ES2354436T3 - Un complejo polipeptídico fluorescente de 40 a 500 nm de tamaño. - Google Patents

Abstract

Un método para fabricar un complejo polipeptídico fluo-rescente esférico que se caracteriza por que un polipéptido fluorescente aislado es reticulado inter-molecularmente consigo mismo o con uno o más polipéptidos y donde dicho complejo es de 40 a 500 nm de tamaño, de manera que el método comprende las etapas de a) aportar al menos un polipéptido fluorescente aisla-do y opcionalmente un segundo polipéptido b) añadir un reactivo reticulante químicoc) terminar la reacción una vez se haya obtenido un complejo polipeptídico del tamaño deseado, y d) aislar el complejo obtenido en la etapa (c)

Description

La presente invención se refiere a un método para fa-bricar un complejo polipeptídico fluorescente esférico que se caracteriza por que un polipéptido fluorescente aislado es reticulado consigo mismo intermolecularmente o bien con uno o más polipéptidos y porque dicho complejo es de 40 nm 5 a 500 nm de tamaño. También hace referencia a un complejo que se puede obtener por dicho método, a los conjugados que comprenden dicho complejo polipeptídico fluorescente y al uso de dicho complejo o conjugado.

Los colorantes fluorescentes se encuentran entre las 10 clases de moléculas que se utilizan con mayor frecuencia y son realmente importantes en el etiquetado o marcado y en la detección de las biomoléculas. Dichos colorantes o mar-cadores fluorescentes se pueden clasificar en colorantes fluorescentes orgánicos de bajo peso molecular por un lado, 15 y en biomoléculas de medio a elevado peso molecular, las proteínas o polipéptidos fluorescentes por otro lado.

La sensibilidad que se puede conseguir, por ejemplo, en un inmunoanálisis usando un colorante fluorescente como un marcador depende considerablemente del número y de la 20 eficacia de las moléculas fluorescentes presentes en el elemento de enlace específico utilizado en el sistema de

detección, por ejemplo, en un anticuerpo utilizado en un inmunoanálisis. En general se acepta que exista una densi-dad más bien óptima baja de fluoróforos de peso molecular bajo que se puedan introducir en, por ejemplo, un anticuer-po. Esto es debido al hecho de que el sobre-marcaje provoca 5 efectos negativos como una elevada tinción del fondo, la extinción de la fluorescencia y/o un enlace reducido del anticuerpo con su antígeno.

Se han realizado grandes esfuerzos en la técnica que han conducido a una ligera mejoría en los métodos de detec-10 ción de fluorescencia. Un intento se ha centrado en el aco-plamiento de moléculas fluorescentes de bajo peso molecular a biopolímeros y el posterior acoplamiento de dichos bio-polímeros marcados a un elemento o miembro de un par de en-lace biológico, por ejemplo, a un anticuerpo. La patente 15 americana 4.169.137 revela que los reactivos de esqueleto polimérico polifuncional que contienen aminas primarias, por ejemplo, polietilenimina o poli-L-lisina se pueden uti-lizar para lograr un biopolímero que está marcado de forma intensiva con un colorante fluorescente de bajo peso mole-20 cular, por ejemplo, con un isotiocianato de fluoresceína, (FITC).

Los derivados de dextrano fluorescentes se han utili-zado para incrementar la intensidad de fluorescencia y en el comercio se dispone de numerosos derivados de dextrano 25 fluorescentes. Ver el “Handbook of fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th edition, R.P. Haughland, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. 97402(1996). Los derivados de

dextrano fluorescentes constan de dextranos solubles (es decir, dextranos con un peso molecular de 10.000, 40.000, 70.000, 500.000 y 2.000.000 Daltons) conjugados con diver-sos colorantes fluorescentes como la fluoresceína, dansyl, rodamina y Rojo de Texas. Los grados de sustitución en es-5 tos derivados de dextrano fluorescentes son 1-2 moléculas de colorante por dextrano de 10.000 Daltons, 2-4 moléculas de colorante por dextrano de 40.000 Daltons, 3-6 moléculas de colorante por dextrano de 70.000 Daltons, aproximadamen-te 64 moléculas de colorante por dextrano de 500.000 Dal-10 tons, y unas 134 moléculas de colorante por dextrano de 2.000.000 Daltons. Grados superiores de sustitución tienden a conducir a la extinción de la fluorescencia y/o a unas interacciones no específicas. Los derivados de isotiociana-to de fluoresceína (FITC) de dextrano o de poli-L-lisina 15 con grados de sustitución que oscilan entre 0,003 y 0,020 moléculas de FITC por molécula de glucosa y entre 0,003 y 0,01 moléculas de FITC por molécula de residuo de lisilo se encuentran disponibles en el comercio procedentes de empre-sas como Sigma Chemical Company. 20

Otro intento por incrementar la intensidad de fluores-cencia utilizaba la rodamina como colorante fluorescente, ver Shechter, Y., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 75(1978)2135-2139. Se obtenían intensidades de fluorescen-cia superiores a las normales para hormonas peptídicas como 25 la insulina y un factor de crecimiento epidérmico por el enlace covalente de estos péptidos a las moléculas alfa-lactalbúmina que eran sustituidas por moléculas de rodamina

(por ejemplo, 7:1). Esto se realizaba mientras se mantenía afinidad de enlace de cada hormona por su receptor (que es uno de los requisitos básicos de cualquier procedimiento de marcaje).

