JPH0266459A - 酵素標識抗体および酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、酵素免疫測定法において使用する酵素標識抗
体および該酵素標識抗体を使用する酵素免疫測定法に関
し、さらに詳しくは固相サンドイツチ法と呼ばれる酵素
免疫測定法に使用する酵素標識抗体に関する。

「従来の技術」 本発明の酵素免疫測定法とは、抗原抗体反応３゜ １゜ の特異性に基づいて、抗原性を有する物質の測定を行う
方法である。更に、本発明が特に好適に使用される固相
サンドイツチ法と呼ばれる酵素免疫測定法とは次のもの
である。すなわち、測定対象物である抗原性を有する物
質を、その物質の抗体が固相に固定されたもの（以下、
固相化抗体）と反応させることにより固定させ、これに
＃ｌ素で標識した抗体（以下、酵素標識抗体）を結合さ
せ、次にその結合物の酵素活性を足 測定することにより、抗原性物質の鰯量をするものであ
る。

従来、この方法において使用する酵素標識抗体としては
、酵素１分子と抗体１分子を架橋反応により結合させた
もの（「酵素免疫測定法」石１１１栄治、河合忠、宮井
潔編集、医学書院（１９８２）、８５〜８８ページ）、
あるいは、酵素と抗体の架橋反応を制御せずに、重合体
として調製させたものが使用されていた。

従来の技術にあっては、例えば酵素１分子と抗体１分子
を架橋反応により結合させたものについては、感度を出
すために酵素標識抗体を大量に使用しなければならない
という欠点があった。また、酵素と抗体の架橋反応を制
御しないで重合体として調製したものについては、固相
化抗体に対する非特異的吸着が多く、ネガティブコント
ロール（抗原濃度０の検体）のノイズが大きくなり、低
濃度の検体を測定するときに感度が悪くなり、低濃度の
検体が測定できないという欠、αがあった。

「発明が解決しようとする１１題」 本発明は、上記問題点を解決するものであり、従来より
も少ない酵素標識抗体量で低濃度の検体を測定できる、
反応性の高い、非特異的ｒｙＬ、ｔの少ない酵素標識抗
体、および該酵素標識抗体を使用する酵素免疫測定法を
髭供することを目的としている。

「課題を解決するだめの手段および作用」本発明は、１
）酵素免疫測定法において使用する酵素標識抗体であり
、酵素抗体複合体１分子が２〜５個の抗体と、２〜５個
の酵素とが架橋されたものからなることを特徴とする酵
素標識抗体、および２）前記の酵素標識抗体を使用する
ことを特徴とする酵素免疫測定法でちり、そのことによ
り上記の目的が達成される。

本発明による、酵素標識抗体の酵素抗体複合体１分子中
に含まれる抗体の分子数と酵素の分子数の制御は、一般
的な合成高分子の重合反応と同様である。すなわち、抗
体分子および酵素分子を架橋する際に、それぞれの分子
に含まれる官能基の数およびそれぞれの分子を反応させ
るときの比率を調整することにより行われる。

こ引りそれぞれの分子に含まれる官能基の種類および数
は、適当な官能基がその分子に存在する場合は、それを
使用し、適当な官能基がその分子に存在しない場合は、
架橋剤を使用して官能基を必要数等大して使用する。

酵素標識抗体は、下記ｆ１ｊ〜（３）に示す手順によっ
て調製される。

ｆｌｌ　　抗体への官能基の導入 測定対象物である抗原に対する抗体に、下記（３）で示
す架橋剤を使用して、マレイミド基、アルダヒト基、チ
オール基又はビリジルージスルフィド基などの官能基を
導入する。なお、調製きれた酵素抗体複合体１分子中の
抗体分子数と酵素分子数を決めるために、抗体量を求め
るときには、酵素標識抗体調製に使用する抗体の一部と
して　１２５■で標識したものをその条件をくり返して
使用するときには、１２３Ｉ標識抗体を必ずしも使用す
る必要はない。

