DE19806291A1

DE19806291A1 - Assayvorrichtungen

Info

Publication number: DE19806291A1
Application number: DE19806291A
Authority: DE
Inventors: Keith May
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 1997-02-14
Filing date: 1998-02-16
Publication date: 1998-08-20
Also published as: ES2144358B1; ITTO980115A1; US6156271A; CA2229331A1; AU5537798A; GB2322192B; ES2144358A1; FR2759782B1; GB2322192A; CA2229331C; IT1302059B1; NL1008254A1; JPH10232189A; AU742664B2; IE980070A1; GB9703094D0; FR2759782A1; NL1008254C2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf Assayvorrichtungen und insbe sondere auf derartige Vorrichtungen, in denen sich eine Flüs sigkeit innerhalb eines porösen Materials auf einem Fließweg entlangbewegt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Viele einfache und herkömmliche Assayvorrichtungen sind der zeit verfügbar, die einen Streifen oder eine Folie porösen Materials umfassen, durch das sich die Probenflüssigkeit fortbewegt und ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz in eine Testzone befördert, in der das Assayergebnis angezeigt wird. Derartige Vorrichtungen werden ungenau als "immuno chromatographische" Vorrichtungen bezeichnet, obwohl das spe zifische Bindungsreagenz nicht notwendigerweise im engeren Sinn immunochemisch sein muß. Beispiele derartiger Vorrich tungen sind in der EP 186 799, der EP 291 194 und der EP 383 619 beschrieben.

In einer typischen Vorrichtung wird die Probenflüssigkeit auf ein Ende eines definierten Fließwegs für die Flüssigkeit auf gebracht. In der Regel wird die Probenflüssigkeit durch einen physisch getrennten Körper aus porösem Material aufgenommen und muß während des Ablaufs des Assays von diesem ersten Kör per in einen oder mehrere andere, der Reihe nach angeordnete poröse Körper fließen. Die aufeinanderfolgenden porösen Kör per besitzen in der Regel verschiedene Eigenschaften, wie Porosität oder Zusammensetzung. Damit der Assay wirksam ar beitet, sollte es einen ungehinderten Fluß der Probenflüssig keit von einem Körper in den nächsten geben. Typischerweise sind die porösen Körper ganz oder teilweise innerhalb eines zum Beispiel aus Kunststoffmaterial aufgebauten Schutzgehäu ses enthalten. Es gibt aber zwangsläufig zumindest teilweisen Kontakt zwischen einer oder mehreren inneren Flächen des Ge häuses und einem oder mehreren der porösen Körper. Die Reihe an porösen Körpern kann durch Befestigung an einem gemeinsa men Träger fest miteinander verbunden werden, zum Beispiel indem sie auf einen einzelnen Verstärkungsstreifen laminiert werden. Alternativ können angrenzende Körper nur durch Ein zwängen im Gehäuse in geeignetem Kontakt gehalten werden.

In der Regel fließt die Probenflüssigkeit aufgrund der Kapil larwirkung durch die Vorrichtung. Beabsichtigt ist, daß die poröse Eigenart der Streifenkomponenten sicherstellt, daß die Flüssigkeit nur durch diese Komponenten fließt und nicht an derswohin in der Vorrichtung. Jedoch kann es in einer typi schen Vorrichtung, insbesondere einer mit einem Schutzgehäu se, Möglichkeiten für die Flüssigkeit geben, alternative Fließwege zu finden, die zum Beispiel durch große Nähe zwi schen einer inneren Fläche des Gehäuses und der Außenseite einer der porösen Komponenten entsteht. Diese Tendenz, von einem geplanten Fließweg abzuweichen, kann verschlimmert wer den, wenn ein Benutzer der Vorrichtung ein zu großes Proben volumen auf die Vorrichtung aufbringt. Unter derartigen Um ständen neigt die Vorrichtung dazu, "überzulaufen". Ein der artiges Überlaufen kann dazu führen, daß eine beträchtliche Menge der Probenflüssigkeit innerhalb der Vorrichtung einen kritischen Abschnitt des geplanten Fließwegs umgeht. Zum Bei spiel kann einige Flüssigkeit eine Testzone erreichen, ohne auf ein oder mehrere Reagenzien, wie ein mobilisierbares mar kiertes Reagenz, die bewußt auf dem geplanten Fließweg aufge tragen worden waren, zu treffen. Ein Überfließen kann daher zu einem falschen Assayergebnis oder zumindest zu einem Ver lust der Assayempfindlichkeit führen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Assayvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, in denen die Wahrscheinlichkeit für ein Abweichen der Probenflüssigkeit vom geplanten Fließweg reduziert ist.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt eine Assayvorrichtung zur Verfügung, der ein Kompositstreifen einverleibt ist, umfassend mindestens zwei Körper eines porösen, flüssigkeitsleitenden Materials, die über eine Grenzfläche in Flüssigkeitskontakt miteinander stehen und zusammen mindestens einen Teil eines Flüssigkeits fließwegs definieren, auf dem während der Durchführung eines Assays Flüssigkeit fließen muß, wobei an der Grenzfläche die, bezogen auf die Richtung des Flüssigkeitsfließwegs, laterale Dimension des Kontaktbereichs des stromaufwärts liegenden Körpers derart verengt ist, daß der Flüssigkeitsfluß vom stromaufwärts liegenden Körper in den stromabwärts liegenden Körper in Richtung der Mittellinie des Fließwegs in den stromabwärts liegenden Körper fokussiert wird. Bevorzugt bil det der verengte Abschnitt des stromaufwärts liegenden Kör pers eine Spitze oder einen Bug. Der stromaufwärts liegenden Körper kann ein Probenaufnahmeelement oder ein Docht sein.

Die Körper aus porösem Material können zumindest teilweise innerhalb eines hohlen Gehäuses, aufgebaut aus festem, feuch tigkeitsundurchlässigem Material, enthalten sein. Im allge meinen befindet sich eine innere Fläche des Gehäuses in Kon takt mit der Grenzfläche der Körper aus porösem Material oder ist ihnen dicht benachbart. In einer Ausführungsform sind die Körper aus porösem Material physisch getrennte Komponenten und werden nur dadurch, daß sie innerhalb des hohlen Gehäuses eingezwängt werden, miteinander in Kontakt gehalten.

Die Körper aus porösem Material können physisch getrennte Komponenten sein, und werden während des Zusammenbaus der Vorrichtung miteinander in Kontakt angeordnet. Alternativ können sie in Kontakt miteinander befestigt werden, z. B. in dem sie auf ein gemeinsames Verstärkungsmaterial laminiert werden.

Bevorzugt sind die Körper aus porösem Material mindestens teilweise in einem aus festem, feuchtigkeitsundurchlässigem Material aufgebauten hohlen Gehäuse enthalten, und das Pro benaufnahmeelement oder der Docht ragt aus dem Gehäuse her aus, wobei aber der Abschnitt des Probenaufnahmeelements oder -dochts, der verengt ist, sich innerhalb des Gehäuses befin det.

In einer Ausführungsform nimmt der stromaufwärts liegende Körper ein stromaufwärts vom verengten Abschnitt des porösen Körpers liegendes mobilisierbares Reagenz auf. Wünschenswer terweise befindet sich das mobilisierbare Reagenz auf einem Abschnitt des innerhalb des Gehäuses geschützten Körpers, so fern die Vorrichtung ein Gehäuse umfaßt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Docht zur Verwen dung als Teil einer Assayvorrichtung, wobei der Docht einen Streifen porösen Materials umfaßt, der an seinem einen Ende eine auf der longitudinalen Achse des Streifens zentrierte, verengte Spitze oder einen Bug besitzt. Bevorzugt umfaßt der verengte Abschnitt nicht mehr als 35% der Gesamtlänge des Dochts. Bevorzugt ist die Breite des Streifens an der Spitze oder dem Bug um mindestens 50% verengt. Ideale Dochtmateria lien sind Faservliese und Faserkunststoffe.

Die Materialien, aus denen die verschiedenen porösen Kompo nenten in der Assayvorrichtung hergestellt sind, sind für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Jedes der herkömmli cherweise in Vorrichtungen dieser Art verwendete poröse Mate rial kann eingesetzt werden. Eine große Anzahl poröser Mate rialien wurde erfolgreich eingesetzt. Diese umfassen herkömm liche Cellulosepapiere und Nitrocellulose. Glasfasermateria lien und Polyethylenschmelzen werden häufig für poröse Körper verwendet, die die Startstelle für mobilisierbare markierte Reagenzien sind. Das Probenaufnahmeelement kann auch aus der artigen Materialien hergestellt werden. Ideale Materialien für das Probenaufnahmeelement sind Faserkunststoffmaterialien wie "Porex" und Faservliese, wie nachfolgend in weiteren Ein zelheiten beschrieben. Wenn notwendig, können derartige Mate rialien entsprechend hydrophil gemacht werden, zum Beispiel durch Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln. Die Ablage rung von Reagenzien auf irgendeinem dieser Materialien, um die Assaychemie zur Verfügung zu stellen, kann durch jede derzeitig im Stand der Technik bekannte Standardtechnik durchgeführt werden. Die spezifischen Bindungsmechanismen, durch die derartige Assays funktionieren, können vollständig konventionell sein. Typischerweise umfassen derartige Assays Antikörper/Nachweissubstanzreaktionen entweder vom Sandwich- oder kompetitiven Typ. Wenn erwünscht, kann die Erzeugung ei nes Komplexes, der ein markiertes Reagenz zur Anzeige des As sayergebnisses einschließt, mit Hilfe indirekter Bindung oder Einfangsmechanismen durchgeführt werden, zum Beispiel unter Verwendung spezifischer Bindungspaare wie Avidin und Biotin. Die Wahl derartiger Routinemaßnahmen beeinflußt nicht das Konzept der Fokussierung des Flüssigkeitsflusses, das für die Erfindung grundsätzlich ist.

