CN102308214B - 包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物 - Google Patents

包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102308214B
CN102308214B CN200980156793.3A CN200980156793A CN102308214B CN 102308214 B CN102308214 B CN 102308214B CN 200980156793 A CN200980156793 A CN 200980156793A CN 102308214 B CN102308214 B CN 102308214B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phycobiliprotein
subunit
uncrosslinked
coupled
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980156793.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102308214A (zh
Inventor
J·沃尔弗斯
F·马莱格
R·K·古普塔
L·A·沙里耶
F·埃斯特韦斯·洛博里
M·A·福曼
E·戈特罗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beckman Coulter Inc
Original Assignee
Beckman Instruments Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beckman Instruments Inc filed Critical Beckman Instruments Inc
Publication of CN102308214A publication Critical patent/CN102308214A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102308214B publication Critical patent/CN102308214B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Abstract

提供了包含(i)偶联至藻胆蛋白串联染料的配体和(ii)未偶联的藻胆蛋白的新颖组合物，其中藻胆蛋白来源于相同的细菌或者真核藻种类。藻胆蛋白一定是相同的或者是不同的，但是必须含有一些可交换的未交联的亚基。还提供了制备这些组合物、包含这些组合物或者这些组合物组分的试剂盒的方法，以及将这些组合物用于细胞和非细胞分析的方法。

Description

包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物
背景技术
藻胆蛋白和它们的串联染料是在流式细胞术中被广泛地用作荧光标记的重要的荧光染料。通过使用由一个激光线激发的单一供体染料来提供具有截然不同的发射光谱的另外的荧光染料，串联染料的使用已经扩宽了流式细胞术中的延伸的多色分析的能力。
当使用多色组合物中的许多串联染料时，在区分荧光信号方面可能会发生困难。迄今为止，本领域一般将这些“困难”归咎于染料的不稳定性。但是，对于处理这些问题没有任何明确的答案或者暗示。因此，在本领域中仍然需要采用偶联有藻胆蛋白的配体的独特组合的组合物和方法来用于分析。尤其是，在本领域中仍然需要含有藻胆蛋白的串联染料组合物，该组合物可限制本领域中已知的组合物所面临的随着时间的降解。
发明内容
为了便于理解，在下文的发明内容和具体实施方式中应用于藻胆蛋白、配体、染料或者种类的术语“第一”、“第二”、“第三”，是用于将存在于相同的组合物中的一种藻“胆蛋白、配体、染料或者种类分别与另一种藻胆蛋白、配体、染料或者种类区分开来。这些术语并不是用来确定数量、次序或者重要度。
在一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含偶联至第一串联染料的第一配体。第一串联染料包括含有交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白和偶联至所述第一藻胆蛋白的第一伴侣染料。所述组合物也包含未偶联的第二藻胆蛋白。第一藻胆蛋白和第二藻胆蛋白来源于第一(即相同的)细菌种类或者真核藻种类。在一个实施方式中，第一藻胆蛋白和第二藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，第一和第二藻胆蛋白是不同的，并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在另一个方面中，如上所述的组合物更进一步地包含偶联至第二串联染料的第二配体。第二串联染料包括第三藻胆蛋白和偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料。所述第三藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。这个组合物也包括含有亚基的未偶联的第四藻胆蛋白。所述第四藻胆蛋白也来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二和第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二和第三藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在更进一步的方面中，如上所述的组合物包含偶联至第三串联染料的第三配体。第三串联染料包含第五藻胆蛋白和偶联至所述第五藻胆蛋白的第三伴侣染料。所述第五藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第五藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。所述组合物也包含未偶联的第六藻胆蛋白。所述未偶联的第六藻胆蛋白含有亚基并且所述未偶联的第六藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第一、第二、第三、第四、第五和第六藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第六藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白，并且所述第六藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在另一个实施方式中，如上所述的组合物也包含偶联至第四串联染料的第四配体。第四串联染料包括第七藻胆蛋白和偶联至所述第七藻胆蛋白的第四伴侣染料。所述第七藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第七藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。所述组合物也包含未偶联的第八藻胆蛋白。所述未偶联的第八藻胆蛋白含有亚基并且所述未偶联的第八藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第八藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七藻胆蛋白，并且所述第八藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在另一个方面中，任何上述的组合物包括一种以上偶联至并非藻胆蛋白的染料的附加配体。
在另一个方面中，上述组合物包含偶联至所述第一串联染料的所述第一配体和所述未偶联的第二藻胆蛋白，并且上述组合物还包括一种以上偶联至来源于所述第一细菌或者真核藻种类的第三藻胆蛋白的附加配体。在一个实施方式中，所述第三藻胆蛋白与所述第一藻胆蛋白或者第二藻胆蛋白是相同的。在另一个实施方式中，所述第三藻胆蛋白不同于所述第一藻胆蛋白或者第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在更进一步的方面中，上述组合物包含偶联至所述第一串联染料的所述第一配体和所述未偶联的第二藻胆蛋白，并且上述组合物还包括(a)偶联至第二串联染料的第二配体和(b)未偶联的第四藻胆蛋白。第二串联染料包括第三藻胆蛋白和偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料。所述第三藻胆蛋白含有交联和未交联的亚基并且所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类。所述未偶联的第四藻胆蛋白含有亚基，并且所述未偶联的第四藻胆蛋白来源于所述第二细菌或者真核藻种类。在一个实施方式中，所述第三和第四藻胆蛋白是相同的。在更进一步的实施方式中，所述第三和第四藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在更进一步的方面中，本发明提供了用于分析样品中细胞种群和非细胞种群的方法。所述方法包括：混合所述样品和本文所描述的组合物；以及通过分析荧光来鉴定所述样品中的所述种群。理想地，所述细胞种群和非细胞种群中的至少一种包括所述第一配体的受体。
权利要求书中本发明的不同实施方式的其它方面和优势将在下面的具体实施方式中公开。
附图说明
图1A-3J是双色和三色试剂组合物的双参数频率图，其中两种不同的荧光染料的荧光强度相对于相同全血样品的不同细胞种群进行绘图。这些频率图表明储存期间通过使用不同含量的游离的藻胆蛋白，提高了本文所描述的配体-染料组合物的稳定性。
图1A提供了被制备的样品的双参数频率图，该样品通过使用现有技术中可用的包含配体/染料偶联物(即CD3-别藻蓝蛋白(APC)(0.5μg))和配体/串联染料偶联物(即CD19-APC-AlexaFluor750串联染料(0.5μg))的试剂组合物，即“现有技术的新鲜混合物”而被制备，该试剂组合物由在2至8℃下单独储存21天的组分新鲜配制，并且样品表明了该试剂组合物的效果。这两个偶联物中的APC是来自相同的细菌种类，即钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)。没有游离的(未偶联的)APC存在。
图1B提供了被制备的样品的双参数频率图，该样品通过使用现有技术中可用的包含CD3-APC(0.5μg)和CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400032
750串联染料(0.5μg)的组合物，即“现有技术的储存混合物”而被制备，该组合物在2至8℃下预配制并且保留了21天，并且该样品表明了该组合物的效果。这两个偶联物中的APC是来自相同的细菌种类，即钝顶螺旋藻。没有游离的(未偶联的)APC存在。
图1C提供了被制备的样品的双参数频率图，该样品通过使用本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400041
750串联染料(0.5μg)和未偶联的APC(0.5μg)的双色试剂组合物而被制备，该试剂组合物由在2至8℃下单独储存21天的组分新鲜配制，并且该样品表明了该组合物的效果。
图1D提供了相同的被制备样品的双参数频率图，该样品通过使用本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400042
750串联染料(0.5μg)和未偶联的APC(0.5μg)的双色试剂组合物而被制备，该试剂组合物在2至8℃下预配制21天，并且该样品表明了该组合物的效果。将图1A和1B和图1C和1D相对比。
图2A提供了经新鲜制备的对照样品的双参数荧光频率图，该样品通过使用现有技术中的包含CD3-APC(0.5μg)和CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400043
750串联染料(0.5μg)的双色试剂组合物，即“现有技术的新鲜混合物”而被制备。
图2B提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了现有技术中的包含CD3-APC(0.5μg)和CD19-APC-AlexaFluor750串联染料(0.5μg)并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物，即“现有技术储存混合物”。
图2C提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor750串联染料(0.5μg)和0.0625μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物。
图2D提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor750串联染料(0.5μg)和0.125μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃保留了21天的双色试剂组合物。图2E提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400047
750串联染料(0.5μg)和0.25μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物。
图2F提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400048
750串联染料(0.5μg)和0.5μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物。
图2G提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400049
750串联染料(0.5μg)和2.0μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物。
图2H提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA000014224354000410
750串联染料(0.5μg)和5.0μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物。
图2I提供了样品的双参数荧光频率图，该样品使用了本文中所描述的包含CD3-APC(0.5μg)、CD19-APC-AlexaFluor750串联染料(0.5μg)和10μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了21天的双色试剂组合物。图2A和2B与图2C至图2I比较，表明本文所描述的组合物与现有技术的组合物相比，稳定性得到提高。
图3A-3J是通过使用三色试剂组合物得到的双参数频率图，其中两种不同的荧光染料的荧光强度相对于相同全血样品的不同细胞种群进行绘图。
图3A和图3B提供了经新鲜制备的样品的荧光频率图，该样品通过使用现有技术中的包含CD4-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400052
700串联染料、CD19-APC和CD8-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400053
750串联染料的组合物，即“现有技术的新鲜混合物”而被制备。提供这些频率图用于和图3E-3J进行比较。图3C和图3D提供了样品的荧光频率图，该样品使用了现有技术中的包含CD4-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400054
