JPH02115A - 薬剤の担体としての並びに免疫分析および細胞／分子分別のミクロ浮選装置としての乳脂小球の使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は薬剤の分外１のための新規な系に関し、更に詳
しくは薬剤の担体として乳脂小球を使用する方法に関す
る。

本発明はまた免疫分析および細胞／分子分別に使用する
ための新規なミクロ浮遊装置に関する。更に詳しくは本
発明の一面は、好１しくは乳脂小球（ＭＦＧ’）すなわ
ち全乳からえられる細胞誘導体である新規な脂質マトリ
ックスの使用に関する。全乳の乳漿膜は密に詰まった脂
ｌｊ′１を包囲しており、この脂質が水または緩衝液中
に浮遊する特徴ある「に力の原因である。

〔従来の技術〕

薬剤の選択的作用は疾患の治療または予防における薬剤
の成功裡の適用にとって重要な必須要件である。然しな
から、薬剤で処理すべき細孔と通常の細胞との間に存在
する多くの類イ以性（たとえば膜の構造と轡並、代謝特
性等の類似性）のために、特定の効率は規則よりむしろ
例外を伴なって起ることが多いうその結果として辞から
先天性桟構不全にわたる広範囲のｅＴ類の疾患の治療の
妨げとなる副作用が起る。薬剤の貧弱な選択性に付随す
る問題はある樵の薬剤が疾患区域に到達しえないことで
ある。たとえば、多くの寄生微生物疾患において、薬剤
は細胞内の微生物を殺すことができない。薬剤に対する
浸透障壁の形体の細胞膜によって寄生微生物の保護が付
与されるからである。あるいはまた、薬剤は主としてそ
の大きな寸法のために標的に到達することができない。

これは中枢神経系に悪影響を及ばずある種の酵素欠陥の
治療に潜在的に有効である酵素についていえる。すなわ
ちこのような酵素は治療上潜在的に有効であっても血液
−脳の障壁を横切ることはでさない。

標的区域への薬剤の輸送のための担体の使用は薬剤の選
択性と作用を改善する有望な方法として今や認識されて
いる。高分子細胞、ウィルスおよび合成粒子のような多
くの種類の担体が提案された。

然しなから、ほとんどの周知の担体は適応しうる薬剤の
範囲と量において限定され、また薬剤部分と正常な生物
学的環境との接触を妨げる性能または治療の必要な区域
への接近する性能においても限定されている。更に、押
体成分の毒性に関して、またはその入手性もしくけコス
トに関して、または担体−薬剤調剤単位に関して困難性
が存在する。

そのために、理想的な薬剤担体の開発に向けて多大の努
力が特にここ１０年間のあいだになされた。この工うな
担体は広範囲の種類の薬剤を生体内の正確な作用位置に
生体の正常な残部に面倒な効果を及はすことなしに搬送
しうるものであるべきである。

担体の有用性は、（１）細胞毒性の欠如、（２）生物学
的分解性、（３）免疫原の欠如（抗原を特異的に担持す
るように設計されていない場合）、（４）分子および巨
大分子が配合材料を変化させ及び／又は不活性にしない
条件下で担体中に配合される効率、（５）担体に付随す
る物質が細胞外の環墳への露出によって変化および／ま
たは破壊を受けることから保護する能力、および（６）
担体に付随する物質が細胞に移される能力、によって決
定される。

生体内および試験管の双方の研究のために薬剤の搬送用
の脂質水ｍ（＋７ボソーム）は現在広く使用されている
。それらは自然形成性二層構造の生物学的分解性脂質成
分から成り、その組成が広い範囲に変えられるからであ
る。この融通性はリポソームの物理的および化学的性質
を変えることを可能にし、これは生体内での保持と吸収
を変えるよう開発しうる。すなわち、リポソーム表面上
の固定電荷は長卸の荷電両性体たとえば脂肪酸または天
然産の陰電荷リン脂質を配合することによって変えられ
る。

生体内でのこのような担体捕捉薬剤の２つの重畳な有力
な用途は、（１）それらが長期間にわたって少量の薬剤
を制御された割合で放出する手段として、恐らく捕捉薬
剤の代謝破壊も減少させることも伴なって使用しうろこ
と、および（２）それらが特定の組織に薬剤を指向させ
る機能をもちうろことにもとづく。

多くの癌は化学治療剤に対して耐性があるので、担体が
上述の性質の一方または他方を利用することによって抗
癌剤の有効性を増大させる手段として考案されるならば
それは非常に重要なことである。これは担体捕捉薬剤に
対する明瞭な利点である。薬剤の楽理後構は薬剤を化学
的に変性することによって変える必要がなく、その生物
学的効果を変性することが薬剤担体の組成を変えること
によって可能になるからである。

まｔ、診断試験すなわち抗原ｉたけ抗体の検出に免疫分
析技術を使用することは近年非常に広範囲に行なわれる
ようになり、そして現在では平凡なことと考えられるほ
ど頻繁に研究と臨床の双方に用いられている。

ある特定の抗原に対する抗体の相対的特異性は、感染症
、妊妹、および体内の薬剤の存在、のような種々の生物
学的効果に対する高度に特異性のある且つ正確な診断試
験の根拠を提供した。実旅に際して、試験Ｆｉ、特定の
抗原（たとえばバクテリア）あるいは特定の碑生物（た
とえばエイズ・ウィルス）に対する抗体を含むと想定さ
れる試験試料を、検知可能に標識された対応する「免疫
学的パートナ−」すなわち補形の抗体または抗原に露出
させることによって行なわれる。抗原−抗体反厄の特異
性は沈殿反応、免疫拡散、抗原抜機赤血球細胞の凝集ま
たは分解、バクテリアまたはラテックス粒子、補形固定
、放射線免疫分析（ＲＩＡ）、および酵素免疫分析（Ｅ
ＩＡ）［酵素結合免疫吸収剤分析（ＥＬＩＳＡ）を含む
〕のような周知の免疫診断技術に利用されている。免疫
分析の２つの技術ＲＩＡおよびＥＩＡはそれらの一般的
にすぐれた感度、およびＥＩＡに包含される大きな安定
性のために特に普及されてきた。