In einem bevorzugten Bereich wird die Erfindung in Assayvor richtungen verwendet, die als "automatisch probenehmend" ent worfen wurden, so daß der Anwender die Vorrichtung mit einer Flüssigkeitsprobe wie einer Körperflüssigkeit nur in Kontakt zu bringen braucht, um das Assayverfahren zu starten. In vie len derartigen Vorrichtungen ist dies die einzige Handlung, die der Anwender vornehmen muß, bevor das Ergebnis des Assays sichtbar oder lesbar wird. Viele derartiger Vorrichtungen ba sieren auf dem Prinzip der "Immunochromatographie". Die Vor richtung enthält einen Streifen aus porösem Trägermaterial, entlang dem sich die aufgebrachte Flüssigkeitsprobe bewegen kann. Während eine derartige Fortbewegung stattfindet, wird ein Reagenz oder mehrere Reagenzien innerhalb der Vorrichtung in eine Nachweiszone auf dem Streifen befördert und führt da zu, daß das Assayergebnis angezeigt wird. In herkömmlicher Weise ist ein markiertes Material innerhalb des Streifens be weglich, wenn er feucht ist, und die Bindung dieses markier ten Materials in der Nachweiszone stellt die Mittel zur Ver fügung, wodurch das Assayergebnis lesbar wird. Beispiele der artiger automatisch probenentnehmender Vorrichtungen sind in der EP 291 194 und der EP 383 619 beschrieben.

Die Möglichkeit für die automatische Probenentnahme kann mit tels eines saugfähigen Probenaufnahmeelements oder "Dochts" vorgesehen werden. Das Material, aus dem der Docht herge stellt ist, wird derart ausgewählt, daß die aufgebrachte Flüssigkeit sehr schnell in den Docht absorbiert wird. Der Docht wirkt dann als Reservoir der Probenflüssigkeit, die nach und nach in den porösen Streifen läuft, damit das immu nochromatographische Verfahren arbeitet. Das bewegliche mar kierte Reagenz kann dem Streifen selbst oder anderswo inner halb der Vorrichtung stromaufwärts der Nachweiszone einver leibt sein. In der EP 291 194 wird vorgeschlagen, daß das markierte Reagenz dem Docht einverleibt sein kann. Ideale verwendbare markierte Reagenzien in diesen Assayvorrichtungen sind Reagenzien (im allgemeinen spezifische Bindungsreagenzi en), die direkt oder indirekt mit wasserunlöslichen teilchen förmigen Direktmarkierungsstoffen markiert sind, wie Farbso le, Metallsole (z. B. Gold), nichtmetallische Elementteilchen wie Selen und Kohlenstoff und andere gefärbte winzige Teil chen wie gefärbte Latexteilchen (Polystyrol) und farbgefüllte Liposomen, die alle für diesen Zweck an sich bekannt sind.

Gemäß der WO 96/09546 kann der Docht ein Faservlies umfassen. Bevorzugtes ungewebtes Material wird durch das als Hydrover wicklung bekannte Verfahren hergestellt. Im Idealfall wird keine chemische Behandlung oder chemisches Härten während des Herstellungsverfahrens verwendet. Derartige Materialien sind an sich bekannt, und werden in großem Umfang verwendet, um Reinigungstücher und Wischer herzustellen. Das ungewebte Dochtmaterial ist bevorzugt hydrophil. Wenn der Gesamtcharak ter des Gewebes hydrophob ist, kann es zum Beispiel mit ober flächenaktiven Mitteln behandelt werden, um es bei Gebrauch hydrophil zu machen. Es kann aus einer Mischung von Fasern hergestellt werden. Diese Mischung kann eine Mischung hydro phober Fasern und hydrophiler Fasern sein, aber der Ge samtcharakter des Materials ist bevorzugt hydrophil. Eine ideale Mischung umfaßt eine Mischung aus Viskose und Poly ester, z. B. ungefähr 30% Viskose und ungefähr 70% Polyester. Jedoch können auch Einzelkomponentengewebe, wie 100% Viskose, verwendet werden. Das "Gewicht" des ungewebten Materials ist wichtig. Das Gewicht des Materials ist bevorzugt mindestens ungefähr 50 g/m² und bevorzugter mindestens ungefähr 70 g/m². Im allgemeinen ist es nicht notwendig, daß das Gewicht unge fähr 120 g/m² übersteigt. Die Verwendung eines aus ungewebtem Stoffmaterial hergestellten Dochts kann stark verbesserte Dochteigenschaften und sehr effiziente Freisetzung jeglichen trockenen markierten Reagenzes, das dem Docht einverleibt sein kann, liefern.

Obwohl derartige Gewebematerialien in herkömmlicher Weise als "ungewebt" ("non-woven") beschrieben werden, bedeutet dies nicht notwendigerweise, daß die Fasern, die das Gewebe ausma chen, in völlig zufälliger Art und Weise angeordnet sind. Es wird im allgemeinen festgestellt, daß als Folge des Verfah rens, durch das das Gewebe hergestellt wird, ein bestimmter Anteil der Fasern überwiegend in einer Richtung liegt und daß der Rest überwiegend in einer anderen Richtung im rechten Winkel zur ersten Richtung liegt. Wenn das Dochtmaterial fa serartig wie ein Faservlies ist, ist es bevorzugt derart aus gewählt und angeordnet, daß der Hauptteil der Fasern parallel zu der Richtung liegt, in der die Flüssigkeit entlang dem Docht in die Vorrichtung hineinfließen soll. Bevorzugt sollte das Zahlenverhältnis von zum Fluß parallelen Fasern zu zum Fluß orthogonalen Fasern ungefähr 2 : 1 oder größer sein, vor ausgesetzt daß genügend zum Fluß orthogonale Fasern vorhanden sind, um die mechanische Integrität des ungewebten Materials für Herstellungszwecke aufrechtzuerhalten.

Bevorzugt umfaßt der Docht nur eine einzelne Lage oder eine Einzelschicht eines Faservlieses. Dies erleichtert die Her stellung und Qualitätskontrolle einer Assayvorrichtung be trächtlich, wenn der Docht verwendet wird, um ein oder mehre re Reagenzien, die für die Assaychemie wichtig sind, wie ein bewegliches markiertes Reagenz, zu enthalten. Wenn der Docht aus mehreren Schichten saugfähigen Materials aufgebaut ist, ist es schwierig sicherzustellen, daß das Reagenz (die Rea genzien) während der Herstellung im Docht gleichmäßig abge schieden wird (werden), und der Fluß einer Probenflüssigkeit durch die Mehrschichtstruktur kann ungleichmäßig sein und zu ineffizienter oder variabler Aufnahme des Reagenz (der Rea genzien) führen.

Um einen wirksamen Docht für die Verwendung in einer immuno chromatographischen Assayvorrichtung auszubilden, sollte der Docht eine ausreichende Absorptionskapazität besitzen. Die Flüssigkeitskapazität des Dochts sollte die Kapazität des Streifens (zusammen mit jeder etwaigen am distalen Ende des Streifens vorgesehenen Vertiefung) übersteigen.

Wenn das Dochtmaterial in Form dünner Lagen vorliegt, wie als Faservlies, ist die Schicht bevorzugt an eine Trägerschicht eines nicht wasserabsorbierenden Materials gebunden, wie eine Kunststofflage. Eine Polyesterlage ist am besten. Die Bindung kann ohne weiteres unter Verwendung einer Vielzahl von Klebe mitteln, die an sich auf dem Gebiet der Laminierung bekannt sind, erreicht werden, wobei der Klebeschritt durch Druck, Wärme oder die Verwendung eines Zwei-Komponenten-Klebemittels herbeigeführt werden kann. Es ist selbstverständlich, daß die Art und Menge des Klebemittels die Absorptionsfähigkeit und Fließeigenschaften des Faservlieses, wenn es an den Träger gebunden ist, nicht signifikant beeinträchtigen sollte. Auch sollte der Klebstoff nicht irgendwelche Reagenzien, wie nicht umgesetzte Überschußmonomere in Mengen enthalten, die die spezifische Bindungseffizienz oder andere Reaktionen stören könnten, die in der Assayvorrichtung während des Gebrauchs vonstatten gehen müssen.

Wenn gewünscht, können dem Docht Komponenten einverleibt wer den, die zur Durchführung des Assays beitragen, wie Puffera genzien und oberflächenaktive Mittel.

Ein wichtiger Bereich, in dem die erfindungsgemäßen Vorrich tungen verwendet werden können, ist die Testtechnologie für den privaten Gebrauch, insbesondere für genaue quantitative Tests. Ein passendes Beispiel, das eine logische Folge des gegenwärtigen Konsumenteninteresses an Schwangerschaftstests und Eisprungvoraussagetests für den privaten Gebrauch dar stellt, ist die genaue Überwachung des Ovulationszyklus, nicht nur um die Wahrscheinlichkeit der Empfängnis zu vergrö ßern, sondern in der Tat um verläßliche Informationen für die Verhütung zur Verfügung zu stellen. Es wurden Vorschläge ge macht, um mit diesem Ziel Körperflüssigkeiten zu analysieren. Ein üblicher Ansatz ist es, die periodischen Schwankungen verschiedener Hormonmetabolitspiegel im Urin zu überwachen. Ein wichtiges Beispiel ist die Bestimmung jeglicher Körper flüssigkeitsnachweissubstanzen, insbesondere bei der Überwa chung des Humanovulationszyklus durch die Bestimmung eines oder mehrerer Hormone oder ihrer Metabolite in einer Körper flüssigkeit wie Urin, zum Beispiel entweder Luteinisierungs hormon (LH) und/oder Östron-3-glucuronid (E-3-G). In der Re gel werden zwei oder mehr derartige Nachweissubstanzen zusam men gemessen, um ausreichend Information zur Verfügung zu stellen.

In diesem Zusammenhang umfaßt eine ideale Probenflüssigkeits testvorrichtung für den privaten Gebrauch ein poröses Träger material, wie einen Streifen, durch den die aufgegebene Pro benflüssigkeit, wie Urin, hindurchdringen kann und worin sich das Assayergebnis durch spezifische Bindung eines nachweisba ren Materials in einem oder mehreren genau definierten Berei chen (Nachweiszonen) des Trägers zeigt, wie als eine oder mehrere schmale Linien oder schmale Punkte, die jeweils ein immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz enthalten.

Derartige Vorrichtungen können in Zusammenhang mit einer elektronischen Vorrichtung zur Überwachung des Fertilitäts status des menschlichen Ovulationszyklus verwendet werden und sehen für einen Benutzer der Vorrichtung eine Anzeige des Fertilitätsstatus vor, und umfassen typischerweise:

a) Ablesemittel zum Ablesen einer Assayvorrichtung für zwei Nachweissubstanzen;
b) Informationsverarbeitungsmittel zur Bestimmung der Pro benkonzentrationswerte für mindestens zwei Nachweissub stanzen der Körperflüssigkeit aus der Ablesung der As sayvorrichtung;
c) Informationsverarbeitungsmittel und Speichermittel zum Ableiten einer Angabe des derzeitigen Fertilitätsstatus des getesteten menschlichen Subjekts aus den bestimmten Konzentrationswerten und aus zuvor bestimmten Konzentra tionswerten; und
d) Anzeigemittel zur Übermittlung des derzeitigen Fertili tätsstatus an den Benutzer der elektronischen Vorrich tung. Bevorzugt umfaßt die Vorrichtung zusätzlich Aufnah memittel zur Aufnahme der Assayvorrichtung, wobei die Ab lesemittel innerhalb der Aufnahmemittel angeordnet sind. Das Ablesen wird am besten mittels optischer Transmission durch die Assayvorrichtung erreicht, während sie durch die Aufnahmemittel aufgenommen ist. Bevorzugt umfassen die Anzeigemittel eine oder mehrere Lichtquellen, die dem Benutzer ein farbiges Signal liefern, wobei eine Verände rung beim Fertilitätsstatus durch einen Farbwechsel ange zeigt wird. Weitere Einzelheiten werden in der EP 703 454 angegeben.

Dieser Vorgang kann auf der Messung von Nachweissubstanzen im Urin, wie E-3-G, LH und Pregnandiol-3-glucuronid (P-3-G) be ruhen. Diese schließen monovalente Nachweissubstanzen wie Haptene ein.

Die EP 703 454 beschreibt verbesserte Assays mittels derer zwei oder mehrere Nachweissubstanzen gleichzeitig in der gleichen Probe bestimmt werden können. Wenn ein Assay die An wesenheit und/oder die Menge gerade einer Nachweissubstanz in einer Probenflüssigkeit nachweisen soll, ist es verhältnismä ßig einfach, die Assaybedingungen festzulegen, um dieses Er gebnis zu erreichen und die Wirkung anderer Komponenten, die in der Probe vorhanden sein können, zu eliminieren. Wenn es jedoch erwünscht ist, eine einzelne Assayvorrichtung zu ver wenden, um mehr als eine verschiedene Nachweissubstanz in der gleichen Probenflüssigkeit zu bestimmen, ist die Aufgabe des "Ausbalancierens" der Bedingungen, um sicherzustellen, daß die getrennten Assayreaktionen effizient und wirksam ablau fen, sehr viel schwieriger, insbesondere in einem Streifen- Assay.

Der flußfokussierende Docht der vorliegenden Erfindung kann in einem Streifen-Assay für eine monovalente Nachweissubstanz (Hapten) unter Verwendung eines teilchenförmigen Direktmar kierungsstoffs, um das Assayergebnis anzuzeigen, vorteilhaft eingesetzt werden, wobei in dem Assay der teilchenförmige Markierungsstoff einen für die monovalente Nachweissubstanz spezifischen Antikörper trägt und die Nachweiszone des Strei fens immobilisierte Nachweissubstanz oder ein Analogon hier von enthält. Jedes Markierungsstoffteilchen trägt eine Viel zahl von identischen Antikörpermolekülen. Als Reagenz können die antikörpertragenden Teilchen während der Herstellung (d. h. während der Aufbringung von Antikörpern auf die Teil chen) standardisiert werden, um sicherzustellen, daß inner halb einer vorgegebenen Charge die Beladung mit aktivem Anti körper konstant ist. Die Konzentration an Nachweissubstanz oder Nachweissubstanzanalogon in der Nachweiszone sollte im Überschuß zur wirksamen Konzentration (molaren Konzentration) des Antikörpers auf den Teilchen sein. Es ist nicht wesent lich, auf jedem Teilchen eine konstante Antikörperbeladung zu haben, weil die Anzahl der Teilchen variiert werden kann. Die Menge an im Assay verfügbarem teilchenmarkierten Antikörper sollte, bezogen auf die voraussichtliche Nachweissubstanzkon zentration in der Probe, im Überschuß sein. Diese Spiegel können durch Versuche eingestellt werden, so daß die Anwesen heit von freier Nachweissubstanz in der Probenflüssigkeit zu einem beträchtlichen Bindungsniveau der freien Nachweissub stanz an den Antikörpern auf den Teilchen führt und daher die mögliche Bindung des teilchenförmigen Markierungsstoffs an die immobilisierte Nachweissubstanz/das Analogon in der Nach weiszone in beträchtlichem Maße verhindert. Das Prinzip bei dieser Art von Assay ist, daß es auf dem Durchschnittsteil chen eine ausreichende Anzahl aktiver Antikörpermoleküle gibt, um ein Binden des Teilchens in der Nachweiszone sicher zustellen, daß aber trotzdem das Vorhandensein der Nach weissubstanz in der Probe eine begrenzende Wirkung auf diese Bindung besitzt. Die Stärke, mit der die Teilchen in der Nachweiszone gebunden werden, ist daher umgekehrt proportio nal zu der Konzentration an Nachweissubstanz in der Proben flüssigkeit. In einem Streifen-Assay wird der teilchenmar kierte Antikörper stromaufwärts von der Nachweiszone aufge bracht, so daß die aufgebrachte Flüssigkeitsprobe auf das teilchenmarkierte Material trifft und es zur Nachweiszone be fördert. In diesem Assayaufbau ist es notwendig sicherzustel len, daß die mögliche Reaktion zwischen der freien Nach weissubstanz und dem teilchenmarkierten Antikörper im wesent lichen vollständig abläuft, bevor diese Reagenzien die Nach weiszone erreichen. Die Stärke, mit der die Teilchen an die immobilisierte Nachweissubstanz/das Analogon in der Nachweis zone binden, ist daher von den restlichen, nichtkomplexierten Antikörpern, die auf den Teilchen verbleiben, abhängig. Es ist notwendig sicherzustellen, daß die Konzentration an immo bilisierter Nachweissubstanz/Analogon in der Nachweiszone hoch ist, um ein wirksames Abfangen der Teilchen, wenn sie durch diese Zone hindurchtreten, zu fördern. Um die Effizienz der vorangehenden Bindung des teilchenmarkierten Antikörpers an die freie Nachweissubstanz in der Probenflüssigkeit zu er höhen, ist es wünschenswert, daß der Antikörper auf den Par tikeln eine sehr hohe Affinität für die Nachweissubstanz be sitzen sollte. Diese Affinität beträgt bevorzugt mindestens ungefähr 10⁹ und bevorzugter mindestens ungefähr 10¹⁰ l/Mol. Die Verwendung derartiger hochaffiner Antikörper stellt ein effizientes Abfangen freier Nachweissubstanz durch die Teil chen sicher und darüber hinaus, daß unter Assaybedingungen, wenn einmal ein Nachweissubstanzmolekül an einen Antikörper auf dem Teilchen gebunden wurde, es sehr unwahrscheinlich ist, daß es freigesetzt wird oder mit einer immobilisierten Nachweissubstanz/einem Analogmolekül ausgetauscht wird, wenn das Teilchen durch die Nachweiszone hindurchtritt. Diese all gemeinen Prinzipien gelten auch bei einem Assay, bei dem zwei oder mehr Nachweissubstanzen bestimmt werden sollen, von de nen mindestens eine monovalent ist.