700串联染料、CD19-APC和CD8-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400055
750串联染料并且在2至8℃下保留了120天的组合物，即“现有技术的储存混合物”。提供这些频率图用于和图3E-3J进行比较。
图3E和图3F提供了样品的荧光频率图，该样品使用了本文所描述的包含CD4-XL-APC-AlexaFluor700串联染料、CD19-APC和CD8-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400057
750串联染料以及0.5μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了120天的组合物。
图3G和图3H提供了样品的荧光频率图，该样品使用了本文所描述的包含CD4-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400058
700串联染料、CD19-APC和CD8-XL-APC-AlexaFluor750串联染料以及1.0μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了120天的组合物。
图3I和图3J提供了样品的荧光频率图，该样品使用了本文所描述的包含CD4-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA000014224354000510
700串联染料、CD19-APC和CD8-XL-APC-AlexaFluor
Figure BPA000014224354000511
750串联染料以及2.0μg天然的、未偶联的APC并且在2至8℃下保留了120天的组合物。
图4提供了波长(A280)相对于从钝顶螺旋藻分离的具有不同交联度的APC样品、和从钝顶螺旋藻分离且没有交联的一种(1)APC样品的大小排阻层析保留体积的绘图。通过计算洗脱峰下的面积来确定APC中的交联百分比。完整的峰的积分面积比上色谱中总面积的比值给出了样品的交联百分比。在图右侧的最高峰对应的是所述的一个(1)未交联的APC样品。图中剩余的峰对应的是交联的APC样品。具体地讲，图左侧的峰对应的是完整的APC分子，而图右侧的小峰(未交联的APC的峰下面)对应的是APC亚基。图5是示意图，显示当被包含藻胆蛋白和可发荧光的(fluorescable)染料的串联染料所标记的配体与被藻胆蛋白所直接标记的配体一起储存时，随着时间发生的亚基互换。小括号(^)代表交联，L1代表第一配体，L2代表第二配体，“染料”代表可发荧光的(fluorescable)染料，“α”代表所述藻胆蛋白的一种亚基，和“β”代表所述藻胆蛋白的第二种亚基。术语“交联”或者其变型术语指的是通过不易断裂的共价键进行的分子单元连接。
具体实施方式
本文描述的组合物和方法针对多色试剂制剂中与包含藻胆蛋白的串联染料的降解或者不稳定性相关的困难提供了解决方法。
在使用包含储存在一起的不同的抗体与藻胆蛋白和它们的串联染料的偶联物的组合物之后，本申请的发明人确定了这个问题。具体地，当偶联至不同抗体的别藻蓝蛋白(APC)和APC-串联染料(比如APC.AlexaFluor
Figure BPA00001422435400061
700，APC.AlexaFluor
Figure BPA00001422435400062
750，APC.Cy
Figure BPA00001422435400063
7等等)的偶联物被一起储存在多色制剂中，与生物样品混合，然后用流式细胞计分析样品时，会观察到如上所述的“困难”。与使用分开储存的相同试剂的新鲜混合物且其他条件都相同时所得到的荧光频率图相比，在所述荧光频率图中观察到补偿要求(溢波(bleed-over))的递增。当使用藻红蛋白(PE)和基于PE的串联染料(比如PE-德克萨斯红TM、PECy5、PECy
Figure BPA00001422435400065
5.5、PE-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400066
647、PE-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400067
700和PECy
Figure BPA00001422435400068
7)的抗体偶联物时，也有类似的观察现象。
并不希望被理论所束缚，发明人推测当混和物相同时，在含藻胆蛋白的配体-串联染料偶联物和配体-藻胆蛋白偶联物之间发生了亚基交换，导致了在串联染料和直接偶联的藻胆蛋白之间的补偿要求(溢波)的不想要的增加。发明人观察到，当交联藻胆蛋白的偶联物比如XL.APC与相应的交联串联染料的偶联物比如XL.APC-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400069
750混合并且放置于大约2至大约8℃的温度下，单个的藻胆蛋白分子的亚基会出现交换。举例来说，发明人观察到，当CD3-APC和CD19-APC-AlexaFluor
Figure BPA000014224354000610
750混合并且随着时间保留在大约2至大约8℃下，通过荧光频率图证明，显示形成了CD3-APC-AlexaFluor
Figure BPA000014224354000611
750和CD19-APC偶联物。图5中图示表明了藻胆蛋白亚基交换的一个方面。当然，本领域的技术人员会理解，图5的示意图中显示的一种以上的配体和/或发荧光的(fluorescable)染料可以偶联至交联的或者未交联的亚基上，并且亚基交换的不同修饰物可以出现在相同的溶液中。
均从聚球藻6301(蓝藻类细菌)分离的别藻蓝蛋白B(APC-B)和别藻蓝蛋白(APC)之间的亚基交换，已经在文献(参见生物化学期刊256，12600(1981))中讨论过。总之，已注意到在APC-B和APC的混合物中，通过亚基交换形成了接近统计学含量的异源三聚体。例如，已知APC具有的四级结构包含基于单独的亚基结构和氨基酸序列的疏水作用以及氢键和离子键的组合而结合的三个α亚基和三个β亚基。APC在低浓度、低pH条件下且当暴露于一种以上离液序列高的离子时，APC也已知可以离解成它的亚基(α-β单体以及α和β组分)。在这里使用的术语“离液序列高的离子”指的是可通过干扰稳定化的分子内相互作用而破坏藻胆蛋白的三维结构的试剂。已经报道了交联的APC组合物并且通过不同供应商(其中ProzymeInc.和MartekBiosciences)销售的交联APC组合物。
本发明人设计出本文所论述的新颖的试剂组合物以便处理不期望有的亚基交换的这个问题。本发明人发现，添加来自与配体偶联的串联染料中的藻胆蛋白相同的细菌种类的、或者能够与之交换亚基的未偶联的藻胆蛋白至包含配体偶联的藻胆蛋白串联染料的试剂组合物中，可产生相对稳定的试剂组合物。本发明内容和下面详细论述的上述这些稳定的染料组合物的不同实施方式解决了本发明人确定的现有技术多色组合物用于生物样品分析时的稳定性问题。本文描述的组合物的不同实施方式可以包含以下被标记的配体：(a)至少一种偶联至包含藻胆蛋白的串联染料的配体；(b)可供选择地一种以上直接偶联至藻胆蛋白的配体；和(c)可供选择地一种以上偶联至并非藻胆蛋白的荧光染料或标记的配体。组合物也包含至少一种未偶联的藻胆蛋白作为另一个组分，所述未偶联的藻胆蛋白可以与偶联至所述串联染料的配体上的藻胆蛋白交换亚基。
在这里使用的术语“稳定的”指的是在和生物样品混合前和/或混合后本发明的所述组合物。在一个实施方式中，“稳定的”指的是当本文描述的所述组合物被加到生物样品中、随后使用荧光分析细胞种群时，不会没有引起荧光性质的显著变化的所述组合物。理想地，“稳定(的)”指的是在所述组合物中配体偶联的串联染料和任何其它配体偶联的藻胆蛋白的荧光性质在被混合后没有发生变化。在更进一步的实施方式中，在混合其所述组分之后且在与生物样品混合之前，所述组合物是立即“稳定(的)”。在另一个实施方式中，在混合后在大约2至大约8℃下保留组合物至少1星期直至52星期，所述组合物是“稳定(的)”。作为另外的实施例，在混合之后至少4、10、15、20、25、30、35、40、45、50或者51个星期，这种组合物是稳定的。
理想地，所述组合物在它们储藏或者使用所需要的任何温度下都是稳定的。在一个实施方式中，所述组合物在降低的温度，即温度低于室温下是稳定的。在另一个实施方式中，所述组合物在大约2至大约10℃下是稳定的。在具体实施方式中，所述组合物在大约2、3、4、5、6、7、8、9或者10℃下是稳定的。在又一个实施方式中，所述组合物在室温下是稳定的。在更进一步的实施方式中，所述组合物在升高的温度，即温度超过室温下是稳定的。
当在用于细胞分析和非细胞分析的方法中使用本文所描述的新颖的染料组合物时，可以观察到相对于新鲜制备的组合物，用所述配体偶联的串联染料或者用所述配体偶联的藻胆蛋白进行标记的细胞的荧光性质降低了溢波或者没有溢波。参见例如本文所提供的图和实施例。更进一步地，所述染料组合物导致了错误数据的减少、由于更少损耗的染料组合物而引起的耗费减小、以及连续不断制备新鲜染料组合物(包括新鲜对照组合物)使所需要的时间减少。
I.定义
提供了下列定义并且下列定义包括本领域中广泛适用的信息。在此提供了某个术语的实施例，这些实施例不是排它性的并且可能包括本领域中其它已知的或者可用的实施例。因此，这种实施例并不是对本发明的限制。
A.“样品”
本文使用的“样品”是任何包含哺乳动物细胞的悬浮液，即包含细胞种群和/或非细胞种群的生物样品。
在特定的实施方式中，提供所述样品的所述哺乳动物是人，尽管也可能采用来自其它未人的哺乳动物的样品。本领域的技术人员容易地理解术语“细胞的”和“非细胞的”。至少一种所述细胞种群或者非细胞种群需要在上述组合物中使用的每个不同配体的受体。典型的“细胞的”种群包括但不限于血液细胞和非血液细胞。这种样品包括但不限于全血、周围血液、骨髓抽出物、淋巴组织、脾组织、脑脊髓液、皮肤组织、粘膜组织、胸腔穿刺液、胸膜液和脊髓液。血液的(即血)细胞种群选自单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒细胞、不成熟的粒细胞、杆状核嗜中性细胞、母细胞、变体淋巴细胞和非典型淋巴细胞。非白细胞的血液细胞种群包括红细胞、网织红细胞、有核红细胞、血小板、网织血小板和巨核细胞。在血液中，非典型的细胞包括中幼粒细胞、晚幼粒细胞、早幼粒细胞、不成熟的粒细胞、杆状核嗜中性细胞、母细胞、非典型淋巴细胞、变体淋巴细胞、有核红细胞、巨血小板、浆细胞等等。非血液的细胞其中包括上皮细胞和内皮细胞。典型的“非细胞的”种群其中包括但不限于小珠、蛋白质、微粒、微粒体。
在一个实施方式中，所述样品是人的全血样品或者包含五个“正常”白细胞种群(单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞)以及由于疾病、对不利的环境刺激(诸如致癌因子)的反应或者治疗法的结果而造成的可能地许多非典型细胞种群的周围血液样品。因此，用于通过这些方法进行分析的合适样品是可能包含成熟的和不成熟的白细胞和非白细胞种群、以及非典型细胞的病人血液样品。在一个实施例中，样品包含母细胞。在更进一步的实施例中，样品包含有核红细胞。作为另一个实施例，样品包含不成熟的粒细胞。作为又一个实施例，样品包含非典型淋巴细胞。不正常的样品中的细胞的其它组合物也可能通过本文描述的方法和组合物来分析。
B.“配体”
在本文所描述的组合物的所有实施方式中，术语“配体”指的是结合至存在于细胞或者非细胞颗粒表面上的受体的部分(诸如抗体)。在一个实施方式中，所述配体“偶联至”、“连接至”或者“结合于”上述串联染料的藻胆蛋白。本领域的技术人员能够容易地通过本领域中的方法将串联染料偶联至配体例如单克隆抗体。在一个实施方式中，所述串联染料通过染料的亚氨基硫烷活化而被偶联至所述配体。
正如本文所定义的，配体包括可检测并且与一种以上特定受体起反应的各种试剂。所有合适的配体的特征在于所期望的其结合颗粒群体上指定受体的能力。在一个实施方式中，所述配体是可优先结合至所有的或者一部分细胞表面受体的组分。典型地，所述配体包含可以被分离的并且天然生成的或者重组制备的或者人工的或者合成的氨基酸序列或者核酸序列。在一个实施方式中，所述配体是蛋白质，例如抗体或者酶，或者其片段。在另一个实施方式中，所述配体是核酸探针。在其它实施方式中，所述配体是多分子的组合体，诸如重组蛋白质的四聚物。可用于构建这种配体的方法是本领域技术人员已知的方法。
通常对于细胞分析，定向于细胞表面决定子的抗体或者抗体片段是所选择的配体。在这里使用的术语“抗体”指的是包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的多克隆的、单克隆、合成的或者重组的抗体。抗体片段也是有用的，并且包括但不限于上述完整的抗体的一种以上Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段或者Fc抗体片段。类似地，单链可变抗体片段或者包含抗体的互补决定区(CDR)的重组构建体可以被用作这些方法中有用的配体。此外，共同具有足够的CDR以便保持可结合所期望细胞表面抗原的抗体的功能等效结合特性的合成抗体或者嵌合抗体或者人源化抗体构建物，可以被用作所选择的配体。
在一个实施方式中，在本文所描述的组合物内使用的单独的配体或者抗体每个都可结合在所选择的样品中的细胞种群上进行差异表达的抗原决定子，并且所述单独的配体或者抗体被选择得与光散射和/或电参数的特定联合组合可提供所期望的差异信息。例如，在一个实施方式中，本文有用的抗体可结合至在白细胞和非白细胞种群上差异表达的抗原决定子。这种抗原决定子可以完全不在非白细胞上，只在白细胞上表达。可供选择地，这种抗原决定子可以在白细胞上大量表达且在非白细胞上最少地表达。因此这种抗体允许从非白细胞(例如红细胞(RBC)、有核红细胞或者血小板)中识别和区分白细胞。还有其它实施方式采用可结合相同细胞类型或者种群上的不同决定子的一种以上抗体。因此可结合相同细胞类型或者种群上的不同决定子的不同抗体的组合物可以被用来代替结合细胞种群上一种决定子的单一抗体。在另一个实施方式中，根据当白细胞成熟和老化时白细胞上抗原决定子的差异表达，这种抗体(或者抗体组合物)也能够区分成熟的白细胞和不成熟的白细胞。
可用作本文所描述的组合物中的配体和用于血液分析的抗体具体包括但不限于其中本领域中已知的抗CD2、抗CD3、抗CD4、抗CD5、抗CD7、抗CD8、抗CD9、抗CD10、抗CD11a、抗CD11b、抗CD13、抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD16b、抗CD18、抗CD19、抗CD20、抗CD23、抗CD24、抗CD25、抗CD33、抗CD35、抗CD36、抗CD38、抗CD41、抗CD45、抗CD45RA、抗CD48、抗CD49d、抗CD50、抗CD52、抗CD53、抗CD55、抗CD56、抗CD59、抗CD61、抗CD62L、抗CD62p、抗CD64、抗CD66b、抗CD66c、抗CD73、抗CD82、抗CD87、抗CD90、抗CD117、抗CD142、抗CD235a、抗CD235b、抗CD235c、抗CD236、抗CD239、抗CD240、抗CD241、抗CD242、抗gp-42、抗LY-6、抗RT6、抗SCA-2、抗κ(Kappa)、抗λ(Lambda)和抗HLA-DR。很容易理解，本发明不受所述组合物中的特定配体选择的限制，并且本领域的技术人员可以选择和利用本文没有具体叙述的其它配体或者抗体，将其包括在本发明的组合物中。