これらの分析の多くは敏感であり且つ特異性があるが、
そのすべては次のうちの１つ以上によって限定される：
高価な笑験室装置（たとえばガンマ・カウンター、螢光
題微鏡、高速遠心分離、分光光度計等）、これらの機器
の操作に熟練した技術者、および若干の危険全示すか又
は冷蔵を必要とする試剤。また、これらの分析のうちの
若干は比奴的鈍感であり、定量的でなく且つ完了１でに
数時間あるいは数日さえ必要とする。

〔発明が解決しようとする課題〕

それ故、数分内に正確な陽および陰の終Ａ’に与えるこ
とができ、定性的ならびに定量的に使用することができ
、最小の実験器具のみを必要とし、そして分析の成分を
容易に貯蔵安定性になしうる、費用が嵩まず、簡単であ
り、然も敏感な診断免疫分析をダグしうるならば、それ
は非常に望ましいことである。本発明はこの課題を解決
しようとするものである。

〔問題を解決するための手段〕

我々は上記の有利な性ａをもつ薬剤用の新規な担体を発
見し、この新規な担体を使用して上記の課題を解決した
。

具体的に述べれば、好ましい担体は乳脂小球（ＭＦＧ）
である。乳脂小球は乳のクリーム留分から構成され、乳
を分泌する細胞の頂部乳漿膜から主として誘導される外
部膜によって安定化されている脂肪小滴から成る。すな
わち、乳脂小球は薬剤の配合を容易になしうる所望の特
性をもつ天然の、豊富にある、安価な担体である。

乳脂小球（ＭＦＧ）は脂溶性物質の搬送に特に有用であ
り、リホソームと同様に、すなわち非方向性で免疫％性
の搬送プロトコールにおいて使用することができる。本
発明の新却な担体の利点として、受容体からの薬剤のり
腰、薬剤からの受容体の保護、大きな荷重の搬送、ＭＦ
Ｇの脂質含量による脂溶性薬剤用の安定なビークルの提
供、１〜１０μｍからえらびうるＭＦＧの寸法、および
ＭＦ’Ｇの低コストがあけられる。

その上、乳脂小球（ＭＦＧ）の密に詰まった脂質中に試
験管内で又は生体内で脂溶性薬剤を容易に配合すること
ができる。この新規な薬剤／ＭＦＧ複合体社局所、経口
筐たは非経口のルートで薬剤を搬送するのに使用するこ
とができ、抗原と抗体はこの薬剤／ＭＦＧ複合体の表面
に結合させてそれらの結合お工びそれらの内容物の搬送
を行なうことができる。

本発明はまた、反応流体の表面への浮遊によって分析の
結合および遊離の生成物を容易に分離する浮遊性マトリ
ックスの使用を伴なう新規な診断免疫分析法をも提供す
る。

更に詳しくは、本発明に使用する好ましいマトリックス
は乳脂小球（ＭＦＧ）［乳のクリーム留分から構成され
、乳の分泌細胞の頂部乳漿膜から主として誘導される外
部膜によって安定化されている脂肪小滴から成る〕から
構成される。従って乳脂小球は抗原捷たに抗体の結合を
容易になしうる所望の特性をもつ天然の、豊富な且つ安
価なミクロ浮選装置を提供する。

本発明の新規な浮選免疫分析はそれ故に現在の分析より
すぐれたいくつかの利点を与える。本発明の浮選分析は
実験室装置を必要とせずに、あるいはせいぜい簡単な遠
心分離を必要とするたけで読みの簡単な終点を数分以内
で発生させる。第２に、分析用の原料は非常に安価であ
り、ゲルタールアルデヒドで安定化させることができ、
そして放射能のような生物学的に危険な要素をもたない
。第３に、本発明の浮選免疫分析の使用は均一な分析を
設計することを可能にする。すなわち、この分析は抗原
−抗体のペレットの遠心分離または洗浄のような分離技
術を必要としない。

また、本発明の浮選の概念は細胞または分子の不均一混
合物の分離手段を与える。この試みにおいて、要件は分
離させるべき細胞と反応する又は分離させるべき分子と
反応する、抗原または抗体にＭＦＧ（乳脂小球）を結合
させることである。

本発明の新規な浮選免疫分析は、薬剤、病原バクテリア
、菌類、ウィルス、細胞抗原（たとえば血液抗原、白血
球抗原、および腫瘍特異性抗原）を包含する広範囲の臨
床的に適切な分子に適用することができる。唯一の要件
は抗原または抗原特異性抗体が浮遊性マ）　ＩＪラック
スよび指示薬に結合しうろことである。

従って本発明は、蛋白および糖蛋白を含む脂質二層で囲
まれた浮遊性マトリックスから成り、該二層が結合また
は混合した抗原または抗体を含み且つ／又は該マトリッ
クスがマ）　ＩＪツクス内に配合し六脂溶性治療剤を含
む組成物、に関する。１つの態様において、上述の組成
物は該二層が結合または混合した抗原まｆｃは抗体を含
み且つ該マ）　ＩＪソックス治療剤を含まないとき免疫
分析および細胞／分子分別に使用される。あるいはまた
、上述の組成物はマトリックス中に脂溶性治療剤が存在
するとき治療用組成物として使用される。

ここに述べる乳脂小球は一体性の膜蛋白を含む脂質二層
によって囲まれたトリグリセライドのコアから成る（Ｍ
ａｔｈｅｒ＆　Ｋｅｅｎａｎ、Ｊ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ　
　Ｂｉｏｌ、２１　：　６５．１９７５）。それらは乳
のクリーム成分から構成され、乳を分泌する細胞の頂部
乳漿から主として誘導される外部膜によって安定化され
ている脂肪小滴から成る。乳脂小球の大きさｔｌｉｌ〜
ｌＯμｍの直径の範囲にあり、乳脂小球膜（ＭＦＧＭ）
と呼ばれる薄い膜によって囲まれている。この膜（横断
面で約１０ｎｍ）は蛋白、リン脂質、糖蛋白、トリグリ
セライド、コレステロール、酵素およびその他の少量成
分の複合混合物から成る（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ等、Ｊ。