抗体としては、ポリクローナル抗体を含む抗血ＩＩ＃や
、細胞融合法によって調製されたモノクローナル抗体を
含む、例えば、マクス腹水液などが使用される。これら
は、免疫グロブリン分画にまで精製されたものが好適で
ある。抗体の種類としては、ＩｇＧ、夏ｇＭ、　ＩｇＡ
。

ＩｇＥ若しくＨＩｇＤなどのクラスの抗体又は、ＩｇＧ
を１７素で分解して得られるＦ（ａｂ’、）２　　若し
くはＦ（ａｂ’）２を還元して得られるＦａｂ’　　な
どが使用可能であるが、抗体分子中に架橋剤を２分子導
入することが容易なことから、ＩｇＧが好ましい。

（２）酵素への官能基の導入 酵素に、下記（３）で示す架橋剤を使用して、チオール
基、マレイミド基、アルダヒト基又はピリジル・ジスル
フィド基などの官能基を必要に応じて導入する。

酵素としては、架橋反応を行なわせる官能基を１分子中
に２個以上存するもの、又はそのような官能基を２個以
上導入することができるものであれば、任意に選択可能
である。

例えばβ−Ｄ−ガラクトシグーゼ（この場合は、チオー
ル基は既に存在しているので導入する必要がない。）、
グルコースオキシダーゼ、西洋わさび／曵−オキンダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼなどが好適である。

（３）　　架橋剤および架橋反応 架橋剤については、使用する抗体および酵素の種類によ
って適宜選択して使用することが可能である。例えば、
マレイミド基を導入する架橋剤としては、Ｎ−サクシニ
ミジルマレイミド酢酸、Ｎ−サクシニミジル４−マレイ
ミド酪酸、Ｎ−サクシニミジル６−マレイミトヘキ丈ン
酸、Ｎ−サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）
−シクロヘキサン−１−カルボン９、Ｎ−スルホサクシ
ニミジル４−マレイミドメチル−シクロヘキサン−１−
カルボン酸、Ｎ−サクシニミジル３−マレイミド安息香
酸、Ｎ−スルホサクシニミジル３−マレイミド安息香酸
、４−サクシニミジル４−　（Ｎ−マレイミドフェニル
）−４−カルボン酸など、アルデヒド基を導入する架橋
剤としては過ヨク素峻、チオール基を導入する架橋剤と
しては、Ｓ−アセチルメルカプト−サクシニックアンハ
イドライド、メチル−３−メルカプトプロピオニミゾイ
ト、メチル−４−メルカプト−ブチリミゾイト、２−イ
ミンチオラン、３−（２’−ピリジルジチオ）プロピニ
ック酸のＮ−ハイドロキシサクシニミドエステル、メチ
ル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオニミゾイト
など、ピリジル・ジスルフィド基を導入する架橋剤とし
ては、Ｎ−サクシニミジル３−　（２’−ピリジルジチ
オ）プロピオネイトなどが使用される。

架橋反応は、上記ｆｉ＋および（２）に基づいて官能基
を導入された抗体および酵素を混合させて反応させる。

この反応に二って官能基が反応し、酵素標識抗体が調製
される。

次に、架橋剤として、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸
を用いて、抗体（ＩｇＧ）とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を、β−Ｄ−ガラクトシグーゼ中のチオール基（１分子
中に１２〜２０個存在する。）を介して架橋する場合を
例として、酵素標識抗体の調ｇ！を詳しく述べる。