本发明的组合物包含一种以上配体。在一个实施方式中，所述组合物包含两种或更多配体。在另一个实施方式中，所述组合物包含三种以上配体。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种以上配体。在又一个实施方式中，所述组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10种配体。本领域的技术人员能容易理解，在单一试剂组合物中被使用的配体数没有“最大值”，并且配体的选择取决于使用的试剂和仪器能力。
存在于单一组合物中的配体可以相同或者可以不同。在一个实施方式中，所述组合物包含两种配体并且所述配体是相同的(L1和L1)。在另一个实施方式中，所述组合物包含两种配体并且所述配体是不同的(L1和L2)。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含三种配体并且所述配体是相同的(L1、L1和L1)。在又一个更进一步的实施方式中，所述组合物包含三种配体并且所述配体是不同的(L1、L2和L3)。在另一个实施方式中，所述组合物包含三种配体并且两种配体是相同的，一种配体是不同的(L1、L1和L2)。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种配体并且所述配体是相同的(L1、L1、L1、L1)。在又一个更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种配体并且所有的四个配体是不同的(L1、L2、L3、L4)。在另一个实施方式中，所述组合物包含四种配体并且任何两种配体是相同的，其他两种配体是相同的，但是不同于开头两种配体(L1、L1、L2、L2)。在又一个更进一步的实施方式中，所述组合物包含四种配体并且任何三种配体是相同的，第四配体是不同的(L1、L1、L1和L2)。对于包含五种以上配体的组合物可以使用类似的级数，本领域的技术人员能够确定这种级数。参见下面的公式，其中n是配体的总数，r是不同于其他配体的配体的数目，并且0＜r＜n。
C r n = n ! r ! ( n - r ) !
经选择用在本文所描述的组合物或者方法中的每个配体可被连接至、偶联至、或者结合至被称作荧光性染料或荧光染料的可检测荧光的标记上。在这些荧光性染料或荧光染料中有藻胆蛋白、使用偶联至可能是或者可能不是藻胆蛋白的伴侣染料的藻胆蛋白的串联染料、以及其它通常用于标记配体的染料。在本文描述的组合物的所有实施方式中，至少一种配体被偶联至包含藻胆蛋白的串联染料。在其它实施方式中，另外有至少一种藻胆蛋白或者其它荧光染料被直接结合至所述配体。
用于将所述配体经被选择的荧光染料而进行连接、偶联或者耦合的方法是类似常规的方法并且是本领域的技术人员已知的。已知的荧光染料连接的方法描述在下列文献中有描述(举例来说，参见：《荧光探针和研究化学品指南》，第6版，R.P.Haugland，分子探针公司，尤金，俄勒冈州，1996；Pierce目录和指南，生命科学和分析研究产品，Pierce化学公司，罗克福德，伊利诺斯，1994/1995)；其中将美国专利6,692,968和5,164,311并入本文以供参考。因此，选择串联染料或者藻胆蛋白或者其它非藻胆蛋白染料的耦合方法并不限制本文描述的所述组合物。偶联串联染料中组分的类似方法是本领域中常规的和已知的。
用于所述方法的配体最佳浓度是基于被选择的配体而限定的，并且可以被本领域的技术人员确定。
C，“串联染料”
在本文描述的组合物的所有实施方式中，至少一种配体被偶联至包含藻胆蛋白的串联染料。本领域的技术人员已知的和本文使用的所述术语“串联染料”指的是非天然生成的分子，该分子由在其偶联至另一种荧光染料(这里是指“伴侣”染料)的亚基之间具有一些交联度的藻胆蛋白所形成。各种已知的和市场上可买到的串联染料可以在本文所描述的组合物中使用。
可在本文所述组合物中使用的串联染料的实施例被描述在下列文献中：美国专利4,542,104；5,272,257；和5,171,846；A.S.Waggoner等人，1993 Ann.N.Y.Acad.Sci.，677：185-193；M.Roederer等人，1996血细胞计数，24：191-197。将上述文献并入本文以供参考。在一个理想的的实施方式中，所述串联染料是别藻蓝蛋白和AlexaFluor700染料的串联染料、别藻蓝蛋白和AlexaFIuor
Figure BPA00001422435400122
750染料的串联染料、别藻蓝蛋白和Cy
Figure BPA00001422435400123
7染料的串联染料、藻红蛋白和德克萨斯红TM染料的串联染料、藻红蛋白和Cy
Figure BPA00001422435400124
5染料的串联染料、藻红蛋白和Cy
Figure BPA00001422435400125
5.5染料的串联染料、藻红蛋白和Cy
Figure BPA00001422435400126
7染料的串联染料、别藻蓝蛋白和H7TM染料的串联染料。
在一个特定地实施方式中，所述串联染料是APC.AlexaFluor
Figure BPA00001422435400127
700染料。在另一个特定的实施方式中，所述串联染料是APC.AlexaFluor
Figure BPA00001422435400128
750染料。在又一个特定的实施方式中，所述串联染料是APC.Cy
Figure BPA00001422435400129
7染料。D.“藻胆蛋白”
本领域中技术人员已知的和本文使用的藻胆蛋白是由两种或更多种被连接的亚基所形成的荧光蛋白质，这些荧光蛋白质可以从细菌或者真核藻类中分离出来并且已经被广泛使用在血液分析中。参见，《藻胆蛋白》，Robert MacColl和Deborah Guard-Friar，CRS出版社(1987)，将其并入本文以供参考。本领域中藻胆蛋白可以普遍购自供应商，其中供应商包括但不限于Invitrogen/分子探针、Pierce(Thermo Fisher Scientific)、Sigma和Prozyme。
在一个实施方式中，所述藻胆蛋白可以从细菌种类中分离。某些藻胆蛋白从蓝藻类细菌中分离。能够表达藻胆蛋白的蓝藻类细菌种类的实例包括但不限于钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)、小单岐藻(Tolypothrix tenuis)或者赖氏鞘氏藻(Lyngbya lagerheimii)。在更进一步的实施方式中，所述藻胆蛋白可以从真核藻种类中分离。
在一个实施方式中，所述藻胆蛋白是但不限于别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(PE)、藻青蛋白(PC)和藻红青蛋白(PEC)。在更进一步的实施方式中，所述藻胆蛋白是R-藻红蛋白(RPE)、B-藻红蛋白(BPE)、C-藻红蛋白(CPE)、Y-藻红蛋白(YPE)、C-藻青蛋白(CPC)、藻红蛋白566(PE566)、藻红青蛋白(PEC)、R-藻青蛋白(RPC)和别藻蓝蛋白(APC)。在另一个实施方式中，所述藻胆蛋白是别藻蓝蛋白。
E.荧光染料或荧光性染料
正如所描述的，在这里使用的被描述为“伴侣”的任何染料可被偶联至藻胆蛋白，以便形成串联染料，该染料也可以被应用在包含一种以上直接偶联至未藻胆蛋白染料的配体的组合物的实施方式中。因此，下列荧光染料、荧光标记或者除了藻胆蛋白以外的荧光染料的描述应用于串联伴侣染料(一般为非藻胆蛋白)、和可被直接偶联至这些组合物中可供选择的配体组分的单独染料。在这些组合物和方法的特定实施方式中，至少一种藻胆蛋白或者其它荧光染料直接连接至配体。在美国专利4,542,104中描述了用于串联染料的供体-受体配对的理想特性，将该专利并入本文以供参考。
每种荧光染料都具有“发射光谱”特征，其中一部分是“峰值发射光谱”特征。在这里使用的术语“发射光谱”一般指的是当荧光染料被激发的时候荧光染料发出的每个频数的电磁幅射的量。通常，发射光谱是通过某个频率的频带形成的范围或者分布，通常以毫微米测定(即波长)。在这里使用的术语“峰值发射光谱”指的是发射光谱的最强的部分。用于各式各样染料的发射光谱是本领域中已知的，并且在各种已知文献中出版，该文献包括但不限于Shapiro，Howard M.(2003)《实际流式细胞计》，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，NJ第296-297页，将这些文献并入本文以供参考。用于任何特定的荧光染料的峰值发射光谱是已知的，并且可以从下面描述这种荧光染料的公布的文献中得到：《比如荧光探针和研究化学品指南》，第6版，R.P.Haugland，分子探针公司，1996；Pierce目录和指南，生命科学和分析研究产品，Pierce化学公司，罗克福德，伊利诺斯，1994/1995)分子探针，及其他本领域的技术人员已知的类似的文献，将上述这些文献并入本文以供参考。通过使用荧光分光光度计进行光谱扫描，可以得到任何特定的荧光染料的发射光谱特性。
本领域的技术人员可以容易地选择许多附加的并且常规使用的荧光染料作为串联染料的“伴侣”染料、或者作为直接偶联至配体的染料。伴侣染料及其他染料可以容易地购自供应商诸如西格玛奥德里奇公司、通用电气医疗集团、分子探针公司(尤金，俄勒冈州)和Prozyme公司(圣莱安德罗，加利福尼亚州)。所述伴侣染料是市场上可买到的，和它们的使用是本领域已知的。
还有其它荧光染料可以从其它来源得到，或者可以在将来被研发出来。预期这种荧光染料可以以与下面的实施例中典型的荧光染料相同的方式用于这些各种方法中。在一个组合物和方法的实施方式中，下面提供的荧光染料的这些列表只是代表性的，并没有试图包括适合用作“伴侣”染料或者作为直接偶联至配体的染料的染料的详细清单。考虑到本说明书的另外的教导，本领域的技术人员应当能够容易地选择适当的荧光染料组合物用在本文描述的组合物和方法中。
来自荧光染料的伴侣染料或者其它染料可以是细胞渗透性的或者非细胞渗透性的。术语“细胞渗透性的”指的是描述在组合物或者反应混合物中不需要附加的透化试剂存在的情况下可容易地穿透细胞膜并且将细胞中组分染色的染料。在另一个实施方式中，可从其中选择伴侣染料或者其它染料的所述荧光染料是非细胞渗透性的染料，诸如在红色、绿色或者蓝色被激发波长区域内的那些非细胞渗透性染料。
可以在本文所述串联染料或者在特定的实施方式中直接偶联至配体的染料中使用的荧光“伴侣”染料的实例，包括但不限于所述花青染料诸如Cy
Figure BPA00001422435400141
5染料、Cy
Figure BPA00001422435400142
5.5染料和Cy
Figure BPA00001422435400143
7染料；所述AlexaFluor
Figure BPA00001422435400144
染料诸如所述AlexaFluor405染料、AlexaFluor
Figure BPA00001422435400146
610染料、AlexaFluor
Figure BPA00001422435400147
595染料、AlexaFluor
Figure BPA00001422435400148
647染料、AlexaFluor
Figure BPA00001422435400149
700染料和AlexaFluor
Figure BPA000014224354001410
750染料和所述AlexaFluor
Figure BPA000014224354001411
488染料；若丹明123；德克萨斯红TM染料；以及AttoTM染料。许多这些染料，以及其它可以被用作本文描述的方法中的串联“伴侣”染料或者作为直接偶联至所述配体的染料，均购自分子探针公司(尤金，俄勒冈州)。参见美国专利No.5,563,070，将其并入本文以供参考。
在一个特定的实施方式中，荧光性的伴侣染料选自德克萨斯红TM染料、AlexaFluor染料、花青染料和AttoTM染料。在另一个特定的实施方式中，所述AlexaFluor
Figure BPA000014224354001413
染料选自AlexaFluor
Figure BPA000014224354001414
610染料、AlexaFluor
Figure BPA000014224354001415
595染料、AlexaFluor
Figure BPA000014224354001416
647染料、AlexaFluor
Figure BPA000014224354001417
700染料和AlexaFluor
Figure BPA000014224354001418
750染料之中。在更进一步的特定实施方式中，所述花青染料选自Cy
Figure BPA000014224354001419
5染料、Cy
Figure BPA000014224354001420
5.5染料和Cy
Figure BPA000014224354001421
7染料。
II.包含藻胆蛋白的组合物
正如上述讨论，在最简单的实施方式中，本文提供的组合物包含偶联至含有藻胆蛋白的串联染料上的配体和未偶联的藻胆蛋白。
A.包含偶联至伴侣染料的藻胆蛋白的串联染料
所述串联染料中的藻胆蛋白组分可以选自上述的任何藻胆蛋白、市场上可买到的任何藻胆蛋白和可以通过常规方法制备或者纯化的任何藻胆蛋白。包含一些交联的亚基(以及可供选择地未交联的亚基)或者经修饰含有交联的藻胆蛋白可以被用于本文描述的组合物和方法的串联染料中。
在致力于确定本领域中购自供应商的APC的交联度中，本发明人使用本领域中已知的技术，包括但不限于高压液相色谱(HPLC)。此外，本领域的技术人员能够在购自供应商的APC上容易地进行已知的纯化和交联技术，以便获得具有与购自商业来源相符的或更高交联的藻胆蛋白。这种纯化或者获得更高交联藻胆蛋白的方法对于本领域的技术人员是已知的。这种常规方法包括Trinquet E.，Maurin F.，Preaudat M.，Mathis G.(2001)“作为近红外荧光的别藻蓝蛋白：分离、鉴定、化学修饰和在均相的荧光共振能量转移系统中使用”，分析生物化学.296，232-244。
在一个实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含至少大约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、76、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或者100％的交联，或者其间的级分百分比。在另一个实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含大约50％至大约100％的交联。在更进一步的实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含大约60％至大约100％的交联。在另一个实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含大约70％至大约100％的交联。在又一个更进一步的实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含大约80％至大约100％的交联。在又一个实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含大约90％至大约100％的交联。在更进一步的实施方式中，串联染料中的藻胆蛋白组分包含大约95％至大约100％的交联。然而，如果串联染料中的藻胆蛋白组分的交联小于20％，则不是本发明的限定。
可偶联至藻胆蛋白以便形成串联染料的荧光“伴侣”染料可以选自上述染料。根据本文描述的方法和组合物的不同实施方式，用作偶联至配体的串联染料中伴侣染料的染料可以和另一种藻胆蛋白一起用在串联染料中，或者该染料被用于独立地标记所述组合物中的配体。
B.未偶联的藻胆蛋白
除上述被标记的配体之外，本文描述的组合物的实施方式也需要未偶联的藻胆蛋白的存在。在这里使用的术语“未偶联的”或者“游离的”藻胆蛋白是如上所述的藻胆蛋白，但是不会偶联至配体。所述未偶联的藻胆蛋白包含亚基，凭此，一些亚基一定不会被交联。在一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白在它的亚基之间没有交联。在另一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白在它的亚基之间有交联。如果交联存在于所述未偶联的藻胆蛋白中，理想地，所述未偶联的藻胆蛋白中的交联的量小于在串联染料中被偶联的藻胆蛋白中的交联的量。