Ｄａｉｒｙ　Ｒｅ５ｓ＋ａｒｃｈ　（１９８３）５０　
：１０７−１３３）。

この膜蛋白の研究はこれらのうちの数成分は糖蛋白であ
ること及び該蛋白は膜中で非対称的に配置されていてそ
れらのうちのある部分Ｆ′ｉＭＦＧの外表面に露出され
ていることを明らかにした（Ｋｏｂｙｌａ等、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｅｔａ　２８８：２８２．１９７２　：　Ｈｕａｎｇ
等、Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ａｅｔａ　３３２　：　５９．１９
７３；　　及びＡｎｄａｒｓｏｎ等、Ｂｉｏｅｈｅｍ、
　Ｊ、　１３９　：　６５３．１９７４）。

乳脂小球は血液中の前駆体物’Ｉｆ（すなわちグルコー
ス、アセテート、低密度胆ｙ蛋白）から乳腺分泌細胞中
で合成される９９％トリグリセライドから成る。仁の高
脂質含量がＭＦＧを脂溶性薬剤の配合の理懇的なビーク
ルとする。

脂溶性薬剤は試験管内で又は生体内で乳脂小球の密に詰
まった脂質中に配合することができる。この薬剤は乳脂
小球の懸濁液中で薬剤を２５℃で約１８時間攪拌するだ
けで試験管中でＭＦＧに配合することができる。時間お
よび温度は１費ではなく、１８〜３７℃で１２〜２４時
間の間で変化させることができる。反応試剤（薬品と乳
脂小球）を適当な温度で必要な時間接触させることによ
って乳脂小球の懸濁液中に薬剤を迅速に且つ安定に配合
するだけで十分である。

脂溶性薬剤はＭＦＧの脂質部の中に集中するようにみえ
る。薬剤配合ＭＦＧは室温で１時間以上安定である。

薬剤は蛋白質表面に結合した抗原を含むＭＦＧ中に配合
することもできる。

デキストランのような抗原は種々の化学技術（たとえば
Ｊｏｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　Ｖｏｌ、９２　：２５７−２７５．１９８３年
に記載の技術）によってＭＦＧの糖蛋白に結合させるこ
とができる。

好ましい方法は膜分子への共有結合なしに細胞光面に抗
原を付ける。脂質多糖類であるミリストール酸化デキス
トラン（ＭＯＤ）がこれにハプテンおよび蛋白を結合さ
せうるように設計された。抗原−ＭＯＤｔ′ｉプラズマ
膜との安定な疎水性相互作用を介して細胞の表面に直接
結合する。抗原−ＭＯＤは脂質多糖類の脂質部分のプラ
ズマ膜の疎水性部分への挿入を介して細胞９面に結合す
ると信ぜられる。

ＭＯＤへのハプテンおよび蛋白の共有結合お、ハプテン
または蛋白に存在する遊離アミン基とＭＯＤ上の反応性
アルデヒド基との間で起る。それ故、合成脂質多糖類を
細胞または抗原にハプテンまたは蛋白を結合させるため
の一般法として使用することができる。

本発明によりＭＦＧに配合するのに使用することのでき
る代表的な脂溶性薬剤として細胞毒性薬剤←たとえばア
ドリアマイシン、ダウンマイシン、メルフアランおよび
ポドフィロトキシン）、ビタミン類（たとえばビタミン
ＤおよびビタミンＥ）、ステロイド（たとえばコーチゾ
ール、エストラジオール、テストステロンおよびプロゲ
ステロン）、および脂溶性抗生物質誘導体があげられる
。

我々ねまた、新鮮な乳を直ちにＰＢＳ中で洗浄すること
によって、室温で貯蔵することによって、および１％ゲ
ルタールアルデヒドに対する透析による温和な固定化に
よって、ＭＦＧの安定性が改良されることも見出した。

我々はまた、等張より低いまたは等張よシ高い溶液への
露出がＭＦＧに目にみえる効果をもたないという点で、
ＭＦＧは露出させる溶液の浸透圧によって影響を受けな
いことも見出した。

本発明のこの面の浮選免疫分析において、抗原または抗
体は種々の化学技術（たとえばＪｏｕ等のＭ・ｔｈｏｄ
ｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　　９２
　：　２５７．１９８３年に記載の技術）によってＭＦ
Ｇの糖蛋白に共有結合させることができる。

赤血球への蛋白およびハプテンの結合にはへテロ三官能
性試剤たとえばＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネ−）ｆ使用して二硫化結合の形成
を介して蛋白を羊の赤血球細胞（ＳＲＢＣ）に結合させ
ることを含む。第２の方法はハプテン−蛋白結合体をサ
クシニル化してカルボジイミドによｌ５ＲＢｃの表面へ
の結合を容易にする第１点をとる。これら２″：）の方
法は別のへテロ三官能性試剤（メチル−ｐ−ヒドロキシ
ペンツイミデート）または多官能性試剤（１，３，５−
）リクロロトリアジン）を使用することによって５ＲＢ
Ｃの表面にハプテンを結合させるよう設計される。第３
の方法は合成脂質多糖類試剤を介して５ＲＢＣの表面に
蛋白およびアミノハプテンを非共有結合させることを含
む。

後者の方法は膜分子への共有結合なしに細胞表面に抗原
を結合させる。脂質多糖類であるミリストール酸化デキ
ストラン（ＭＯＤ）がこれにハプテンおよび蛋白を結合
させうるものとして設計された。抗原−ＭＯＤはプラズ
マ膜との安定な疎水性相互作用を介して細胞表面に直接
結合する。

抗原−ＭＯＤはプラズマ膜の疎水部分への脂質多糖類の
脂質部分の挿入を介して赤血球細胞表面に結合すると信
ぜられる。ＭＯＤへのハプテンおよび蛋白の共有結合は
ハプテンまたは蛋白の遊離アミノ基とＭＯＤ上の反応性
アルデヒド基との間で起る。赤血球細胞にハプテンまた
は蛋白を結合する之めの一般法として合成脂質多糖類を
使用することができる。

