DE2729872A1 - Pruefmittel zur bestimmung einer eigenschaft einer probe - Google Patents
Pruefmittel zur bestimmung einer eigenschaft einer probeInfo
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Description
DH. ING. K. AVirKSXnOFF
DH. K. ν. PKCH MANN
DIt. ING. D. ItKHHENS
8OOO MÜNCHEN OO SCUV. EIUEItSTHASSi: 2
ΤΚΙ.ΚΚΟΝ (08Θ) 0β2
TKLKX 5 21070
TKI.KORAHMB I
1A-49 592
Patentanmeldung
Anmelder: THYROID DIAGNOSTICS, INC.
74 Loomis Street
Bedford, Massachusetts, USA
Titel: Prüfmittel zur Bestimmung einer
Eigenschaft einer Probe
709886/0608
DH.K. ν. l'KCIIMANN
DlPl.. ING. H. GOETZ
Beschreibung
ΠΟΘΟ MÜNCHEN OO
SCllU'ElaKHSTHASSK 2
TKLEKON (089) UDIiO 31 5 24 070
l-nOTEOTI-ATKNT MONOUEX
1A-49 592
Die Erfindung betrifft ein Prüfmittel zur Bestimmung einer Eigenschaft einer Probe, besonders zum Nachweis und
zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeiten. Das Prüfmittel umfaßt einen Streifen, der aus einem Material besteht,
das imstande ist, Flüssigkeit durch Kapillarwirkung zu transportieren, und der an einer vorher bestimmten
Stelle einen Teil zur Aufnahme der zu untersuchenden Probe und an vorbestimmten Stellen auf Streifenteile, die Reagentien
enthalten, besitzt, um eine nachweisbare Reaktion zu ergeben, die auf die zu bestimmenden Charakteristika anspricht.
Der Anfang des Streifens wird in die Entwicklungsflüssigkeit eingetaucht, die dadurch über die Länge des
Streifens fließt und dadurch einen entsprechenden Kontakt zwischen der zu untersuchenden Probe und den Reagentien
herbeiführt, was zum Auftreten einer nachweisbaren Reaktion an einer vorher bestimmten Stelle des Streifens führt, die
eine Funktion der zu bestimmenden Charakteristika ist. Das Prüfmittel ist besonders geeignet zur Durchführung von Bindungsbestimmungen,
insbesondere solchen, bei denen ein Radio-Isotop als Markierung verwendet wird, wie radioimmunologische
Bestimmungen (RIA).
Die Erfindung betrifft Prüfmittel und ihre Anwendung zum Nachweis einer Eigenschaft einer Probe. Insbesondere
betrifft die Erfindung Prüfmittel und ihre Anwendung zur Durchführung von Bindungsbestimmungen, wie zur Bestimmung
eines Liganden oder der Bindungsfähigkeit des Liganden einer flüssigen Probe, wie einer biologischen Flüssigkeit. In einer
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bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Prüfmittel
zur Durchführung von Bindungsbestimmungen, bei denen ein Radio-Isotop als Markierung angewandt wird.
Prüfmittel in Form von Teststreifen sind üblich zur
Analyse verschiedener Arten von Proben, wie flüssigen Pro-
der
ben in Art von Industrieflüssigkeiten, biologischen Flüssigkeiten usw, aufgrund ihrer Bequemlichkeit und Schnelligkeit
bei der Anwendung. Teststreifen, die geeignet sind zum Nachweis von verschiedenen,klinisch bedeutsamen Substanzen in
biologischen Flüssigkeiten, wie Urin und Serum, haben sich insbesondere als sehr vorteilhaft erwiesen zur Erleichterung
der Diagnose und Behandlung von Krankheitszuständen bei Menschen und Tieren.
Übliche Teststreifen umfassen im allgemeinen eine absorbierende oder poröse Matrix, in der Indikatorreagentien
enthalten sind, üblicherweise kolorimetrische. Die zu
untersuchende Probe wird mit der Reagensmatrix z.B. durch kurzes Eintauchen in Berührung gebracht, wenn die Probe
flüssig ist, und die Indikatorreaktion wird nach einer bestimmten Zeit beobachtet. Solche Teststreifen besitzen die Einschränkung,
daß, wenn mehr als eine chemische Reaktion auftritt, alle Testreaktionen miteinander verträglich sein müssen,
da sie alle in Gegenwart der anderen, in der Matrix enthaltenen Reagentien ablaufen.