在一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白一定来源于和所述串联染料中被偶联的藻胆蛋白相同的细菌或者真核藻种类。作为最好的结果，对于每个被配体偶联的串联染料，相应的未偶联的藻胆蛋白(来源于和所述串联染料中的藻胆蛋白相同的种类)必须被添加至组合物中。在一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白和被偶联的藻胆蛋白相同。当术语“相同”被用于描述被偶联的和未偶联的藻胆蛋白时，术语“相同”指的是每个分子的相同结构特性。
在另一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白不同于所述串联染料中被偶联的藻胆蛋白，但是所述未偶联的藻胆蛋白包含可与所述串联染料中的藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
所述未偶联的藻胆蛋白可以购自上述供应商，或者可以是如上所述分离的、天然的蛋白质、合成蛋白质或者经修饰的蛋白质。然而，所述藻胆蛋白的来源、或者为本发明的用途目的所做的修饰量并不是对本发明的限制。所述未偶联的藻胆蛋白也可以被改变或修饰，以便消除或者减少它的荧光。在一个实施方式中，比如通过用紫外光幅射，使所述未偶联的藻胆蛋白进行光漂白。在另一个实施方式中，所述藻胆蛋白可以被化学漂白，即通过使用1-3％次氯酸钠
Figure BPA00001422435400161
试剂来进行漂白。通过使用本领域中的标准方法，本领域的技术人员能够容易地修饰未偶联的藻胆蛋白以便用于本发明的用途。
组合物中所需要的未偶联的藻胆蛋白的含量是可以足以稳定所述组合物的量。理想地，所述未偶联的藻胆蛋白以在稳定状态下允许未交联的亚基进行交换的量存在。在一个实施方式中，未偶联的藻胆蛋白比上串联染料中偶联的藻胆蛋白的比率至少是0.125∶1、0.25∶1、0.50∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1或者20∶1、以及它们之间的级分比率。在另一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白比上所述偶联的藻胆蛋白的比率是大约0.125∶1至大约20∶1。在又一个实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白比上所述偶联的藻胆蛋白的比率是大约0.25∶1至大约10∶1。在更进一步的实施方式中，所述未偶联的藻胆蛋白比上所述偶联的藻胆蛋白的比率是4∶1至0.25∶1。
在一个实施方式中，串联染料中的偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是相同的，并且它们是别藻蓝蛋白、藻红蛋白、藻青蛋白或者藻红青蛋白。在另一个实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是不同的。但是，如果串联染料中偶联的藻胆蛋白和未偶联的藻胆蛋白不相同，则它们必须包含可以彼此交换的未交联的亚基。比如，串联染料中偶联的藻胆蛋白和未偶联的藻胆蛋白是不同的，它们独立地是别藻蓝蛋白、藻红蛋白、藻青蛋白或者藻红青蛋白，并且它们包含可以彼此交换的未交联的亚基。在更进一步的实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是相同的，并且它们是APC、R-PE、B-PE、C-PE、Y-PE或者PEC。仍然在更进一步地实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是不同的，它们独立地是APC、R-PE、B-PE、C-PE、Y-PE或者PEC，并且它们包含可以彼此交换的未交联的亚基。在又一个实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是相同的，并且它们是R-PE、B-PE、Y-PE、PE566、PEC、R-PC5或者APC。在更进一步的实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是不同的，它们独立地选白R-PE、B-PE、Y-PE、PE566、PEC、R-PC或者APC，并且它们包含可以彼此交换的未交联的亚基。在另一个实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是相同的，并且是别藻蓝蛋白。在又一个实施方式中，串联染料中偶联的藻胆蛋白和所述未偶联的藻胆蛋白是相同的，并且是藻红蛋白。
C.组合物中的与附加配体偶联的染料组分
除含单一藻胆蛋白的串联染料和单一未偶联的藻胆蛋白之外，含染料和配体的组合物的其它实施方式可以包含多个配体、多个串联染料、多个未偶联的染料及其他任选的组分。为了在列举各种细胞种群中最有效，优选所述染料组合物包含多种配体偶联的荧光染料。本领域的技术人员可以容易地确定上下文中使用的术语“附加(的)”。举例来说，术语“附加(的)”可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10种以上组分，包括配体偶联的染料组分和未偶联的藻胆蛋白。
所述染料组合物中包括的每个附加的染料或者附加的藻胆蛋白必须被直接偶联至组合物中一种以上的配体。在本文描述的大多数组合物中，在染料组合物中不含未标记的或者未偶联的配体。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括一种以上被偶联至并非藻胆蛋白的荧光染料或荧光性染料上的附加配体。举例来说，染料组合物可以包括被偶联至y个染料上的x个配体，其中x＝y并且是整数。在一个实施方式中，x和y是1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10。在更进一步的实施方式中，x和y是1、2、3或者4。所述染料可以是如上所述的任何染料。本领域的技术人员能够容易地选择合适的染料用于将其添加至染料组合物中。
在另一个实施方式中，本发明的所述染料组合物包括一种以上直接偶联至附加藻胆蛋白的附加配体。在一个实施方式中，所述附加藻胆蛋白来源于和染料组合物中被配体偶联的串联染料中的所述藻胆蛋白相同的细菌或者真核藻种类。在另一个实施方式中，所述附加藻胆蛋白来源于另一个细菌或者真核藻种类，作为染料组合物中配体偶联的串联染料中的所述藻胆蛋白。举例来说，所述染料组合物可以包括偶联至y′个染料的x′个配体，其中x′＝y′并且是整数。在一个实施方式中，x′和y′是1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10。在更进一步的实施方式中，x′和y′是1、2、3或者4。用于直接标记另一种配体的藻胆蛋白可以是如上所述的任何藻胆蛋白。在一个实施方式中，所述附加藻胆蛋白并不含有可与组合物中任何藻胆蛋白(或者是所述配体偶联的串联染料、或者是未偶联的藻胆蛋白)中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在更进一步的实施方式中，所述附加藻胆蛋白含有可与组合物中配体偶联的串联染料中一种以上藻胆蛋白或者未偶联的藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。本领域的技术人员能够容易地选择合适的藻胆蛋白，用于直接偶联至配体并且随后添加至试剂混合物中。
在另一个实施方式中，本发明的染料组合物包括一种以上偶联至包含附加藻胆蛋白的附加串联染料的附加配体。举例来说，所述染料组合物可以包括x″个配体，每个分别偶联至y″个串联染料，其中x″＝y″并且是整数。在一个实施方式中，x″和y″是1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10。在更进一步的实施方式中，x″和y″是1、2、3或者4。在一个实施方式中，所述附加串联染料中的藻胆蛋白来源于和第一配体偶联的串联染料组合物中藻胆蛋白相同的细菌或者真核藻种类。在另一个实施方式中，所述附加藻胆蛋白来源于和第一染料组合物中藻胆蛋白不同的细菌或者真核藻种类。然而，如果附加串联染料中的附加藻胆蛋白来自于另一个细菌或者真核藻种类，则未偶联形式中的相同藻胆蛋白必须被添加至染料组合物中。然而，不管所述藻胆蛋白的来源如何，本领域的技术人员可以从如上所述的任何藻胆蛋白中选择。
组合物的各种实施方式包含偶联至串联染料的多个配体。举例来说，在一个理想的实施方式中，除了(a)偶联至第一串联染料的第一配体和(b)第一未偶联的藻胆蛋白之外，所述组合物还可以包含下列组分：(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包括(i)包含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类；和(ii)偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料；和(d)包含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白。第二藻胆蛋白来源于所述第二细菌或者真核藻种类。所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的。可供选择地，所述第三和第四藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白包含可与所述第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在另一个理想的实施方式中，除了上述组分以外，所述组合物可以更进一步地包含：(e)偶联至第四藻胆蛋白的第三配体，所述第四藻胆蛋白来源于第一细菌种类、第一真核藻种类、第二细菌种类或者第二真核藻种类。所述第四藻胆蛋白和第一、第二或者第三藻胆蛋白相同；或者可供选择地，所述第四藻胆蛋白不同于第一、第二或者第三藻胆蛋白并且包含可与第一、第二或者第三藻胆蛋白中的未交联亚基相交换的未交联的亚基。
在更进一步理想的实施方式中，除了(a)偶联至第一串联染料的第一配体和(b)第一未偶联的藻胆蛋白之外，所述组合物还可以包含以下成分：(c)偶联至第三藻胆蛋白的第二配体，所述第三藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻类类型。所述第三藻胆蛋白和第一或者第二藻胆蛋白相同；或者可供选择地，所述第三藻胆蛋白不同于第一或者第二藻胆蛋白并且所述第三藻胆蛋白包含可与第一和第二藻胆蛋白中的未交联亚基相交换的未交联的亚基。在一个方面，所述第三藻胆蛋白并不包含可与所述第一或者第二藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。在另一个方面，所述第三藻胆蛋白包含可与所述第一或者第二藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
在另一个理想的实施方式中，所述组合物更进一步地包括一种以上偶联至非藻胆蛋白染料的附加配体。
D.组合物中其它可供选择的非染料组分
除了附加的配体、藻胆蛋白、串联染料和荧光染料之外的组分，可以被包括在本文描述的组合物中。本领域的技术人员可以容易地选择所述附加组分的选择物，并且选择物取决于其中被分析的样品、所述组合物的组分、被分析的参数。举例来说，参见美国专利No.6,551,831中列举的表面活性剂，将其并入本文以供参考。
组合物的实施方式可以更进一步地包含其它组分，例如用于将所述组合物的pH维持在大约6至大约9的范围内任何期望pH的缓冲液。缓冲液的实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水或者等渗盐水，诸如ISOTON II缓冲液(Coulter公司，迈阿密，佛罗里达)和在美国专利No.3,962,125中确定的那些，将其并入本文以供参考。
可以向组合物中添加防腐剂，并且防腐剂可以选自但不限于5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(可以购买这种防腐剂，比如ProClin
Figure BPA00001422435400191
300或者ProClin
Figure BPA00001422435400192
150)。
本领域的技术人员可以选择适用于本文描述的各种方法中所使用的组合物的表面活性剂、缓冲液、防腐剂或者其它常规试剂。这种选择并非是对本文教导的方法和组合物进行限制。
E.包含多种被标记配体的组合物
在一个理想的的实施方式中，所述组合物包含偶联至串联染料的一种配体(L1-串联染料1)。在另一个实施方式中，所述组合物包含两种配体，其中一种抗体被偶联至串联染料(L1-串联染料1)，并且另一种配体被直接偶联至藻胆蛋白(L2-pbp)。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含两种配体，其中一种配体被偶联至一种串联染料(L1-串联染料1)，而另一种配体被偶联至第二串联染料(L2-串联染料2)。在另一个实施方式中，所述组合物包含三种配体，其中一种配体偶联至一种串联染料(L1-串联染料1)，第二配体偶联至第二串联染料(L2-串联染料2)，而第三配体被偶联至藻胆蛋白(L3-pbp)。在另一个实施方式中，所述组合物包含偶联至一种串联染料的一种配体(L1-串联染料1)、偶联至藻胆蛋白的第二配体(L2-pbp)和单独偶联至x种串联染料的x种配体(Lx-串联染料x)。在更进一步的实施方式中，所述组合物包含偶联至一种串联染料的一种配体(L1-串联染料1)、偶联至藻胆蛋白的第二配体(L2-pbp)和单独偶联至x种非藻胆蛋白的可发荧光的(fluorescable)染料的x种配体(Lx-染料x)。
III.本发明的组合物的具体实施方式
作为上面一般描述的组合物的第一实施例，组合物包含(a)偶联至第一串联染料的第一配体。第一串联染料包括第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白包含偶联至第一伴侣染料的交联的和未交联的亚基，第一伴侣染料偶联至所述第一藻胆蛋白。所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类。所述组合物还包含(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类。在这个组合物的一个实施方式中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的。在这个组合物的另一个实施方式中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的，并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表1。
表1
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类-1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