このようにして我々は、デキストランを塩化ミリストイ
ルに結合させた後に醸化デキストランに抗体をまず結合
させることによって間接的にＭＦＧを抗体に結合させる
ことができた。ミリスチン酸部分はＭＦＧ膜中に挿入さ
れ、そして結合抗体は抗原または抗１ｇ抗血清によるＭ
ＦＧの膠着によって表面上に検出されうる。

我々はまた、ＭＦＧｐ面にＮ−ヒドロキシ・サクシニル
化・ビオチンを結合させ、そしてこの結合を螢光標識ア
ビジン添加後に螢光顕徴鋳によυ検出することができた
。

同様に、過沃素酸ナトリウムを使用してデキストランを
まず酸化し、次いで細胞上のアミノ基壇たはＨＲＰによ
りシック塩基を生成させることによって、赤血球細胞に
ＭＦＧ、バクテリア（イー・コリイおよびビー・サブチ
リス）およびＨＲＰ（ホースラデイツシュ・パーオキシ
ダーゼ）を結合させた。この反応生成物を次いでナトリ
ウム・ボロハイドライドで安定化させた。

前述の如く、抗原または抗体は前記の３つの方法のうち
１つを使用することによってＭＦＧの糖蛋白に結合され
る。

補形の抗体または抗原は着色指示薬（たとえば赤色を与
える赤血球、着色バクテリア、またはある種の他の容易
に目にみえる指示薬）の表面に結合せしめられる。肉眼
でみえる指示薬が好ましい。ＭＦＧの補形リガンドと指
示薬との間の相互作用は複合体を生成させ、この複合体
は、例えばＭＦＧの浮遊性のために、試験管中の反応混
合物の頂部に上昇する。

このような相互作用が起ったとき、反応管の１部におけ
るＭＦＧと一緒の着色指示薬（たとえば赤血球細胞、着
色したバクテリア、酵素）は見ることができる。ＭＦＧ
と指示薬との間に反応が存在しない場合、ＭＦＧ層には
着色はみられず、むしろ細胞を指示薬として使用したと
きにはこれらＶｉ管の底部において残漬としてみられる
。この標準分析法を種々の方法で変形して定量分析を行
なうことができ、そして指示薬の浮遊の阻止により試験
試料中の抗原（Ａ、）または抗体（Ａｂ）の分析を行な
うことができる。

従って、Ａｇ被９ＭＦＧを緩衝剤中の抗体結合赤血球細
胞（Ａｂ−ＲＢＣ）の懸濁液と接触させ反応させると、
Ａｂ−ＲＢＣはＭＦＧに結合して反応器の頂部に上昇し
て表面において赤色環を生成する。試料が抗体を含むと
きは、該抗体はＭＦＧのＡｇに結合し、キれによって指
示薬が次に加えられるときＡｂ−ＲＢ　Ｃの結合を阻止
する。ＭＦＧは再び頂部に上昇するが、結合Ａｂ−ＲＢ
　Ｃの不在下では反応器の頂部における環の着色は白色
であり、セしてＡｂ−ＲＢ　ＣはＭＦＧに結合しない限
り管の底部に降下する。

以下に述べる浮選免疫分析の操作を要約して下記に示す
。

Ａ、抗体の存在の分析　　　　　予見される結果１）　
Ａｇ−ＭＦＧ＋試験試料 （Ａｂ） ２）　Ａｂ−ＲＢＣ（次に添加） あるいは １）　Ａｇ−ＭＦＧ＋試験試料 （抗体なし） ２＞　Ａｂ−ＲＢＣ（次に添加） Ｂ、抗体の存在の分析 １）Ａｂ−ＭＦＧ十試験試料 （Ａｇ） ２）　Ａｇ−ＲＢＣ（次に添加） 抗体の存在下、Ａｇ−ＭＦＧ と試験試料からのＡｂとの間 で生成した複合体は反応器の 頂部に上昇して白色環を形成 し、そして非結合指示薬は反 応益底部において赤色スポラ トを形成する。

試験試料中にＡｂが存在し ないと、Ａｇ−ＭＦＧとＡｂ− ＲＢＣとの間で生成した複合 体は反応器の頂部に上昇して 赤色環を形成する。

抗原の存在下、Ａｂ−ＭＦＧ と試験試料からのＡｇとの間 で生成した複合体は反応器の 頂部に上昇して白色［’に形成 し、そして非結合指示薬（Ａｇ −ＲＢＣ）は反応器底部におい て赤色スポットを形成する。

あるいは １）Ａｂ−ＭＦＧ＋試験試料 （Ａｇなし） ２）　Ａｇ−ＲＢＣ（次に添加） 試験試料中にＡｇが存在し ないと、Ａｂ−ＭＦＧとＡｇ− ＲＢＣとの間で生成した抱合 体は反応器の頂部に上昇して 赤色環を形成する。

Ｃ０抗体の分析 １）Ａｇ−ＭＦＧ＋Ａｇ−ＲＢＣ 十試験試料（Ａｂ） （同時に存在） 試験試料中にＡｂが存在す ると、ＭＦＧ−Ａｇ　：Ａｂ　：Ａｇ−ＲＢＣの間に生
成したブリッ ジ複合体は反応器の頂部に上 昇して赤色環を形成する。

あるいは １）Ａｇ−ＭＦＧ＋Ａｇ−ＲＢＣ 十試験試料（Ａｂなし） （同時に存在） 試験試料中にＡｂが存在し ないと、非結合Ａｇ−ＭＦＧが 反応器の頂部において白色環 を形成し、そして非結合Ａｇ− ＲＢＣは底部において赤色ス ポットを形成する。

Ｄ、抗原の分析 １）Ａｂ−ＭＦＧ＋Ａｂ−ＲＢＣ ＋試験試料（Ａｇ） （同時に存在） 試験試料中に抗原が存在す ると、ＭＦｃ−Ａｂ　：Ａｇ　：　Ａｂ−ＲＢＣの間で
生成したブリ ッジ神合体は反応器の頂部に 上昇して赤色環を形成する。

