JPH0246109B2 - Kosomenekisokuteiho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は固相法による酵素免疫測定法に関す
る。 従来技術 ペプチドホルモンなどのアミノ酸関連物質；炭
水化物およびその代謝物質；脂質；ヌクレオチド
などの生体関連物質の検出・同定・定量には、例
えば、抗原抗体反応を用いた固相法による酵素免
疫測定法が用いられる。この固相法により被側定
物質を定量する方法のひとつにサンドイツチ法が
知られている。このサンドイツチ法を用いて、例
えばインシユリンを定量する場合には、まず、担
体となるABSやポリスチレンなどでなるビーズ
を準備しこの表面にインシユリンの抗体となる免
疫グロブリンＧ（IgC）を担持させて固相化抗体
が調製される。この固相化抗体を、濃度既知のイ
ンシユリン溶液に加えインシユリンを抗原として
担体上に固定し、第一固相系が調整される。他
方、あらかじめHRP（ペルオキシターゼ）などの
酵素で標識したインシユリンの抗体となるIgGを
標識抗体として調整しておく。これを前記第一固
相系に加えるとこの標識坑体はインシユリンに結
合し、第二固相系が形成される。被測定物質であ
るインシユリンは抗体であるIgGにサンドイツチ
状にはさまれた形態となる。ここへABTS〔２・
2′−アジノービス−（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルフオン酸）〕などの酵素基質を加え
ると基質が酵素反応をうける。得られる反応生成
物は反応液のOD液を測定することにより、あら
かじめOD値とインシユリン濃度との関係を示す
検量線から被側定物質中のインシユリン濃度を知
ることができる。このようにして未知試料中に含
まれる特定物質を定量することができる。OD値
の測定には、酵素反応終了後の一部をキユベツト
（セル）に移すことが必要である。このとき担体
がキユベツトに入りやすい。この混入担体が光路
をさえぎり、測定誤差や測定不能の原因となつて
いる。混入担体をキユベツトから取り除くには手
間がかかる。そのために、酵素標識抗体の量を一
定にしておき、担体に結合しなかつた酵素の量を
測定することも考えられるが、余分な手間がかか
り能率が悪い。サンドイツチ法以外に競合反応法
も用いられる。この場合も上記と同様に測定時の
固相による光路の妨害が原因となる。固相法を実
施するにあたり、反応時間を短縮しかつ簡便にす
るために担体の直径を小さくし反応液との接触面
積を大きくして反応速度を増大できれば便利であ
る。しかし、粒子径の小さい担体は通常の大きさ
の担体よりもさらにキユベツト内に入りやすくな
る。このため微小な粒子は遠心分離器にかけて除
去しなければならず、不便である。光路の妨害を
極小にするべく、担体として透明性に優れたアク
リルアミドゲルを用いることも考えられうる。し
かし、抗原あるいは抗体の固相化に化学的な結合
方法を用いねばならないために、操作が著しく不
便である。さらに透明性という観点のみからアク
リルアミドを素材として用いているため、担体の
素材としては必ずしも適切でない。 発明の目的 本発明の目的は、試料の分光学的側定にさいし
担体がキユベツトに入り込んで光路をさえぎり測
定値を狂わせるということのない固相法による酵
素免疫測定法を提供することにある。本発明の他
の目的は、微小粒子を担体として用いて反応効率
を高め、固相系の影響を受けることなく分光学的
手法により被測定物質の定量を可能にする酵素免
疫測定法を提供することにある。 発明の要旨 本発明の固相法による酵素免疫測定法は酵素反
応溶液の比重が担体を含む固相系の比重よりも小
さく、かつ酵素反応停止後の溶液の比重が固相系
の比重よりも大きくなるよう設定され、そのこと
により上記目的が達成される。 本発明方法はサンドイツチ法、競合反応法など
の固相法による酵素免疫測定法に適用しうる。サ
ンドイツチ法は、抗体もしくは抗原を担体に担持
させ、該抗体もしくは抗原に特異的に反応する抗
原もしくは抗体である被測定物質を検出、同定、
もしくは定量する固定法であつて、(1)該被側定物
質を前記担体に担持された抗体もしくは抗原に結
合させ第一固定系を形成する工程、(2)該被測定物
質と特異的に反応する酵素で標識された抗体もし
くは抗原を第一固相系の被測定物質に結合させ第
二固相系を形成する工程、(3)該酵素により酵素反
応をうける基質を第二固相系と反応させる工程、
および(4)酵素反応生成物を介して該被測定物質を
分光学的に検出、同定もしくは定量する工程が包
含される。 以下にサンドイツチ法の場合を例にあげ、本発
明について説明する。 本発明に用いられる担体は、任意の形状例えば
ビーズ状に形成され得、かつ抗原または抗体を物
理吸着などにより担持しうる材質であればよく、
特に限定されない。その一例を挙げれば、ABS、
ポリエスチレンなどの熱可塑性樹脂がある。この
担体は、通常、直径６mm程度のビーズ状に成形し
て用いられる。担体の直径はさらに小さくてもよ