作为本文描述的组合物的第二实施例或者实施方式，组合物包含(a)偶联至第一串联染料的第一配体。第一串联染料包括第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白包含偶联至第一伴侣染料的交联的和未交联的亚基，第一伴侣染料偶联至所述第一藻胆蛋白。所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类。所述组合物还包含(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类。在这个组合物的一个实施方式中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的。在这个组合物的另一个实施方式中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的，并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。组合物的这个第二实施方式更进一步地包含(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包括(i)含交联和未交联亚基的第三藻胆蛋白和(ii)偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料。所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌或者真核藻种类。在这个组合物的一个实施方式中，所述第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的。在这个组合物的另一个实施方式中，所述第三藻胆蛋白不同于所述第一或者第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表2。
表2
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
在更进一步的实施方式中，组合物包含：
(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包括：(i)含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；和(ii)偶联至所述第一藻胆蛋白的第一伴侣染料；
(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的，并且所述第二藻胆蛋白含有可与所述第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；
(c)偶联至第二串联染料的第二配体，第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；其中，第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第三藻胆蛋白不同于第一和第二藻胆蛋白并且所述第三藻胆蛋白含有可与第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及
(d)偶联至第三串联染料的第三配体，所述第三串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第三伴侣染料；其中，第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于第一、第二或者第三藻胆蛋白并且所述第四藻胆蛋白含有可与第一、第二或者第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表3。
表3
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
  偶联至串联染料-3的配体-3   偶联至伴侣染料-3的藻胆蛋白-4(种类1)
在更进一步的实施方式中，组合物包含：
(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包括：(i)含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；和(ii)偶联至所述第一藻胆蛋白的第一伴侣染料；
(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；
(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；其中，第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第三藻胆蛋白不同于第一和第二藻胆蛋白并且所述第三藻胆蛋白含有可与第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；
(d)偶联至第三串联染料的第三配体，所述第三串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第三伴侣染料；其中，第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于第一、第二或者第三藻胆蛋白并且所述第四藻胆蛋白含有可与第一、第二或者第三藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及
(e)偶联至第四串联染料的第四配体，所述第四串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第五藻胆蛋白，所述第五藻胆蛋白来源于所述细菌或者真核藻种类并且偶联至第四伴侣染料；其中第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白是相同的；或者所述第五藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白并且所述第五藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表4。
表4
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
  偶联至串联染料-3的配体-3   偶联至伴侣染料-3的藻胆蛋白-4(种类1)
  偶联至串联染料-4的配体-4   偶联至伴侣染料-4的藻胆蛋白-5(种类1)
在又一个实施方式中，组合物包含：
(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；
(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者第一真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及
(c)一种以上偶联至非藻胆蛋白染料的附加配体。参见表5。
表5
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  偶联至非藻胆蛋白染料-2的配体-2
在更进一步的实施方式中，提供的组合物包含：
(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；
(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；
(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；以及
(d)含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类；其中，所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是不同的并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表6。
表6
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类2)
  未偶联的藻胆蛋白-4(种类2)
在另一个实施方式中，提供的组合物包含：
(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；
(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；
(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；
(d)含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类；其中，所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是不同的并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及
(e)偶联至第四藻胆蛋白的第三配体，所述第四藻胆蛋白来源于第一细菌种类、第一真核藻种类、第二细菌种类或者第二真核藻种类；其中所述第四藻胆蛋白和第一藻胆蛋白、第二藻胆蛋白或者第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于第一、第二或者第三藻胆蛋白并且含有可与第一、第二或者第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表7。
表7
  组合物组分   串联染料组分
  偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类2)
  未偶联的藻胆蛋白-4(种类2)
  偶联至藻胆蛋白-3(种类2)的配体-3
利用本说明书的教导，附加的组分，可以制备包含本领域的技术人员选择的附加组分的其它组合物。
IV.用于制备和使用本发明的所述组合物的方法
本文论述的用于制备所述组合物的方法一般包括合并或者预混合经选择的多色组合物中被标记的配体和游离的藻胆蛋白组分，并且可供选择地储存该预混合的组合物。正如本领域的技术人员所确定的那样，如必要的话，然后稀释所述组合物，并且将所述组合物与所选择的生物样品混合以便用于分析。
具体地，通过混合下述(a)和(b)来制备所述组合物：(a)偶联至第一串联染料的第一配体，第一串联染料包括含有交联的第一藻胆蛋白和第一染料；所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一染料；和(b)未偶联的第一藻胆蛋白，其来源于第一细菌或者真核藻种类。如上所述，可以加入附加的组分，这取决于要被分析的种群。在一个实施方式中，偶联至第二染料的第二配体被添加至所述反应混合物中，第二染料选自由第二藻胆蛋白、包含第二藻胆蛋白的第二串联染料、非藻胆蛋白染料所构成的组。
本领域的技术人员能够确定如下所述的方法中需要使用的组合物的量。在一个实施方式中，至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或者200μL的组合物被使用。在另一个实施方式中，大约5至大约200μL的组合物被使用。在更进一步的实施方式中，大约100μL的组合物被使用。
这些组分一般通过在任何选定的温度(包括室温、环境温度)下或者在降低的温度低至2℃的温度下温育来混合或反应。在另一个实施方式中，可以使用大约40℃的升高的温度。然而，在分析的时候组合物的温度必须足以满足样品中细胞的生存力。在一个实施方式中，可以使用大约2至大约8℃的温度，特别可用于所述混合物的混合和储存。
所述反应时间范围一般大于大约15秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟或者15分钟，或者它们之间的秒数。在另一个实施方式中，所述温育时间是大约15秒至大约30分钟。在更进一步的实施方式中，如果调节组合物中所述组分的浓度，可以得到更快的反应时间。
包含如上所述组分和如上述制备的组合物在分析样品中的细胞种群和非细胞种群的常规方法中是有效的，如下面实施例所示。这种常规的流式细胞术方法对于本领域的技术人员是已知的，并且包括将样品和本文所描述的组合物混合、以及通过分析荧光来确定所述样品中的种群。理想地，至少一种细胞种群和非细胞种群包括所述第一配体的受体。参见美国专利No.6,551,831，将其并入本文以供参考。
V.本发明的试剂盒
在又一个方面，提供的试剂盒能够用于混合或者使用常规的流式细胞术分析中的这些组合物。理想地，这种试剂盒被用于进行本发明的流式细胞诊断方法。然而，这种试剂盒可以被组合用于研发和评估其它稳定试剂中的研究目的。
所述组合物、其组分以及进行上述方法的许多变型所必需的组分，可以被组合成试剂盒以便于使用。这种试剂盒可以包含形成组合物所需组分作为单独的组分。在一个实施方式中，存在于单独的容器中的一种单独组分是偶联至第一串联染料的第一配体，第一串联染料包括含交联并来源于第一细菌或者真核藻种类且偶联至第一染料的第一藻胆蛋白。存在于第二容器中的第二单独组分是来源于第一细菌或者真核藻种类的未偶联的第一藻胆蛋白。购买者可以自行处理将这两种组分混合使用。在另一个实施方式中，所述试剂盒可以包含一种“预混合”容器，该容器包含：(a)偶联至第一串联染料的第一配体，第一串联染料包括：(i)含交联的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类和(ii)第一伴侣染料；以及(b)未偶联的第一藻胆蛋白，其来源于第一细菌或者真核藻种类。正如以上的讨论，本文所论述的组合物的优点在于，这些组合物并不降解或者这些组合物在可干涉血液分析的单独组分之间具有亚基交换。
附加的容器可以更进一步被包括在试剂盒中。这些附加容器可以单独地包含上述任何可选择的组分。然而即使有的话，所述附加组分必须具有不能不利地影响试剂组合物稳定性的生理性pH。
这种试剂盒可以更进一步地包含用于混合所述组合物的单独组分的一个或多个说明书、包含所述组合物的组分的合适容器、用于混合所述组合物和生物样品的合适容器、细胞的正常或者疾病特征值的合适对照物或者表格；抗凝血剂或者凝血途径抑制因子、适合于进行流式细胞分析的其它试剂及其组合物；用于样品的合适稀释液和缓冲液、一次性手套、抗感染说明书、涂药棒或者容器以及预备杯(preparator cup)。
本领域的技术人员可以组装许多试剂盒和信息以及进行样品分析方法所必需的组分。
在一个实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)包括偶联至第一串联染料的第一配体的第一容器，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；和(b)包括含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白的第二容器，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基。一种以上附加的容器可以被归纳入试剂盒中，并且容器可以包含上述任何一个试剂。参见表8。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表8
 容器   容器组分   串联染料组分
 1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
 2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
 3以上   上述可选择的组分
在另一个实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)包含偶联至第一串联染料的第一配体的第一容器，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；(b)包括含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白的第二容器，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白包含可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及(c)包括偶联至第二串联染料的第二配体的第三容器，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；其中，第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第三藻胆蛋白不同于所述第一或者第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表9。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表9