まず、抗体のアミ７基を介して抗体１分子中に１個の架
橋剤を導入し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体のモル
比を１：ｌになるように反応させた場合、生成する酵素
抗体複合体は、はとんど酵素と抗体が１分子ずつ結合し
たものンこなる。一方、抗体１分子中に２個の架橋剤を
導入し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体のモル比を１
：１で反応させた場合は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ中
に架橋剤と反応する官能基（チオール基）が２個以上存
在するために、合成高分子の場合のように重合反応が進
み、酵素抗体複合体１分子中に多数の抗体と酵素を含む
ポリマー化した酵素抗体複合体が生成する。そこで、本
発明では、抗体に導入する架橋剤の平均個数を１〜２０
間になるように制御し、（それぞれの抗体分子に導入さ
れる架橋剤の個数は、１２．３・・・などのように整数
となる。平均個数とけ、厚内の全抗体分子に導入された
架橋剤の個数の総和を、厚内の全抗体分子の総和で割っ
たものを意味する。）かつ、抗体とβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの間に架橋反応を行なわせる際に、抗体とβ−Ｄ
−ガラクトシグーゼリモル比を制御することにより、重
合度（酵素抗体複合体１分子に含まれる、抗体と酵素の
分子数）を制御する。この方法によって、酵素抗体複合
体１分子が２〜５個の抗体と、２〜５個の酵素とが架橋
されたものからなる酵素標識抗体が得られる。

酵素抗体複合体１分子中の抗体分子数と酵素分子数の決
定は、以下のようにして行う。

ｆｉ＋　　まず、酵素抗体複合体の調製に用いる抗体を
、クロラミンＴ法により１２５１でアイソトープ標識す
る。

（２）　　アイソトープ標識した抗体の放射活性を、ガ
ンマ・カクンターにより測定し、抗体１ｆｎｇあたりの
放射活性を求める。

（３）　　１２６　Ｉで標識していない同じ抗体を用い
て、アイソトープ標識した抗体を希釈し、抗体１■あた
りの放射活性が１１０００００ｃｐになるようにする。

（４）　　この抗体を使用して、酵素抗体複合体を調製
する。

６）得られた酵素抗体複合体の分子量を、分子量マーカ
ーを使用して、ゲル濾過の溶出位置、または５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（ＳＤＳ電気泳動）などにより求める。

（６）　　酵素抗体複合体の酵素活性から、酵素抗体複
合体中の酵素量を求める。

（７）　　酵素抗体複合体をガンマ・カクンターにより
測定し、上記（３）の値から複合体中の抗体量を求める
。このとき、（３）で調製した抗体を同時に測定し、１
２５１の崩壊による放射活性の減衰を補正する。

（８）　　上記＋６１　、　＋６１および（７）で求め
た値並びに使用した抗体および酵素の分子量から、酵素
抗体複合体１分子中の抗体分子数と酵素分子数を決定す
る。

本発明の酵素標識抗体を使用する酵素免疫測定法として
は、従来の技術の項で述べた固相丈ンドイッチ酵素免疫
測定法が特に適している。

固相サンドイッチ決の測定方法は、従来の方法と変わり
なく、検体中の抗原と同相化抗体を、まず反応させた後
、未反応の検体を洗浄し、次に酵素標識抗体を反応させ
る２ステツプ法、又は、検体中の抗原、固相化抗体およ
び酵素標識抗体を同時に反応させる１ステツプ法のいず
れの方法も適用可能である。従来技術との逮いは、酵素
Ｗ識抗体だけを、従来タイプのものの代わりに、本発明
の酵素標識抗体を使用することだけでろる。

測定対象物としては、従来の固相サンドイッチ＃素免疫
測定法で測定される抗原は、いずれも測定可能である。

例えば、インスリン、ヒトじゅう毛膜ゴナドトロピン（
ＨＣＧ）、アルファーフェトプロティン（ＡＦ　Ｐ　）
、フェリチン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＢｓ抗原な
どが挙げられる。

本発明の酵素標識抗体が、抗体１分子と酵素１分子から
なる酵素標識抗体よりも感度が出る理由は、恐らく以下
の理由によると思われる。

例えば、 ｆｉｌ　　抗体１分子と酵素１分子からなる酵素標識抗
体Ａ （２）抗体Ｎ分子と酵素Ｎ分子からなる酵素標識抗体Ｂ ０２種類を同一酵素量で使用した場合を比較する。

まず抗原抗体反応、すなわち測定対象物である抗原との
反応性を比較すると、酵素標識抗体の分子の！ｉ（濃度
）はＢ＃ｉＡの１／ＮになるためＢの反応性ＨＡの１／
Ｎになる。一方、酵素Ｓ識抗体１分子で比較した場合、
Ｂの１分子中にＦｉＡ１７）Ｎ倍の抗体分子を含むため
、Ｂの反応性はＡのＮ倍となる。したがって、抗原抗体
反応についてＦｉＡもＢもほとんど同じであり、ＡもＢ
も（複合体として）同分子数だけ抗原と反応すると考え
られる。

次に、酵素標識抗体が抗原抗体反応を起こした後の抗原
抗体複合体物中の酵素量（酵素活性）を比較すると、Ｂ
はＡのＮ倍の酵素分子を含むため、抗原抗体複合体物中
の酵素量は酵素標識抗体Ｂが反応した場合は、Ａが反応
した場合に比べてＮ倍になり、結果としてＮ倍の酵素活
性（シグナル）が得られる。

すなわち、酵素標識抗体Ａ、Ｂを同一酵素量で使用した
場合、抗原抗体反応に関しては、ＡｌＢともほぼ同一の
反応性を示すが、抗原抗体反応後の酵素活性に関しては
、ＢはＡのＮ倍になるため、全体として、Ｂの方がＡよ
りもＮ倍の感度が出ることになる。

また、本発明の酵素標識抗体が、抗体６分子以上と酵素
６分子以上とからなる酵素標識抗体よりもネガティブコ
ントロールの値が低く出る理由は、本発明の酵素標識抗
体の方が何らかの理由（立体構造など）により、固相へ
の非特異的吸着が小さくなるためであると思われる。さ
らに、一般的に酵素標識抗体の分子量が大きくなりすぎ
ると、抗原抗体反応性も低くなることが多い。従って高
分子数の抗体と酵素とからなる酵素標識抗体の場合は、
ネガティブコントロールの値が高くなることとも、相俟
って低濃度域の測定が不可能になるのであろう。

「実施例」 以下、具体的な実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する。

試験例１　抗体の精製 モノクローナル抗体含有マウス腹水、又は抗原を免疫さ
れた動物から得られた抗血清の５−を、０．１　Ｍ　）
リス−塩酸緩衝液（１）Ｎ７．４）で透析したものを、
ＤＥＡＥ−セファセル（ファルマシア社製）カラム（ベ
ツド容積３０　ｄ　）　Ｅかけ、流出されてくる索通り
画分を、ＯＤ　２８０ｎｍで吸光を示す一分４０−を回
収する。この回収物に、同量の飽和硫安水溶液を加え、
４℃で一夜放置後、遠心分離して沈殿を回収し、０゜０
３６Ｍリン酸緩衝液−０，１５ＭＮａＣ，ｆｆ（ｐＨ６
，５）（以下、０．０３６　Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　’Ｉを５
Ｔｒｄ！加えて溶解する。飽和硫安水溶液を最終濃度が
１．４Ｍとなるようｔこ加え、４℃で１夜放置後、遠心
分離して沈殿を回収し、０．０３６　Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　
１．５−を加えて溶解した後、０．０３６　Ｍ　Ｐ　Ｂ
　Ｓで数回透析する。

試験例２　固相化抗体の調製 試験例１で精製した抗体を１００μ９／ｒｎｌ！の濃度
になるようをこ、０．０２　Ｍリン酸緩衝液、０．１Ｍ
　Ｎ３Ｃ／　（ｐＨ７）に溶解したものに、界面活性剤
で洗浄した径６．２ｆｌのポリスチレンビーズをＩ目せ
、３０℃で６０分間インキュベートした後、４℃で１夜
放置する。液を除去した後、１％牛血清アルブミンを含
む０．０２　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液を加えて再び浸漬し、
４０℃で６０分間インキュベートを行う。液を除去し、
同じ緩衝液で数回洗浄する。

実施例１ 酵素標識抗体の調製 ヒトアルファーフェトプロティン（以下、ＡＦＰとする
）を免疫されたマクス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の抗ＡＦＰ抗体
産生細胞と、マクスυ 腫瘍細胞ｐ　３ＶＥ　１を融合して得られた抗ＡＦＰモ
ノクローナル抗体産生細胞を、マクス腹水中で増殖させ
ることにより得られた抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、
試験例１の方法でＩｇＧレベルまで精製したもの（以下
、ＩｇＧとする）を抗体として使用した。酵素とじては
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ペーリンガーマンハイム
山之内社製、大腸菌由来、ＥＩＡ用、分子＋１５４００
００）を使用した。

ＩｇＧを１２５Ｔ標織したものと、標識していないもの
を混合し、ＩｇＧ１ｆｆ１ｇあたりの放射活性が１００
０００　ｃｐｍとした、ＩｇＧ　Ｑ度４ｆｆ１ｇ／−の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）＋モネ；Ｊツ＃を
用意した。この液２ｄに、架橋剤Ｎ−サクシニミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボン酸２〜１０■を、ジメチルホルムアミド１ｄに溶
解させた液３０μｅを添加し、３０℃で１０′−にβ−
Ｄ−ガラクトシダー ゼが５ｒｎｇ／−となるように溶解したものを、０、８
４　ｄ加え、３０℃で１時間反応後、４℃で一夜放置し
た。これにより、ＩｇＧｒ−導入されていたマレイミド
基と、β−Ｄ−ガラクトシダーゼが木来有しているチオ
ール基が架橋することにより、酵素抗体複合体が生成さ
れる。

この反応液を、０．０２　Ｍ　’Ｊリン酸緩衝液０゜Ｉ
　Ｍ　ＮａＣｌ、　０．１％牛血清アルブミン、１ｍＭ
ＭｇＣｌ！ｚ、０．１％アジ化ナトリクム（ｐ）１７．
０）（以下、緩衝液Ａ）で平衡化したセフ１０−ＦＢ）
で平衡化したセフ１７′ツクスＧ２５（ファルマシア社
製）カラム（１，ＯｎＸ４．５　ｃｒｓ　）により、未
反応の架橋剤を除去し、ＥＤＴＡ／ＰＢを加えて希釈し
、濃度を２　ｍ９　／　ｄに調この液２−に、扛傘；止
ＥＤＴＡ：ｂ企丑」３００（ファルマシア製）カラム（
２，６，ｎＸ１００　ａｍ　）に添加し、緩衝液Ａで溶
出することによりｌ−ずつ分画した。溶出されたメイン
ピークとその前後を含む３分画（合計３−）を集め、そ
の分画に含まれる分子量、ＩｇＧ量および酵素量を測定
した。

分子量の測定 分子量を、同一カラムに同一条件で展開した分子量マー
カーのクロマトグラムと比較することにより求めた。

ＩｇＧ量の測定 この分画の放射活性をガンマ・カクンターにより測定し
た。同時に、前記のＩｇＧｌｌｎｇあたりの放射活性を
１０００００　ｃｐｍ　　としたＩｇＧの一部を、酵素
ａａ抗体の作製に使用せずに保存していた屯のの放射活
性も測定した。この両者の放射活性を比較することによ
り、この分画中に含まれるＩｇＧｇｋを測定した。

酵素量の測定 ５０μｌの酵素活性測定用のサンプル又Ｆｉ緩衝液Ａ（
基質ブランクのために行う。）に、オルト−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−Ｗ−）クトビラノシド０．１％、０．０
２Ｍリン酸緩衝液、０、１　Ｍ　ＮａＣｌ！、０．１％
牛血清ア／ｌ／プミン、１ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ／　ｘ、
０．１％ＮａＮ５　（ｐＨ７，０）からなる酵素基質液
５００μｅを添加し、３７℃で６０分聞反応させた後、
反応停止液としてＮａ２ＣＯ３の０．１へ啜水溶液２ｍ
ｌを加えた。次に、基質ブランクを対照として、ＯＤ　
４ｘｏ　ｎｍ　ｆ）吸光度を測定した。

予め測定しておいた実験に使用したβ−り一ガラクトシ
ダーゼの比活性から、酵素標識抗体（ｆｉｌｌ記の分画
）中のβ−Ｄ−ガラクトシグーゼ量を計算した。

以上のようにして求めた、前記の分画の分子量、ＩｇＧ
量および酵素量並びにβ−Ｄ−ガラクトシグーゼの分子
量５４００００およびＩｇＧの分子盟約１５００００と
から、精製した酵素抗体複合体１分子中のＩｇＧと酵素
の分子数を求め、使用した架橋剤濃度との関係をまとめ
ると表−１のとおりであった。

（以下余白） 酵素免疫測定法 抗原、固相化抗体および酵素標識抗体を、ｌステップで
反応させる方法で行った。

酵素標識抗体サンプル１，２．３をそれぞれ酵素活性が
等しくなるように、緩衝液Ａで希釈したものを作製し、
免疫測定用酵素標識抗体液とした。（この免疫測定用酵
素標識抗体液の酵素活性は、緩衝液Ａで更に１０倍に希
釈して前記の酵素活性の測定法を適用したとき、吸光度
は０．５であった。） 試験管に検体１００μｊ、上記の免疫測定用酵素標識抗
体液３００μｌを加え、さらにＡＦＰを免疫したクサイ
より得た抗血清をＩｇＧ分画にまで精製したものを、試
験例２に従ってビーズに固定化した固相化抗体１個を加
えた。

軽く振盪後、３７℃で９０分間反応を行った。

上清液を除去し、生理食塩水２　ｆｄで２度洗浄ｔ、１
ｆｆｌ、オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド０．１％、０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．１　
ＭＮａＣ１％０．１％牛血清７　／Ｌ／プミ　　ン　、
　　　１　　　ｍＭ　　　　ＭｇＣ１ｚ　　　、　　　
０．　１　　　％　　ＮａＮ５（ｐＨ７，０）からなる
酵素基質液５００μｌを添加しく同時に空の試験管に酵
素基質液を５００μｌいれたものを用意し、基質ブラン
クとした）、３７℃で６０分間反応させた。次に、反応
停止液としてＮａ２ＣＯｓの０．１Ｍ水溶液２　ｍｌを
加えた。

次に、基質ブランクを対照としてＯＤ４２１）　ｎｍの
吸光度を測定した。

ＡＦＰを緩衝液Ａに０〜６ｏｎｙ／ｄの濃度に溶解した
標準ＡＦＰ液を検体として、上記の測定を行い、標準Ａ
Ｆ　Ｆｉ１度とＯＤａｚｏｎｍの関係を調べ、標準曲線
と作成した。得られた標準曲線を第１図に示した。

第１図より、抗体１分子と酵素１分子からなる酵素標識
抗体を使用したもの（サンプル１）は、感度が低い（こ
の場合は、感度を高めるには、酵素標識抗体を大量に使
用しなければならない。）。また、抗体７分子以上と酵
素７分子以上からなる酵素標識抗体を使用したもの（サ
ンプル３）は、固相化抗体に対する非特異的に吸着する
酵素量が多くなり、ネガティブコントロールのノイズが
大きく、低濃度の検体を測定することができない。一方
、本発明のＵ素標織抗体（４ｊンプル２）Ｖｉ、反応性
が高く高感度であり、またネガティブコントロールも低
くすぐれた性能であることがわかる。

実施例２ 酵素標識抗体の調製 抗体として、ＡＦＰをクサイに免疫して作製した抗ＡＦ
Ｐ抗体含有抗血清を、試験例１の方法で、ＩｇＧレベル
まで精製したもの（以下、ＩｇＧとする）を使用した。

酵、素としては、グルツースオキシダーゼ（分子ｆｔ１
５３０００）を使用した。

この液２ｓｌに、架橋剤としてＮ−サクシニミジル３〜
（２′−ピリジルジチオ）グロビオネート（分子量２９
４）を、３■／震ｌになるようにジメチルホルムアミド
に溶解したものを５０μｌ加え、３０℃で１０分間反応
させた。反応後、予めＰＲで平衡化したバイオグルＰ６
ＤＧ（バイオランド社）カラムにより、未反応の架橋剤
を除去した。架橋剤を除去した後、２−メルカプトエタ
ノールを最終濃度１　ｍＭになるように加え、架橋剤中
のジスルフィド結合を還元し、グルツースオキシダーゼ
にチオール基を導入した。導入されたチオール基の量は
、還元によって生じたチオピリドンの吸収から求めた。

グリコースオキシダーゼ１分子あたり、２〜３個のチオ
ール基が導入されていた。ＩｇＧとの架橋反応に使用す
るために、バイオグルＰＳＤＧカラムによφメルカプト
エタノールを除去し、ＰＢで希釈し、濃度を２〜／震ｔ
に調整した。

ＩｇＧをＩｔｓ　１標識したものと、標識していないも
のを混合し、Ｉｇに１ｍｇあたりの放射活性が１１００
０００ｃｐとした、ＩｇＧｅ度４　ｒｎｇ／　ｍｔのＰ
Ｒを用意した。架橋剤Ｎ−サクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸を
２〜ｌＱｍｙ／腫ｌになるようにジメチルホルムアミド
に溶解したものの３０μｌを、上記のように用意したＩ
ｇＧ液の２　ｍｌに加え、３０℃で１０分間撹拌し、反
応だせた。

反応後、予めＰＢで平衡化したセファデックス０２５カ
ラムにより、未反応の架橋剤を除去し、ＰＢを加えて希
釈し、濃度を１１ｎｇ／−に調整した。濃度を調整した
ものｌ震ｌに、上記ノチオール基を導入した２　ｑ　／
　ｍｌのグルツースオキシダーゼを０．５〜１　ｍｌ　
ｍ　加し、３０℃で１時間反応後、４℃で１夜放置した
。

反応液を０．０２　Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣ
１，０，１％牛血清アルブミン（、ｐＨ７，０）（以下
、緩衝液Ｃ）で平衡化したセファロースＣＬ６Ｂカラム
（１，６０Ｘ１００ｆｆｉ）に添加し、緩衝液Ｃで溶出
することによりｌｄずつ分画した。溶出されたメインビ
ークとその前後を含む３分画（合計３　ｍｌ　）を集め
、その分画に含まれるＩｇＧ量、酵素量および分子量を
測定した。

ＩｇＧ量の測定 この分画に含まれるＩｇＧ量の測定は実施例１と同様に
行った。

酵素量の測定 酵素量の測定は、以下のように行った。

０−シアニジシフ　５．６４を２．０　ｍｌの０．０５
Ｎ　ＨＣ／　ニ溶解し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１００を含む９８ｄのＰＢと混合した。混合後、西洋ワ
サビペルオキシグーゼ０．８■を溶解したものを調製し
た（以下、発色液）。酵素活性測定用のサンプル又は緩
衝液Ｃ（基質プラン夕のために行う。）の２０μｌを試
験管にとり、発色液１　ｍｌを加え３０℃で５分間イン
キエベートした。２００μｌの０．５５　Ｍグルコース
のＰＢ溶液を添加し、酵素反応を開始させ、３０°Ｃで
２０分間反応させた。０．５　ｍｌの１Ｍアジ化ナトリ
ウムを加えて、酵素反応を停止させ、基質ブランクを対
照として４３６ｎｍの吸光度を測定することにより、酵
素活性を測定した。

予め、測定しておいた実験に使用したグルコースオキシ
ダーゼの比活性から、酵素標識抗体（前記の分画）中の
グルコースオキシダーゼ量を計算した。

分子量の測定 前記の分画の分子量を決定するため、前記の分画を分子
量マーカーとともに、還元剤を加えずに、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動条件は、
Ｌａｅｍｌ　１　ｉの条件で行った。