く、それには例えば、スチレンを乳濁重合させて
得たラテツクスや懸濁重合させて得られるゲルが
ある。このような微細粒子を用いると反応時の反
応形態が液相−液相反応に近くなり、そのために
反応速度が増大する。その結果、反応時間が短縮
されうる。これら担体はその反応に適切な比重を
有しておればそのまま反応系に供することができ
るが硫酸バリウム、炭酸カルシウムなどの無機塩
類を充填剤として加えてその比重を大きくするこ
とが可能である。ラテツクスやゲルの場合もモノ
マーに充填剤を添加して重合させれば充填剤を含
有する担体となる。さらに重合方法によつても比
重を変化させることができる。 このような担体に、被測定物質に対する抗体も
しくは抗原となる物質を例えば物理的吸着により
担持させる。例えば、インシユリンを被測定物質
とする場合には、担体上にインシユリンの抗体と
してIgGを担持させる。これをインシユリンに結
合させ、第一固相系を形成させる。次いで、酵素
で標識した、被測定物質に特異的に反応する抗体
もしくは抗原を結合させて第二固相系を形成させ
る。担体をＡ、被測定物質をＢ、被測定物質の抗
体もしくは抗原をC₁、酵素標識した抗体もしく
は抗原をC₂とすれば第一固相系はＡ−C₁−Ｂ、
第二固相系はＡ−C₁−Ｂ−C₂で表わされる。C₁
とC₂は同一の物質であつてもよい。C₂としては、
例えば、HRP（ペルオキシダーゼ）を標識酵素と
して結合させたIgGが用いられる。なお、標識坑
体もしくは抗原は例えばJ.Histochem.Cytochem.
22、1084（1974）に記載のNakaneらの方法によ
り容易に調製されうる。 次いで、第二固相系の酵素基質溶液を加えて酵
素反応を行なわせる。このとき、第二固相系は反
応液に完全に浸漬していることが必要である。し
たがつて第二の固相系の比重は反応溶液の比重よ
りも大きいことが望ましい。反応溶液は必要に応
じて比重調整物質が添加される。比重調整物質に
は塩化ナトリウム、塩化マグネシウムなどの無機
塩類；グリセロールなどの多価アルコール；グル
コースなどの糖類；尿素；酸；塩基などがある。
これら比重調整物質は酵素反応を妨害しない範囲
で適宜添加される。比重調整物質あらかじめ基質
溶液に加えておけば操作が簡単である。 酵素反応終了後、反応液には反応生成物、酵
素、固相系が含有される。これに反応停止液を加
えて反応を完全に停止させる。反応停止液には、
反応液と混合しうる、有機溶剤や酸、アルカリが
利用されうる。反応停止液は、上記反応溶液に使
用されるのと同様の比重調整物質を用いてあらか
じめ比重調整がなされており、これを反応液に加
えることにより、反応液に存在する固相系が溶液
上に浮上する。比重調整された反応停止液は酵素
反応を停止させることが可能でかつ分光学的測定
を妨害しないことが重要である。 反応停止後、酵素反応液を分光学的手法により
例えばOD測定を行なう。このOD側定値から、
あらかじめ作成した検量線を用いてインシユリン
量を求めることができる。反応停止後の反応液は
比重調整がなされているため、その一部をそのま
まキユベツトに移したとき、たとえ固相系がキユ
ベツト内に移行しても底に沈まない。それゆえ、
光路を妨害することがない。 競合反応法により測定を行なう場合にも本発明
方法を適用すれば、担体、酵素反応時の溶液、お
よび反応停止剤が比重調整さているため、測定時
に固相系による妨害がなく、正確な測定ができ
る。 実施例 以下に本発明を実施例について説明する。 実施例 １ (A) 固相化抗体の調整：担体としてポリスチレン
を素材とする直径6.35mmの球形ビーズを形成し
た。このビーズを５％のScat20X−Ｎ（半井化
学社製）を用いて洗浄し、次いで、水洗し、風
乾した。比重は1.05であつた。別に、モルモツ
トに精製ブタインシユリン（ノボ社製のアクト
ラピツドMC）を免疫した抗インシユリン血清
を産生させた。この血清をDEAE−セルロース
によるイオン交換クロマトグラフイーにかけ、
IgG分画を得た。これを10μｇ／mlとなるよう
に0.1MHz7.0のリン酸緩衝液に溶解させた。上
記ビーズ100個をビーカーにとり、これに上記
IgGのリン酸緩衝液25mlを加え、37℃で１時間
インキユベートした。これをさらに４℃で16時
間放置した。生成した固相化抗体を取し、上
記リン酸緩衝液で充分洗浄した。得られた固相
化抗体にウシ血清アルブミンを0.1％含むリン
酸緩衝液（BSA溶液）25mlを加えて４℃で16
時間放置した。 (B) 酵素標識坑体の調製：(A)で得た1gG分画にＮ
−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシ
イミドを作用させ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
（以下β−Ga1）で標識した。得られた標識酵
素を１ｍＭの塩化マグネシウムを加えた0.02M
リン酸緩衝液で500倍に希釈した。 (C) 第一固相系の調製：塩化ナトリウム0.1M、
BSA0.1％を含むPH７ 0.02Mのリン酸緩衝液