 容器   容器组分   串联染料组分
 1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
 2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
 3   偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
 4以上   上述可选择的组分
在更进一步的实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)包含偶联至第一串联染料的第一配体的第一容器，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；(b)包括含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白的第二容器，第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；(c)包括偶联至第二串联染料的第二配体的第三容器，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；其中，第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第三藻胆蛋白不同于所述第一或者第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及(d)包括偶联至第三串联染料的第三配体的第四容器，所述第三串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第三伴侣染料；其中，第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二或者第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二或者第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表10。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表10
 容器   容器组分   串联染料组分
 1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
 2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
 3   偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
 4   偶联至串联染料-3的配体-3   偶联至伴侣染料-3的藻胆蛋白-4(种类1)
 5以上   上述可选择的组分
在更进一步的实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)包含偶联至第一串联染料的第一配体的第一容器，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；(b)包括含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白的第二容器，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；(c)包括偶联至第二串联染料的第二配体的第三容器，所述第二串联染料包括：含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；偶联至第二伴侣染料，第二伴侣染料偶联至所述第三藻胆蛋白；其中第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第三藻胆蛋白不同于第一和第二藻胆蛋白并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；(d)包括偶联至第三串联染料的第三配体的第四容器，所述第三串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第三伴侣染料；其中，第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二或者第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二或者第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及(e)包括偶联至第四串联染料的第四配体的第五容器，所述第四串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第五藻胆蛋白，所述第五藻胆蛋白来源于所述细菌或者真核藻种类并且偶联至第四伴侣染料；其中，第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白是相同的；或者所述第五藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白，并且所述第五藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表11。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表11
 容器   容器组分   串联染料组分
 1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
 2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
 3   偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
 4   偶联至串联染料-3的配体-3   偶联至伴侣染料-3的藻胆蛋白-4(种类1)
 5   偶联至串联染料-4的配体-4   偶联至伴侣染料-4的藻胆蛋白-5(种类1)
 6以上   上述可选择的组分
在又一个实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)包含偶联至第一串联染料的第一配体的第一容器，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；(b)包括含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白的第二容器，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及(c)包括一种以上偶联至非藻胆蛋白染料的附加配体的第三容器。参见表12。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表12
  容器   容器组分   串联染料组分
  1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
  2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
  3   偶联至非藻胆蛋白的染料-2的配体-2
  4以上   上述可选择的组分
在更进一步的实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)包含偶联至第一串联染料的第一配体的第一容器，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至第一伴侣染料；(b)包括含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白的第二容器，所述第二藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类；其中，第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是相同的；或者第二藻胆蛋白和第一藻胆蛋白是不同的并且第二藻胆蛋白含有可与第一藻胆蛋白中未交联的亚基相交换的未交联的亚基；(c)包括偶联至第二串联染料的第二配体的第三容器，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；以及(d)包括含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白的第四容器，所述第二藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类；其中，所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表13。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表13
 容器   容器组分   串联染料组分
 1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
 2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
 3   偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类1)
 4   未偶联的藻胆蛋白-4(种类2)
 5以上   上述可选择的组分
在另一个实施方式中，提供的试剂盒包含：(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌或者真核藻种类并且偶联至已被偶联的第一伴侣染料；(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；其中，所述第二藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白是相同的；或者所述第二藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白是不同的，并且所述第二藻胆蛋白含有可与所述第一藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包括含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌或者真核藻种类并且偶联至第二伴侣染料；(d)含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于所述第二细菌或者真核藻种类；其中，所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的；或者所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；以及(e)偶联至第四藻胆蛋白的第三配体，所述第四藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类、所述第一真核藻种类、所述第二细菌种类或者所述第二真核藻种类；其中，所述第四藻胆蛋白和第一藻胆蛋白、第二藻胆蛋白或者第三藻胆蛋白相同；或者所述第四藻胆蛋白不同于第一、第二或者第三藻胆蛋白并且含有可与第一、第二或者第三藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基。参见表14。可供选择地，所述组合物的组分可以存在于一个容器中。
表14
 容器   容器组分   串联染料组分
 1   偶联至串联染料-1的配体-1   偶联至伴侣染料-1的藻胆蛋白-1(种类1)
 2   未偶联的藻胆蛋白-2(种类1)
 3   偶联至串联染料-2的配体-2   偶联至伴侣染料-2的藻胆蛋白-3(种类2)
 4   未偶联的藻胆蛋白-4(种类2)
 5   偶联至藻胆蛋白的配体-3(种类1或2)
 6以上   上述可选择的组分
下列实施例举例说明本发明的各个方面。这些实施例并没有限制本发明的权利要求所限定的保护范围。
实施例
实施例1
实施这个实施例以便确定从钝顶螺旋藻中分离的APC中的交联百分比。
在SephadexG-50柱上在磷酸盐缓冲液(10mM K3PO4+150mM NaCl+2mM EDTApH7.2)中对不同的交联的和未交联的APC样品脱盐。在MicronYM-30膜(密理博公司，Part#UFC903024)上浓缩所述脱盐溶液至大约15±2mg/ml。然后使用本领域的技术和下面的条件/仪器通过HPLC分析这些APC样品。
柱子：Superdex
Figure BPA00001422435400323
200HR大小排阻层析柱(通用电气医疗集团，Part#17-1088-01)
洗脱液：10mM K3PO4+150mM NaCl+2mM EDTA+1M NaClO4 pH 7.2
流速：0.8mL/min
在缓冲液中每个浓缩的APC样品被稀释至0.5mg/mL并且在22±2℃下被温育30分钟。然后将每个样品注射进大小排阻层析柱，并且在洗脱期间监控波长A280、A652和A616。用于代表样品和n-APC的A280的图显示在图4中。在12ml的保留体积下洗脱完整的APC，并且在14.5ml的保留体积下洗脱解离的APC。通过计算洗脱峰下的面积来确定APC中的交联百分比。色谱中完整的峰的积分面积比上总面积的比值给出了样品的交联百分比。图4是这些交联和未交联APC的色谱图。
在图右侧的最高峰对应的是所述的(1)未交联的APC样品。图中剩余的峰对应的是交联的APC样品。具体地讲，图左侧的峰对应的是完整的APC分子，而图右侧的小峰(在未交联的APC峰的下面)对应的是APC亚基。根据这些色谱图，所述交联的APC样品的交联百分比是大约76至大约96％。
实施例2
这个实施例举例说明本文描述的所述组合物和方法的优点，包括含有未偶联的藻胆蛋白的被2-色配体偶联的串联染料组合物。
制备了四(4)种组合物，并且每种组合物包含两(2)种单独结合于从钝顶螺旋藻中分离的藻胆蛋白的单克隆抗体和串联染料。具体地讲，每个组合物(10μL)包含0.5μg偶联至别藻蓝蛋白的CD3(CD3-APC)和0.5μg偶联至别藻蓝蛋白-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400331
750串联染料的CD19(CD19-APC-AlexaFluor750)。
组合物1，即对照组合物，是新鲜制备的，并且没有包含附加组分。组合物2没有包含附加组分，但是在2至8℃下保留21天。组合物3和4还包含0.5μg从钝顶螺旋藻中分离的未偶联的APC，组合物3是所有所述组分的新鲜混合物，而组合物4在添加至生物样品和分析前在2至8℃下保留21天。
然后将这些组合物单独地和含全血的生物样品(0.1ml)相混合，温育10-12分钟，使用标准VersaLyse
Figure BPA00001422435400333
方法加工，并且使用流式细胞仪进行分析。本领域的技术人员能够容易地进行本领域中已知的Versalyse
Figure BPA00001422435400334
方法，包括将经处理的生物样品和Versalyse
Figure BPA00001422435400335