Daher ist ein bevorzugter Bereich, in dem die vorliegende Er findung eingesetzt wird, eine Assayvorrichtung zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration von zwei oder mehr Nachweissubstanzen in einer einzelnen Probenflüssigkeit, wie einer Urinprobe, wobei min destens eine der Nachweissubstanzen mit Hilfe einer Sandwich- Bindungsreaktion bestimmbar ist, die zwei für verschiedene Epitope auf der Nachweissubstanz spezifische Bindungsreagen zien einschließt, und mindestens eine andere der Nachweissub stanzen ein Hapten ist (und daher nicht ohne weiteres mittels einer Sandwich-Bindungsreaktion bestimmbar ist), wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) Vorsehen einer Vorrichtung, umfassend einen Streifen po rösen Materials, entlang dem die Probenflüssigkeit wan dern kann, wobei der Streifen zwei oder mehr räumlich ge trennte Nachweiszonen besitzt (mindestens eine pro zu be stimmender Nachweissubstanz), stromabwärts der Proben flüssigkeitszugabestelle auf dem Streifen angeordnet, wo bei von den Zonen:
- i) mindestens eine Zone ein immobilisiertes Einfangagens enthält, das ein spezifisches Bindungsagens für die erste Nachweissubstanz oder ein spezifisches Bin dungsagens, das einen die erste Nachweissubstanz ent haltenden Sandwichkomplex einfangen kann, und
- ii) mindestens eine weitere Zone ein immobilisiertes Ein fangagens enthält, das entweder Hapten oder ein Ana logon hiervon ist;
b) Vorsehen von zwei oder mehr Populationen von Teilchen, die in der Lage sind, mit der Probenflüssigkeit durch den Streifen zu wandern, wobei von den Populationen:
- i) mindestens eine Population ein Bindungsagens trägt, das für die erste Nachweissubstanz spezifisch ist oder für ein anderes spezifisches Bindungsagens spe zifisch ist, das an einer Sandwichreaktion mit der ersten Nachweissubstanz teilnehmen kann, und
- ii) mindestens eine andere Population ein für das Hapten spezifisches Bindungsagens trägt; und
c) Sorge zu tragen, daß die Populationen von Teilchen in der Probenflüssigkeit suspendiert werden und mit der Proben flüssigkeit durch den Streifen wandern, wobei die Anwe senheit der ersten Nachweissubstanz in der Probenflüssig keit dazu führt, daß Teilchen in der mindestens einen Nachweiszone in einer zu der Konzentration der ersten Nachweissubstanz in der Probenflüssigkeit direkt propor tionalen Menge gebunden werden, und wobei die Anwesenheit des Haptens in der Probenflüssigkeit zu einer Verringe rung der Bindung von Teilchen der mindestens einen ande ren Population in der anderen Nachweiszone in einer zu der Konzentration des Haptens in der Probenflüssigkeit direkt proportionalen Menge führt, wobei die das immobi lisierte Hapten oder immobilisierte Haptenanalogon ent haltende Nachweiszone bevorzugt stromabwärts von der zur ersten Nachweissubstanz gehörenden Nachweiszone liegt.

Ein Beispiel für die erste Nachweissubstanz ist das Luteini sierungshormon (LH). Ein Beispiel für die zweite Nachweissub stanz ist Östradiol oder ein Metabolit hiervon, wie Östron-3- glucuronid (E-3-G).

Bevorzugte Teilchen sind Latexteilchen, die gefärbt sein kön nen.

Ganz besonders bevorzugt ist die Affinität des antihaptenspe zifischen Bindungsagens mindestens ungefähr 10⁹, bevorzugt ungefähr 10¹⁰ l/Mol.

Bevorzugt wird die Stärke der Teilchenbindung in jeder der Nachweiszonen durch Messung der Extinktion elektromagneti scher Strahlung, wie Licht, wenn sie durch die Streifendicke hindurchtritt, bestimmt.

Der den Flüssigkeitsfluß fokussierende Docht der vorliegenden Erfindung wird in einer Assayvorrichtung zur Verwendung bei der Bestimmung von zwei oder mehr Nachweissubstanzen in einer einzelnen Probenflüssigkeit nützlicherweise angewendet, wobei mindestens eine der Nachweissubstanzen mit Hilfe einer Sand wich-Bindungsreaktion bestimmbar ist, die zwei für verschie dene Epitope auf der Nachweissubstanz spezifische Bindungs reagenzien einschließt, und mindestens eine andere der Nach weissubstanzen ein Hapten ist (und daher nicht ohne weiteres mit Hilfe einer Sandwich-Bindungsreaktion bestimmbar ist), wobei die Vorrichtung, die bevorzugt innerhalb eines schüt zenden Gehäuses ist, umfaßt:

a) einen Streifen porösen Materials, entlang dem eine Pro benflüssigkeit wandern kann;
b) zwei oder mehr Nachweiszonen (mindestens eine pro zu be stimmender Nachweissubstanz) auf dem Streifen, stromab wärts von der Probenflüssigkeitszugabestelle des Strei fens angeordnet, wobei von den Zonen:
- i) mindestens eine Zone ein immobilisiertes Einfangagens enthält, das ein spezifisches Bindungsagens für die erste Nachweissubstanz ist oder ein spezifisches Bin dungsagens, das einen die erste Nachweissubstanz ent haltenden Sandwichkomplex einfangen kann, und
- ii) mindestens eine andere Zone ein immobilisiertes Ein fangagens enthält, das entweder das Hapten oder ein Analogon hiervon ist;
c) zwei oder mehr Teilchenpopulationen, stromabwärts von den Nachweiszonen angeordnet, die in der Lage sind, mit der Probenflüssigkeit durch den Streifen zu wandern, wobei von den Populationen:
- i) mindestens eine Population ein Bindungsagens trägt, das für die erste Nachweissubstanz oder für ein wei teres spezifisches, ebenfalls in der Vorrichtung vor handenes Bindungsagens, das an einer Sandwichreaktion mit der ersten Nachweissubstanz teilnehmen kann, spe zifisch ist, und
- ii) mindestens eine weitere Population ein für das Hapten spezifisches Bindungsagens trägt;
wobei die Anwesenheit der ersten Nachweissubstanz in der Probenflüssigkeit dazu führt, daß Teilchen in der minde stens einen Nachweiszone in einer zu der Konzentration der ersten Nachweissubstanz in der Probenflüssigkeit di rekt proportionalen Menge gebunden werden, und die Anwe senheit des Haptens in der Probenflüssigkeit zu einer Verringerung der Bindung von Teilchen der mindestens ei nen weiteren Population in der anderen Nachweiszone in einer zu der Konzentration des Haptens in der Probenflüs sigkeit direkt proportionalen Menge führt, wobei die das immobilisierte Hapten oder immobilisierte Haptenanalogon enthaltende Nachweiszone bevorzugt stromabwärts von der zur ersten Nachweissubstanz gehörenden Nachweiszone liegt.

Das Streifenmaterial ist bevorzugt zumindest durch seine Dic ke hindurch durchsichtig. Ein ideales Streifenmaterial ist Nitrocellulose.

Weil der Assay für das Hapten keine kompetitive Reaktion ist, in der es die Möglichkeit eines freien Austauschs zwischen Nachweissubstanz in der Probe und als Reagenz im Assay vorge sehener Nachweissubstanz (in diesem Fall auf dem Streifen im mobilisierte Nachweissubstanz/Analogon) gibt, ist es in die sem spezifischen Kontext wesentlich, daß während des Ablaufs des Assays ausreichend Gelegenheit für die Nachweissubstanz in der Probe vorhanden ist, an die antikörpertragenden Teil chen gebunden zu werden, bevor diese Teilchen auf die jewei lige Nachweiszone auf dem Streifen treffen. Um dies sicherzu stellen, ist es erwünscht, daß es eine vergleichsweise lange Kontakt zeit zwischen dem teilchenförmigen Reagenz und der Probe gibt. Innerhalb der akzeptablen physischen Abmessungs grenzen der Assayvorrichtung sollte demgemäß die die immobi lisierte Nachweissubstanz/das Analogon enthaltende Nachweis zone soweit wie möglich stromabwärts von der Quelle des teil chenmarkierten Reagenz sein. Insbesondere wenn die Assayvor richtung zwei oder mehr Nachweissubstanzen in derselben Pro benflüssigkeit bestimmen soll und mindestens eine der weite ren Nachweissubstanzen mit Hilfe einer Sandwichreaktion be stimmt wird, sollte die Nachweiszone für das Hapten im Ideal fall stromabwärts von der oder den in den Sandwichassays vor handenen Nachweiszone oder Nachweiszonen sein.