あるいは １）Ａｂ−ＭＦＧ＋Ａｂ−ＲＢＣ試験試料中にＡｇが存
在し＋試験試料（Ａｇなし）　ないと、非結合Ａｂ−Ｍ
ＦＧが反応器の頂部において白色環 （同時に存在）　　　　を形成し、そして非結合Ａｂ−
ＲＢＣＦｉ底部において赤色ス ポットを形成する。

後記の実施例において、純抗原およびモノクローナル抗
体の良く決定された系が示される。使用した抗原はバク
テリウム・リューコノストック・メセンテロイズから誘
導されたデキストランである。この抗原はα−１，３−
およびα−１，６−の糖結合から主として成る良ぐ特徴
づけられた分子である。その高分子量と物理化学的特性
とが組合わさってこの分子を高度に免疫性としており且
つＭＦＧの表面糖蛋白に又は指示薬に結合しやすくして
いる。この分子の精製は容易である。最後に、この抗原
は数種のバクテリアの細胞壁中に存在し且つアスペルギ
ラスに付随している。

抗体はデキストランのα−１，３−結合基に対して特異
性のあるモノクローナル抗体である。

上記の新規な浮選免疫分析の他に、我々はＭＦＧが細胞
と分子を分別するのに使用しうろことも見出した。これ
はデキストランを共有結合させた羊の赤血琢細胞（ＳＲ
ＢＣ）が表面に抗デキストランまたはデキストランをも
つＭＦＧに結合するという事実によって実証される。後
者の場合、抗デキストランはｄｅｘ−ＭＦＧおよびｄｅ
ｘ−Ｂ　ＲＢ　Ｃｆ結合するために加えられる。

例１ 乳脂小球 薬物を担持すべき乳脂小球は、原料牛乳を室温で１，５
００ｘｆで１０分遠心分離し、下層（下方浮遊）の水性
物質を除法して得る。ＭＦＧをｐＨ７，４の燐酸塩緩衝
食塩水（“ＰＢＳ”と略記）を添加して当初の容積にし
１，５００ｘＧで１０分間遠心分離し、下層の流体を除
く操作で、３回洗う。かたまった０、９−のＭＦＧを０
１１−のアドリアマイシンと保温し、ＰＢＳ中に１巧／
−の濃度で１晩室温に溶解させることによってアドリア
マイシンは極めて効率良く、ＭＦＧ上に迅速且つ安定に
保持される。得られたＭＦＧをストツブコック付の１０
−シリンジに移し、ＰＢＳで１０−にして１，５００ｘ
Ｇで１０分間遠心分離する。下層の流体をストップコッ
クを開いて除き、乳脂小球層１ＰＢｓにゆっくり懸濁し
てから遠心分離する操作で３回洗う。最終の乳脂小球層
に約４−のＰＢＳを加えて室温貯蔵用の２０（７ｖ）％
の最終濃度とする。ＭＦ’Ｇ中のアドリアマイシンの存
在量は螢光顕微鏡法を用いて５９０　ｎｍのその螢光発
光で検知される。別法として４７０ｎｍの励起波長と５
９０　ｎｍの発光波長を螢光分光法的測定によって第１
の下層７ラクシヨン中に残留するアドリアマイシンの量
を測定して後、差引きによって（ＭＦＧに）包含された
アドリアマイシンのｔｉｎ出することができる。薬物は
ＭＦＧの脂肪蓄積中に濃縮されていて、添加した薬物の
８０チ迄がＭＦＧ中に包含されていることが明らかとな
っている。

ＭＦＧ上に保持させた薬物は少なくとも７日間、薬物を
損失せずに室温で貯蔵できる。注射する前にガンマ−線
照射で滅菌できる。

例２ 乳脂小球の治療的使用 アドリアマイシンｉＭＦＧに保持させる前に、抗原又は
抗体をＭＦＧに共有結合的に結合させて、例１の方法全
実施する。この場合、抗原又は抗体は、好ましくは出願
人の前記同時係属出願に記載したようにして、先ずＭＦ
Ｇに結合させるっ この例では、下記の例３に述べるようにデキストランを
ＭＦＧに結合させて、次に前記の例１記載のようにＭＦ
Ｇ上にアドリアマイシンを保持させる。倒立顕微競と倒
立しな崩球計算器を用いてＭＦＧ’ｉグリッドに浮遊さ
せて計数して後、ＭＦＧＩＰＢＳで２Ｘ１０”　ＭＦＧ
／ｄ（Ｄ濃度に稀釈する。完全フロインドアジュバント
中の０．５μｍのデキストランを尾静脈を経てマウスに
静脈注射する。６日後、マウスを殺して肝臓全取出して
、抗デキストランプラーク形成組胞応答を検定する。未
処置動物に比してｄｅｘ−ＭＦＧに混ぜたアドリアマイ
シンで処理した動物には抗デキストラン応答の９５％の
低下が起こることが判明する。従って、ＭＦＧにのせた
アドリアマイシンのデキストランと結合した細胞への特
異的集中が起こることが明らかである。

例３ 抗体の存在検定（分析） 乳脂小球と結合させるデキストランを、ｐＩＩ７．４の
燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１０η／−のデキスト
ラン溶液を１０ｍＭの最終濃度の過沃素酸ナトリウムで
１時間室温で処理して、先ず酸化する。酸化したデキス
トランを４０℃で１００容のＰＢＳに対して大規模透析
する。乳脂小球は原料牛乳を、室温で１０分間１５００
ｘＧで遠心分離し、下層の水性物質を除去して得る。乳
脂小球はＰＢＳを加えて当初容積にして１５００ｘＧで
１０分間遠心分離し、下層の流体を除去する方法で３回
洗浄した。０．９−のかたまったＭＦＧに０．１−の醇
化デキストランを加え室温で１晩放置する。酸化デキス
トランＩｄＭＦＧ表面上のアミン基と結合してシッフ塩
基を形成する。生成したデキストランと結合した乳脂小
球をストツブコック付の１０−シリンジに移し、ＰＢＳ
で１０−にして１５００ｘＧで１０分間遠心分離する。

ストップコックを開いて下層流体を除き、乳脂小球層を
１０−のＰＢＳにそっと懸濁してから遠心分離すること
で３回洗う。最終の乳脂小球層は室温貯蔵用に約４−の
ＰＢＳを加えて２０　（”ｆ／ｖ　）％の最終濃度とす
る。

酸化デキストランとＭＦＧの間でこのように形成された
シッフ塩基はｄｅｘ−ＭＦＧの洗浄前に１０ｍＭの水素
化硼素ナトリウムを加えて安定化できる。還元し７’（
ｄｅｘ−ＭＦＧはグルタルアルデヒドの１％ＰＢＳ溶液
の１００容に対して１晩透膜してさらに安定化できる。

ｄｅｘ−ＭＦＧの部分滅菌はデキストランの浮選特性又
は抗原性を失なわずに１０．０００ラドのガンマ−線照
射を用いた処理で得られる。

結合（カップリング）の効率はｄｅｘ−ＭＦＧを抗デキ
ストラン抗体と培養し１．ｄｅｘ−ＭＦＧの凝集を顕微
鏡的に観察することで検定できる。指示薬赤血球と結合
すべき抗体は、ヘテロ２官能性試薬、Ｎ−サクシンイミ
ジイル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（
ＳＰＤＰ）で処理される。抗体の修飾は１：２５乃至１
　：　１００のモル比で５ＰＤＰと室温で攪拌しつつ培
養することで達成される。

これは抗体分子当り５−２０のピリジルジチオプロピオ
ネ−）　（ＰＤＴＰ）分子を生ずる。生成した修飾抗体
の大規模透析は４℃で１，０００容のＰＢＳに対して行
なう。

抗体を結合すべき赤血球（ＲＢＣ）は羊の静脈刺傷で得
て、脱繊維素し、３回洗ってＰＢＳ中に５０（ｖ／ｖ）
％懸濁体として保存する。ＰＤＴＰ修飾抗体での処理に
先立ち、ＲＢＣの２％ＰＢＳ懸濁液のＩＺ５−を、つく
ったばかりの１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）の０．
５−と室温で１時間置いて血球表面上のジスルフィド基
金チオール基に還元する。遊離ＤＴＴを、次に還元ＲＢ
Ｃを１５−のＰＢＳを加え１．５００ＸＧで１０分間遠
心分離して上澄みを除くことを４回行なう洗浄で、除い
た。得られた０、２５−のかた１つた還元ＲＢＣに０．
５艷のＰＤＴＤ修飾抗デキストラン抗体を加え、混合物
を回転振盪器で１晩、室温で培養した。得られた抗−ｄ
ａｘ−ＲＢＣを、１５−のＰＢＳを加え１．５００ｘＧ
で１０分間遠心分離し、上澄み流体を除く操作で４回洗
う。４℃の保存用に最終のＲＢＣペレットは約２．２５
−のＰＢＳを加えて１０（ｖ／ｖ）％の最終＃度とする
。

抗ｄｅｘ−ＲＢ　Ｃは１チグルタルアルデヒドと滅菌と
で上と同じく安定化できる。

結合（カップリング）の効率は抗ｄｅｘ−ＲＢ　Ｃを、
ＭＯＰＣ１０４Ｅ蛋白質に対して調製した抗体と培養し
、抗−ｄｅｘ−ＲＢＣの凝集を顕微鏡的に観察して検定
できる。

６　Ｘ　６０　ｍＭ管中での、かくして調製した抗−ｄ
ｅ：ｔ−ＲＢＣの２い／、）％懸濁液の２５０　ｐｔの
、４（Ｖ／ｖ）％のｄｅｘ−ＭＦＧ懸濯液の２５０　ｐ
ｔへの添加で全容が５００μｔとなり、ゆっくりと混合
し室温で３０−６０分おくと管の頂部に強い陽性の“赤
環″を生ずる。（表面にデキストランの無い）対照ＲＢ
Ｃを加えると、反応管の底部に赤色（即ちＲＢＣに付随
するヘモプロビンンが生じる。

抗デキストラン抗体を含有する試験試料の添加は、ｄｅ
ｘ−ＭＦＧへの抗体の結合を生じ、指示薬−ＲＢＣの乳
脂小球への結合を阻害する、即ち抗デキストラン抗体が
存在すると反応管の頂部のＭＦＧ環は白色で指示薬細胞
はすべて反応管の底に落ちる。これが免疫検定の特異性
を示しておシ、これは試験試料中の（抗デキストラン）
抗体検知についての免疫検定の有用性を示している。

例４ 抗原の存在検定（分析） 例３の方法に従って抗体をＭＦＧの表面に共有結合的に
結合する。相補性抗原、デキストラン、を例３の方法で
指示薬ＲＨＯに結合する。例３と同様な反応を行なうと
、抗原が試験試料中にあれば、これが抗体ＭＦＧと結合
して、指示薬ｄｅｘ−ＲＢＣの結合を阻害する。従って
ｄｅｘ−ＲＢＣは反応器（試験管）の底に落下して赤斑
を生じ、Ａｂ−ＭＦＧは頂部に上昇して白環を形成する
。第１図の写真Ｃ参照。

試験試料中に抗原が存在しないと、指示薬ｄｅｘ−ＲＢ
ＣはＭＦＧと結合して反応器の頂部に上昇して陽性の赤
環を形成する。第１図の写真Ｂ参照。（赤血球表面にデ
キストランの無い）対照ＲＢＣを用いると、指示薬はＡ
ｂ　−Ｍ　Ｆ　Ｇと結合できず管の底部に赤色ペレット
ヲ形成し、そしてＡｂ−ＭＦＧの白埠が頂部に形成され
る。第１図の写真Ａ参照。