试剂/0.2％甲醛(1ml)混合10分钟，旋降经处理的样品，对上清液进行抽气，将团粒再悬浮于磷酸盐缓冲液(3mL)中，旋降磷酸盐缓冲液，以及将团粒再悬浮于磷酸盐缓冲液/0.1％甲醛(0.5ml)中用于分析。参见图1A-1D。
这些结果清楚地显示了本发明的组合物(图1D)与现有技术(图1B)相比用于流式细胞分析的有效性。
实施例3
这个实施例举例说明了本文描述的组合物和方法的优点，涉及将未偶联的藻胆蛋白添加至被2-色配体偶联的串联染料组合物中。
制备了九(9)种组合物，并且每种组合物包含了两(2)种单独结合于藻胆蛋白的单克隆抗体和串联染料。具体地讲，每个组合物(10μL)包含偶联至从钝顶螺旋藻分离的别藻蓝蛋白的CD3(0.5μg；CD3-APC)和0.5μg的偶联至别藻蓝蛋白(从钝顶螺旋藻分离)-AlexsFluor
Figure BPA00001422435400336
750串联染料的CD19(CD19-APC-AlexaFluor750)。组合物1，即所述“现有技术的新鲜混合物”，是新鲜制备的，并且没有包含附加组分。组合物2，即所述“现有技术的储存混合物”，没有包含附加组分，但是在2至8℃下保留21天。组合物3-9还包含从钝顶螺旋藻中分离的不同含量的未偶联的APC，并且在添加至生物样品和分析前在2至8℃下保留21天。参见表15。
表15
Figure BPA00001422435400341
然后如上述实施例2所述，将这些组合物用于血液样品的流式细胞分析中。参见图2A-2I。
这些结果举例说明了将天然的未偶联的APC(广泛的范围)添加至被两种颜色的配体所偶联的APC串联染料和被配体偶联的APC试剂组合物中时在将亚基交换的影响减到最小中的有效性。较高浓度(特别是500μg/ml以上)导致提高的细胞的非特异标记性。然而，含量是0.0625μg(图2C)至2μg(图2G)的未偶联的APC显示，细胞的非特异标记性没有这样的提高，并且也为现有技术(图2B)的组合物提供了所期望的稳定性。该结果还表明，添加0.0625μg-10.0μg范围的游离的、未偶联的藻胆蛋白限制了预配制产品随时间的降解。
实施例4
这个实施例举例说明了本文描述的组合物和方法的优点，涉及将未偶联的藻胆蛋白添加至被3-色配体偶联的藻胆蛋白和被配体偶联的串联染料组合物中。制备了五(5)种组合物，并且这五(5)种组合物包含三(3)种单独结合于从钝顶螺旋藻中分离的藻胆蛋白的单克隆抗体和所述两种串联染料。具体地讲，每个组合物(10μL)包含0.5μg偶联至从钝顶螺旋藻分离的别藻蓝蛋白的CD19(CD19-APC)，0.5μg偶联至别藻蓝蛋白(从钝顶螺旋藻分离的)-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400351
700串联染料的CD4(CD19-APC-A700)，和0.5μg偶联至别藻蓝蛋白(从钝顶螺旋藻分离)-AlexaFluor
Figure BPA00001422435400352
750串联染料的CD8(CD8-APC-A750)。组合物1，即对照组合物，是新鲜制备的，并且没有包含附加组分。组合物2没有包含附加组分，但是在2至8℃下保留120天。组合物3-5此外还包含从钝顶螺旋藻分离的不同含量的未偶联的APC，并且在分析前在2-8℃下保留120天。参见表16。
表16
Figure BPA00001422435400353
然后这些组合物如实施例2所述，单独地用于分析血液样品。参见图3A-3J。这些图显示了通过使用不同含量的游离藻胆蛋白在储存期间配体-染料组合物的稳定性。因此这些结果说明，游离的、未偶联的藻胆蛋白限制了三色试剂的较复杂混合物中预配制的组合物随着时间的降解。
上述所有的出版文献、专利和专利申请以及优先权文件的公开被并入本文以供参考。本文描述的方法和组合物的众多常规修饰和变型被包括入上述的说明书中，并且预期对于本领域的技术人员而言是显而易见的。对本发明的不同实施方式的组合物和方法的这种修饰和改变应被被认为是包括在本文的权利要求的保护范围中。

Claims (23)

1.一种组合物，其包含：
(a)偶联至第一串联染料的第一配体，所述第一串联染料包含：
(i)含交联的和未交联的亚基的第一藻胆蛋白，所述第一藻胆蛋白来源于第一细菌种类或者第一真核藻种类；和
(ii)偶联至所述第一藻胆蛋白的第一伴侣染料；和
(b)含亚基的未偶联的第二藻胆蛋白，所述第二藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类，其中未偶联的藻胆蛋白是没有偶联至配体的藻胆蛋白；
其中：
所述第二藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白是相同的；或者
所述第二藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白是不同的，并且所述第二藻胆蛋白含有可与所述第一藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白在所述亚基之间不含交联；或者所述第二藻胆蛋白在所述亚基之间含有交联；或者其中，所述第二藻胆蛋白是天然蛋白质；或者所述第二藻胆蛋白是被修饰的蛋白质。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一藻胆蛋白中的交联量大于所述第二藻胆蛋白中的交联量。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白被修饰以便消除或者减少荧光；或者所述第二藻胆蛋白被漂白。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述修饰并不影响所述第二藻胆蛋白的交联。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二藻胆蛋白对所述第一藻胆蛋白之比率是0.25：1至10：1。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一藻胆蛋白和所述第二藻胆蛋白选自于由别藻蓝蛋白、藻红蛋白、藻青蛋白和藻红青蛋白所构成的组；或者所述第一藻胆蛋白和所述第二藻胆蛋白选自于由R-藻红蛋白、B-藻红蛋白、Y-藻红蛋白、藻红蛋白566、藻红青蛋白、R-藻青蛋白以及别藻蓝蛋白所构成的组。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一细菌种类是蓝藻类细菌。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述蓝藻类细菌选自于由钝顶螺旋藻、多变鱼腥藻、无类囊体蓝藻、小单岐藻以及赖氏鞘氏藻所构成的组。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含：
(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包含：
(i)含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；和
(ii)偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料；
其中：
所述第一、第二和第三藻胆蛋白是相同的；或者
所述第三藻胆蛋白不同于所述第一和第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，进一步包含：
(d)偶联至第三串联染料的第三配体，所述第三串联染料包含：
(i)含交联的和未交联的亚基的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；和
(ii)偶联至所述第四藻胆蛋白的第三伴侣染料；
其中：
所述第一、第二、第三和第四藻胆蛋白是相同的；或者
所述第四藻胆蛋白不同于所述第一、第二或者第三藻胆蛋白，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第一、第二或者第三藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，进一步包含：
(e)偶联至第四串联染料的第四配体，所述第四串联染料包含：
(i)含交联的和未交联的亚基的第五藻胆蛋白，所述第五藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；和
(ii)偶联至所述第五藻胆蛋白的第四伴侣染料；
其中：
所述第一、第二、第三、第四和第五藻胆蛋白是相同的；或者
所述第五藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白，并且所述第五藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含：
(c)偶联至第三藻胆蛋白的第二配体，所述第三藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类或者所述第一真核藻种类；
其中：所述第三藻胆蛋白与所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白是相同的；
或者
所述第三藻胆蛋白不同于所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白，并且所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一和第二藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述第三藻胆蛋白不含可与所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；或者所述第三藻胆蛋白含有可与所述第一藻胆蛋白或者所述第二藻胆蛋白中的未交联的亚基相交换的未交联的亚基；或者其中，所述第一配体和所述第二配体是相同的；或者所述第一配体和所述第二配体是不同的。
15.如权利要求1或者权利要求13所述的组合物，其特征在于，进一步包含一种以上偶联至并非藻胆蛋白的染料的附加配体。
16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包含：
(c)偶联至第二串联染料的第二配体，所述第二串联染料包含：
(i)含交联的和未交联的亚基的第三藻胆蛋白，所述第三藻胆蛋白来源于第二细菌种类或者第二真核藻种类；和
(ii)偶联至所述第三藻胆蛋白的第二伴侣染料；
(d)含亚基的未偶联的第四藻胆蛋白，所述第四藻胆蛋白来源于所述第二细菌种类或者所述第二真核藻种类；
其中：
所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是相同的；或者
所述第四藻胆蛋白和所述第三藻胆蛋白是不同的，并且所述第四藻胆蛋白含有可与所述第三藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，进一步包含：
(e)偶联至第五藻胆蛋白的第三配体，所述第五藻胆蛋白来源于所述第一细菌种类、所述第一真核藻种类、所述第二细菌种类或者所述第二真核藻种类；
其中：
所述第五藻胆蛋白和所述第一藻胆蛋白、所述第二藻胆蛋白、所述第三藻胆蛋白或者所述第四藻胆蛋白相同；或者
所述第五藻胆蛋白不同于所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白，并且所述第五藻胆蛋白含有可与所述第一、第二、第三或者第四藻胆蛋白的所述未交联的亚基相交换的未交联的亚基。
18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一配体包含核酸序列或者氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述氨基酸序列包括抗体、酶、重组蛋白质、多分子组合体或者它们的片段。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述多分子组合体是重组蛋白质的四聚物。
21.一种用于分析样品中细胞种群和非细胞种群的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品和如权利要求1所述的组合物混合，其中所述细胞种群和非细胞种群中的至少一种包含所述第一配体的受体；和
(b)通过分析荧光来确定所述样品中的所述种群。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，进一步包括确定每个所述种群的至少一种附加参数。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述附加参数是独立地选自于由一种以上荧光通道、一种以上光学参数、一种以上电参数、时间、散射及它们的组合所构成的组。
CN200980156793.3A 2008-12-12 2009-12-10 包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物 Active CN102308214B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12192308P 2008-12-12 2008-12-12
US61/121,923 2008-12-12
PCT/US2009/067481 WO2010068742A1 (en) 2008-12-12 2009-12-10 Multicolor flow cytometry compositions containing unconjugated phycobiliproteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102308214A CN102308214A (zh) 2012-01-04
CN102308214B true CN102308214B (zh) 2014-06-25

Family

ID=42240997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980156793.3A Active CN102308214B (zh) 2008-12-12 2009-12-10 包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8663935B2 (zh)
EP (1) EP2356456B1 (zh)
JP (1) JP5718247B2 (zh)
CN (1) CN102308214B (zh)
WO (1) WO2010068742A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059672A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Beckman Coulter, Inc. Calibration kit for flow cytometry
EP2912464B1 (en) 2012-10-24 2017-04-26 Becton Dickinson and Company Hydroxamate substituted azaindoline-cyanine dyes and bioconjugates of the same
GB201309057D0 (en) * 2013-05-20 2013-07-03 Cell Therapy Ltd Method
JP7189204B2 (ja) * 2017-08-31 2022-12-13 アジレント・テクノロジーズ・インク ＰｅｒＣＰを含有する抗体製剤を安定化させるための組成物
CN109781975B (zh) * 2017-11-14 2022-05-06 河南乾坤科技有限公司 富集循环稀有细胞的试剂及方法