Aumentar el número de moléculas o partículas de marca-5 je no siempre funciona. Por ejemplo, H.M. Shapiro describe un intento de incrementar las señales de fluorescencia Por Tomas Hirschfeld y cols., en Block Engineering, donde va-rios cientos de moléculas de fluoresceína se acoplaban a un polímero sintético, la polietilenimina, que luego se conju-10 gaba con un anticuerpo. El método no funcionaba porque la emisión de fluorescencia de las moléculas de fluoresceína se extinguía debido a las cortas distancias entre fluorófo-ros en la misma molécula de polímero. Ver “Practical Flow Cytometry”, tercera edición, H.M. Shapiro, Wiley-Liss, New 15 York, 1995, p.277.

Aunque obviamente es posible introducir una gran can-tidad de colorantes fluorescentes de bajo peso molecular en un conjugado deseado, el gran inconveniente incluso en la actualidad parece ser la extinción de la fluorescencia que 20 se produce si varias moléculas de colorante fluorescente de bajo peso molecular están demasiado próximas.

Un intento alternativo consiste en utilizar partículas de látex que se marcarán con moléculas de colorante fluo-rescentes de poco peso molecular. Las ventajas de dichas 25 microesferas marcadas se han descrito, por ejemplo, en US 5.516.635. Mientras que dichas partículas parecen aportar una mayor sensibilidad en los análisis, debido muy proba-

blemente a una extinción reducida de la fluorescencia, di-chas partículas en ciertas configuraciones pueden tener al-gunos inconvenientes como dificultades en una producción reproducible de dichas partículas marcadas de látex, pro-blemas en estabilidad, alguna fuga de colorante fluorescen-5 te que sale de dichas partículas y unos efectos no deseados provocados por el propio látex en sí.

Los polipéptidos o las proteínas de medio a elevado peso molecular son bastante diferentes de los colorantes fluorescentes de bajo peso molecular anteriormente comenta-10 dos y por tanto requieren consideraciones y métodos distin-tos. Dicha proteína fluorescente puede transportar hasta 30 cromóforos por molécula. Por ejemplo, se ha descrito que la ficoeritrina (PE), un elemento de la familia de las ficobi-liproteínas, puede tener hasta 34 cromóforos asociados. Un 15 anticuerpo conjugado a la PE puede, por ejemplo, ser utili-zado en un inmunoanálisis en placa fluorescente y dicho análisis ha resultado ser bastante sensible (Custer, M.C., y Lotze, M.T., J. Immunol. Methods 128(1990) 109-117).

Las ficobiliproteínas son proteínas captadoras de luz 20 del grupo de los ficobilisomas anclados en los tilacoides de las cianobacterias y de las algas rojas. Estos recogen la energía de la luz visible y la canalizan al sistema fo-tosintético de la clorofila. Debido a sus excepcionales propiedades fotosintéticas son de gran interés en los pro-25 cedimientos para la detección de la fluorescencia.

Las biliproteínas comprenden normalmente 2 a 3 subuni-dades diferentes, donde las subunidades pueden oscilar en-

tre 10.000 y 60.000 Dalton en peso molecular.

Tal como se ha mencionado antes las ficobiliproteínas están comprendidas por 2 a 3 subunidades diferentes. Por ejemplo, la APC nativa consiste en 6 subunidades de ficobi-liproteínas que constituyen la 104-kDa ficobiliproteína 5 APC.

Se sabe que la APC nativa se disocia en subunidades monoméricas en la mayoría de las condiciones de análisis (por ejemplo, en el caso de una concentración tampón y/o proteínica baja). Esta inestabilidad por ejemplo en los 10 tampones fisiológicos representa un inconveniente importan-te del APC nativo.

Se ha descubierto que los preparados de APC pueden ser estabilizados mediante la reticulación intramolecular del APC. Los preparados de aloficocianina estabilizados y reti-15 culados (conocidos aquí como XL-APC) fueron desarrollados por Glazer y Ong para hacer este colorante más adecuado pa-ra ser utilizado en el inmunoanálisis (Ong, L.J., y Glazer, A.N.,Physiol. Veg. 23(1985)777-787). Dichos autores tomaban un preparado estándar de APC y lo trataban con un agente 20 químico reticulante, el 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC/EDC), de manera que un promedio de una subunidad alfa se enlazaba a una subunidad beta formando un enlace covalente. Luego el producto se desnaturalizaba con urea 8M para disociarlo en sus componentes: las subunidades 25 monoméricas alfa y beta y las subunidades diméricas alfa-beta. Los dímeros unidos por medio de un enlace covalente se separaban de los monómeros usando una filtración en gel

y la electroforesis desnaturalizante, y luego los dímeros se colocaban en un entorno que les permitía re-asociarse en un complejo (αß)3 que presentaba una estabilidad inusual-mente elevada en comparación con el APC nativo. El material resultante se conoce como XL-APC. Este material ha incre-5 mentado su estabilidad en presencia de sales caotrópicas (como el perclorato sódico) o bien en concentraciones míni-mas de tampón si se compara con el APC nativo. Cuando cir-cula sobre un gel desnaturalizante, la mayor parte del ma-terial circula como una banda simple que equivale al dímero 10 αß unido covalentemente. Se sabe que cuanto mayor es el porcentaje de subunidades dímeras αß, mejor es la utilidad del XL-APC. Una serie de preparados XL-APC están disponi-bles en el comercio. Tienen unos porcentajes distintos de dímeros αß estabilizados mediante un enlace covalente, to-15 dos ellos con un porcentaje superior al 50% de dímero en el producto final.