Ein besonderer Bereich der Erfindung ist daher ein Streifen assay für zwei Nachweissubstanzen zur Bestimmung von LH und E-3-G in einer aufgebrachten Urinprobe, in der die beiden As sayergebnisse in räumlich getrennten Nachweiszonen auf dem Streifen nachgewiesen werden, wobei die E-3-G-Zone stromab wärts von der LH-Nachweiszone, bezogen auf die Probenflüssig keitsapplikationsstelle, liegt und die Probe durch einen flußfokussierenden Docht aufgenommen wird.

In einer Ausführungsform wird die Erfindung in einem quanti tativen Streifenassay verwendet, in dem das Assayergebnis in einer Nachweiszone durch Binden eines markierten Reagenz, das multiple aktive Bindungsstellen besitzt, die für die geteste te Nachweissubstanz spezifisch sind, gezeigt wird. Der Mar kierungsstoff ist ein nachweisbares Mikroteilchen, wie ein (gefärbtes) Latexteilchen, ein Metallsol (z. B. Gold), ein Farbsol oder ein nichtmetallisches Elementteilchen (z. B. Koh lenstoff, Selen) in einer Größe, die ausreichend klein ist, um die Wanderung durch das poröse Streifenmaterial zu ermög lichen, aber ausreichend groß ist, um die Bildung eines nach weisbaren Endergebnisses zu ermöglichen, wenn das markierte Material in der Nachweiszone konzentriert wird. Teilchenför mige Markierungsstoffe der bereits in Streifensandwichassays verwendeten Art sind am besten. In einem typischen Assay wer den die multiplen aktiven spezifischen Bindungsstellen in dem markierten Reagenz durch eine Vielzahl identischer Antikör per, bevorzugt monospezifischer (z. B. monoklonaler) Antikör per, vorgesehen, die jedem Markierungsstoffteilchen anhaften.

Nach der EP 703 454 führt insbesondere in einem Haptenassay die Verwendung von multiple identische aktive nachweissub stanzspezifische Bindungsstellen besitzenden teilchenförmigen Markierungsstoffen zu einer wertvollen Zunahme der Empfind lichkeit. Die überschüssigen Bindungsstellen auf dem Markie rungsstoffteilchen ermöglichen die effektive Bindung des Teilchens in der Hapten tragenden Nachweiszone. Jedoch, viel leicht aufgrund der Geometrie des Systems, das man sich als eine planare Nachweiszonenoberfläche mit einem mehr oder we niger sphärischen Markierungsstoffteilchen vorstellen kann, verursacht die vorherige Bindung auch nur einer verhältnismä ßig kleinen Menge Haptennachweissubstanz aus einer Probe an die gekrümmte Oberfläche des Markierungsstoffteilchens einen Inhibierungsgrad für die Bindung des Markierungsstoffteil chens in der Nachweiszone, der ausreicht, um die Bindung zu beeinflussen und einen nachweisbaren Effekt zu bewirken.

Es ist ausgesprochen wünschenswert, daß, wenn einmal ein Nachweissubstanzmolekül spezifisch an das Markierungsstoff teilchen gebunden wurde, es für den verbliebenen Teil des As sayprotokolls derart gebunden bleiben soll, was zur Bildung des nachweisbaren Assayergebnisses in der Nachweiszone führt. Ein Weg, um dies zu erreichen, ist die Verwendung eines spe zifischen Bindungsagens im markierten Reagenz, das eine sehr hohe Affinität für die Nachweissubstanz besitzt. Es ist jetzt üblich, monoklonale Antikörper mit Nachweissubstanz- Affinitäten von 10⁸ zu verwenden. Wir haben als vorteilhaft gefunden, in Zusammenhang mit einem Streifenhaptenassay mar kierte spezifische Bindungsagensien mit Nachweissubstanz- Affinitäten von mindestens ungefähr 10⁹ und bevorzugter von mindestens ungefähr 10¹⁰ l/Mol einzusetzen. Ein gutes Verfah ren zur Affinitätsmessung in Lösung wird in Friquet et al., J. Immunol. Methods, 77 (1985) S. 305-319 beschrieben. Mono klonale Antikörper mit derart hohen Affinitäten können in der herkömmlichen Art und Weise gezüchtet und durch normale Se lektionsverfahren identifiziert werden. Obwohl es wünschens wert ist, Antikörper, die hohe Affinität in Lösung zeigen, einzusetzen, ist dies nicht der einzige Weg, um dies zu er reichen. Es wird gelegentlich beobachtet, daß ein Antikörper, der vergleichsweise niedrige Affinität in Lösung zeigt in seinen Wirkungseigenschaften transformiert werden kann, wenn er auf einer festen Phase immobilisiert wird.

Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein quantita tiver Streifen-Assay für Nachweissubstanzen in menschlichen Körperflüssigkeiten, insbesondere Haptenen, unter Verwendung eines fokussierten Flüssigkeitsflusses, wie hier beschrieben. Ein besonderes Beispiel ist ein derartiger Assay für Östra diol oder einen Metaboliten hiervon wie Östron-3-glucuronid (E-3-G). Eine besonders wichtige Ausführungsform der Erfin dung ist ein Streifen-Assay für Urin-E-3-G, der in der Lage ist, E-3-G über einen Konzentrationsbereich von 5-60 ng/ml Urin quantitativ zu bestimmen. Ein derartiger Assay ist zur Verwendung in einem Verfahren, das einem Benutzer Kenntnis über den Fertilitätsstatus eines Ovulationszyklus verschaffen soll, besonders gut geeignet, wobei die Körperflüssigkeits konzentration von Östradiol oder einem Metaboliten hiervon als ein nützlicher Indikator eines solchen Status angesehen wird.

Wenn erwünscht, kann eine erfindungsgemäße Assayvorrichtung, wie oben dargestellt, zusätzlich in der Lage sein, andere Nachweissubstanzen in der gleichen Probe zu bestimmen, wenn möglich, durch Anwendung konventioneller Sandwichassaytechno logie. Zum Beispiel ist eine Ausführungsform der Erfindung eine Streifen-Assayvorrichtung, die eine quantitative Bestim mung von Urin-E-3-G, wie oben dargestellt, vorsieht und gleichzeitig eine quantitative Bestimmung von Luteinisie rungshormon (LH) in Urin mit Hilfe eines Sandwichassayverfah rens, wobei die E-3-G- und LH-Ergebnisse in zwei getrennten Nachweiszonen angezeigt werden. Geeigneterweise kann in einem derartigen kombinierten Assay der Markierungsstoff der glei che für jeden Assay sein, obwohl der fachkundige Leser natür lich erkennen wird, daß normalerweise zwei Populationen von Markierungsstoffteilchen erforderlich sein würden, wobei eine multiple Bindungsstellen für das E-3-G und die andere ein spezifisches Bindungsmaterial für das LH trägt. Die E-3-G- Nachweiszone enthält immobilisiertes E-3-G oder ein Analogon hiervon und die LH-Nachweiszone enthält immobilisiertes spe zifisches Bindungsmaterial, wie einen Anti-LH-Antikörper.

Die Erfindung wird nun im einzelnen, nur beispielhaft, mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, die nicht maßstabsgetreu sind.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Gesamtansicht der Außenseite einer Assayvor richtung.

Fig. 2 ist eine Draufsicht auf die Vorrichtung von Fig. 1, wobei ein Teil des Vorrichtungsgehäuses entfernt wurde.

Fig. 3 veranschaulicht, wie ein erfindungsgemäßer Vorrich tungsdocht aus einer großen Lage porösen Materials herausge schnitten werden kann.

Fig. 4 veranschaulicht einen alternativen Aufbau zu dem in Fig. 3 gezeigten.

Die Fig. 5 und 6 zeigen jeweils einzelne Dochte, die wie in den Fig. 3 und 4 dargestellt gebildet sind.

Die Fig. 7 und 8 entsprechen den Fig. 1 und 2 und zei gen einen alternativen Aufbau einer erfindungsgemäßen As sayvorrichtung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß Fig. 1 hat die Assayvorrichtung ein herkömmliches äu ßeres Erscheinungsbild und umfaßt ein aus einem oberen und einem unteren Formteil 101 und 102 gebildetes hohles Gehäuse 100. Das Gehäuse 100 besitzt im allgemeinen eine längliche rechteckige Form und hat an einem Ende 103 einen verlängerten Abschnitt 104 von vermindertem Querschnitt, auf den eine ent fernbare Kappe (nicht gezeigt), wenn gewünscht, aufgesetzt werden kann. In einer typischen Assayvorrichtung würde die Kappe an der Schulter 105 anliegen und, wenn sie aufgesetzt ist, für eine glatte, kontinuierliche Außenseite der gesamten Vorrichtung sorgen. Vom vorderen Ende 106 des verlängerten Abschnitts 104 des Gehäuses erstreckt sich ein poröses Pro benaufnahmeelement oder ein Docht 107, der dazu dient, die Probenflüssigkeit aufzunehmen und dann die aufgenommene Flüs sigkeit durch Kapillarwirkung in das Innere des Gehäuses 100 als Teil des geplanten Flüssigkeitsfließwegs zu befördern. Wie in Fig. 1 zu sehen, enthält das obere Formteil 101 des Gehäuses in seiner oberen Fläche 109 eine Öffnung 108, durch die das Innere des Gehäuses gesehen werden kann. Die Öffnung 108 ermöglicht es einem Benutzer, das Assayergebnis zu sehen, das als ein sichtbarer Farbwechsel oder ein ähnlicher Effekt, der durch die Öffnung beobachtet werden kann, angezeigt wird. Alternativ kann das Assayergebnis mit Hilfe eines äußeren Ab lesegeräts (nicht gezeigt), wie durch das optische Re flexionsvermögen oder die optische Transmission durch die As sayvorrichtung, abgelesen werden. Im letzteren Fall ist es notwendig, daß die Unterseite der Assayvorrichtung ebenfalls eine Öffnung oder ähnliche Mittel, durch die Licht hindurch treten kann, besitzt.

Keines der in Fig. 1 gezeigten Details ist für die Erfindung kritisch, und beträchtliche Abweichungen in der Form und dem äußeren Aufbau der Assayvorrichtung können vorgenommen wer den.

Gemäß Fig. 2 wurde das obere Formteil entfernt, um das Inne re der Assayvorrichtung zu zeigen. Die wesentlichen inneren Komponenten umfassen den Abschnitt 200 des Probenaufnahmeele ments 107, das sich innerhalb des Gehäuses erstreckt, und ei nen weiteren Streifen 201 aus porösem Material, der sich mit dem Probenaufnahmeelement 107 in Kontakt befindet und eine Nachweiszone 202 umfaßt. Der Ort der Nachweiszone 202 befin det sich unter der Öffnung im oberen Gehäuseformteil. Der Standort der Öffnung ist durch gestrichelte Linien 203 ange geben.

Der geplante Flüssigkeitsfließweg befindet sich entlang dem Probenaufnehmer 107 und von da entlang der Länge des porösen Streifens 201 durch die Nachweiszone 202 hindurch und über sie hinaus. Innerhalb des Probenaufnahmeelements 107, bei ei ner innerhalb des Gehäuses versteckten Stelle 204, ist ein Vorrat mobilisierbares markiertes Reagenz aufgetragen, das im feuchten Zustand innerhalb des Probenaufnehmers und des porö sen Streifens beweglich ist. Die sich fortbewegende Proben flüssigkeit kann dieses mobilisierbare Reagenz aufnehmen und in Richtung der Nachweiszone tragen, in der das markierte Reagenz akkumulieren und ein auf das Testergebnis hinweisen des Assaysignal erzeugen kann. Zum Beispiel kann das mobili sierbare Reagenz ein spezifisches Bindungsreagenz sein, wie ein mit einem sichtbaren Markierungsstoff, wie einem teil chenförmigen Direktmarkierungsstoff, markierter Antikörper. Beispiele sind Goldsole und gefärbte Latexteilchen. Die Akku mulation des sichtbaren Markierungsstoffs in der Nachweiszone 202, zum Beispiel durch die Bildung eines Sandwichkomplexes mit einer Nachweissubstanz und einem weiteren, bereits in der Nachweiszone immobilisierten spezifischen Bindungsagens, führt in einem positiven Test zur Ausbildung von Farbe in der Nachweiszone.

An der Grenzfläche 205 zwischen Probenaufnahmeelement 107 und dem porösen Streifen 201 sind die lateralen Dimensionen des Probenaufnehmers verringert, so daß die Breite des Probenauf nehmers an diesem Punkt in Richtung der Mittellinie verengt ist. Dies fokussiert den Fluß der sich fortbewegenden Flüs sigkeit auf die Mittellinie des porösen Streifens und hindert dadurch die sich fortbewegende Flüssigkeit daran, einen al ternativen Flüssigkeitsfließweg an der Grenzfläche zwischen dem Probenaufnahmeelement und dem porösen Streifen zu finden. Die Wahrscheinlichkeit, daß die sich fortbewegende Flüssig keit innerhalb des Gehäuses anderswohin fließt, ist dadurch vermindert.

Wie in Fig. 2 dargestellt, hat der Probenaufnehmer 107 im allgemeinen eine rechteckige, längliche abgeflachte Form. An seinem inneren (rechten) Ende 206 wurde jede Ecke entfernt, als das Aufnahmeelement während der Herstellung in Form ge schnitten oder gestanzt wurde. Wie gezeigt, wurde jede Ecke entfernt, um eine nach innen geschwungene Kante 207 zurückzu lassen, die von der Seite 208 des Probenaufnehmers in Rich tung des rechten äußeren Endes verläuft. Diese gekrümmten Kanten treffen sich nicht, sondern hinterlassen einen hervor tretenden Abschnitt 209 des Probenaufnehmers als eine auf der Mittellinie oder der longitudinalen Achse angeordnete stumpfe Spitze.

Die Grenzfläche zwischen dem Probenaufnahmeelement 107 und dem stromabwärts liegenden porösen Streifen 201 wird durch ein Überlappen zwischen der hervortretenden stumpfen Spitze 209 und dem stromaufwärts liegenden Ende 210 des porösen Streifens erzeugt. Die sich entlang dem Probenaufnehmer fort bewegende Probenflüssigkeit wird daher auf diese stumpfe Spitze hin fokussiert, bevor sie die Grenzfläche mit dem po rösen Streifen erreicht, und fließt dadurch vom Probenaufneh mer in den porösen Streifen. Wenn die Probenflüssigkeit erst einmal auf den porösen Streifen übergetreten ist, kann sie dort sowohl longitudinal als auch lateral frei fließen, so daß von der Grenzfläche an aufwärts die gesamte Breite des porösen Streifens feucht werden kann. Die Dimensionen des po rösen Streifens können ohne weiteres derart ausgewählt wer den, daß, wenn die sich fortbewegende Flüssigkeit die Nach weiszone im porösen Streifen erreicht, sie im wesentlichen einheitlich über die gesamte Breite des Streifens fließt.

Das Probenaufnahmeelement 107 und der poröse Streifen 201 können innerhalb des Gehäuses durch eine Anzahl von Mechanis men an Ort und Stelle gehalten werden. Wenn gewünscht, können das Probenaufnahmeelement und der poröse Streifen miteinander verbunden werden, zum Beispiel indem sie auf einen gemeinsa men Verstärkungsstreifen (nicht gezeigt) vor Aufnahme in das Gehäuse laminiert werden. In alternativer Weise oder zusätz lich können das Probeaufnahmeelement und der poröse Streifen innerhalb des Gehäuses durch physisches Einzwängen mittels Teilen des Gehäuseformteils, die mit dem Aufnahmeelement und dem Streifen in Eingriff stehen, an Ort und Stelle gehalten werden. Eine Möglichkeit in Fig. 2 ist nur anhand eines Bei spiels angegeben, wobei das Probenaufnahmeelement 107 mit ei nem Loch 211 perforiert ist, durch das ein einen Stift 212 bildender Teil des unteren Vorrichtungsformteils herausragt, wenn das Aufnahmeelement während des Zusammenbaus der Vor richtung im Gehäuse angebracht wird. In ähnlicher Weise be sitzt der poröse Streifen 201 ebenfalls eine Perforation 213, durch die ein anderer Stift 214 herausragt. Zusätzlich zum Bereitstellen positiver Befestigungsstellen für diese Kompo nenten innerhalb des Vorrichtungsgehäuses können derartige Perforationen auch den Zusammenbau der Streifenkomponenten (insbesondere die genaue Aufbringung der Reagenzien) erleich tern, wie es in der WO 95/13542 beschrieben ist. Andere in terne Charakteristika des Gehäuseformteils, wie Zapfen oder Rippen, können ebenfalls vorhanden sein, um zusätzliche oder alternative Befestigungsmittel zum Halten der Streifenkompo nenten an Ort und Stelle vorzusehen. In Fig. 2 übernehmen Zapfen 215 und 216 diese Funktion.