（以下0.02Mリン酸緩衝液）を調製した。精製
ブタインシユリン（ノボ社製、アクトラピツド
MC）を上記の0.02Mリン酸緩衝液で希釈し、
濃度０、10、20、40、80、160、320μunit／ml
の希釈列を調製した。試験管に各濃度のインシ
ユリン溶液を100μずつ分注し、各々0.5mlの
0.02Mリン酸緩衝液を加えた。これに(A)項で調
製した固相化抗体を１個づつ加え、37℃で１時
間インキユベートした。インキユベート後、吸
引取し、２mlの0.02Mリン酸緩衝液で１回洗
浄して第一固相系を得た。 (D) 第二固相系の調製：(C)項で得られた第一固相
系に(B)項で得られた酵素標識坑体溶液300μ
を加え37℃で２時間インキユベートした。反応
液を吸収除去し、0.02Mリン酸緩衝液２mlで２
回吸引洗浄して第二固相系を得た。 (E) 酵素反応：(D)項で得得た第二固相系と基質と
してｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシシドを0.1％含む１ｍＭの塩化マグネシ
ウムを加えた0.02Mリン酸緩衝液を0.5ml加え、
37℃で１時間インキユベートした。次いで、20
％のグリセロールを含む0.1M炭酸ナトリウム
溶液２mlを加え酸素反応を停止させた。 (F) 分光学的測定：(E)項の反応停止後の溶液をキ
ユベツトにあけ、その420nｍにおけるOD値を
測定した。このとき測定溶液中に存在する固相
系は液上層部に浮上するため測定時の光路を妨
害しない。インシユリン濃度に対応するOD値
をプロツトし、図に示す検量線を作成した。こ
れを用いて未知検体に含有されるインシユリン
量が定量されうる。 実施例 ２ (A) 固相化抗体の調製：担体の素材としABSを
用いたこと以外は実施例１と同様である。な
お、担体となる球形ビーズの比重は1.02であつ
た。 (B) 酵素標抗体の調製：(A)項で得た１ｇＧ分画を
J.Histochem.Cytochem.22、1084（1974）に記
載のNakaneらの方法によりペルオキシダーゼ
（Horse radish peroxidase）で標識した。得
られた酵素標識抗体はBSA溶液により1200倍
に希釈した。 (C) 第一固相系の調製：実施例１と同様である。 (D) 第二固相系の調製：実施例１と同様である。 (E) 酸素反応：酵素基質溶液として、２，2′−ア
ジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルフオン酸）25ｍＭと過酸化水素５ｍＭ
とを含むPH７の0.1Mリン酸緩衝液を調製した。
(D)項で得た第二固相系に上記基質溶液を加え37
℃で１時間インキユベートした。次いで、
0.5M流酸を２ml加えて酵素反応を停止させた。 (F) 分光学的測定：405nｍにおけるOD値を測定
したこと以外は実施例１と同様である。 発明の効果 本発明方法によれば、このように、固相法によ
る酵素免疫測定法において酵素反応系を構成する
反応液、反応停止液および担体が各々比重調整さ
れているため、分光学的手法による測定時のキユ
ベツト内の固相系はすべて液上層部に浮上する。
そのため、固相系による光路の妨害がなく、正確
な測定ができる。さらに、担体はその粒径に関係
なく反応液上層部に浮上するため、反応系に最適
な素材の微小粒子を担体として用いることができ
る。したがつて、反応速度が増大し、測定範囲も
拡大されうる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明方法におけるインシユリン濃度と
OD値との関係の一例を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素反応時の溶液の比重が担体を含む固相系
   の比重よりも小さく、かつ酵素反応停止後の溶液
   の比重が固相系の比重よりも大きくなるよう設定
   することを包合する、分光学的測定法を用いた固
   相法による酵素免疫測定法。 ２ 前記酵素反応の開始時に反応系が比重調整物
   質を含む特許請求の範囲第１項に記載の測定法。 ３ 前記酵素反応を停止させる反応停止剤は比重
   調整物質を含む特許請求の範囲第１項に記載の測
   定法。 ４ 前記担体は高分子化合物を素材とする特許請
   求の範囲第１項に記載の測定法。 ５ 前記担体はガラスもしくはアルミナである特
   許請求の範囲第１項に記載の測定法。 ６ 前記担体は充填剤を含む特許請求の範囲第１
   項に記載の測定法。 ７ 前記担体は重合可能なモノマーを乳化重合さ
   せてなるラテツクスである特許請求の範囲第１項
   に記載の測定法。 ８ 前記担体は重合可能なモノマーを懸濁重合さ
   せてなるゲルである特許請求の範囲第１項に記載
   の測定法。 ９ 前記比重調整物質は無機塩類、酸、塩基、多
   価アルコールおよび糖類でなる群から選択される
   少なくとも一種である特許請求の範囲第２項もし
   くは第３項に記載の測定法。 １０ 前記充填剤は無機塩類である特許請求の範
   囲第６項に記載の測定法。