例５ 例３の方法に従って乳脂小球（ＭＦＧ）をデキストラン
と結合させたｄｅｘ−ＭＦＧと、例３の方法で赤血球（
ＲＢＣ）をデキストランと結合させたｄｅｘ−ＲＢＣを
、単りローン性抗デキストラン抗体の存在下で、反応器
中でｌ：１の比で混合する。顕微袋観察で混合しｆｃｄ
ｅｘ−ＲＢＣとｄｅｘ−ＭＦＧの塊がみられる。この実
験を６×６０−管中、等容の２チデキストラン−ＭＦＧ
と１チデキストランーＲＢＣを含む５００μｔの全容積
で行なうと、指示薬赤血球はＭＦＧと結合し、管の頂部
に上昇して赤環を形成する。添加抗体が無いか又は検定
に使用したＭＦＧかＲＢＣのいずれかが結合しているデ
キストランが無い時は、ＭＦＧ層にＲＢＣが存在しない
。従ってＭＦＧと結合する指示薬細胞は臨床用遠心分離
機（５００ＸＧ）のゆつくシした回転をさせるとすぐ管
の頂部に上昇し、大きく容易に見えるようになる。遠心
分離せずに反応管を放置しても同一の結果を生ずる。

例６ 抗原の存在検定（分析） 例３の方法に従って抗体ｉＭＦＧと指示薬５ＲＢＣの両
方に共有結合的に結合させた。試験試料中に抗原が存在
すると、これがＡｂ　−Ｍ　Ｆ　ＧとＡｂ−８ＲＢ　Ｃ
の間にブリッジを形成し、従って指示薬赤血球は試験管
の頂部に上昇して赤塚を形成する。

試験試料中に抗原が無いと、赤血球はＭＦＧと結合せず
、検定管の頂部の塚は白い、即ちＭＦＧｆｃけが存在す
る。

本発明を脂質原としての乳脂小球および指示薬としての
赤血球細胞に特に関連して上記のように述べたけれども
、記述した免疫分析において他の材料ヲ使用することも
本発明の範囲内にある。たとえば赤血球細胞の代りに着
色したバクテリア（たとえばイー・コリイおよびビー・
サブチリス）、ホースラデイツシュ・パーオキシダーゼ
等を使用することができる。

浮遊性マトリックスとしてＭＦＧの代りにリン脂質配合
物を使用して水より密度の小さい脂質ビークルを作るこ
とができる。また、合成ポリマーを使用して抗体せたは
抗原の結合のための化学的に反応性のある基を表面にも
つ小球またはビーズを作ることもできる。

更に、多くの異なった抗原ならびにこれらの抗原に対す
るポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を使
用することも本発明の範囲内にある。使用しうる抗原の
なかには次のものがある。１）　蛋白、炭水化物および
核酸を包含する巨大分子抗原；２）　　ハプテンたとえ
ばＮ−ε−ジニトロフェニル−リジン、３−アミノピリ
ジン、４−アミノピリジン、４−アミノフタレートおよ
び５−アミノイソフタレート；３）バクテリア（たとえ
ばシュードモナス、ミイコバクテリウム）、菌類（ｆ？
：、とえはカンディア）、ウィルス（たとえばエイズ・
ウィルス、レトロウィルス）およびプロトシア（たとえ
ばシストソーマ）を包含する病原性および非病性の微生
物に付随する抗原；４）細胞表面抗原たとえば血液群抗
原、特異性Ｔ細胞抗原（たとえば’ｒｈｙ−１、Ｉｙｔ
　２、Ｌ３　Ｔ４、Ｔ４、Ｔ８など）；５）腫瘍特異性
抗原、たとえば１６０，０００分子量糖蛋白（ｇｐ　１
６０）、ヒト肺腫瘍細胞に付随する細胞表面分子。これ
らの分子の多くのものは前記の及びＪｏｕらのＭｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ　　９２：２５
７−２７５（１９８３）に記載の技術を使用してＲＢＣ
および／−！Ｅ７’ＣはＭＦＧに容易に結合させること
ができる。たとえば前記のようなデキストランの結合の
他に、上記のハプテンもミリストイル酸化デキストラン
を結合剤として使用して膜に成功裡に結合させることが
できた。モノクローナル抗デキストラン抗体の他に成功
裡に結合させることのできた蛋白として、ペンスージョ
ーンズ蛋白、ヒトγ−グロブリン、ウシγ−グロブリン
、ラビット抗ヒトＦａｂ抗体、マウス抗フタレート抗体
、およびモノクローナル抗フタレート抗体があけられる
。

上記の実施例は説明を簡明にするために抗原−！たは抗
体の存在もしくは不在での定性分析について記載したけ
れども、本発明は定量的な方法に使用することもできる
。定量分析において、既知量のｖｃｓまたは抗体を含む
標準試料を血清で２倍に希釈して、適轟に結合させたＭ
ＦＧおよび指示薬ＲＢＣで培養することができる。この
ようにして、終点（すなわちＭＦＧへの指示薬ＲＢＣの
結合を阻止して管の頂部における赤色の出現を防ぐこと
のできる最小量の抗原または抗体）を決定することがで
きる。未知量の抗原または抗体を含む試料を同様に終点
まで希釈すれば、試験試料中の抗原または抗体の量を計
算することができる。この操作を実証する１つの例を第
２図に示す。そこでは既知量の遊離デキストランを加え
てｄｅｘ−ＭＦＧへの抗デキストランＲＢＣの結合を阻
止する。この阻止け５００　ｎｆのデキストランについ
て起るが５０ｎｆでは起らない（第２図のｄとｅ参照）
。この操作で誘導されるデータを使用して標準曲線を作
成することによって、試験試料中の抗原（凍たは抗体）
の量を定量することができる。