Zur Veranschaulichung wurde die Assayvorrichtung, wie sie in den Fig. 1 und 2 gezeigt ist, mit sehr einfachem Aufbau dargestellt, mit nur zwei physischen Komponenten, die den As saystreifen aufbauen, (dem Probenaufnehmer 107 und dem strom abwärts liegenden porösen Streifen 201) und nur einer Nach weiszone 202. Es ist bereits übliche Praxis im Stand der Technik, für Assayvorrichtungen dieses allgemeinen Typs einen viel komplexeren Aufbau zu verwenden. Zum Beispiel ist es üb liche Praxis, daß der Assaystreifen eine Kontrollzone ent hält, die in der Regel stromabwärts von der Nachweiszone an geordnet ist und in der während des Gebrauchs ein Signal an gezeigt wird, um dem Benutzer zu versichern, daß der Test richtig funktioniert hat. Es kann mehr als eine Nachweiszone auf dem Teststreifen geben, entweder um für eine einzelne Nachweissubstanz ein quantitatives Ergebnis zu liefern, oder um gleichzeitig für mehr als eine Nachweissubstanz, die in der Probenflüssigkeit vorhanden sein kann, Ergebnisse zur Verfügung zu stellen. Mehr als ein mobiles Reagenz kann vor gesehen werden, z. B. um spezifische Ergebnisse für verschie dene Nachweissubstanzen zu liefern oder verschiedene Test- und Kontrollsignale zur Verfügung zu stellen. Wenn mehr als ein mobiles Reagenz vorgesehen ist, können diese von einem gemeinsamen Punkt aus starten an verschiedenen Punkten inner halb des Flüssigkeitsfließwegs aufgetragen werden. Es ist für das mobilisierbare Reagenz (oder die Reagenzien) nicht nötig, daß es (sie) auf dem Probenaufnahmeelement aufgetragen wird (werden). Statt dessen können derartige Reagenzien auf dem po rösen Streifen selbst, stromaufwärts von der (den) Nachweis zone(n) angeordnet sein. Eine weitere Alternative ist es, ein oder mehr mobilisierbare Reagenzien in einer weiteren porösen Komponente, die als Zwischenkomponente zwischen dem Proben aufnahmeelement und dem die Nachweiszone(n) enthaltenden Streifen angeordnet ist, aufzubringen. Bei all diesen Mög lichkeiten können die Vorzüge der vorliegenden Erfindung ver wirklicht werden, wenn ein Mittel zur Fokussierung des Flus ses, wie beschrieben, dort vorgesehen ist, wo die sich fort bewegende Flüssigkeit die Grenzfläche von einer porösen Kom ponente zur nächsten überqueren muß.

Gemäß Fig. 3 wird eine Lage oder längliches Material 300 in einzelne Probenaufnahmeelemente (Dochte) 301 geschnitten. Während des Schneidens wird ein Ende 302 des Probenaufnahmee lements 301, das im Vorrichtungsgehäuse nach Zusammenbau das Ende sein soll, derart geformt, daß es die erfindungsgemäßen Mittel 303 zur Fokussierung des Flüssigkeitsflusses liefert. In Fig. 3 wird der Abschnitt 303 zur Fokussierung des Flüs sigkeitsflusses des Probenaufnahmeelements durch zwei entge gengesetzte nach innen gekrümmte Schnitte erzeugt, die die Ecken des Probenaufnehmers entfernen. Jeder Docht wird durch ein Loch 304 perforiert, um Befestigungsmittel während des Zusammenbaus der schließlichen Assayvorrichtung zur Verfügung zu stellen.

In Fig. 4 werden geradlinige Schnitte verwendet, um den Pro benaufnehmer 400 mit einem stumpfen, zugespitzten Ende 401 vorzusehen.

Fig. 5 zeigt einen einzelnen erfindungsgemäßen Docht 500, wie er in der in Fig. 2 zu sehenden Vorrichtung verwendet wird. Der Docht ist von im wesentlichen länglicher rechtecki ger Form mit parallelen Seiten 501. Das Ende 502, das das stromabwärts liegende Ende sein soll, wenn der Docht als Teil einer Assayvorrichtung verwendet wird, besitzt jedoch eine deutlich sich zunehmend verengende laterale Ausdehnung, um die für die Erfindung kritischen Charakteristika der Flußfo kussierung zu liefern. Die resultierende stumpfe Spitze oder der Bug des Dochts ist auf der mittleren longitudinalen Achse 503 des Rechtecks zentriert. Die Seiten 504 dieser Spitze oder dieses Bugs sind konkave Kurven. Die Breite A des äuße ren Endes der Spitze oder des Bugs sollte nicht größer als ungefähr 50% der Breite B des Hauptteils des Dochts sein. Be vorzugt ist die Länge A nicht größer als ungefähr 40% der Lange B. Die Länge C, die den Längenabschnitt des Dochts dar stellt, in dem die Breite deutlich verengt ist, um die Fluß fokussierungseigenschaften vorzusehen, sollte nicht größer als ungefähr 35%, bevorzugt nicht größer als ungefähr 25% der Gesamtlänge des Dochts D sein. Im idealen Fall ist sie nicht größer als ungefähr 20% von D. In einem typischen erfindungs gemäßen Docht liegt die Länge D im Bereich von ungefähr 2 bis 10 cm, gebräuchlicher von ungefähr 3 bis ungefähr 7 cm, z. B. ungefähr 5 cm. Seine Breite B übersteigt in der Regel unge fähr 1 cm nicht, und ist typischerweise von ungefähr 5 bis ungefähr 7 mm.

In Fig. 6 ist eine ähnliche Ansicht eines Dochts 600 mit ei ner Spitze oder einem Bug 601 zu sehen mit geraden, nach in nen gerichteten Seiten 602, wie allgemein in Fig. 4 darge stellt. Die relativen Längen A, B, C und D in dem in Fig. 6 dargestellten Docht sollten nach den gerade bei Fig. 5 be schriebenen Grundsätzen bestimmt werden.

Wenn gewünscht, kann die Spitze oder der Bug des Dochts in einer echten, d. h. scharfen Spitze enden, aber eine stumpfe Spitze, wie hier beschrieben und veranschaulicht, ist bevor zugt.

Die Fig. 7 und 8 zeigen einen alternativen Aufbau einer erfindungsgemäßen Assayvorrichtung mit ähnlichem Grundkon zept, zu dem bereits oben anhand der Fig. 1 und 2 be schriebenen.

Fig. 7 zeigt eine Gesamtansicht der Außenseite der Vorrich tung. Sie umfaßt ein längliches hohles Gehäuse 700 mit einem vergleichsweise breiten Mittelabschnitt 701 mit verengten Ab schnitten 702, 703, die sich an jedem Ende erstrecken. Das Gehäuse ist aus einem oberen Formteil 704 und einem unteren Formteil 705, typischerweise aus Kunststoffmaterial, gebil det. Der sich nach vorne erstreckende Abschnitt 702 besitzt ein abgerundetes Ende 706, das eine "Mündung" 707 aufweist, aus der ein poröses Probenaufnahmeelement (Docht) 708 heraus ragt. Der rückwärtige Abschnitt 703 des Gehäuses umfaßt an seiner oberen Fläche eine rechteckige Öffnung 709, die das Innere der Vorrichtung zeigt. An der Unterseite des Vorrich tungsgehäuses kann sich eine entsprechende Öffnung (nicht ge zeigt) befinden, wenn erwünscht ist, daß das Testergebnis durch Transmission durch die Vorrichtung abgelesen wird. Das hintere Ende 710 des Gehäuses endet in einer quadratischen Form mit einer abgeschrägten Ecke 711. Gegebenenfalls kann die Vorrichtung mit einer Zweifachkappe (nicht gezeigt), wie in der WO 95/13541 beschrieben, versehen werden.

Fig. 8 zeigt die Vorrichtung von Fig. 7, wobei das obere Gehäuseformteil entfernt wurde, um die inneren Komponenten zu zeigen. [In dieser Ansicht ist die Vorrichtung in den beilie gend eingereichten informellen Zeichnungen gedreht darge stellt].

Das Probenaufnahmeelement (Docht) 708 erstreckt sich in das Gehäuse 705 bis über das hintere Ende 800 des erweiterten Ge häuseabschnitts 701 hinaus. Das hintere Ende 801 des Dochts 708 ist deutlich verengt, um eine Spitze oder einen Bug 802 für einen fokussierten Flüssigkeitsfluß, wie hier bereits be schrieben, vorzusehen. Stromabwärts vom Docht befindet sich ein zweiter poröser Körper 803, der einen rechteckigen Strei fen Trägermaterials, wie Nitrocellulose, umfaßt. Der Bug 802 des Dochts überlappt mit dem vorderen Ende 804 des Trägers 803, um über Flüssigkeitsfluß Kontakt zwischen diesen zwei Komponenten herzustellen. Der Trägerstreifen 803 wird mittels einer Perforation 805, die mit einem im Gehäuse eingeformten Stift 806 zusammenwirkt, an Ort und Stelle gehalten, und das wird durch andere physische Merkmale des Gehäuseformteils, dargestellt durch zwei Zapfen 807 und 808, die mit den Seiten 809, 810 des Trägerstreifens zusammenwirken, ergänzt. Die An ordnung des Dochts wird durch eine Perforation 811 und einen entsprechenden Formstift 812 bestimmt. In Richtung des strom abwärts liegenden Endes 801 des Dochts, aber oberhalb des deutlich verengten Abschnitts 802, befindet sich ein aufge tragenes Band 813 an mobilisierbarem Reagenz, das, wenn die Vorrichtung verwendet wird, durch eine fließende Probenflüs sigkeit vom Docht in das Trägermaterial befördert werden kann. Die Anordnungen der beiden Reaktionszonen 814 und 815 werden auf dem Träger durch gestrichelte Linien dargestellt. Diese können eine Testzone und (stromabwärts) eine Kontroll zone sein. In alternativer Weise können sie einzelne Zonen zum Nachweis von zwei verschiedenen Nachweissubstanzen in ei ner gemeinsamen Probe sein. Im letzteren Fall kann das mobi lisierbare Reagenz zwei verschiedene Spezies aufweisen, die getrennt mit der Probe wechselwirken, um in den beiden Zonen Signale zu liefern. Auch noch mehr Zonen und Reagenzien kön nen in der Vorrichtung, wenn gewünscht, verwendet werden.