以上のように求めた、前記の分画のＩｇＧ量、酵素量お
よび分子量並びにグルコースオキシダーゼの分子ｆｉ１
５３０００およびＩｇＧの分子置駒１５００００とから
、精製した酵素抗体複合体１分子中のＩｇＧと酵素の分
子数を求め、使用した架橋剤Ｎ−サクシニミジル４−（
Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボ
ン酸の濃度と反応に使用したグルコースオキシダーゼ液
の使用量との関係をまとめると表−２のとおりであった
。

表　　−２ 酵素免疫測定法 まず、抗原と固相化抗体を反応させた後、洗滌し、次に
酵素標識抗体との反応を行う２ステツプ法で行った。

酵素標ｊｗ＆抗体サンプル４．５．６をそれぞれ酵素活
性が等しくなるように、緩衝液Ｃで希釈したものを作製
し、免疫測定用酵素標識抗体液とした。（この免疫測定
用酵素Ｉ！ｌＩ識抗体液の酵素活性は、緩衝液Ｃで更に
１０倍に希釈して前記の酵素活性の測定法を適用したと
き、吸光度は０．８５であった。） 試験管に検体１００μｌと緩衝液０３００μｌを加え、
さらに実施例１で使用したものと同じ固相化抗体１個を
加えた。軽く振盪後、３７℃で６０分間反応を行った。

上清液を除去し、生理食塩水２ばて２度洗浄した後、上
述の免疫測定用酵素標識抗体液５００μｌを加え、３７
℃で６０分間反応を行った。上１青液を除去し、生理食
塩水２　ｍｌで２度洗浄した後、前述の発色液と０．５
５　Ｍグルコースを１：１０で混合したものを５００μ
ｌ加え（同時に、空の試験管にも、同じものを５００μ
ｌいれたものを用意し、基質ブランクとした）、３７℃
で６０分間インキエペートした。

次に、２−の１Ｍアジ化ナトリクム水溶液を加えて、酵
素反応を停止させ、基質ブランクを対照として、４３６
ｎｍの吸光度を測定した。

ＡＦＰを緩衝液Ｃにθ〜６０ｎｙ／ｇｌの濃度に溶解し
た標準ＡＦＰ液を検体として、上記ブリ、り の飛走を行い、標準ＡＦＰ濃度とＯＤ　４３１１ｆ１ｍ
の関係を調べ、標準曲線を作成した。

得られた標準曲線を第・２図に示した。

第２図より、実施例１と同様に、本発明の酵素標識抗体
（ｆンプル５）は、反応性が高く高感度であり、またネ
ガティブコントロールも低くすぐれた性能であることが
わかる。

「発明の効果」 本発明の酵素標識抗体は、酵素抗体複合体１分子が２〜
５個の抗体と、２〜５個の酵素とが架橋されたものから
なるので、固相サンドイッチ酵素免疫測定法に使用され
たとき、従来よりも少ない使用量で、感度が高く、且固
相化抗体に非特異的に吸着される酵素の量が少ないため
、氏濃度の検体を正確に測定することができる。

従って、この酵素標識抗体を使用した酵素免疫測定法は
、生体中の微量のホルモンなどのタンノ曵り質やガンマ
−カーなどを、感度良く測定するのに、特に有効である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗体として抗ＡＦＰモノクローナル抗体、酵
素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用して調製され
た酵素標識抗体を用いて、酵素免疫測定法でＡＦＰを測
定したときのＡＦＰ濃度−吸光度の関係を示すグラフ、
＠２図は抗体として抗ＡＦＰボククローナル抗体、酵素
としてグルコースオキシダーゼを使用して調製された酵
素標識抗体を用いて、ＡＦＰを測定したときのＡＦＰ濃
度−吸光度の関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）酵素免疫測定法において使用する酵素標識抗体であ
   り、酵素抗体複合体１分子が２〜５個の抗体と、２〜５
   個の酵素とが架橋されたものとからなることを特徴とす
   る酵素標識抗体。 ２）請求項１記載の酵素標識抗体を使用することを特徴
   とする酵素免疫測定法。