本発明はまた、細胞または分子の浮選による分離装置と
して抗原（′！たは抗体）結合ＭＦＧｉ使用することも
包含するっこの場合、細胞表面上の又は溶液中遊離の補
形分子と特異的に相互作用する抗原または抗体をＭＦ’
Ｇに結合させる。これらのＭＦＧとこのような細胞の懸
濁ａｔたはこのような分子の溶液との反応は結合細胞ま
たは結合分子の管頂部への浮遊をもたらす。このように
して分離した分子または細胞はＭＦＧ層から回収するこ
とができ、非結合細胞は細胞ペレットから回収すること
ができ、そして非結合分子は上記溶液から回収すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白および糖蛋白を含む脂質二層で囲まれた浮遊性
   マトリックスから成り、該二層が結合または混合した抗
   原または抗体を含み且つ／又は該マトリックスがマトリ
   ックス内に配合した脂溶性治療剤を含む組成物。 ２、該二層が結合または混合した抗原または抗体を含み
   且つ該マトリックスが治療剤を含まないとき該組成物が
   免疫分析および細胞／分子分別に使用される請求項１記
   載の組成物。 ３、該マトリックス中に脂溶性治療剤が存在するとき該
   組成物が治療用組成物として使用される請求項１または
   ２記載の組成物。 ４、治療剤が細胞毒性治療剤である請求項３記載の組成
   物。 ５、浮遊性マトリックスが乳脂小球である請求項１〜４
   のいづれか１項に記載の組成物。６、抗原がデキストラ
   ンであり、抗体が抗デキストラン・モノクローナル抗体
   である請求項１〜５のいづれか１項に記載の組成物。 ７、抗体または抗原を検出するための免疫分析法であつ
   て；抗体または抗原を含むと想定される試料をこの想定
   される抗体または抗原に対して補形の抗原または抗体を
   結合させた固体の浮遊性マトリックスと接触させ；上記
   の補形の抗原と抗体が存在する場合に抗原−抗体結合体
   を生成させる時間放置し；次いで該マトリックスに結合
   した抗原または抗体に対して補形の抗原または抗体を結
   合させた容易に目にみえる指示薬を加えて、補形の抗原
   と抗体が存在する場合に抗原−抗体結合体を生成させる
   時間放置し；そして反応管中の着色指示薬の位置を観察
   することによつて試験試料中の抗体または抗原の存在を
   決定することから成ることを特徴とする免疫分析法。 ８、マトリックスおよび指示薬がそれらに結合した抗原
   をもち且つ補形の抗体を含むと想定される試料に同時に
   接触せしめられ、そして試験試料が該想定抗体を含む場
   合に免疫結合体ブリッジを形成させる時間放置される請
   求項７記載の免疫分析法。 ９、マトリックスおよび指示薬がそれらに結合した抗体
   をもち且つ補形の抗原を含むと想定される試料に同時に
   接触せしめられ、そして試験試料が該想定抗原を含む場
   合に免疫結合体ブリッジを形成させる時間放置される請
   求項７記載の免疫分析法。 １０、マトリックスが乳脂小球から成る請求項７〜９の
   いづれか１項に記載の免疫分析法。 １１、指示薬が赤血球細胞、着色したバクテリアもしく
   は酵素である請求項７〜１０のいづれか１項に記載の免
   疫分析法。 １２、試験試料中の抗体または抗原を検出するための診
   断用具であつて、 （ａ）試験試料中に含まれると想定される抗体または抗
   原に対して補形の抗原または抗体を結合させた固体の浮
   遊性マトリックスを含む第１容器；および （ｂ）該マトリックスに結合した抗原または抗体に対し
   て補形の抗体または抗原を結合させた容易に目にみえる
   指示薬を含む第２容器； を収納するように区画されている診断用具。 １３、固体の浮遊性マトリックスが乳脂小球から成り且
   つ／又は指示薬が赤血球細胞、着色したバクテリアもし
   くは酵素である請求項１２記載の診断用具。 １４、試験試料中の抗体または抗原を検出するための診
   断用具であつて；固体の浮遊性マトリックスと容易に目
   にみえる指示薬とを含む容器を備え、該マトリックスと
   指示薬の双方に、想定される抗体に対して補形の抗原が
   想定される抗原に対して補形の抗体のいづれかを結合さ
   せて成る診断用具。 １５、固体の浮遊性マトリックスが乳脂小球から成り且
   つ／又は指示薬が赤血球細胞、着色したバクテリアもし
   くは酵素である請求項１４記載の診断用具。 １６、試験試料中の抗原または抗体の量を定量的に測定
   するために、診断用具が抗原または抗体の既知標準濃度
   の血清による２倍希釈液を含む容器を更に備えていて終
   点に到達するようになつており、それによつてほとんど
   の試料の添加が管の頂部において白色環を生成させ、ほ
   とんどの希釈試料の添加が管の頂部において赤色環を生
   成させるようになつている請求項１２記載の診断用具。 １７、細胞または分子を分離させるための用具であつて
   、分離させるべき細胞の表面分子に対して又は分離させ
   るべき分子に対して補形の抗原または抗体を結合させた
   固体の浮遊性マトリックスを含む容器を備えて成る分離
   用具。 １８、固体の浮遊性マトリックスが乳脂小球から成る請
   求項１７記載の分離用具。 １９、細胞または分子を分離させるための用具であつて
   、 （ａ）分離させるべき細胞の表面分子と同じ又は分離さ
   せるべき分子と同じ抗原または抗体を結合させた固体の
   浮遊性マトリックスを含む第１容器； （ｂ）固体の浮遊性マトリックス上の抗体または抗原に
   対して補形であり、分離させるべき該表面分子または分
   離させるべき該分子によつて表わされる抗原または抗体
   ；を収納するように区画されている分離用具。 ２０、固体の浮遊性マトリックスが乳脂小球から成る請
   求項１９記載の分離用具。 ２１、哺乳動物に治療剤を投与する方法であつて、治療
   剤を乳脂小球に配合し、次いでこの乳脂小球治療剤単位
   調剤を哺乳動物に局所、経口、または非経口投与するこ
   とを特徴とする方法。 ２２、生体内で乳脂小球中に治療剤を配合する方法であ
   つて、乳脂小球を治療剤で培養することを特徴とする方
   法。 ２３、生体内で乳脂小球中に治療剤を配合する方法であ
   つて、乳を分泌している哺乳動物に治療剤を注射し、そ
   して該哺乳動物から乳を集めて治療剤を配合した乳脂小
   球を得ることを特徴とする方法。