Wenn getrennte mobilisierbare Reagenzien enthalten sind, müs sen diese nicht notwendigerweise an derselben Stelle aufge tragen werden. Die Reaktionszonen 814 und 815 liegen unter halb der Gehäuseöffnung, wobei dessen Lage durch gestrichelte Linien 816 angegeben ist.

Bei Gebrauch fokussiert der vorhandene Bug am hinteren Ende des Dochts den Flüssigkeitsfluß in Richtung der Mittellinie des Trägermaterials und reduziert die Wahrscheinlichkeit, daß die sich fortbewegende Flüssigkeit an der Grenzfläche zwi schen den zwei porösen Körpern von dem geplanten Fließweg ab weicht.

Die in den Fig. 7 und 8 dargestellte Ausführungsform ist eine ideale Testvorrichtung zur Verwendung bei der Messung der Konzentration von für den Status des humanen Ovulations zyklus relevanten Hormonen im Urin. Der Docht wird bevorzugt aus einem Faservlies, wie hier beschrieben, gebildet. Das mo bilisierbare Reagenz umfaßt bevorzugt zwei Populationen teil chenförmiger Markierungsstoffe, wie Latexteilchen, die je weils einen Anti-LH-Antikörper und einen Anti-E-3-G-Anti körper tragen. Eine der Reaktionszonen (bevorzugt die Zone stromaufwärts) enthält ein immobilisiertes spezifisches Bin dungsreagenz, das dazu führen kann, daß der markierte Anti- LH-Antikörper bei Anwesenheit einer LH-Nachweissubstanz ein gefangen wird. Die andere Reaktionszone enthält bevorzugt ein immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz, das zu einer kompetitiven Reaktion führen kann, wenn E-3-G in der aufge brachten Probe vorhanden ist. In der bevorzugten Ausführungs form erzeugt die stromaufwärts liegende Nachweiszone ein nachweisbares Signal, das direkt proportional zur Konzentra tion von LH in der aufgebrachten Probe ist. Die stromabwärts liegende Zone erzeugt ein nachweisbares Signal, das umgekehrt proportional zur Konzentration von E-3-G ist. Die Intensität der in diesen Zonen erzeugten Signale kann optisch abgelesen werden, bevorzugt mittels Transmission durch die Vorrichtung. Die Signale können mit Hilfe eines elektronischen Monitors interpretiert werden. Die Eigenschaften zur Flußfokussierung des geformten Dochts der Erfindung tragen zur Empfindlichkeit des Assays bei und damit zur Genauigkeit der hiervon ableit baren Information.

Durch Vorsehen des porösen Körpers, z. B. des Probenaufnahmee lements, mit einem deutlich verengten äußeren Ende an der Grenzfläche zum porösen stromabwärts liegenden Körper liefert die Erfindung den Vorteil, den Flüssigkeitsfluß zu fokussie ren, ohne irgendeinen anderen Vorzug der porösen Komponente zu verringern. Zum Beispiel im Falle des Probenaufnahmeele ments ist es wünschenswert, daß dieses Element maximale Flüs sigkeitsabsorptionskapazität besitzt, um ein ausreichendes Reservoir an Probenflüssigkeit zu liefern, damit die Assay vorrichtung arbeitet. Es wäre daher außerordentlich uner wünscht, ein Probenaufnahmeelement mit wesentlich geringerer Breite über seine gesamte Länge zu haben. Obwohl das Proben aufnahmeelement mit verengter Breite gegenüber seinem strom abwärts liegenden Partner einige Vorteile hinsichtlich der Fokussierung der Flüssigkeit an der Grenzfläche besäße, wäre die notwendige zusätzliche Länge des verengten Probenaufnah meteils, um vergleichbare Flüssigkeitsaufnahmekapazität vor zusehen, unerwünscht. Dies würde die Gesamtdimensionen der Assayvorrichtung vergrößern und würde sie weniger leicht brauchbar und herstellbar machen. Es gibt einen Bedarf im Stand der Technik, Tests dieser Art mit einem minimalen Zeit aufwand durchzuführen, und dieses Ziel ist mit zunehmender Gesamtlänge des Flüssigkeitsfließwegs nicht vereinbar.

Ein weiterer Vorteil des den Flüssigkeitsfluß fokussierenden Dochts der Erfindung ist, daß dessen Verwendung in einer As sayvorrichtung zu erhöhter Assayempfindlichkeit führen kann.

Noch ein weiterer Vorteil des speziell geformten Dochts ist, daß viel größere Herstellungstoleranzen während des Zusammen baus einer Assayvorrichtung vorhanden sein können. Wenn der Docht während des Zusammenbaus einer ein Gehäuse und eine Reihe poröser Komponenten umfassenden Vorrichtung nicht rich tig ausgerichtet wird, kann unnötiger Kontakt zwischen dem Dicht und dem Inneren des Gehäuses hergestellt werden. Bei Verwendung eines erfindungsgemäßen, den Fluß fokussierenden Dochts kann eine nicht ganz korrekte Ausrichtung des stromab wärts liegenden Endes des Dochts toleriert werden, ohne daß dies zu einer Situation führt, in der ein Überfluten der As sayvorrichtung an der Grenzfläche zwischen dem Docht und der nächsten porösen Komponente auftreten kann.

Claims

1. Assayvorrichtung (100), der ein Kompositstreifen einver leibt ist, umfassend mindestens zwei Körper (107, 201) eines porösen, flüssigkeitsleitenden Materials, die über eine Grenzfläche in Flüssigkeitskontakt miteinander ste hen und zusammen mindestens einen Teil eines Flüssig keitsfließwegs definieren, auf dem während der Durchfüh rung eines Assays Flüssigkeit fließen muß, dadurch ge kennzeichnet, daß an der Grenzfläche die, bezogen auf die Richtung des Flüssigkeitsfließwegs, laterale Dimension (A) des Kontaktbereichs (502) des stromaufwärts liegenden Körpers (107) derart verengt ist, daß der Flüssigkeits fluß vom stromaufwärts liegenden Körper (201) in den stromabwärts liegenden Körper in Richtung der Mittellinie (503) des Fließwegs in den stromabwärts liegenden Körper fokussiert wird.

2. Assayvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Körper aus porösem Material mindestens teilweise innerhalb eines hohlen Gehäuses (101, 102), aufgebaut aus festem, feuchtigkeitsundurchlässigem Material, enthalten sind.

3. Assayvorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Körper aus porösem Material phy sisch getrennte Komponenten sind und während des Zusam menbaus der Vorrichtung miteinander in Kontakt angeordnet werden.

4. Assayvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Körper aus porösem Material physisch getrennte Komponenten sind und nur dadurch, daß sie innerhalb des hohlen Gehäuses eingezwängt sind, miteinander in Kontakt gehalten werden.

5. Assayvorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der verengte Ab schnitt des stromaufwärts liegenden Körpers eine Spitze oder einen Bug bildet.

6. Assayvorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der stromaufwärts liegende Körper ein Probenaufnahmeelement oder ein Docht ist.

7. Assayvorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Körper aus porösem Material mindestens teilweise in einem hohlen Gehäuse, aufgebaut aus festem, feuchtig keitsundurchlässigem Material, enthalten sind, und daß das Probenaufnahmeelement oder der Docht aus dem Gehäuse hervorragt, aber der Abschnitt des Probenaufnahmeelements oder des Dochts, der verengt ist, sich innerhalb des Ge häuses befindet.

8. Assayvorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenaufnahmeelement oder der Docht aus einem Faservlies hergestellt ist.

9. Assayvorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenaufnahmeelement oder der Docht aus Faserkunststoffmaterial hergestellt ist.

10. Assayvorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dem stromaufwärts liegenden Körper ein mobilisierbares Reagenz stromaufwärts vom verengten Ab schnitt des porösen Körpers einverleibt ist.

11. Assayvorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, die die Anwesenheit oder Konzentration von mindestens zwei verschiedenen Nachweissubstanzen in einer einzelnen auf die Assayvorrichtung aufgebrachten Probe nachweisen kann.

12. Assayvorrichtung nach Anspruch 11, die in einer einzeln aufgebrachten Urinprobe sowohl E-3-G als auch LH nachwei sen kann.

13. Assayvorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Docht einen Streifen aus porösem Material umfaßt der an seinem einen Ende eine auf der longitudinalen Achse des Streifens zentrierte verengte Spitze oder einen Bug besitzt.

14. Assayvorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeich net, daß der verengte Abschnitt nicht mehr als 35% der Gesamtlänge des Dochts umfaßt.

15. Assayvorrichtung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, da durch gekennzeichnet, daß die Breite des Dochts an der Spitze oder dem Bug um mindestens 50% verengt ist.