Recientemente se ha demostrado (WO 01/96383) que se puede obtener una APC de intensidad fluorescente elevada si la purificación de dicho APC se realiza en las condiciones 20 que evitan la exposición de las biliproteínas a agentes fuertemente caotrópicos. Dicho APC reticulado, de una ele-vada intensidad fluorescente, resulta ser un 28% más efec-tivo en términos de eficiencia cuántica de fluorescencia si se compara con un APC obtenido por los métodos previamente 25 aplicados. Este APC (conocido como APC1) retiene la misma estructura trimérica (αß)3 que el APC pero incorpora un en-lazador peptídico 10-kDa al núcleo de la molécula. Al igual

que para el APC estándar también es necesario reticular el APC1 para producir una etiqueta de estabilidad suficiente en las condiciones de análisis rutinarias.

La US 5.891.741 revela que es posible utilizar amino-dextrano con una característica de activación especial para 5 introducir hasta 20 moléculas de PE en dicho aminodextrano. Cuando dicho PE-aminodextrano se etiqueta a un anticuerpo de interés ello conduce a un incremento en la sensibilidad del análisis del orden de 2,2 a 5,6 veces. Este incremento en sensibilidad se debe al gasto de utilizar aminodextrano 10 y por lo tanto puede estar sujeto a interferencias causadas por este reactivo portador. También parece que para ciertas aplicaciones la sensibilidad conseguida por dicho método no es suficiente.

Un método alternativo para superar los problemas que 15 surgen con respecto a la sensibilidad de los análisis usan-do ficobiliproteínas purificadas ha sido el uso de los lla-mados ficobilisomas tal como se describen en EP 821 742. Los ficobilisomas son complejos de ficobiliproteínas y po-lipéptidos incoloros que funcionan como las principales an-20 tenas receptoras de luz en las algas rojas y azul verdosas (Gantt, E. BioScience 25 (1975)781-788). El criterio prin-cipal para la integridad funcional de estos complejos es la demostración de que exhiben una transferencia de energía altamente eficaz entre ficobiliproteínas, por ejemplo, en 25 los ficobilisomas de Porphyridium cruentum de ficoeritrina (PE) a ficocianina (PC) y finalmente a aloficocianina (APC). Los polipéptidos incoloros están implicados en el

montaje y posicionamiento de las ficobiliproteínas dentro de los ficobilisomas para una estabilidad y transferencia de energía apropiada.

Los ficobilisomas de diferentes organismos comparten una serie de propiedades comunes, que incluyen: (1) “pesos 5 moleculares complejos” extremadamente altos (5-20x106 Dal-tons), es decir, el peso de un mol de un complejo de fico-bilisoma comprendido por múltiples moléculas; (2) múltiples máximos de absorción en la gama visible del espectro elec-tromagnético; (3) elevadas absortividades molares 10 (emax>107M-1cm-1); (4)eficiente transferencia de energía vi-bracional direccional (>90%) entre las ficobiliproteínas constituyentes, frecuentemente desde una o más especies de sensibilización hasta un elemento aceptor terminal capaz de fluorescencia; (5) grandes cambios o variaciones de Stoke 15 respecto a las ficobiliproteínas aisladas; (6) eficiencias cuánticas elevadas de las ficobiliproteínas constituyentes; (7)elevada solubilidad en tampones acuosos; y (8)estructuras del núcleo que contienen aloficocianina.

Los ficobilisomas aislados se disocian fácilmente en 20 ficobiliproteínas y en una variedad de complejos ficobili-proteínicos en las condiciones más favorables. Como para el APC purificado se tienen que tomar medidas para estabilizar los ficobilisomas, por ejemplo, por reticulación intramole-cular. 25

Como el experto apreciará los ficobilisomas son difí-ciles de purificar y aislar y todavía más de caracterizar debido a su variación en el peso molecular así como en la

composición polipeptídica.

Por lo tanto una tarea de la presente invención con-sistía en conseguir un método que en la práctica conduzca a un complejo polipeptídico fluorescente que al menos supere parcialmente los problemas mencionados. 5

Se ha descubierto que algunos de los inconvenientes ya conocidos se pueden superar mediante un método para produ-cir un complejo polipeptídico fluorescente esférico que se caracterice por un polipéptido fluorescente aislado, reti-culado inter-molecularmente consigo mismo o con uno o más 10 polipéptidos para dar lugar a un complejo de 40 a 500 nm de tamaño.

La presente invención también hace referencia a un complejo polipeptídico fluorescente esférico que comprende un polipéptido fluorescente aislado que está reticulado in-15 ter-molecularmente consigo mismo o con uno o más polipépti-dos y que tiene un tamaño de 40 a 500 nm.

Como apreciará el experto, el complejo polipeptídico de la presente invención es esférico. El tamaño del comple-jo polipeptídico corresponde al tamaño medio. En otras con-20 figuraciones preferidas de la presente invención el tamaño medio del complejo polipeptídico conforme a la presente in-vención se situará entre 50 y 400 nm, es decir se preferirá un tamaño medio entre 55 y 350 nm o bien de unos 60 nm o algo superior pero siempre inferior a 300 nm. 25

La presente invención se refiere además a un conjugado que comprende el complejo polipeptídico fluorescente de la invención y un elemento de un par enlazante.

Se prefiere el complejo polipeptídico fluorescente conforme a la presente invención o bien un conjugado que comprenda dicho complejo, que se pueda utilizar como eti-queta o marcador fluorescente en un análisis o prueba es-pecífica de enlace. Estos usos representan otras configura-5 ciones preferidas conforme a la presente invención.

Tal como se ha indicado antes, en una primera y prefe-rida configuración la presente invención hace referencia a un método para fabricar un complejo polipeptídico fluores-cente esférico caracterizado por un polipéptido fluorescen-10 te aislado, reticulado inter-molecularmente consigo mismo o con uno o más polipéptidos para dar lugar a un complejo de 40 a 500 nm de tamaño.

La parte polipeptídica del complejo polipeptídico fluorescente conforme a la presente invención consiste pre-15 feriblemente en al menos un 30% en peso de al menos un po-lipéptido fluorescente aislado. Se prefiere que se trate de al menos un 40% en peso del polipéptido total y que este porcentaje sea preferiblemente de un 50% en peso o supe-rior. 20

“Un polipéptido fluorescente” equivale a un polipépti-do fluorescente que tiene un peso molecular entre 10.000 Dalton y 300.000 Dalton y es capaz de emitir luz fluores-cente después de la excitación apropiada.

El término “aislado” se utiliza para indicar que se 25 han utilizado métodos bioquímicos rutinarios para purificar un polipéptido fluorescente, por ejemplo, de fuentes natu-rales, a una homogeneidad o pureza deseadas. El término

aislado se entenderá como que al menos contiene un 75% de la proteína deseada en lo que se refiere al contenido. El polipéptido fluorescente aislado más preferido tiene una pureza de cómo mínimo un 90% o de al menos un 95%, respec-tivamente. 5

Los polipéptidos fluorescentes preferidos se eligen de los grupos de proteínas fluorescentes conocidos como las proteínas fluorescentes verdes, las proteínas fluorescentes rojas o las ficobiliproteínas.

Ejemplos de proteínas fluorescentes verdes (GFPs) son 10 la Aequorea GFP, Renill GFP, y Phialidium GFP, un ejemplo de una proteína fluorescente roja (RFP) es la Discosima RFP, respectivamente. Las proteínas fluorescentes que están relacionadas con una GFP o una RFP, por ejemplo la proteína fluorescente de ciano (CFP) o la proteína fluorescente ama-15 rilla (YFP), relacionada con Aequorea GFP, estarán compren-didas también en las GFP o RFP. Preferiblemente la GFP y la RFP se relacionan con los polipéptidos fluorescentes men-cionados específicamente en este párrafo.

Información detallada sobre el uso de las GFP se pue-20 de hallar, por ejemplo, en la WO98/36099, en la que un li-gando marcado con GFP se utiliza para la detección de un objetivo. Este ligando marcado consta de una etiqueta se-leccionada del grupo que consiste en una proteína fluores-cente verde y una variante fluorescente del mismo, y un li-25 gando configurado para enlazarse al objetivo. Las técnicas como la microscopía fluorescente se utilizarán para visua-lizar el marcador etiquetado. La clase o el tipo de las así

llamadas ficobiliproteínas (a veces conocidas como bilipro-teínas) representa una clase preferida mayoritariamente de polipéptidos fluorescentes conforme a la presente inven-ción.

Las ficobiliproteínas son aisladas entre una amplia 5 variedad de algas y cianobacterias. Muchas ficobiliproteí-nas se encuentran disponibles en los comercios procedentes de diversas fuentes como son: Molecular Probes, Inc., Euge-ne, oreg. and Prozyme, Inc., San Leandro, Calif. Como el nombre indica, las ficobiliproteínas tienen un polipéptido 10 o parte proteínica, cuya presencia aporta una gama amplia de grupos funcionales para la conjugación a moléculas pro-teináceas y no-proteináceas. Los grupos funcionales que están presentes incluyen el grupo amino, tiol y carboxilo. En algunos casos, puede ser deseable introducir más grupos 15 funcionales, en particular grupos tiol cuando la ficobili-proteína se ha de conjugar a otra proteína.

Ejemplos de ficobiliproteínas útiles en la presente invención son la aloficocianina, la ficocianina, R-ficoeritrina, aloficocianina B, ficoeritrocianina y B-20 ficoeritrina. Preferiblemente, se utiliza la aloficocianina en un método conforme a esta invención.

Tal como se ha descrito antes, la reticulación intra-molecular es una ventaja para estabilizar una ficobilipro-teína. 25

Se puede hacer referencia a la ficobiliproteína com-puesta por 2 a 3 subunidades distintas de ficobiliproteínas como un monómero de ficobiliproteína. A modo de ejemplo, el

monómero de APC consiste en 6 subunidades de ficobilipro-teínas, mientras que el monómero APC1 consiste en 6 subuni-dades de ficobiliproteínas y adicionalmente el polipéptido enlace 10 kDa.

Preferiblemente, el polipéptido fluorescente aislado 5 utilizado en un método conforme a la presente invención es un monómero de ficobiliproteína.

Se prefiere también que la ficobiliproteína utilizada para fabricar el complejo polipeptídico fluorescente con-forme a la presente invención sea una ficobiliproteína don-10 de las subunidades α y ß se unan mediante un enlace cova-lente. El polipéptido fluorescente más preferido es el APC o APC1, en el que las subunidades α y ß están enlazadas den un APC o APC1, como en XL-APC o XL-APC1, respectivamen-te, comprendiendo cada una de ellas tres subunidades α y 15 tres subunidades ß. La reticulación entre las subunidades de una proteína fluorescente, por ejemplo, entre las sub-unidades α y ß del APC tal como se conocen, es una reticu-lación intra-molecular, que, por ejemplo, está dentro del monómero APC. Por el contrario la reticulación conforme a 20 la presente invención tiene lugar entre varios monómeros de un polipéptido fluorescente, como por ejemplo XL-APC, lo que da lugar a un complejo polipeptídico altamente polimé-rico, que comprende varios monómeros APC.

Alternativamente, un polipéptido fluorescente aislado 25 se puede reticular con uno o más polipéptidos. El polipép-tido puede ser un polipéptido que trabaje como una molécula soporte o portador, por ejemplo, puede ser una albúmina de

suero bovino. Preferiblemente, el o los polipéptidos se se-leccionarán del grupo compuesto por un miembro de un par de enlace, y/o de un segundo polipéptido fluorescente aislado.

En ciertas configuraciones será una ventaja que el complejo polipeptídico fluorescente conforme a la presente 5 invención comprenda al menos otra molécula fluorescente. Dicha molécula fluorescente puede ser o bien un colorante de bajo peso molecular o bien otra proteína fluorescente. Preferiblemente la molécula fluorescente es un segundo po-lipéptido fluorescente. Tal como apreciará el experto dicho 10 segundo polipéptido fluorescente se elige para conseguir suficiente solapamiento en su espectro de emisión o absor-ción con el espectro de absorción o emisión, respectivamen-te, del primer polipéptido fluorescente. Se puede conseguir así una fluctuación mayor de la longitud de onda entre la 15 longitud de onda de absorción y emisión. Las ventajas de dicha fluctuación son bien conocidas y se recogen en WO 93/03062.

El polipéptido más preferido es un agente enlazante específico, por ejemplo, un miembro de un par específico de 20 enlace.

Un agente enlazante específico tiene al menos una afi-nidad de 107L/mol hacia su correspondiente molécula objeti-vo. El agente enlazante específico tiene preferiblemente una afinidad de 108L/mol o incluso 109L/mol por su molécula 25 objetivo. Tal como apreciará el experto el término especí-fico se utiliza con frecuencia para indicar además que existen otras biomoléculas distintas de la molécula objeti-

vo presente en una muestra que no se enlazan de forma sig-nificativa al agente enlazante específico. Preferiblemente el nivel de enlace a una biomolécula que no sea la molécula objetivo da lugar a una afinidad de enlace que es meramente el 10%, más preferiblemente el 5% de la afinidad por la 5 molécula objetivo o menos. El agente específico preferido cumplirá los criterios preferidos mencionados en cuanto a la afinidad y a la especificidad.

Los dos miembros o socios de un par de enlace especí-fico son los ejemplos mejor conocidos de los agentes de en-10 lace específicos. Los pares de enlace bien conocidos y ade-cuados en biología, bioquímica o inmunoquímica son el hap-teno o el antígeno/anticuerpo, biotina o análogos de bioti-na como el aminobiotina, iminobiotina o destiobioti-na/avidina o estreptavidina, azúcar/lectina, ácido nucleico 15 o análogo del ácido nucleico/ácido nucleico complementario, receptor/ligando, por ejemplo, receptor de la hormona este-roidea/hormona esteroidea. Se pueden preferir estos pares de enlace como pares de enlace bioafines. Los miembros de los pares de enlace preferidos son un hapteno o un antígeno 20 y un antígeno que se enlazan a este hapteno o antígeno, respectivamente.

También se prefieren los agentes de enlace específicos que se obtienen por visualización de los fagos (ver, por ejemplo, Allen, J.B., et al., TIBS 20(1995)511-516). 25

Preferiblemente, el miembro de un par de enlace se se-lecciona del grupo formado por un anticuerpo y un hapteno.

El término anticuerpo hace referencia a un anticuerpo

policlonal, a un anticuerpo monoclonal, a fragmentos de di-chos anticuerpos, así como a los elementos genéticos que comprenden el dominio de enlace de un anticuerpo. Se puede utilizar cualquier fragmento de anticuerpo que retenga los criterios mencionados de un agente de enlace específico. 5

Los anticuerpos son generados por los procedimientos más novedosos, por ejemplo, tal como se describen en Tijs-sen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoas-says 11(1990), todo el libro, especialmente las páginas 43-78; Elsevier, Amsterdam). 10

Los haptenos son pequeñas moléculas con un peso mole-cular inferior a 2kDa, preferiblemente interior a 1,5 kDa y más preferiblemente inferior a 1 kDa. Un hapteno en sí no es inmunogénico. Sin embargo, cuando se conjuga con las moléculas apropiadas, dichos conjugados se pueden utilizar 15 para dar lugar al hapteno inmunogénico y por consiguiente generar una respuesta inmune apropiada. Se conocen los an-ticuerpos policlonales así como monoclonales frente a los haptenos de diversas clases. Por ejemplo, haptenos bien co-nocidos son la fluoresceína, el dinitrofenilfosfato, las 20 hormonas esteroidales, muchos fármacos de bajo peso molecu-lar, la digoxina y digoxigenina.

Un método para fabricar el complejo polipeptídico fluorescente esférico conforme a la presente invención com-prende preferiblemente las etapas de 25

a) aportar al menos un polipéptido fluorescente aisla-do y opcionalmente un segundo polipéptido

b) añadir un reactivo reticulante químico

c) terminar la reacción una vez se haya obtenido un complejo polipeptídico del tamaño deseado, y

d) aislar el complejo obtenido en la etapa (c)

Mientras que es posible aislar y purificar el complejo polipeptídico fluorescente reticulado intermolecularmente y 5 después utilizar dicho complejo purificado para enlazarlo a una biomolécula, por ejemplo, a un miembro de un par de en-lace, es también posible pre-polimerizar al menos un primer polipéptido fluorescente aislado y opcionalmente al menos un segundo polipéptido y después añadir a esta mezcla de 10 reacción un elemento o miembro de enlace de un par de enla-ce. Este método comprende preferiblemente las etapas de

a) aportar al menos un polipéptido fluorescente aisla-do y opcionalmente un segundo polipéptido

b) añadir un reactivo reticulante químico 15

c) añadir un miembro o elemento de un par de enlace

d) terminar la reacción una vez se haya obtenido un complejo polipeptídico del tamaño deseado, y

e) aislar el complejo obtenido en la etapa (d)

El complejo polipeptídico fluorescente conforme a la 20 presente invención tiene un tamaño de 40 a 500 nm. El tama-ño indicado se refiere al tamaño medio puesto que como apreciará el experto existe siempre una gama o distribución en el tamaño. Se sabe que la determinación del tamaño puede depender de los criterios utilizados al evaluar el tamaño. 25 Para evaluar el tamaño de un complejo polipeptídico confor-me a la presente invención se ha utilizado la espectrosco-pia de correlación de fotones (PCS) en las siguientes con-

diciones. El material de muestra se diluye en cloruro sódi-co 1 mM tal como ha recomendado el fabricante del instru-mento PSC (Malvern Zetasizer HSa) y el análisis de tamaños se ha realizado de un modo automático.

Un complejo polipeptídico fluorescente esférico fabri-5 cado conforme a la presente invención tiene unas ventajas significativas en cuanto a sensibilidad, si se compara con los conjugados más novedosos. Esto se demuestra en los ejemplos aportados.

El reactivo de reticulación química y por lo tanto el 10 modo y la estrategia del acoplamiento químico intermolecu-lar se puede seleccionar según se requiera. Las químicas de acoplamiento cuyos elementos de referencia son los residuos –SH, -NH2, ó –COO- así como el grupo –OH de las tirosinas, el grupo imidazol de las histidinas o los grupos imino 15 heterocíclicos de los triptófanos son ya conocidos. Varias químicas de acoplamiento apropiadas se conocen por sus técnicas para cada uno de estos grupos funcionales (Aslam, M.Dent,A., The preparation of protein-protein conjugates in “Bioconjugation”(1998)216-363, London, McMillan). 20

Para muchas aplicaciones la sensibilidad y la estabi-lidad de un complejo polipeptídico fluorescente tal como se ha fabricado en anteriores métodos es suficiente. Sin em-bargo, en algunas aplicaciones es crucial la estabilidad a largo plazo. Se ha averiguado sorprendentemente que una 25 etapa adicional de reticulación del complejo mencionado puede ser una gran ventaja en cuanto a la estabilidad. El método conforme a la presente invención comprende preferi-

blemente la etapa de añadir un reactivo reticulante adicio-nal tan pronto se ha obtenido el complejo polipeptídico fluorescente de 40 a 500 nm. De este modo el complejo poli-peptídico fluorescente se reticula todavía más intermolecu-larmente y luego se estabiliza. Los reactivos reticulantes 5 químicos preferidos en esta segunda etapa de reticulación son los ésteres NHS homobifuncionales, y los imidoésteres homobifuncionales. Más preferiblemente, el suberato disuc-cinimilo (DSS) o bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3).

En otra configuración preferida la presente invención 10 se refiere al uso de un conjugado que comprende el complejo polipeptídico fluorescente conforme a la presente invención y el miembro de un par de enlace biológico en un análisis de enlace específico.

Los sistemas matriciales para pruebas en los que se 15 detectan en paralelo varios analitos (por ejemplo, polinu-cleótidos o moléculas detectables inmunológicamente) son cada día más importantes. La detección de un analito en di-cha matriz se basa normalmente en un principio de análisis en sándwich, es decir, una captura inmovilizada y un reac-20 tivo de detección marcado directa o indirectamente. Por ejemplo, es posible acoplar varios anticuerpos de diferente especificidad a una fase sólida y analizar una muestra para averiguar la presencia, ausencia o concentración de cada uno de los analitos correspondientes. Los anticuerpos tie-25 nen que adherirse a un área pequeña pero de densidad muy alta. En dicha matriz las etiquetas que permiten la detec-ción con una sensibilidad muy elevada son de gran importan-

cia porque solamente existen pocas posibilidades para el enlace de un reactivo de detección. Los detalles relaciona-dos con la teoría de dichos sistemas de pruebas matriciales se pueden hallar en la patente americana 5.516.635.

En una configuración preferida conforme a la presente 5 invención se utiliza un conjugado que comprende un miembro o elemento de un par de enlace y el complejo polipeptídico fluorescente conforme a la presente invención se utiliza como un reactivo de detección en un sistema de pruebas ma-triciales. 10

Tal como apreciará fácilmente el experto, además de la aplicación detallada de forma específica del complejo poli-peptídico fluorescente nuevo como un marcador para un ele-mento de enlace en un inmunoanálisis, existen una gran va-riedad de otras aplicaciones distintas, en las cuales el 15 complejo polipeptídico fluorescente se utiliza como un mar-cador o etiqueta fluorescente. En otra configuración prefe-rida la presente invención se refiere al uso de un complejo conforme a la presente invención como un marcador fluores-cente en general. Para daros un ejemplo, el complejo poli-20 peptídico conforme a la presente invención se puede utili-zar en los procedimientos de rastreo de elevada sensibili-dad, por ejemplo, en el marcaje de sustratos enzimáticos y en el barrido para el descubrimiento de cualquier fármaco nuevo. 25

Los siguientes ejemplos y referencias ayudarán a com-prender la presente invención, cuya verdadera finalidad se indica en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Activación por SATP de XL-APC

Mientras no se especifique lo contrario, las reaccio-nes se llevaban a cabo a temperatura ambiente (RT). Se cen-5 trifugaban 10 mg de XL-APC (PB25, Prozima, San Leandro CA) durante 10 minutos a 270000 g y se descartaba el sobrena-dante. El residuo se volvía a suspender en 1 ml de tampón fosfato 50 mM pH 8,2 y la solución se dializaba frente a tampón fosfato 50 mM pH 8,2 durante la noche. El XL-APC se 10 hacía reaccionar en un cociente molar 1:12 con acetiltio-propionato de N-succinimilo durante 3,5 horas a RT. El XL-APC activado por SATP se dializaba durante la noche a 4ºC frente a tampón fosfato 50 mM pH 6,6. El desbloqueo de los grupos SH se realizaba añadiendo 25 µl de hidroxilamina 1M 15 e incubando durante 1 hora.

Ejemplo 2

Activación por MHS de XL-APC

10 mg de XL-APC se centrifugaban durante 10 minutos a 27000 g y se descartaba el sobrenadante. El residuo se 20 volvía a suspender en 1 ml de tampón fosfato 50 mM pH 6,7 y la solución se dializaba frente a tampón fosfato 50 mM pH 6,7 durante la noche. La activación por MHS del XL-APC se realizaba con el éster maleimidohexanoil-N-hidroxisuccinimida en una relación molar 1:12 en tampón 25 fosfato a pH 6.7 durante 2 horas a 4ºC. El XL-APC activado se dializaba durante la noche a 4ºC frente a tampón fosfato pH 6.6 50 mM.

Ejemplo 3

Activación por MHS del anticuerpo monoclonal anti-DIG (MAB)

Se utilizaba Inmunoglobulina (IgG)de una antidigoxige-nina (DIG)MAB. Se disolvían 20 mg de anti-DIG MAB en 1 ml de tampón fosfato 100 mM pH 7,0 y se dializaban frente al 5 mismo tampón durante la noche. La activación por MHS de un anti-DIG MAB se realizaba con el éster maleimidohexanoil-N-hidroxisuccinimida en un cociente molar 1:8 durante 2 horas

a 4ºC. EL anti-DIG MAB activado se dializaba a 4ºC frente a tampón fosfato 50 mM a pH 6,6 durante la noche. 10

Ejemplo 4

Preparación de un conjugado XL-APC-anti-DIG

5 mg de XL-APC activado por SATP bloqueado del ejemplo 1 se hacían reaccionar con 5 mg de anti-DIG MAB activado por MHS del ejemplo 3 en tampón fosfato pH 7,0 durante 2 h 15 a temperatura ambiente. La reacción se extinguía añadiendo 15 µl de solución de cisteina 100 mM e incubando durante 15 minutos. Finalmente, se añadían 100 µl de iodo acetamida 0,5M y se incubaban durante 30 minutos a temperatura am-biente. La mezcla de reacción se dializaba frente a tampón 20 fosfato 50 mM pH 6,6 durante la noche. El producto crudo se purificaba en una columna de Superose 6® (tampón: fosfato 50 mM pH 6,6, velocidad de flujo: 0,5 ml/min). El conjugado se dializaba frente al tampón HEPES pH 7,2 a 4ºC durante la noche. 25

Ejemplo 5

Preparación de un conjugado poli (XL-APC)-anti-DIG

4 mg de XL-APC activado por SATP desbloqueado del ejemplo 1

reaccionaban con 4 mg de XL-APC activado por MHS del ejem-plo 2 en tampón fosfato a pH 6,85 a temperatura ambiente. Después de 2 horas de polimerización se añadían 16 mg de anti-DIG MAB activado por MHS del ejemplo 3 y se incubaban durante otros 90 minutos adicionales. La reacción se extin-5 guía al añadir 15 µl de solución de cisteina 100 mM e incu-bando durante 10 minutos. Finalmente se añadían 50 µl de yodo acetamida 0,5M y se incubaban durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se dializaba frente a tampón fosfato 50 mM pH 6,6 durante la noche. El 10 producto crudo se purificaba en una columna de Superose 6® (tampón: fosfato 50 mM pH 6,6, velocidad de flujo: 0,5 ml/min). El conjugado se dializaba frente al tampón HEPES pH 7,2 a 4ºC durante la noche.

Ejemplo 6 15

Evaluación de conjugados

Una proteína marcada con biotina y digoxigenina se inmovi-lizaba en un chip de poliestireno revestido de estreptavi-dina. El chip se incubaba a una concentración final de 250 µg/ml del conjugado del ejemplo 4 ó 5, respectivamente. en 20 tampón HEPES. Se utilizaba un láser He/NE para la excita-ción de la fluorescencia y se utilizaba una cámara CCD para la detección de la fluorescencia.

Como se puede deducir de la tabla 1, la señal resul-tante del conjugado poli (XL-APC)-anti-DIG del ejemplo 5 25 era unas 20 veces superior a la intensidad de la señal ob-tenida con el novedoso conjugado XL-APC-anti-DIG del ejem-plo 4.

Tabla 1:

Conjugado

intensidad de la señal

(XL-APC)-anti-DIG

379

poli(XL-APC)-anti-DIG

6930

Ejemplo 7 5

Preparación del conjugado DSS-reticulado-(poli(XL-APC)-anti-DIG)

El pH de la solución de conjugado del ejemplo 5 se ajustaba a pH 8 con tampón fosfato. DSS en DMSO se añadía en un exceso molar de 20 veces si se compara con el anti-10 cuerpo incorporado y se incubaba durante 30 minutos a tem-peratura ambiente. Para extinguir la reacción se añadía glicina en una concentración final 30 mM. El conjugado se dializaba frente al tampón HEPES pH 7,2 a 4ºC durante la noche. 15

Ejemplo 8

Prueba de estabilidad de los conjugados

Para verificar la estabilidad se incubaban las solu-ciones 250 µM de los conjugados del ejemplo 5 y 7 durante 14 días a 35ºC. La evaluación de los conjugados se realiza-20 ba antes y después de la incubación a 35ºC conforme al método descrito en el ejemplo 6.

Tabla 2:

conjugado

intensidad de la señal remanente (14 días a 35ºC en % de la señal

de partida)

(XL-APC)-anti-DIG

30%

poli(XL-APC)-anti-DIG

>95%

Como se puede ver de la tabla 2, la señal conseguida con el segundo conjugado se mantiene muy estable incluso después del almacenamiento durante dos semanas a 35ºC.

Claims (10)

1. 1. Un método para fabricar un complejo polipeptídico fluo-rescente esférico que se caracteriza por que un polipéptido fluorescente aislado es reticulado inter-molecularmente consigo mismo o con uno o más polipéptidos y donde dicho 5 complejo es de 40 a 500 nm de tamaño, de manera que el método comprende las etapas de

   a) aportar al menos un polipéptido fluorescente aisla-do y opcionalmente un segundo polipéptido

   b) añadir un reactivo reticulante químico 10

   c) terminar la reacción una vez se haya obtenido un complejo polipeptídico del tamaño deseado, y

   d) aislar el complejo obtenido en la etapa (c)
2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína fluorescente se selecciona del grupo compuesto por la pro-15 teína fluorescente verde, la proteína fluorescente roja y una ficobiliproteína.
3. 3. El método de la reivindicación 2, en el que la proteína fluorescente es una ficobiliproteína.
4. 4. El método de la reivindicación 3, en el que la ficobili-20 proteína comprende subunidades α- y ß- unidas por un enlace covalente.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en el que la ficobili-proteína es la aloficocianina.
6. 6. El complejo polipeptídico fluorescente esférico que se 25 puede obtener por cualquiera de los métodos conforme a la reivindicación 1 a 5.
7. 7. Un conjugado que comprende el complejo conforme a las

   reivindicaciones 6 y un elemento o miembro de un par de en-lace.
8. 8. El conjugado de la reivindicación 7, en el que el miem-bro o elemento de un par de enlace se elige del grupo com-puesto por un anticuerpo y un hapteno. 5
9. 9. Uso de un conjugado conforme a la reivindicación 7 o bien 8 en una valoración del enlace específica.
10. 10. Uso de un complejo conforme a la reivindicación 6 como un marcador fluorescente.

    10