CN117030580A (zh) * 2023-09-15 2023-11-10 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） LDNs在坏死性小肠结肠炎诊断中的应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4542104A (en) * 1983-04-06 1985-09-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. Univ. Phycobiliprotein fluorescent conjugates
US4857474A (en) * 1985-03-29 1989-08-15 Research Corporation Phycoerythrins useful in fluorescent conjugates
US5272257A (en) * 1990-05-21 1993-12-21 Coulter Corporation Method of preferential labelling of a phycobiliprotein with an amine-reactive dye for use in a multiple color assay and product for such use
US5695990A (en) * 1995-04-10 1997-12-09 Cubicciotti; Roger S. Phycobilisomes, derivatives, and uses therefor
US6342389B1 (en) * 1995-04-10 2002-01-29 Roger S. Cubicciotti Modified phycobilisomes and uses therefore
US5714386A (en) * 1996-01-11 1998-02-03 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cy7-allophycocyanin conjugates for use in multiplex fluorescence detection assays
AU721792B2 (en) * 1996-09-06 2000-07-13 Medarex, Inc. Cyanidin compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
US5994089A (en) * 1997-05-16 1999-11-30 Coulter International Corp. Simultaneous analyses of white blood cell subsets using multi-color, multi-intensity fluorescent markers in flow cytometry
US6809186B1 (en) * 1999-01-22 2004-10-26 Martek Biosciences Corporation Simple method for labeled conjugate production
US6368864B1 (en) 2000-05-05 2002-04-09 Coulter International Corp. Dyes and methods of reticulocyte enumeration
CA2415319A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Martek Biosciences Corporation Recombinant phycobiliprotein and phycobiliprotein linker fusion proteins and uses therefore
US7256050B2 (en) * 2000-06-16 2007-08-14 Martek Biosciences Corp. High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
US20020165349A1 (en) * 2000-08-04 2002-11-07 Kirsch Wolff M. Iron regulating protein -2 (IRP-2) as a diagnostic for neurodegenerative disease
US20070009931A1 (en) * 2000-08-04 2007-01-11 Kirsch Wolff M Negative correlation between IRP-2 and Transferrin receptor expression as a diagnostic of Alzheimer's disease
WO2003005972A2 (en) * 2001-07-13 2003-01-23 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Method for identifying tolerance in graft recipients
US6703216B2 (en) * 2002-03-14 2004-03-09 The Regents Of The University Of California Methods, compositions and apparatuses for detection of gamma-hydroxybutyric acid (GHB)
US7341843B2 (en) * 2003-04-11 2008-03-11 Allergan, Inc. Botulinum toxin A peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy
US8008545B2 (en) * 2003-04-15 2011-08-30 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals
US20050069958A1 (en) * 2003-09-26 2005-03-31 Mills Rhonda A. Method for simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte
ES2354436T3 (es) * 2004-04-08 2011-03-15 Roche Diagnostics Gmbh Un complejo polipeptídico fluorescente de 40 a 500 nm de tamaño.
US20060024744A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Mills Rhonda A Methods for substantially simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte
WO2006047452A2 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Anaspec, Inc. Reactive 1,3’-crosslinked carbocyanines and their bioconjugates
US20060160998A1 (en) * 2005-01-19 2006-07-20 Suk Roelf J Methods for isolation and purification of fluorochrome-antibody conjugates
US20080131914A1 (en) * 2005-09-14 2008-06-05 Ahearn Joseph M Assessing risk of cerebrovascular thrombosis by measuring c4d

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A New Fluorescent Antibody Label for Three-ColorFlow Cytometry with a Single Lase;ALAN S. WAGGONER;《ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES》;19830320;第667卷;第185-第193页 *
ALAN S. WAGGONER.A New Fluorescent Antibody Label for Three-ColorFlow Cytometry with a Single Lase.《ANNALS NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES》.1983,第667卷第185-第193页.
Cy7PE and Cy7APC: Bright New Probes for Immunofluorescence;Mario Roederer;《Cytometry 》;19960701;第24卷;第191页左栏第1段，第192页右栏1-4段，第195页第右栏倒数第1段， *
Mario Roederer.Cy7PE and Cy7APC: Bright New Probes for Immunofluorescence.《Cytometry 》.1996,第24卷

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010068742A1 (en) 2010-06-17
US20100151493A1 (en) 2010-06-17
EP2356456A1 (en) 2011-08-17
CN102308214A (zh) 2012-01-04
JP5718247B2 (ja) 2015-05-13
EP2356456B1 (en) 2016-05-18
JP2012512161A (ja) 2012-05-31
EP2356456A4 (en) 2012-08-01
US8663935B2 (en) 2014-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102308214B (zh) 包含未偶联的藻胆蛋白的多色流式细胞术组合物
Fujimoto et al. Flow cytometric method for enumeration and classification of reactive immature granulocyte populations
CN1327927C (zh) 细胞分离组合物和方法
Owens et al. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry
Pearce et al. Multiparameter analysis of murine bone marrow side population cells
Barnett et al. Reduction of intra‐and interlaboratory variation in CD34+ stem cell enumeration using stable test material, standard protocols and targeted training
Tario et al. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry
Preffer et al. Advances in complex multiparameter flow cytometry technology: Applications in stem cell research
Murdoch et al. Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label: application in double labelling for cell surface antigen and cell cycle analysis
CN101561443A (zh) 五分类白细胞模拟物粒子、其制备方法以及含该模拟粒子的质控物和校准物
Shelby et al. Membrane phase separation drives responsive assembly of receptor signaling domains
CN110023736A (zh) 用于鉴定造血细胞亚型的用途、方法、试剂盒、组合物和抗体
Ortega‐Pierres et al. Protection against Trichinella spiralis induced by a monoclonal antibody that promotes killing of newborn larvae by granulocytes
Cherian et al. Flow cytometric monitoring for residual disease in B lymphoblastic leukemia post T cell engaging targeted therapies
Rios et al. FcεRI expression and dynamics on mast cells
CN104011542B (zh) 用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法
Mrdjen et al. High dimensional cytometry of central nervous system leukocytes during neuroinflammation
Bantly et al. CellVue® Claret, a new far-red dye, facilitates polychromatic assessment of immune cell proliferation
CN108732082A (zh) 细胞分群方法
Hübl et al. Measurement of absolute concentration and viability of CD34+ cells in cord blood and cord blood products using fluorescent beads and cyanine nucleic acid dyes
CN103398935A (zh) 一种用于白细胞分类计数的方法以及试剂盒
Gutensohn et al. Direct volumetric flow cytometric quantitation of CD34+ stem and progenitor cells
Giannelli et al. A six‐color flow cytometric assay for the analysis of peripheral blood dendritic cells
Santis et al. Applicability of papain solutions in immunohematology
Gagnon et al. Studying dynamic plasma membrane binding of TCR-CD3 chains during immunological synapse formation using donor-quenching FRET and FLIM-FRET

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant