and quantify bound TA in cells on tissue biopsies normal or pathological.
  • the mAbs of the invention can be used to carry out diagnostics in pathologies where the evolution of the disease modifies the rate of TA, especially in oncology, virology and in autoimmune diseases.
  • the invention also relates to a kit for the in vitro diagnosis of the presence of TA in a biological sample.
  • an appropriate solid phase serving as a support for the assay such as a micro-titration plate
  • Radiolabelled mAbs are advantageously used to detect TA present in tissues in vivo, which is of major interest in the pathologies mentioned above. These mAbs are labeled for example using 3 H propionate. According to yet another aspect of the invention, the monoclonal antibodies of the invention are used to detect anti-idiotype antibodies in the sera.
  • the invention therefore provides the means of having anti-TA anti-idiotype antibodies.
  • anti-TA anti-idiotype antibodies are new and as such are therefore also the subject of the invention. They are characterized by their ability to react specifically with the monoclonal antibodies of the invention. In addition to their applications as diagnostic agents, the mAbs of the invention can be used as laboratory reagents for research purposes.
  • the invention also provides the means for detecting anti-TA antibodies using TA immobilized on an insoluble support.
  • the coupling products in which TA is covalently attached to the insoluble support via a polyfunctional compound not exhibiting enzymatic activity, as chosen in particular from the compounds mentioned above, are new products which enter into the part of the invention.
  • the invention also relates to coupling products in which TA is covalently attached to the intermediate compound lacking the above enzymatic activity, itself adsorbed on the insoluble support.
  • Advantageous products include gelatin as an intermediate protein.
  • the method of in vitro detection of antiTA antibodies according to the invention comprises:
  • a biological sample into contact with a coupling product as defined above on which TA is coupled, under conditions suitable for the production of an antigen-antibody type complex, and highlighting the possible immunological reaction between the anti-TA antibodies present in the biological sample and the complex comprising TA.
  • a serum containing anti-IgG or anti-IgM antibodies with a marker is advantageously used.
  • Such coupling products make it possible to measure the level of free anti-TA antibodies and of circulating immune complexes containing anti-TA antibodies in various biological fluids. This application is of particular interest in pathologies where the anti-TA antibody titer varies according to the course of the disease.
  • the coupling products of the invention comprising TA covalently linked are therefore particularly useful for determining the titer of anti-TA antibodies in patients susceptible to cancer. They are also of great interest in the case of patients suffering from autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, HIV, hepatitis B, herpes zonas, herpes simplex, primary biliary cirrhosis, and other immunological disorders.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, HIV, hepatitis B, herpes zonas, herpes simplex, primary biliary cirrhosis, and other immunological disorders.
  • the invention further relates to a kit for the in vitro diagnosis of the presence of anti-TA antibodies in a biological sample.
  • This kit is characterized in that it comprises: - an appropriate solid phase serving as a support for the assay, such as a micro-titration plate,
  • the applications, coupling products, diagnostic methods and kits described in connection with the anti-TA monoclonal antibodies also apply for the anti-polyclonal antibodies.
  • the coupling products with these polyclonal antibodies are new products targeted by the invention.
  • FIG. 1 representing the variation of the anti-TA antibody titers in immunized mice and in non-immunized mice
  • FIGS. 2a and 2b the variations in the level of anti-IgG IgG and in anti-TA IgM of 2 human sera
  • FIG. 3 the evolution of the anti-TA antibody titles during the growth of a grafted tumor
  • the figures 4 and 5 the variations in the anti-TA antibody titers relative to the evolution of tumors
  • FIG. 6 the inhibition of the reactivity of the antiTA mAbs by sulfur compounds
  • FIGS. 7a and 7b the IgG and IgM titers measured in various autoimmune diseases
  • FIG. 8 the purification of anti-TA antibodies from human serum
  • FIG. 9 the reactivity of the mAb with TA
  • nitro groups are generated on polystyrene plates using a mixture of 47/53 (v / v) concentrated nitric acid and sulfuric acid, for 5 min at 4 ° C. (CHIN and LANKS, 1977, Anal. Biochem., 1977, vol 83, p. 709-719).
  • the polynitrostyrene plates are then washed intensively with deionized water and then the polynitrostyrene is transformed into polyaminostyrene by reduction under vacuum for 6 h at 60 ° C. using 6% sodium dithionite in a 2M KOH solution. .
  • the degree of substitution in amino groups is checked by reacting the plates with picryl sulfonic acid and by measuring the optical density at 405 nm. Average optical density values of 0.258 ⁇ 0.033 are obtained on 12 wells distributed at random on a plate.
  • the plates are then incubated for 16 h at room temperature, washed intensively with the bicarbonate solution, distilled water, dried and stored in a desiccator under nitrogen.
  • EXAMPLE 4 COUPLING YOUR TA ON PLATES ALREADY FUNCTIONALIZED VIA GELATINE COUPLED COVALENTLY TO THE SUPPORT
  • Buffers A and B of the following compositions are used: Buffer A
  • anti-TA antibodies The presence of anti-TA antibodies is determined in sera of immunized mice and in fluids of hybridoma cultures obtained from clones secreting immunoglobulins, by operating as follows:
  • the sera are diluted in buffer A at a rate of 1/100 to 1/3200.
  • the culture fluid is used either pure or diluted from 1/2 to 1/256 in buffer A.
  • Gelatin-TA plates of the type of those prepared according to Examples 2, 3 or 4 are used.
  • each dilution 100 ⁇ l of each dilution is added to the wells of columns 1 to 5 with TA covalently linked or to the control wells 7 to 11.
  • the wells of columns 7 to 12 serve as a control and do not receive, during the coupling step, TA, as NaHCO 3 , at a rate of 200 ⁇ l.
  • TA as NaHCO 3
  • Various sulfur-containing compounds are added to a hybridoma culture fluid diluted 1/10 in buffer A. These concentrations vary from 0.1 to 1.2 mM.
  • Control Ab is a culture fluid, diluted to 1/10 to which only buffer A has been added.
  • IgM are isolated from a culture medium of a clone secreting an antibody by intensive dialysis against distilled water (GARCIA-GONZALEZ et al, in J. Immunol. Methods (1988), vol 111, p.17- 23). Their purity, determined by electrophoresis on polyamide gel (PAGE) is greater than 90%.
  • the purified IgMs are coupled as described in (QUASH et al, Advances in polyamine Research, ed. By RA Campbell et al, Raven Press, NY, vol 2, 1978, p. 85-92) by their carbohydrate residues oxidized to functionalized polyhydrazido titration microplates.
  • TA is first transformed into an activated form using N-OH succinimide (NHS) and dicyclohexyl carbodiimide in solution in dioxane. 1 mole of TA dissolved in dioxane is added to N-OH succinimide (NHS) and dicyclohexyl carbodiimide in solution in dioxane. 1 mole of TA dissolved in dioxane is added to N-OH succinimide (NHS) and dicyclohexyl carbodiimide in solution in dioxane. 1 mole of TA dissolved in dioxane is added to
  • TA-NHS is recrystallized from ether.
  • TA-NHS is coupled to peroxidase.
  • Peroxidase is used in solution in 0.01 M phosphate pH 7.2. It is added to TA-NHS in a POD / TA-NHS molar ratio of 1/10. The reaction is allowed to proceed for 16 h at 4 ° C. and then the uncoupled TA and the reaction products of low molecular weight are removed by dialysis. Dialysis is carried out against a 0.01 M phosphate buffer, pH 8.1.
  • BSA bovine serum albumin
  • TA-NHS is first transformed into acid hydrazide by reaction with hydrazine, according to a TA-NHS / hydrazine molar ratio of 10/1.
  • TA-hydrazide (TA / Hz) is separated from the unreacted hydrazine by chromatography on a column of silica gel.
  • TA-Hz is added to 10 mg of fetuin with its oxidized sugar residues, dissolved in 0.01 M of phosphate, pH 5.0.
  • the fetuin / TA-hydrazide molar ratio is 2/1.
  • the reaction is allowed to proceed for 16 h at 4 ° C., then the free TA-Hz is removed by dialysis.
  • TA-NHS is reacted, in a molar ratio of 1/1 with hexamethylene diamine (HMD).
  • HMD hexamethylene diamine
  • TA-HMD is coupled to fluorescein isothiocyanate in a molar ratio of 1/1 using a bicarbonate buffer of pH 8.5.
  • TA in solution in a bicarbonate buffer at concentrations of 0.1 to 0.2 mM is added to polystyrene plates with bound anti-TA antibodies. The plates are incubated at 37 ° C, 1 h, then rinsed with TCT. The TA-POD complex is added to each well and the plates are incubated for another hour at 37oC. They are then washed and the POD activity is measured by the addition of 0.08% H 2 O 2 , O-phenylene diamine at 1 mg / ml in a citrate buffer at pH 4.5.
  • TA linked We operate as described above for free TA but we use TA linked to BSA.
  • Hela cells and MRC 5 cells are used in culture.
  • the cells are fixed in cold 80% acetone and washed 4 times in PBS.
  • the endogenous activity of POD is blocked by a treatment of 10 min. with 3% H 2 O 2 in PBS. After another 3 washes in PBS, the plates are incubated for 1 h at room temperature with a culture medium derived from clone 11B6G5 diluted 1/5 or 1/10 in PBS containing 0.2% BSA and 10% normal serum. sheep (buffer A).
  • reaction is allowed to continue for 20 min. at room temperature then the slides are washed in deionized water counter stained with hematoxylin and mounted in polyvinyl alcohol.
  • the preparation is diluted to a final concentration of 0.5 mg / ml and filtered through 0.20 ⁇ m filters.
  • One part is mixed with an equal volume of complete Freund's adjuvant (sample A).
  • a second part is mixed with an equal volume of incomplete Freund's adjuvant (sample B).
  • a third part is diluted 2 times with a phosphate buffer (sample C).
  • mice are bled on day 23 by retro-orbital puncture.
  • the anti-TA antibody titer of the sera of the mice is determined by an immunoenzymatic test with covalently bound TA and the spleen of the mice is removed for fusion, the serum showing a high antiTA antibody titre, for example DO per minute x 10 greater than 5 at the 1/100 dilution.
  • the spleen of the immunized mouse is removed and the splenocytes are washed twice with 108 cells of a non-secreting myeloma cell line Sp2 0 / Ag14 (ATCC CRL 1581) in RPMI 1640 devoid of serum .
  • the cell mixture is centrifuged at 1500 rpm for 5 min.
  • 0.8 ml of a 50% polyethylene glycol 4000 solution (w / v) product sold by Sigma Chemical Co. is slowly added to the pellet.
  • the suspension is centrifuged at 1000 revolutions / min for 15 min. to remove polyethylene glycol.
  • the cells are resuspended in selective media (RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum, hypoxanthine 13.6 x 10 -3 g / l and Azaserine 1.73 x 10 -3 g / l ) and cultured in 24-well culture plates at a dilution of 10 5 cells / well.
  • Culture supernatants from wells with hybrid growth are screened for their ability to react with TA covalently coupled to proteins attached to chemically modified polystyrene plates having
  • the bound antibodies are detected with a serum of rabbit with anti-mouse IgG (H + L) antibodies labeled with alkaline phosphatase.
  • EXAMPLE 10 DETERMINATION OF TITLES IN ANTI-TA ANTIBODIES AND USE OF THESE TITLES AS AN INDICATOR OF AN EVOLUTION
  • FIG. 3 shows the evolution of the anti-TA antibody titer during the growth of an L1210 tumor. This variation shows the variation in OD / min x 10 as a function of different dilutions (1 / dilution) - before the graft of the tumor one day after the tumor transplant and a day before the mouse died On the 6th day after the transplant of the tumor, this titer decreases sharply (one day before death).
  • anti-TA titers When determining antiTA antibody titers based on tumor growth (using L1210 leukemia), anti-TA titers are found to be lower in mice with the fastest tumor growth and are higher in mice with slower tumor growth (Figure 4).
  • the variation of the OD (at 405 nm) is represented as a function of the dilution (1 / dilution) with mice before the transplant of tumor C with mice that do not develop tumors after 30 days and with mice having tumors on day 26, just before their death B6D2F1 mice were used.
  • EXAMPLE 11 DETERMINATION OF THE SPECIFICITY OF ANTI-TA MONOCLONAL ANTIBODIES USING AN IMMUNOENZYMATIC TEST WITH YOUR COVALENCE BIND.
  • the reactivity of three monoclonal antibodies, produced by clones 11B6G5, 13C5B6 and 22D3D7 respectively, is studied with respect to various suffering compounds.
  • the anti-TA R antibody titers expressed in OD at 405 nm after 30 min. incubation (pure culture supernatant) are 1.5, 0.9 and 0.65 respectively.
  • the results obtained are shown in FIG. 6 which gives the reactivity with respect to:
  • the anti-TA antibodies chosen react with oxidized TA and not with reduced TA. This conclusion is confirmed by the fact that TA covalently linked, treated with NaBH4 is no longer recognized by the anti-TA monoclonal antibody.
  • the anti-TA mAbs of the invention give a strong nuclear staining and, on the other hand, a weak granular cytoplasmic staining on cells transformed in culture.
  • Hela cells and MRC5 cells are cultured for 3 days. At the end of this period, the cells are washed and immunohistological studies are performed.
  • double-stranded anti-DNA antibodies generally react with cardiolipin, note that the mAb tested does not have reactivity towards this antigen.
  • EXAMPLE 13 STUDY OF THE ANTI-TA TITLE IN PATIENT SERUMS FOR THE DETECTION OF VARIOUS PATHOLOGIES. . Detection of systemic lupus erythematosus (LED)
  • the anti-TA antibody titer is determined in the sera of patients with systemic lupus erythematosus and in the sera of normal patients.
  • T systemic lupus erythematosus
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • RA rheumatoid arthritis
  • S syphilis
  • TH Hashimoto's thyroiditis
  • IgM titers are always higher than those of the control, this increase being particularly significant in the case of LED, S and TH.
  • the increase in IgG titer is significant only in the case of S or TH.
  • Microbeads containing TA covalently attached are used.
  • the reactivity of anti-TA mAb with cellular antigens was studied by Western blotting.
  • Antigens are used (1) from MRC5 cells (after 48 h of culture) (2), from MRC5 cells (after 48 h of culture with 100 mM of TA, (3) of Hela cells (after 48 h of culture) and (4) Hela cells (after 48 hours of culture with 100 mM of TA).
  • the results obtained are given in FIG. 10, part A corresponding to the experiments carried out under denaturing conditions, and part B under non-denaturing conditions.

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Abstract

L'invention concerne des anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec l'acide thioctique sous forme oxydée en donnant lieu à un complexe du type antigène-anticorps et des produits de couplage, soit d'anticorps monoclonaux anti-acide thioctique, soit de l'acide thioctique, fixé directement ou indirectement sur un support insoluble. Ces produits de couplage sont utiles pour le diagnostic respectivement de la présence d'acide thioctique ou d'anticorps anti-thioctique.

Description

MOYENS POUR LE DIAGNOSTIC D'ACIDE THIOCTIQUE ET
D'ANTICORPS ANTI-ACIDE THIOCTIQUE ET APPLICATIONS
BIOLOGIQUES L'invention concerne des moyens pour le diagnostic d'acide thioctique (désigné ci-après par TA) et d'anticorps anti-TA. Elle se rapporte plus spécialement à des anticorps polyclonaux et à des anticorps monoclonaux anti-TA ainsi qu'à des dérivés de TA et d'anticorps monoclonaux anti-TA, fixés par covalence sur des supports insolubles.
Elle vise également des méthodes d'obtention de ces dérivés et des anticorps ainsi que leurs applications biologiques, plus spécialement à des fins de diagnostic.
On sait que l'acide thioctique, également appelé acide lipoïque, est un facteur de croissance pour de nombreuses bactéries et protozoaires et constitue un coenzyme ou un substrat chez les plantes, les microorganismes et les tissus animaux. Compte tenu de son rôle majeur dans le métabolisme des êtres vivants, on conçoit l'intérêt de le localiser dans les tissus ou les constituants cellulaires et de déterminer sa teneur. On a constaté que le taux en TA varie notamment dans le cas d'anomalies du métabolisme des acides gras chez les bactéries, ou durant la vie embryonnaire, ou encore dans le cas de pathologies chez l'homme telles que le diabète ou le cancer où le métabolisme des oxacides est altéré.
Les techniques proposées à ce jour pour déterminer le taux de TA dans un échantillon biologique ou dans les bactéries sont toutefois d'une grande complexité et donc inappropriées pour effectuer des dosages de routine.
Il s'agit de méthodes de dosage microbiologiques (brevet US 3049549) ou par chromatographie en phase gazeuse (article de White dans Analytical Biochemistry, 110, 89-92, 1981) ou encore de chromatographie en phase gazeuse suivie d'une étude par spectrométrie de masse (article de Pratt et al dans Biochem. J., 258, 749-754, 1989).
Cette dernière technique, qui est la plus généralement utilisée, comprend : l'hydrolyse du matériau, pour libérer TA lié aux protéines, par chauffage en présence de HCl 6 M, à 110°C pendant 11 h,
- l'extraction sélective dans le benzène, - l'isolement de TA extrait par chromatographie sur du gamma-aminophényl arsénoxyde-agarose, la transformation du thioctate libéré en ester méthylique, la séparation et la détermination quantitative du thioctate de méthyle par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse. Cette méthode présente au moins deux inconvénients majeurs. D'une part, elle nécessite de grandes quantités de matériau ; d'autre part, pour fournir des indications sur la localisation tissulaire de TA, une étape de purification préalable est nécessaire.
Or, cette localisation est importante étant donné le rôle attribué à TA dans le métabolisme d'oxoacide de certaines pathologies comme indiqué ci-dessus. En ce qui concerne la localisation sub-cellulaire, on a décrit la présence de déshydrogénase lipoamide noncomplexé sur les membranes de Thermoplasma acidophilum et sur celles de Trypanosoma brucci. Mais la présence de TA sur cette enzyme n'a pu être vérifiée en raison de l'effet destructeur de l'étape d'hydrolyse.
La recherche par les inventeurs d'une voie permettant de doser TA avec une grande spécificité mais dans des conditions non destructrices les a conduits à une approche immunologique du problème.
Les travaux effectués ont porté sur l'élaboration de moyens de diagnostic permettant de déterminer, dans un échantillon biologique, qualitativement et quantitativement soit TA, soit des anticorps anti-TA, par simple réaction de type antigène-anticorps. L'obtention d'anticorps anti-TA, en particulier d'anticorps monoclonaux anti-TA permet de disposer de moyens de haute spécificité pour déterminer les variations du taux de TA, par exemple dans un état pathologique donné et facilite de nouvelles investigations.
Ces travaux ont également permis de développer des moyens pour la mise en évidence dans le sérum d'anticorps anti-TA et la mesure de la teneur en anticorps. La détection de la présence d'anticorps anti-TA revêt en effet également un grand intérêt. En poursuivant leurs recherches dans ce domaine, les inventeurs ont constaté que des supports insolubles sur lesquels TA est fixé par covalence constituent des outils de diagnostic particulièrement performants.
On a déjà décrit des produits de couplage de TA fixé par covalence à des supports insolubles tels que
Séphadex(R), Sépharose(R), cellulose, polyacrylamide et polystyrène (voir Methods in Enzymology, vol. 62, Part D,
1979). De tels produits sont utilisés en vue de la réduction de liaisons S-S.
Dans Methods of Enzymology, vol. 62, 326, 1979, on rapporte l'utilisation de lipoyl-Sépharose(R) pour absorber des anticorps liant de la biotine.
En revanche, il n'avait jamais été envisagé d'utiliser de tels produits de couplage pour le diagnostic qualitatif et quantitatif d'anticorps anti-TA, puisque l'existence d'anticorps anti-TA n'avait pas été décrite.
L'étude de produits de ce type en vue de l'élaboration de moyens pour le diagnostic d'anticorps anti-TA a conduit à développer de nouveaux produits de couplage dans lesquels TA est fixé par covalence au support par l'intermédiaire d'un composé tel qu'une protéine, une glycoprotéine, un glycolipide ou un polysaccharide. L'utilisation d'une protéine (PDH.E2) d'origine bactérienne, contenant naturellement TA, pour détecter d'éventuels anticorps anti-mitochondries a déjà été décrite par FUSSEY et al. (PNAS, 1990, vol 87, p. 3987-3991). Cependant, il s'agit d'une protéine présentant une activité enzymatique. De plus, son utilisation nécessite d'importantes étapes de purification, d'où un coût élevé. Dans cette publication, le PDH.E2 est adsorbé au support de polystyrène et non couplé.
L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens pour le diagnostic de TA constitués par des anticorps monoclonaux anti-TA et des anticorps polyclonaux anti-TA.
Elle a également pour but de fournir des moyens pour le diagnostic d'anticorps polyclonaux anti-TA comprenant TA fixé sur un support insoluble. Elle vise également à fournir, en tant que produits nouveaux, des anticorps monoclonaux anti-TA fixés sur des supports insolubles, des dérivés de TA fixés sur des supports insolubles par l'intermédiaire d'un composé ne présentant pas d'activité enzymatique choisi parmi ceux mentionnés ci-dessus et des anticorps anti-TA polyclonaux et monoclonaux.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de réagir spécifiquement avec TA soit libre, soit présent dans un constituant biologique, sous forme oxydée, en donnant lieu à un complexe du type antigène-anticorps. Leur spécificité vis-à-vis de TA oxydé est telle que dans les conditions d'un immunoessai tel que rapporté dans l'exemple 3, les anticorps ne donnent de réaction qu'avec TA oxydé. Des anticorps monoclonaux de l'invention sont capables de reconnaître la forme énantiomère R de TA oxydé.
D'autres anticorps monoclonaux sont capables de former un complexe antigène-anticorps avec TA oxydé sous forme S, ce qui pourra permettre de déterminer la proportion d'énantiomère S après synthèse.
D'autres anticorps monoclonaux reconnaissent les deux formes R et S de TA oxydé.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils réagissent en formant un complexe du type antigène-anticorps avec de l'ADN à double brin, mais ne réagissent pas, dans les mêmes conditions, avec de l'ADN à simple brin.
Les anticorps monoclonaux entiers de l'invention sont encore caractérisés en ce que : - ils appartiennent à la classe des IgM, des IgG ou des IgA,
- ils possèdent un PM d'environ 160000 pour les IgG, de l'ordre de 800 à 900000 pour les IgM, et de 160 à 320000 pour les IgA.
L'invention vise également les fragments de ces anticorps monoclonaux.
Elle vise plus spécialement les fragments tels qu'obtenus par digestion enzymatique ou par synthèse peptidique, constitués par la partie Fab ( fragment antibody binding ou fragment de liaison de l'anticorps).
L'invention vise en outre tout fragment tel qu'isolé à partir du fragment Fab dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec TA oxydé. Selon un autre aspect, les anticorps monoclonaux anti-TA de l'invention sont du type des anticorps monoclonaux susceptibles d'être induits par un procédé comprenant les étapes : - de fusion de cellules productrices d'anticorps dirigés contre TA oxydé avec des cellules de myélome de souris,
- de sélection des hybridomes capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis de TA oxydé,
- de clonage de ces hybridomes, et de purification des anticorps monoclonaux tels que produits à partir de liquides d'ascites de souris ou de milieux de culture.
Les cellules productrices d'anticorps anti-TA oxydé sont obtenues par exemple à partir d'un animal immunisé selon les techniques classiques, avec du TA avantageusement couplé à une substance immunogène.
L'immunisation est avantageusement réalisée selon la technique décrite par Köhler et Milstein (1975), Nature, vol 256, p.495.
TA utilisé pour l'immunisation est de manière habituelle couplé à une substance immunogène, par exemple à des protéines, des glycoprotéines, des sucres aminés et des polysaccharides et administré mélangé ou non à un adjuvant tel que l'adjuvant complet de Freund.
Pour l'étape de fusion, on sélectionne avantageusement les rates des animaux présentant le titre en anticorps anti-TA le plus élevé.
La fusion entre les splénocytes et les cellules d'une lignée de myélome non sécrétante est effectuée selon le protocole habituel décrit par Kôhler et Milstein, dans la référence ci-dessus.
Après l'étape de fusion, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clones, avantageusement selon la technique classique de dilution limite. On sélectionne selon la technique décrite dans les exemples les clones qui produisent le plus d'anticorps aux fins de culture à grande échelle. Cette sélection est réalisée en déterminant le titre en anticorps anti-TA des surnageants de culture, et ce en mettant avantageusement en oeuvre la méthode de l'invention qui sera décrite plus loin. Les cellules hybrides sélectionnées sont récupérées des cultures par exemple par centrifugation et injectées à des animaux, par raison de commodité de préférence à des souris, pour produire des ascites, ou sont mises en culture en fermenteur.
Les anticorps monoclonaux récupérés sont purifiés par chromatographie d'affinité. Des résultats satisfaisants sont obtenus en utilisant une colonne de Protéine A- Sépharose(R).
L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux produits par les clones 11B6G5 et 13C5B6 et 22D3D7 des exemples.
En variante, les anticorps monoclonaux sans restriction de l'espèce sont sélectionnés à l'aide de TA fixé, à partir d'un pool hétérogène d'immunoglobulines ou encore à partir d'une population hétérogène de lymphocytes sécrétant ces anticorps. Ces lymphocytes sécréteurs peuvent être immortalisés par fusion avec un virus tel que EBV. L'invention concerne également les souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux définis ci-dessus.
Ces hybridomes sont caractérisés en ce qu'ils sont formés de cellules hybrides résultant de la fusion des cellules de myélome de souris avec une cellule de souris produisant des anticorps, après immunisation de la souris avec TA couplé à la substance immunogène, lesdites cellules hybrides étant capables de produire des anticorps spécifiques anti-TA.
Les clones des hybridomes producteurs d'anticorps présentent l'avantage d' être homogènes sur le plan cellulaire et d'une grande stabilité.
La préparation de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention et comprend les étapes de fusion et de sélection, définies ci-dessus en rapport avec les anticorps monoclonaux.
L'étape d'immunisation d'animaux avec TA avantageusement couplé à une substance immunogène, évoquée ci-dessus pour la préparation d'anticorps monoclonaux, permet d'induire la formation d'anticorps polyclonaux antiTA. L'invention vise également les anticorps polyclonaux anti-TA en tant que produits nouveaux.
Ces anticorps sont caractérisés en ce qu'ils sont formés d'une population d'anticorps réagissant spécifiquement avec TA oxydé en donnant lieu à des complexes du type antigène-anticorps.
Outre la voie d'induction expérimentale par injection à un animal d'un immunogène artificiel défini, comportant TA fixé, suivie d'une caractérisation des anticorps à l'aide de TA fixé, les anticorps polyclonaux peuvent être produits par induction naturelle à partir d'immunogènes naturels renfermant TA tel que le complexe PDH, E2.
L'invention vise encore des lymphocytes sécréteurs d'anticorps polyclonaux anti-TA immortalisés par exemple avec un virus tel que EBV. Les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments tels que définis ci-dessus, ainsi que les anticorps polyclonaux anti-TA, constituent des outils de grande spécificité pour le diagnostic qualitatif et quantitatif de TA dans les fluides et échantillons biologiques. L'invention vise donc l'application de ces anticorps monoclonaux ou de leurs fragments pour détecter in vitro la présence de TA dans un échantillon biologique. Le terme AcM tel qu'utilisé ci-après désigne aussi bien les anticorps monoclonaux anti-TA entiers que leurs fragments tels que définis plus haut.
Dans cette application, l'AcM peut être libre ou immobilisé sur un support.
Les produits de couplage comprenant des AcM fixés par covalence à des supports insolubles sont des produits nouveaux et en tant que tels entrent également dans le cadre de l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'AcM est couplé directement par liaison covalente au support insoluble. On opère avantageusement selon la technique de QUASH et al, J. Immunol. Methods, 1978, vol 22, p.165-174.
Selon un autre mode de réalisation, l'AcM est couplé au support insoluble par l'intermédiaire d'un composé, polyfonctionnel, jouant le rôle d'un bras de couplage de longueur appropriée pour maintenir la réactivité de la molécule d'AcM fixée. Le composé intermédiaire est lié par covalence au support et à l'AcM.
Parmi les composés polyfonctionnels préférés, on citera les agents homo ou hétéro bifonctionnels tels que MBS ou SPDP ; les protéines, y compris les anticorps dirigés contre la partie Fc de cet AcM, les polysaccharides, les glycoprotéines ou encore les glycolipides.
Des protéines appropriées comprennent entre autres la gélatine, le sérum albumine et les immunoglobulines. Le couplage des composés bifonctionnels sur les supports insolubles est avantageusement réalisé selon la technique décrite dans le brevet FR 2331567.
Le composé jouant le rôle de bras peut être le cas échéant adsorbé sur le support insoluble.
Des supports insolubles appropriés pour élaborer les produits de couplage de l'invention comprennent des matériaux macromoléculaires, substitués par des groupes fonctionnels susceptibles de réagir avec l'AcM, ou le composé bifonctionnel lorsqu'il est présent.
Comme matériaux macromoléculaires des supports utilisables selon l'invention, on citera du polystyrène, du polychlorure de vinyle, du polypropylène, de l ' agarose, du polyamide, de l'acide polyacrylique ou méthacrylique et leurs esters, de la cellulose, des noyaux magnétiques ou paramagnétiques enrobés de matériaux macromoléculaires tels que le polystyrène ou des méthacrylates. Ces supports se présentent sous une forme quelconque. Le plus généralement, il s'agit de plaques ou de billes.
Des groupes fonctionnels appropriés pour ces matériaux comportent soit un groupe aminé libre, soit un COOH, soit un OH, soit un SH, soit un phénol.
Le composé bifonctionnel évoqué ci-dessus est le cas échéant adsorbé sur le matériau du support insoluble, jouant le rôle de site d'ancrage.
La détection selon l'invention de TA libre ou lié à une molécule biologique, telle que des glycoprotéines, des glycolipides, des lipides ou des polysaccharides comprend :
- la mise en contact de l'échantillon à tester avec une préparation d'AcM immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre TA et l'AcM.
Pour cette mise en évidence, on utilise aux fins de compétition du TA comportant un groupe marqueur. Ce groupe est par exemple une enzyme, un groupe fluorescent, un groupe radioactif, ou tout autre groupe utilisable pour un marquage, pouvant être révélé.
Le groupe marqueur, conformément à une autre disposition de l'invention, est porté par une protéine ou une glycoprotéine liée à TA. Ainsi, la protéine ou la glycoprotéine peut être biotinylée.
Dans ce cas, la présence de TA dans l'échantillon à tester est mise en évidence par une diminution du signal due au marqueur lié au TA.
Le plus généralement, l'échantillon biologique est mis en contact avec les anticorps immobilisés. Après un temps de contact approprié, les plaques sont lavées pour éliminer les molécules qui n'ont pas réagi. On met ensuite à réagir TA marqué. La détermination des molécules du marqueur permet de quantifier TA fixé à l'AcM.
Cette méthode de détection de l'invention avec utilisation de l'AcM libre ou immobilisé permet de révéler avec une grande sensibilité la présence de TA dans un échantillon biologique, en particulier de localiser et de quantifier TA lié dans des cellules sur des biopsies de tissus normaux ou pathologiques.
Outre ces applications immunohistologiques, les AcM de l'invention, libres ou immobilisés sont utilisables pour réaliser des diagnostics dans des pathologies où l'évolution de la maladie modifie le taux de TA, spécialement en cancérologie, virologie et dans les maladies auto-immunes.
L'invention vise également un kit pour le diagnostic in vitro de la présence de TA dans un échantillon biologique.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d'AcM libre ou immobilisé comme défini ci-dessus,
- une préparation de TA avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur,
- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Les AcM radiomarqués sont avantageusement utilisés pour détecter TA présent dans les tissus in vivo, ce qui présente un intérêt majeur dans les pathologies évoquées ci-dessus. Ces AcM sont marqués par exemple à l'aide 3H propionate. Selon encore un autre aspect de l'invention, les anticorps monoclonaux de l'invention sont utilisés pour détecter des anticorps anti-idiotype dans les sérums.
L'invention fournit donc les moyens de disposer d'anticorps anti-idiotypes anti-TA.
Ces anticorps anti-idiotypes anti-TA sont nouveaux et en tant que tels font donc également l'objet de l'invention. Ils sont caractérisés par leur capacité à réagir spécifiquement avec les anticorps monoclonaux de l'invention. Outre leurs applications comme agents de diagnostic, les AcM de l'invention sont utilisables comme réactifs de laboratoire à des fins de recherche.
L'invention fournit également les moyens de détecter des anticorps anti-TA à l'aide de TA immobilisé sur un support insoluble.
Ces moyens sont caractérisés en ce qu'il s'agit de produits de couplage comprenant TA lié par covalence à un support insoluble.
Ces produits de couplage sont du même type que ceux définis plus haut comportant les AcM. II s'agit donc de produits de couplage dans lequels TA est fixé indirectement au support insoluble.
Les produits de couplage dans lesquels TA est fixé par covalence au support insoluble par l'intermédiaire d'un composé polyfonctionnel ne présentant pas d'activité enzymatique, tel que choisi notamment parmi les composés évoqués plus haut, sont des produits nouveaux qui entrent dans le cadre de l'invention. L'invention vise également les produits de couplage dans lequels TA est fixé par covalence sur le composé intermédiaire dépourvu d'activité enzymatique cidessus, lui-même adsorbé sur le support insoluble. Des produits avantageux comprennent de la gélatine comme protéine intermédiaire. Ces produits de couplage comprenant TA immobilisé directement ou indirectement sur un support insoluble sont avantageusement mis en oeuvre selon l'invention pour déterminer la présence d'anticorps anti-TA dans un échantillon biologique et pour évaluer le titre en anticorps.
La méthode de détection in vitro d'anticorps antiTA selon l'invention comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique avec un produit de couplage tel que défini ci-dessus sur lequel est couplé TA, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe de type antigène-anticorps, et la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre les anticorps anti-TA présents dans l'échantillon biologique et le complexe comportant TA. Pour mettre en évidence la formation d'un complexe et pour le quantifier, on utilise avantageusement un sérum renfermant des anticorps anti-IgG ou anti-IgM avec un marqueur. De tels produits de couplage permettent de mesurer le taux d'anticorps anti-TA libres et de complexes immuns circulants contenant des anticorps anti-TA dans différents fluides biologiques. Cette application revêt un intérêt tout particulier dans les pathologies où le titre en anticorps anti-TA varie selon l'évolution de la maladie.
Des essais réalisés ont ainsi montré que dans le cas de tumeurs cancéreuses, le titre en anticorps anti-TA augmente dans le sérum des patients présentant ces tumeurs lorsque la croissance de la tumeur est faible, et au contraire, diminue lorsque la croissance de la tumeur est très rapide.
Les produits de couplage de l'invention comportant TA lié par covalence sont donc particulièrement utiles pour déterminer le titre en anticorps anti-TA chez des patients susceptibles d'être atteints d'un cancer. Ils s'avèrent également d'un grand intérêt dans le cas de patients souffrant de maladies auto-immunes telles que l'arthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, HIV, l'hépatite B, l'herpès zonas, l'herpès simplex, la cirrhose biliaire primitive, et d'autres désordres immunologiques.
L'invention vise en outre un kit pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps anti-TA dans un échantillon biologique.
Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend : - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation de TA couplé tel que défini ci-dessus, - une préparation d'un autre anticorps marqué réagissant avec les Ig à mettre en évidence,
- un système de détection spécifique de l'anticorps marqué, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
Comme indiqué plus haut, les applications, produits de couplage, méthodes et kits de diagnostics décrits en rapport avec les anticorps monoclonaux anti-TA s'appliquent également pour les anticorps polyclonaux antiTA. A cet égard, on notera que les produits de couplage avec ces anticorps polyclonaux sont des produits nouveaux visés par l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 à 10 :
- la figure 1 représentant la variation des titres en anticorps anti-TA chez des souris immunisées et chez des souris non immunisées,
- les figures 2a et 2b les variations de taux en IgG antiTA et en IgM anti-TA de 2 sérums humains, - la figure 3, l'évolution des titres en anticorps anti-TA durant la croissance d'une tumeur greffée, les figures 4 et 5, les variations des titres en anticorps anti-TA par rapport à l'évolution de tumeurs,
- la figure 6, l'inhibition de la réactivité des AcM antiTA par des composés soufrés,
- les figures 7a et 7b, les titres IgG et IgM mesurés dans diverses maladies autoimmunes,
- la figure 8, la purification d'anticorps anti-TA à partir de sérum humain, - la figure 9, la réactivité de l'AcM avec TA, et
- la figure 10, une photo de Western blot de protéines cellulaires et d'un AcM de l'invention.
EXEMPLE 1 : PREPARATION DE PLAQUES DE POLYSTYRENE AVEC TA LIE PAR COVALENCE 1.1 Modification chimique des plaques de polystyrène
On génère tout d'abord des groupements nitro sur des plaques de polystyrène en utilisant un mélange de 47/53 (v/v) d'acide nitrique et d'acide sulfurique concentrés, pendant 5 mn à 4°C (CHIN et LANKS, 1977, Anal. Biochem., 1977, vol 83, p.709-719).
On lave ensuite intensivement les plaques de polynitrostyrène avec de l'eau désionisée puis on transforme le polynitrostyrène en polyaminostyrène par réduction sous vide, durant 6 h à 60°C à l'aide de dithionite de sodium à 6 % dans une solution de KOH 2M. On vérifie le degré de substitution en groupes amino en faisant réagir les plaques avec de l'acide picryl sulfonique et en mesurant la densité optique à 405 nm. On obtient des valeurs moyennes de densité optique de 0,258 ± 0,033 sur 12 puits distribués au hasard sur une plaque.
Ces valeurs sont de 0,225 ± 0,033 en opérant sur 6 lots différents (QUASH et al, dans Quash and Rodwell (EDS), M. DEKKER, N.Y. (1989), p.155. 1.2 Couplage de TA au polyaminostyrène
On ajoute dans chaque puits 200 μl de NaHCO3 à 2,5 %, pH 8, contenant 2 nmoles d'acide thioctique et 10 nmoles d'un carbodiimide hydrosoluble.
Les plaques sont ensuite incubées 16 h à température ambiante, lavées intensivement avec la solution de bicarbonate, de l'eau distillée, séchées et stockées dans un dessicateur sous azote.
EXEMPLE 2 : PREPARATION DE PLAQUES DE POLYSTYRENE AVEC TA LIE PAR COVALENCE PAR L'INTERMEDIAIRE DE GELATINE FIXEE DE MANIERE COVALENTE AU POLYAMINOSTYRENE 2.1 Modification chimique des plaques de polystyrène
On opère comme indiqué ci-dessus.
2.2 Couplage de la gélatine au support de polyaminostyrène
On. ajoute dans chaque puits 100 μg de tampon A défini dans l'exemple 2 et contenant 10 μg/ml de gélatine et 10 mg/ml de carbodiimide hydrosoluble (éthyl-3(3- diméthylaminopropyl) carbodiimide. Ces plaques sont incubées 5 heures à 37°C sous agitation. Elles sont ensuite lavées intensivement avec le tampon B défini ci-après. 2.3 Couplage de TA sur la gélatine fixée au polyaminostyrène
On ajoute dans les puits des colonnes 1 à 6 100 μl de NaHCO3 à 2,5 %, pH 8, contenant 2 μmoles par puits de TA et 10 μmoles d'un carbodiimide hydrosoluble.
On ajoute dans les puits des colonnes 7 à 12 100μl de NaHCO3 2,5 %, pH 8, ne contenant ni TA ni carbodiimide hydrosoluble.
Les plaques sont incubées 16 heures à T = +4ºC puis lavées intensivement avec le tampon B, puis avec de l'eau distillée, séchées et stockées sous azote. EXEMPLE 3 : PREPARATION PE PLAQUES DE POLYSTYRENE AVEC TA
LIE PAR COVALENCE PAR L'INTERMEDIAIRE DE GELATINE ADSORBEE AUX SUPPORTS DE POLYSTYRENE OU DE POLYAMINOSTYRENE
3.1 Adsorption de la gélatine aux supports de polystyrène ou d'aminopolystyrène
On dépose dans chaque puits 100 μl d'une solution de NaHCO3 0,1 M, pH9, contenant 10 μg/ml de gélatine. Ces plaques sont incubées 5 heures à 37°C sous agitation, puis lavées intensivement avec le tampon B.
3.2 Couplage de TA sur la gélatine adsorbée aux supports polystyrène ou polyaminostyrène.
On opère comme indiqué ci-dessus dans 1.2
EXEMPLE 4 : COUPLAGE DE TA SUR DES PLAQUES DEJA FONCTIONNALISEES PAR L'INTERMEDIAIRE DE GELATINE COUPLEE DE MANIERE COVALENTE AU SUPPORT
4.1 Couplage de la gélatine au support fonctionnalisé Exemple de plaques fonctionnalisées :
- Primaria(R) (Becton Dickinson)
- Covalink(R) (Nunc) On opère comme indiqué dans l'exemple 1.2.
4.2 Couplage de TA à la gélatine couplée de manière covalente aux plaques déjà fonctionnalisées
On opère comme indiqué dans l'exemple 1.2.
EXEMPLE 5 : DETERMINATION IMMUNOENZYMATIQUE DU TITRE EN ANTICORPS ANTI-TA AVEC ANTIGENE LIE PAR COVALENCE (CELIA)
5.1 Anticorps anti-TA murin
On utilise les tampons A et B de compositions suivantes : Tampon A
NaCl 0,14 M
Na2HPO4 0,01 M }
KH2PO4 0,01 M } pH 7,2
Tween 20 0,1 % p/v
Tampon B (TCT)
NaCl 0,14 M
Tween 20 0,1 % p/v
Tris 0,05 M ajusté à pH 8,1 avec de l'acide citrique
On détermine la présence d'anticorps anti-TA dans des sérums de souris immunisées et dans des fluides de cultures d' hybridomes obtenus à partir de clones sécrétant des immunoglobulines, en opérant comme suit :
- les sérums sont dilués dans le tampon A à raison de 1/100 à 1/3200.
- le fluide de culture est utilisé soit pur, soit dilué de 1/2 à 1/256 dans le tampon A.. On utilise des plaques de gélatine-TA du type de celles préparées selon les exemples 2, 3 ou 4.
Seuls les puits des colonnes 1 à 6 comportent du TA lié par covalence.
On ajoute 100 μl de chaque dilution dans les puits des colonnes 1 à 5 avec TA lié par covalence ou aux puits témoins 7 à 11. Les puits des colonnes 7 à 12 servent de témoin et ne reçoivent, lors de l'étape de couplage de TA, que du NaHCO3, à raison de 200 μl. Dans les colonnes 6 et 12, on n'ajoute que le tampon A.
Après 1 h à 37ºC, la plaque est lavée trois fois avec le tampon B.
On ajoute alors à chaque puits 100 μg d'un conjugué constitué par un sérum de chèvre anti IgG de souris (H+L) marqué à l'aide de phosphatase alcaline, dilué à 1/2000 dans le tampon A.
Après 30 minutes d'incubation, les plaques sont lavées une fois avec le TCT, puis on ajoute à chaque puits 100 μl d'une solution contenant 10 mM de pnitrophénylphosphate (substrat d'enzyme PNPP), 0,5 mM de MgCl2 dans 1 M de diéthanolamine pH 9,8. Les densités optiques sont mesurées à intervalles réguliers.
5.2 Anticorps anti-TA humain
On opère comme indiqué ci-dessus mais lorsqu'on teste des sérums humains, on remplace le conjugué ci-dessus par du sérum de mouton anti IgG humain (FC spécifique) ou anti-IgM humain (spécifique de la chaîne μ) marqué avec de la phosphatase alcaline, dilué dans le tampon A.
Sur la figure 1, on rapporte la variation de la DO/mn x 10 en fonction de la dilution (valeurs 1/dilution) obtenue avec un sérum de souris immunisées
Figure imgf000024_0001
et de souris non immunisées
Figure imgf000024_0002
On constate que le sérum des souris non immunisées possède un titre faible mais significatif en anticorps anti-TA.
Les résultats obtenus sur deux sérums humains concernant le taux en IgG anti-TA
Figure imgf000024_0004
et en IgM anti-TA
Figure imgf000024_0003
sont rapportés sur les figures 2a et 2b. EXEMPLE 6 : DETERMINATION DE LA SPECIFICITE DES ANTICORPS ANTI-TA MURINS
Etude de l'inhibition de la réactivité de AcM anti-TA par des composés soufrés.
On ajoute divers composés renfermant du soufre à un fluide de culture d'hybridome dilué à 1/10 dans le tampon A. Ces concentrations varient de 0,1 à 1,2 mM.
Le témoin Ab est un fluide de culture, dilué à 1/10 auquel on a seulement ajouté du tampon A.
Après incubation à 37°C pendant Ih, on ajoute 100 μl de chaque mélange aux puits avec du TA lié par covalence ou aux puits témoins sans TA.
Les plaques sont incubées à 37°C pendant 1 heure puis la présence d'anticorps liés est déterminée comme décrit ci-dessus. Les résultats sont présentés sur la figure 6.
EXEMPLE 7 : DETERMINATION DE LA TENEUR EN TA DE FLUIDES BIOLOGIQUES
7.1 Préparation de microplaques de titrage avec un anticorps monoclonal (IgM) anti-TA lié par covalence
On isole des IgM d'un milieu de culture d'un clone sécrétant un anticorps par dialyse intensive contre de l'eau distillée (GARCIA-GONZALEZ et al, dans J. Immunol. Methods (1988), vol 111, p.17-23). Leur pureté, déterminée par electrophorese sur gel de polyamide (PAGE) est supérieure à 90 %.
Les IgM purifiées sont couplées comme décrit dans (QUASH et al, Advances in polyamine Research, éd. by R.A. Campbell et al, Raven Press, N.Y., vol 2, 1978, p. 85-92) par leur résidus glucidiques oxydés à des microplaques de titration polyhydrazido fonctionnalisées.
7.2 Préparation de TA marqué par une enzyme
TA est tout d'abord transformé en une forme activée en utilisant du N-OH succinimide (NHS) et du dicyclohexyl carbodiimide en solution dans du dioxane. On ajoute 1 mole de TA dissoute dans du dioxane à
1 mole de DCC et 1 mole de NHS. Après 16 h à température ambiante, on élimine le précipité formé par filtration et le filtrat clair contenant TA-NHS est porté à siccité à l'aide d'un évaporateur rotatif.
On recristallise TA-NHS dans de l'éther.
On effectue le couplage de TA-NHS à de la peroxydase. On utilise la peroxydase en solution dans 0,01 M de phosphate pH 7,2. On l'ajoute à TA-NHS dans un rapport molaire POD/TA-NHS de 1/10. On laisse la réaction s'effectuer durant 16 h à 4°C puis on élimine par dialyse le TA qui ne s'est pas couplé et les produits de la réaction de faible poids moléculaire. La dialyse est effectuée contre un tampon phosphate 0,01 M, pH 8,1.
7.3 Préparation de TA lié à des protéines marquées par de la biotine On opère comme indiqué ci-dessus pour coupler TA¬
NHS à de la peroxydase mais en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA) prémarquée avec de la biotine.
7.4 Préparation de TA lié à des résidus sucres de la fétuine. On transforme tout d'abord TA-NHS en hydrazide d'acide par réaction avec de l'hydrazine, selon un rapport molaire TA-NHS/hydrazine de 10/1. Le TA-hydrazide (TA/Hz) est séparé de l'hydrazine n'ayant pas réagi par chromatographie sur une colonne de gel de silice.
On ajoute TA-Hz à 10 mg de fétuine avec ses résidus sucres oxydés, en solution dans 0,01 M de phosphate, pH 5,0. Le rapport molaire fétuine/TA-hydrazide est de 2/1.
On laisse la réaction s'effectuer pendant 16 h à 4°C, puis on élimine le TA-Hz libre par dialyse.
7.5 Préparation de TA lié à des agents colorants
On fait réagir TA-NHS, selon un rapport molaire de 1/1 avec de l'hexaméthylène diamine (HMD). TA-HMD est séparé du TA ou du HMD qui n'a pas réagi sur une colonne de chromatographie de gel de silice.
On effectue le couplage de TA-HMD à de l'isothiocyanate de fluorescéine selon un rapport molaire de 1/1 en utilisant un tampon bicarbonate de pH 8,5.
7.6 Détermination de TA TA libre : On ajoute du TA en solution dans un tampon de bicarbonate à des concentrations de 0,1 à 0,2 mM à des plaques de polystyrène avec des anticorps anti-TA liés. Les plaques sont incubées à 37°C, 1h, puis rincées avec du TCT. On ajoute à chaque puits le complexe TA-POD puis les plaques sont incubées une autre heure à 37ºC. Elles sont alors lavées et l'activité POD est mesurée par l'addition de 0,08 % de H2O2, de O-phénylène diamine à 1 mg/ml dans un tampon citrate à pH 4,5.
TA lié : On opère comme décrit ci-dessus pour le TA libre mais on utilise du TA lié à de la BSA.
EXEMPLE 8 : DETECTION DE TA LIE DANS LES CELLULES
On utilise des cellules Hela et des cellules MRC5 en culture.
Les cellules sont fixées dans de l'acétone froide à 80 % et lavées 4 fois dans du PBS. L'activité endogène de la POD est bloquée par un traitement de 10 min. avec 3 % de H2O2 dans PBS. Après 3 autres lavages dans PBS, les plaques sont incubées 1 h à température ambiante avec un milieu de culture dérivé du clone 11B6G5 dilué à 1/5 ou 1/10 dans PBS contenant 0,2 % de BSA et 10 % de sérum normal de mouton ( tampon A).
Les plaques sont alors lavées avec le tampon A puis sont incubées 30 min. à température ambiante avec un sérum de mouton biotinylé anti-Ig (H+L) de souris dilué à 1/2000 dans PBS contenant 0,2 % de BSA (tampon B).
On effectue ensuite 4 lavages avec du tampon B, puis on ajoute un complexe peroxydase streptavidine-biotine dilué à 1/100 dans le tampon B. On incube 30 min. à température ambiante puis on effectue 4 lavages dans PBS. On révèle l'activité POD avec une solution contenant 1,5 mg de 3-amino-9-éthyl carbazole, 360 μl de N N' diméthyl formamide, 15 μl de H2O2 (30 %) ajouté extemporanément dans 7,2 ml d'acétate de sodium 0,1 M ajusté à pH 5,2 avec de l'acide acétique.
On laisse la réaction se poursuivre 20 min. à température ambiante puis les lames sont lavées dans de l'eau désionisée contre colorées avec de l'hématoxyline et montées dans de l'alcool polyvinylique.
EXEMPLE 9 : PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-ACIDE THIOCTIQUE
9.1 Préparation de l'immunogène
On ajoute 10 mg de l'acide thioctique D,L à 1 mg d'hémocyanine. On ajoute au mélange 2 mg de 1 éthyl-3 (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et on incube le mélange réactionnel avec agitation douce pendant 16 h, à température ambiante. On dialyse alors intensivement le contenu contre un tampon phosphate 50 mM pH 7,2.
La préparation est diluée jusqu'à une concentration finale de 0,5 mg/ml et filtrée sur des filtres 0,20 μm. Une partie est mélangée avec un égal volume d'adjuvant complet de Freund (échantillon A).
Une deuxième partie est mélangée avec un volume égal d'adjuvant de Freund incomplet (échantillon B).
Une troisième partie est diluée 2 fois avec un tampon phosphate (échantillon C).
9.2 Immunisation de souris
On utilise des souris femelles Balb C de 6 semaines de IFFA Credo France. Une première injection par voie intrapéritonéale est effectuée avec 0,2 ml d'échantillon A au jour 0. Une deuxième injection est ensuite effectuée avec 0,2 ml d'échantillon B au 12e jour et une troisième injection avec 0,15 ml d'échantillon C au 24e jour. 9.3 Contrôle du titre anti-TA des sérums avant fusion
Les souris sont saignées au 23e jour par ponction rétro-orbitale. On détermine le titre en anticorps anti-TA des sérums des souris par un test immunoenzymatique avec TA lié par covalence et on prélève aux fins de fusion la rate des souris dont le sérum montre un titre en anticorps antiTA élevé, par exemple DO par minute x 10 supérieur à 5 à la dilution de 1/100.
9.4 Protocole de fusion
3 jours après la dernière injection, la rate de la souris immunisée est prélevée et les splénocytes sont lavés deux fois avec 108 cellules d'une lignée cellulaire de myélome non sécrétante Sp2 0/Ag14 (ATCC CRL 1581) dans du RPMI 1640 dépourvu de sérum. Le mélange cellulaire est centrifugé à 1500 tours/mn pendant 5 min. On ajoute lentement au culot 0,8 ml d'une solution de polyéthylène glycol 4000 à 50 % (p/v) produit commercialisé par Sigma Chemical Co.
La suspension est centrifugée à 1000 tours/mn pendant 15 min. pour éliminer le polyéthylène glycol. Les cellules sont remises en suspension dans des milieux sélectifs (RPMI 1640 supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10 %, de l'hypoxanthine 13,6 x 10-3g/l et Azaserine 1,73 x 10-3g/l) et mis en culture dans des plaques de culture à 24 puits à une dilution de 105 cellules/puits.
9.5 Méthode de criblage
Les surnageants de culture provenant de puits avec une croissance d'hybride sont criblés pour leur capacité à réagir avec TA couplé par covalence aux protéines fixées sur les plaques de polystyrène chimiquement modifiées ayant
96 puits. Les anticorps liés sont détectés avec un sérum de lapin ayant des anticorps anti-IgG (H+L) de souris marqués avec une phosphatase alcaline.
Le développement d'une couleur est quantifié à 415 nm. Les surnageants qui donnent une densité optique allant jusqu'à 0,2 après 20 mn d'incubation sont choisis. La détermination de la classe et de la sous-classe des anticorps correspondants est réalisée en utilisant des anticorps conjugués avec la biotine.
EXEMPLE 10 : DETERMINATION DES TITRES EN ANTICORPS ANTI-TA ET UTILISATION DE CES TITRES COMME INDICE D'UNE EVOLUTION
TUMORALE CHEZ DES SOURIS GREFFEES AVEC UNE TUMEUR On détermine les titres en anticorps anti-TA chez des souris sur lesquelles on a greffé des tumeurs. Sur la figure 3, on a représenté l'évolution du titre en anticorps anti-TA durant la croissance d'une tumeur L1210. On rapporte sur cette figure la variation de la DO/mn x 10 en fonction de différentes dilutions (1/dilution) - avant la greffe de la tumeur
Figure imgf000031_0001
un jour après la greffe de la tumeur
Figure imgf000031_0002
et un jour avant la mort de la souris
Figure imgf000031_0003
Au 6e jour après la greffe de la tumeur, ce titre diminue fortement (un jour avant la mort).
Lorsqu'on détermine les titres en anticorps antiTA en fonction de la croissance de la tumeur (en utilisant une leucémie L1210), on trouve que les titres anti-TA sont plus bas chez les souris avec la croissance de la tumeur la plus rapide et sont plus élevés chez les souris avec la croissance de la tumeur moins rapide ( figure 4).
Ces résultats sérologiques sont confirmés dans une autre expérience dans laquelle on utilise la tumeur B16.
Sur la figure 5, on a représenté la variation de la DO (à 405 nm) en fonction de la dilution (1/dilution) avec des souris avant la greffe de la tumeur C avec des souris ne développant pas de tumeurs après 30 jours
Figure imgf000032_0006
et avec des souris ayant des tumeurs au 26e jour, juste avant leur mort
Figure imgf000032_0005
On a utilisé des souris B6D2F1. EXEMPLE 11 : DETERMINATION DE LA SPECIFICITE D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-TA EN UTILISANT UN TEST IMMUNOENZYMATIQUE AVEC TA LIE PAR COVALENCE.
On étudie la réactivité de trois anticorps monoclonaux, produits respectivement par les clones 11B6G5, 13C5B6 et 22D3D7 par rapport à différents composés souffrés. Les titres en anticorps anti-TA R exprimés en D.O. à 405 nm après 30 min. d'incubation (surnageant de culture pur) sont respectivement de 1,5, 0,9 et 0,65. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 6 qui donne la réactivité vis-à-vis de :
Figure imgf000032_0001
- composés disulfures tels que gluthatione oxydé
Figure imgf000032_0002
acide dithiopropionique,
Figure imgf000032_0004
- composé hétérocyclique soufré tel que la biotine
Figure imgf000032_0003
Il ressort de la figure 6 que seuls 11B6G5 et 13C5B6 (tous deux IgM) satisfont le caractère de la spécificité vis-à-vis de TA. Au regard de la stéréospécificité, la réactivité de 13C5B6 est inhibée de la même manière avec R-TA et S-TA tandis qu'à de faibles concentrations en énantiomères, 11B6G5 apparaît présenter une plus forte affinité pour l'énantiomère R que pour le S.
D'autres composés contenant du soufre examinés possédent tous des groupes sulphydryle libres réduits : BAL, β mercaptoéthanol, DTT et TA réduits. Tous ces composés abolissent complètement la réactivité de TA lié par covalence pour les anticorps lorsque ces anticorps seuls ou la plaque seule sont incubés avec eux. Cependant, dans le cas de plaques traitées avec ces produits soufrés, étant donné qu'une étape de lavage est introduite après le traitement avec ces composés SH, il semble raisonnable de conclure que l'intégrité de la liaison -S-S- dans TA est une nécessité pour son immunoréactivité.
En d'autres termes, les anticorps anti-TA choisis réagissent avec TA oxydé et non avec TA réduit. Cette conclusion est confirmée par le fait que TA lié par covalence, traité avec NaBH4 n'est plus reconnu par l'anticorps monoclonal anti-TA.
Compte tenu de la spécificité montrée par 11B6G5, cet anticorps monoclonal est utilisé pour les études immunohistologiques. EXEMPLE 12 : DETERMINATION DE LA REACTIVITE DES ANTICORPS MONOCLONAUX AVEC DIFFERENTS ANTIGENES
Au cours d'études immunohistochimiques, il a été constaté que les AcM anti-TA de l'invention donnent une forte coloration nucléaire et en revanche une faible coloration cytoplasmique granulaire sur des cellules transformées en culture.
Pour identifier les cibles cellulaires réagissant avec ces anticorps, plusieurs séries d'expériences ont été réalisées en utilisant des antigènes nucléaires et des polynucléotides synthétiques, ainsi que des antigènes cytoplasmiques. On rapporte dans le tableau 1, les résultats obtenus avec d'une part l'AcM 13C5B6 et d'autre part TA, de l'ADN à double brin ou à simple brin, des polynucléotides synthétiques, des protéines et des cellules parmi lesquelles des cellules normales MCR5 et des cellules transformées Hela.
Les cellules Hela et les cellules MRC5 sont cultivées pendant 3 jours. A la fin de cette période, les cellules sont lavées et les études immunohistologiques sont effectuées.
Figure imgf000034_0001
L'examen des résultats montre que l'AcM de l'invention réagit avec l'ADN double brin, mais ne forme pas de complexe avec l'ADN simple brin, dans les conditions expérimentales utilisées. On observe également une réaction fortement positive avec les antigènes nucléaires (noyaux cellulaires).
Bien que les anticorps anti-ADN à double brin réagissent de façon générale avec la cardiolipine, on notera que l'AcM testé n'est pas doté de réactivité vis-à- vis de cet antigène.
Les résultats obtenus avec les polynucléotides synthétiques montrent une forte réactivité avec le poly dIdC et le poly dGdC (titres respectivement de 150 et de 330).
Avec les antigènes cytoplasmiques, aucune réaction n'est observée.
Sur le tableau 2, on donne les résultats de tests Elisa avec l'AcM 11B6G5 et l'AcM 13C5B6 sur le noyau (ny) et le cytoplasme (cyt) de MRC5 et Hela.
Figure imgf000035_0001
Les résultats présentés sur le tableau 2 montrent que ces deux anticorps monoclonaux interagissent fortement avec les composés nucléaires dans les cellules HeLa mais faiblement avec les constituants cytoplasmiques.
Avec les cellules MRC5, la réaction avec les anticorps monoclonaux est limitée aux composants nucléaires.
EXEMPLE 13 : ETUDE DU TITRE ANTI-TA DANS LES SERUMS DE PATIENTS POUR LA DETECTION DE DIVERSES PATHOLOGIES. . Détection du lupus érythémateux disséminé (LED)
On détermine le titre en anticorps anti-TA dans les sérums de patients atteints de lupus érythémateux disséminé et dans les sérums de patients normaux.
On rapporte dans le tableau 3 les titres en IgG et IgM, les titres en anticorps antinucléaires (ACAN) et ceux en anticorps anti-ADN (FARR) obtenus dans une série d'expériences sur 10 patients atteints de LED. (Dans ce tableau LED1 à 10 correspond au numéro du sérum de patients atteints de LED et Sn à des sérums normaux).
Figure imgf000037_0001
On constate que les titres en TA pour les IgG et les IgM sont plus élevés pour la majorité des sérums provenant de patients LED par rapport aux sujets normaux. Dans le tableau 4, on rapporte les résultats obtenus dans une autre série d'expériences, avec les sérums de 8 patients atteints de LED (LED n à 18), comparés à des sera normaux C3 à C22. En plus des titres en IgG et IgM, on indique les titres en IgA. On rappelle à ce propos que des travaux de Kerr dans Bioch. J. 271, 285-296, 1990 ont montré que les IgA peuvent être impliquées dans les lésions nêphropatiques.
TABLEAU 4
SEBUM Titre IgG Titre IgM Titre IgA
LED 11 2386 339088 56
LED 12 3398 1896 199
LED 13 1607 3176 15
LED 14 21215 4168 2
LED 15 200808 9130 22
LED 16 2305 2045 10
LED 17 651 0
LED 18 4185 1055 270
C3 277 565 0
C7 215 222 43
C8 . 390 431 0
C9 613 1131 0
C10 735 514 63
C11 316 397 0
C12 371 622 3
C13 849 529 7 On constate que les titres anti-TA qu'ils soient exprimés en titres IgM, IgG ou IgA sont clairement différents lorsqu'on compare les sérums normaux et ceux de patients atteints de LED.
. Détection de la thyroïdite d'Hashimoto.
Tableau 5
SERUM Titre à 500 en IgG Titre à 500 en IgM
T77098 > 106 81
T77102 > 106 178
T77103 9679 0
T77120 12479 54
T77130 8056 69
T77132 16997 586
T77140 16375 1244
T77147 19455 112
T77175 47181 340
T77198 > 106 1360
T77206 332403 36
T77220 967466 5327
T77229 36296 37
T77235 8196 47
T77249 62172 5395
T77269 14043 0
T77275 19558 0
T77312 9960 0
T77327 4662 0
T77332 12983 0
T77335 6834 0
T77340 14325 0
T77407 5179 0
T77408 7990 0
T77420 19421 0 . Détection de la syphilis
TABLEAU 6
Syphilis Titre à 500 en IgG Titre à 500 en IgM
49770 72908 220
49816 33359 569
49864 6676 675
48975 7081 34
49038 7516 1236
49115 61629 394
49148 > 106 5916
49194 6378 272
49247 4890 32
49310 7260 109
49404 5633 353
49488 5364 367
49518 8528 975
49605 44610 394
49641 17459 0
49644 5400 0
49645 5041 0
49648 1596 0
49688 9649 0
49703 5765 0
. Détection de la polyarthrite rhumatoïde
TABLEAU 7 Polyarthrite Titre à 500 en IgG Titre à 500 en IgM rhumatoïde
PI 672 0
P3 2079 0
P4 1919 2
P5 572 0
P6 2312 10
P7 3081 0
P8 1124 4
P9 1908 1
P10 126 0
P11 536 0
P12 214 0
P13 497 5
P14 2762 2
P15 1872 7
P16 3302 3
P17 1136 0
P18 2951 17
P19 1148 0
P20 2531 0
P21 3239 0
P22 2046 0
P23 1546 0
P24 6981 342
P25 2373 122
P26 4312 0
P27 2515 34
P28 1243 2
P29 2338 0
P30 2384 65
P31 1229 0 P32 2929 0
P33 3128 0
P34 2305 0
P35 1311 36
P36 4042 124
P37 4214 0
P38 3187 94
P39 1743 0
P40 2336 150
P41 2158 0
P42 1681 0
P43 871 2
P44 2168 27
P45 4201 33
P46 3267 2
P47 3802 1
P48 8308 61
P49 7125 706
P50 3275 529
P51 2773 15
P52 5973 0
P53 2353 0
P54 3330 51
P55 2270 0
P56 2608 337
P57 2033 0
P58 1679 2
Comparaison des résultats des tableaux 5, 6 et 7 avec les sérums normaux. Titre à 500 en IgG Titre à 500 en IgM
C3 863 0
C4 2487 122
C5 1785 0
C6 2171 192
C7 2681 0 C8 1372 13
C9 1242 64
C10 1878 0
C11 1236 0
C12 397 0
C13 2088 43
C14 2486 9
C15 252 0
C16 3708 9
C17 2957 3
C18 2211 0
C19 2180 12
C20 2292 108
C21 964 0
C22 3085 189 . Détermination des titres en anticorps anti-TA dans différentes maladies auto-immunes On rapporte sur les figures 7a et 7b les titres en anticorps anti TA, respectivement les titres d'IgM et d'IgG, obtenus sur 25 sérums par catégorie de maladie, pour les maladies suivantes : cirrhose biliaire primitive (CBP), myasthénie (M),
lupus erythémateux disséminé (LED), arthrite rhumatoïde (AR), syphilis (S), thyroïdite d'Hashimoto (TH). Sur ces figures T représente les résultats obtenus avec les témoins.
On constate que les titres en IgM sont toujours supérieurs à ceux du témoin, cette augmentation étant particulièrement significative dans le cas de LED, S et TH. En revanche, l'augmentation en titre IgG n'est significative que dans le cas de S ou de TH.
EXEMPLE 15 : PURIFICATION D'ANTICORPS ANTI-TA A PARTIR DE SERUM HUMAIN
On utilise des microbilles contenant TA fixé par covalence.
On laisse incuber avec un sérum humain puis, après lavage, on élue les anticorps anti-TA fixés à l'aide d'un tampon de pH 2,2.
La quantité de protéine éluée et la réactivité vis-à-vis de TA mesurée en ELISA des anticorps élues sont rapportées respectivement sur les figures 8 et 9. Sur ces figures on indique les valeurs de DO (à 280 nm pour la figure 8 et à 405 nm pour la figure 9) en fonction de la quantité de produit élue en ml. EXEMPLE 16 : UTILISATION DES AcM COMME REACTIFS BIOLOGIQUES
On a étudié par Western blot la réactivité d'AcM anti-TA avec des antigènes cellulaires. On utilise des antigènes (1) de cellules MRC5 (après 48 h de culture) (2), de cellules MRC5 (après 48 h de culture avec 100 mM de TA, (3) de cellules Hela (après 48 heures de culture) et (4) de cellules Hela (après 48 heures de culture avec 100 mM de TA). Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 10, la partie A correspondant aux expériences réalisées dans des conditions dénaturantes, et la partie B dans des conditions non dénaturantes.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont capables de réagir spécifiquement avec TA sous forme oxydée en donnant lieu à un complexe du type antigène-anticorps.
2/ Anticorps monoclonaux selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils forment un complexe de type antigène-anticorps avec TA oxydé, sous forme R et/ou sous forme S.
3/ Anticorps monoclonaux selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils réagissent avec de l'ADN à double brin et que dans les mêmes conditions ils ne forment pas de complexe du type antigène-anticorps avec de l'ADN simple brin. 4/ Anticorps monoclonaux selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que :
- ils appartiennent à la classe des IgM, des IgG ou des IgA,
- ils possèdent un PM d'environ 160000 pour les IgG, de l'ordre de 800 à 900000 pour les IgM et de l'ordre de 160 à 320000 pour les IgA, 5/ Fragments des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en particulier fragments constitués par la partie Fab ou encore tels qu'isolés à partir de la partie Fab dès lors qu'ils sont capables d' interagir spécifiquement avec TA oxydé.
6/ Anticorps monoclonaux anti-TA du type des anticorps monoclonaux susceptibles d'être induits par un procédé comprenant les étapes : - de fusion de cellules productrices d'anticorps dirigés contre TA oxydé avec des cellules de myélome de souris, - de sélection des hybridomes capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis de TA oxydé,
- de clonage de ces hybridomes, et - de purification des anticorps monoclonaux tels que produits à partir de liquides d'ascites de souris ou de milieux de culture, ces étapes étant précédées le cas échéant par l'immunisation d'un animal, selon les techniques classiques, avec du TA avantageusement couplé à une substance immunogène.
7/ Anticorps monoclonaux produits respectivement par les clones 11B6G5, 13C5B6 et 22D3D7 de l'exemple 10.
8/ Anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-TA, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés à partir d'un pool hétérogène d'immunoglobulines ou encore à partir d'une population hétérogène de lymphocytes sécrétant ces anticorps, ces lymphocytes sécréteurs étant le cas échéant immortalisés par un virus tel que EBV.
9/ Souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8.
10/ Souches d'hybridomes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion des cellules de myélome de souris avec une cellule de souris produisant des anticorps, après immunisation de la souris avec TA couplé à la substance immunogène, lesdites cellules hybrides étant capables de produire des anticorps spécifiques anti-TA.
11/ Anticorps polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont formés d'une population d'anticorps réagissant spécifiquement avec TA oxydé en donnant lieu à des complexes du type antigène-anticorps.
12/ Procédé d'obtention d'anticorps polyclonaux selon la revendication 11 par induction expérimentale par injection à un animal d'un immunogène artificiel comportant TA fixé.
13/ Lymphocytes sécréteurs d'anticorps anti-TA immortalisés par exemple avec un virus tel que EBV par induction naturelle à partir d'immunogènes naturels renfermant TA tel que le complexe PDH, E2.
14/ Produits de couplage comprenant des anticorps monoclonaux anti-TA entiers ou leurs fragments liés par covalence à un support insoluble, de forme quelconque, notamment sous forme de plaques ou de billes.
15/ Produits de couplage comprenant des anticorps polyclonaux anti-TA, ou leurs fragments, liés par covalence à un support insoluble, de forme quelconque, notamment sous forme de plaques ou de billes.
16/ Produits de couplage selon la revendication 14 ou 15 caractérisés en ce que les anticorps monoclonaux ou leurs fragments sont fixés directement au support insoluble ou en variante sont fixés à ce support par l'intermédiaire d'un composé bifonctionnel jouant le rôle d'un bras de couplage de longueur appropriée pour maintenir la réactivité de la molécule fixée, le composé bifonctionnel étant notamment une protéine, un polysaccharide, une glycoprotéine ou encore un glycolipide, ou selon une autre variante, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, et le cas échéant le composé bifonctionnel lorsqu'il est présent, sont adsorbés sur le support insoluble.
17/ Produits de couplage selon l'une des revendications 14 à 16 caractérisés en ce que le support insoluble est un matériau macromoléculaire substitué, par des groupes fonctionnels susceptibles de réagir avec l'AcM, ou le composé bifonctionnel lorsqu'il est présent. 18/ Produits de couplage comprenant TA fixé par covalence à un support insoluble selon la revendication 16 ou 17, par l'intermédiaire d'un composé polyfonctionnel ne présentant pas d' activité enzymatique choisi notamment parmi une protéine, une glycoprotéine, un glycolipide ou un polysaccharide, ce composé polyfonctionnel étant couplé de manière covalente au support insoluble ou étant adsorbé sur ce support.
19/ Produit de couplage selon la revendication 17, comprenant TA couplé à un support insoluble par l'intermédiaire d'une protéine telle que la gélatine, cette dernière étant le cas échéant adsorbée sur le support.
20/ Méthode de détection in vitro de TA, libre ou lié à une molécule biologique, caractérisée par :
- la mise en contact de l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, ou de leurs fragments selon 1'une quelconque des revendications 1 à 8 ou 11, le cas échéant sous forme d'un produit de couplage selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et - la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre TA et l'AcM, cette mise en évidence étant réalisée en particulier en utilisant aux fins de compétition TA marqué par exemple par un groupe fluorescent, radioactif, ou une enzyme, ou tout autre groupe pouvant être révélé, ce groupe étant le cas échéant porté par une protéine ou une glycoprotéine liée à TA. 21/ Kit pour le diagnostic in vitro de la présence de TA dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d'AcM monoclonaux ou polyclonaux libres ou immobilisés, comme défini ci-dessus, - une préparation de TA avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur,
- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
22/ Kit pour le diagnostic in vitro de la présence de TA dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, libres ou immobilisés, comme défini ci-dessus,
- une préparation de TA avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur,
- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. 23/ Anticorps monoclonaux et leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 radiomarqués.
24/ Utilisation des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8 pour la détection d'anticorps anti-idiotypes dans les sérums.
25/ Anticorps anti-idiotypes anti-TA, caractérisés par leur capacité à réagir spécifiquement avec les anticorps monoclonaux anti-TA selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8.
26/ Application des anticorps monoclonaux anti-TA et de leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 en tant que réactifs de laboratoire.
27/ Méthode de détection in vitro d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-TA dans un échantillon biologique, caractérisée par l'utilisation de TA lié sur un support insoluble tel que défini dans les revendications 18 ou 19, et comprenant plus particulièrement :
- la mise en contact d'un échantillon biologique avec un produit de couplage tel que défini ci-dessus sur lequel est couplé TA, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe de type antigène-anticorps, et la mise en évidence de la réaction immunologique éventuelle entre les anticorps anti-TA présents dans l'échantillon biologique et le complexe comportant TA.
28/ Kit pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-TA dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation de TA couplé tel que défini dans la revendication 18 ou 19, une préparation d'un anticorps marqué autre qu'un anticorps anti-TA réagissant avec les Ig à mettre en évidence,
- un système de détection spécifique de l'anticorps marqué, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
29/ Application des méthodes et/ou kits selon l'une quelconque des revendications 20, 21, 22, 27 et 28 en cancérologie, virologie, dans les pathologies de maladies auto-immunes.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2331567A1 (fr) * 1975-11-13 1977-06-10 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau procede de fixation chimique sur un support, de composes organiques comportant un residu glucidique et produits obtenus par ce procede
EP0044441A1 (fr) * 1980-07-17 1982-01-27 Miles Laboratories, Inc. Anticorps monoclonaux pour médicaments, procédés pour leur préparation et cellules somatiques hybridomes les sécrétant

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