In letzter Zeit wurden bestimmte Teststreifen entwickelt, die es erlauben, daß verschiedene Testreaktionen
in einer vorbestimmten Reihenfolge ablaufen. In der US-PS 3 011 874 ist ein typischer derartiger Teststreifen
beschrieben. Dieser Teststreifen umfaßt einen Papierstreifen, der in der Breite in verschiedene Bänder aufgeteilt
ist, zunächst ein leeres Band, das in die flüssige Probe eingetaucht wird, und anschließend nacheinander Reaktionsbänder, ein Band, das ein Gas freisetzt, und ein Trennband
sowie ein Indikatorband. Es besteht jedoch weiterhin seit
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langem ein Bedarf an einer weiteren Verbesserung.
Zunächst besitzen die üblichen Teststreifen eine begrenzte Empfindlichkeit. Da die nachweisbare Reaktion, die
bei den üblichen Streifen auftritt, nahezu immer eine Farbänderung ist, erlaubt es die begrenzte Farbauflösung des
Auges sowie der angewandten Spektrometer nicht, mit üblichen Teststreifen Substanzen, wie Hormone, Vitamine und
ähnliches nachzuweisen, die in Körperflüssigkeiten in Konzentrationen unter 0,1 mg/ml auftreten. Zweitens muß ein
verhältnismäßig großes Probenvolumen vorhanden sein, um die gesamte Reagensmatrix üblicher Teststreifen zu benetzen.
Die Anwendung der in der oben erwähnten US-PS 3 011 874 angegebenen
Teststreifen erfordert ein ausreichendes Probevolumen, um durch Kapillarabsorption den gesamten Streifen
bis zu dem Grenzband zu benetz en. )fple bekannten analytischen
Verfahren zum Nachweis von Substanzen, die in Proben in kleinen Mengen auftreten, beruhen auf der Bindungsaffinität derartiger Substanzen zu bestimmten synthetischen
oder natürlich vorkommenden Bindemitteln. Das zur Zeit am häufigsten angewandte Verfahren zur Bindungsbestimmung ist
vermutlich das radioimmunologische Verfahren, bei dem die nachzuweisende Substanz unter geregelten Bedingungen mit
einer radioaktiv markierten Form dieser Substanz um die Bindung mit einer begrenzten Menge eines spezifischen Antikörpers
konkurriert. Der Anteil der radioaktiv markierten Form, der mit dem Antikörper Bindungen eingeht, zu dem in
freiem Zustand verbleibenden Anteil ist eine Funktion der in der Testprobe vorhandenen Substanzmenge. Da die Verfahren
zur Bindungsbestimmung eine genaue und zeitlich genau regulierte Zugabe geringer Reagensmengen erfordern, sind
die bekannten Verfahren zeitraubende und mühsame Naßchemie. Die Kombination von Bindungsbestimmungen mit Prüfmitteln,
die versuchen, das Verfahren zu vereinfachen und die Kosten derartiger Bestimmungen zu verringern, war außerordentlich
begrenzt trotz der Tatsache, daß viele Hundert Veröffentlichungen in den letzten 20 Jahren erschienen sind,
die sich allein auf radio-immunologische Verfahren beziehen.
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Die US-PS 3 888 629 beschreibt ein Prüfinittel, bei dem die Bindungsreaktion in einem scheibenförmigen Matrixkissen
stattfindet, das in einem Bereich einer Säule festgehalten wird. Die freie und gebundene markierte Substanz
werden getrennt, indem man über dem das Kissen enthaltenden Bereich der Säule einen Bereich mit einem Reservoir
einer Waschflüssigkeit anbringt und einen ein absorbierendes Material enthaltenden Bereich unter dem das Kissen
enthaltenden Bereich. Wenn die Waschlösung durch das Reaktionskissen gesaugt wird, wird die freie Markierungssubstanz
zusammen mit der Waschflüssigkeit wegtransportiert und die gebundene Markierungssubstanz bleibt aufgrund der
Filtereigenschaften des Reaktionskissens zurück. Dieses Prüfmittel ist mühsam und umständlich anzuwenden und erfordert
viele zeitraubende Handgriffe.
In der DT-OS 2 241 646 ist ein kompliziertes automatisches Gerät zur Durchführung von radio-immunologischen
Bestimmungen beschrieben, bei denen die Bindungsreagentien, d.h. die Markierungssubstanz und der spezifische Antikörper,
und ein Anteil der zu untersuchenden Flüssigkeit auf einen Cellulosestreifen auf (bestimmten) diskreten Stellen aufgebracht
werden. Nach eirsrlnkubationszeit werden die Testbereiche
auf dem Streifen durch Durchsaugen einer Flüssigkeit gewaschen, wodurch die freie Markierungssubstanz entfernt
wird. Die in jedem Testbereich zurückbleibende Radioaktivität wird dann gemessen und steht in einem Verhältnis zu der
Menge an unbekannter Substanz in der Probe. Außer daß ein aufwendiges kompliziertes Gerät erforderlich ist, fordert
dieses Verfahren ein geregeltes Aufbringen der Reagentien und genau einzuhaltende Inkubationszeiten, ebenso wie übliche
Methoden der Naßchemie.
ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Prüfmittel zu entwickeln, das auf analytische Verfahren
angewandt werden kann, bei daien eine Reihe von aufeinanderfolgenden
Testreaktionen stattfindet und wofür nur eine geringe Probengröße angewandt werden muß. Dabei soll die
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Empfindlichkeit des analytischen Verfahrens unter 0,1 mg/ml
liegen. Vor allem soll das Prüfmittel geeignet sein zur Durchführung von Bindungsbestimmungen zum Nachweis von
Eigenschaften von flüssigen Proben, bei denen der Benutzer keine Bindungsreagentien aufbringen muß oder sorgfältige
Inkubationszeiten beachten muß, und besonders für Verfahren, bei denen radioaktiven Markierungen angewandt werden, wie
radioimmunologische Bestimmungen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch ein Prüfmittel, umfassend einen länglichen Streifen, bestehend
aus einem Material, das imstande ist, eine Entwicklerflüssigkeit
längs durch Kapillarwirkung zu transportieren. Eines der Enden des Streifens wird als Anfang bezeichnet
und das andere als Ende, um die Tatsache deutlich zu machen, daß die Bewegung der Entwicklerflüssigkeit über den
Streifen durch Eintauchen oder andere-Berührung der Entwicklungsflüssigkeit
am Anfang des Streifens beginnt und aufhört, wenn die Leitfront der Entwicklerflüssigkeit das
Ende erreicht. Der Streifen besitzt einen Teil, der dafür vorgesehen oder markiert ist, die zu untersuchende Probe
aufzunehmen,und einen oder mehrere Teile mit Reagentien, umfassend einen oder mehrere Reagensbestandteile.
Alle Bestandteile der Reagentien können in einzelnen diskreten Teilen des Streifens angeordnet sein. Einige der Reagensbestandteile
können zusammen in einem einzelnen diskreten Teil des Streifens vorliegen und die restlichen Reagensbestandteile
können einzeln oder in entsprechender Kombination in einem oder mehreren diskreten Bereichen auf dem
Streifen angeordnet sein oder jeder der Reagensbestandteile kann jeweils in einem eigenen Bereich auf dem Streifen
angeordnet sein. Die Reihenfolge der verschiedenen Reagensbestandteile, die auf den Bereichen des Streifens angeordnet
sind,und des die Probe aufnehmenden Bereichs sowie der Abstand dazwischen.wird so bestimmt, daß bei vollständigem
Durchgang der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen eine
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nachweisbare Reaktion, die eine Funktion des zu bestimmenden Charakteristikums ist, an einer vorher bestimmten Meßstelle
auftritt.
Die Figuren 1,3 bzw. 5 sind Aufsichten auf drei
unterschiedliche Formen eines erfindungsgemäßen Prüfmittels.
Längs-Die Figur 2 ist ein Schnitt des in Figur 1 angegebenen
Prüfmittels entlang der Linie 2-2.
Längs-Figur 4 ist ein Schnitt des in Figur 3 angegebenen
Prüf mittels entlang der Linie 4-4.
Figur 6 ist die Ansicht der Rückseite auf das in Figur 5 angegebene Prüfmittel und
Figur 7 der Längsschnitt durch das in Figur 5 angegebene Prüfmittel entlang der Linie 7-7.
Figur 8 ist eine perspektivische Ansicht einer Anordnung,
umfassend das in den Figuren 5 bis 7 angegebene Prüf-
mittel in einer dicht geschlossenen Kammer, wobei das Prüfmittel mit einem Volumen Entwicklerflüssigkeit in Berührung
steht.
Figur 9 ist eine perspektivische Ansicht eines Teilschnitts der in Figur 8 angegebenen Anordnung, die umgedreht
und in einer Vertiefung eines Gerätes angeordnet ist. zur Messung der Reaktion der Reagentien.
Im einzelnen ist in den Figuren 1 und 2 ein Prüfmittel 10 angegeben, umfassend einen Streifen 11, bestehend
aus einem Material, üblicherweise saugfähigem Papier, das gegenüber der ausgewählten Entwicklerflüssigkeit,üblicherweise
einer wäßrigen Lösung, absorbierend/wirkX. Der Streifen
11 besitzt einen Anfangsteil 12 und einen Endteil 16. Ein die Probe aufnehmender Bereich 13 ist auf dem Streifen
durch entsprechende Markierung, wie einen getrockneten Fleck einer Farbstofflösung, markiert. Die Teile 14 und 15 des
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Streifens 11 enthalten entsprechende Bestandteile eines Reagenssystems,
das ausgewählt ist zum Nachweis einer speziellen Eigenschaft einer Probe. Bei der Anwendung wird die zu
untersuchende Probe auf den die.Probe aufnehmenden Bereich 13 des Streifens 11 aufgebracht und der Anfangteil 12 in
die Entwicklerflüssigkeit getaucht, die sich dann durch Kapillarwirkung entlang dem Streifen 11 auf den Endteil 16
zu bewegt. Die Entwicklerflüssigkeit wird so ausgewählt, daß die aufgebrachte Probe und die Bestandteile des Reagenssystems
in geeigneter Weise zusammenkommen durch die sich in dem Streifen 11 fortbewegende Entwicklerflüssigkeit. Wenn die
Front der Entwicklerflüssigkeit den Endteil 16 erreicht, tritt eine nachweisbare Reaktion des Reagenssystems, die in
Beziehung steht zu der zu bestimmenden Eigenschaft in einem vorbestimmten Meßbereich auf dem Streifen 11, z.B. in dem
Bereich 15, auf. Eine derartige Reaktion wird mit Hilfe geeigneter
Mittel gemessen, z.B. durch Messung einer chemischen oder physikalischen Eigenschaft dieses Bereichs. Zum Beispiel
kann, wenn die nachweisbare Reaktion des Reagenssystems eine physikalische Eigenschaft, wie Fluoreszenz, Lichtabsorption
oder Radioaktivität ist, die Eigenschaft an dem intakten Streifen messen werden. Auch wenn die nachweisbare Reaktion
eine chemische Eigenschaft ist, wie das Auftreten eines chemischen Produktes oder das Verschwinden eines chemischen
Reagens , kann eine solche Eigenschaft gemessen werden durch Zugabe eines Indikators auf den Meßbereich auf dem Streifen
oder indem man zunächst den Meßbereich von dem Rest des Streifens abtrennt und geeignete Messungen und/oder Zugaben von
Reagens durchführt. Wenn die Reaktion auf dem intakten Streifen z.B. in dem Bereich 15 gemessen wird, ist es günstig,
die gesamte verbleibende Oberfläche des Streifens in geeigneter Weise zu maskieren, um sicherzustellen, daß die gemessene
Reaktion nur diejenige ist, die in dem Meßbereich d.h. dem Bereich 15 auftritt. Ein Maskierungsmittel bzw. eine Maske
kann angewandt werden, wie eine Abdeckung die für die physikalische Eigenschaft, die gemessen werden soll,undurchlässig
ist und eine Öffnung besitzt, die mit dem Bereich 15 überein-
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- fr-
stimmt. Vorzugsweise wird ein Indikator, der auf Berührung mit der Entwicklerflüssigkeit anspricht, in den Endteil 16
eingebaut, um die Vollständigkeit des Versuchs anzuzeigen. Es ist auch bevorzugt, daß das Volumen der Entwicklerflüssigkeit,
in die der Anfangsteil 12 eingetaucht wird, gleich ist dem genauen Volumen der Entwicklerflüssigkeit,
das von dem Streifen 11 aufgenommen istf wenn die Front
der Entwicklerflüssigkeit an dem Endteil 16 ankommt, wodurch eine automatische Beendigung des Transports der Entwicklerflüssigkeit
zu geeigneter Zeit eintritt.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Prüfmittels zum Nachweis eines Liganden einer flüssigen Probe
umfaßt das Reagenssystem geeignete bindende Reagentien einschließlich einem spezifischen Bindungspartner, wie einem
Antikörper oder einem anderen bindenden Protein für den Liganden, und eine Markierungskomponente, umfassend eine
markierte Form des Liganden oder eines bindenden Analogen davon. Vorbestimmte Mengen der Markierungskomponente und
des spezifisch bindenden Partners, wobei der letztere in immobilisierter Form vorliegen kann, sind in den Teilen
14 bzw. 15 enthalten. Bei der Anwendung werden, mit der sich vorwärts bewegenden Entwicklerflüssigkeit entlang dem Streifen
11 die Probe und die Markierungskomponente vermischt und mit dem immobilisierten Bindungspartner in Berührung gebracht,
woraufhin die Markierungskomponente und ein in der Probe vorhandener Ligand um die Bindungsstellen des bindenden
Partners in Konkurrenz treten. Der Anteil der Markierungskomponente, der tatsächlich an den Bindungspartner gebunden
wird, wird dadurch in dem Bereich 15 immobilisiert. Wenn die Entwicklerflüssigkeit zu dem Endteil 16 fortschreitet,
wird der nicht gebundene oder freie Teil der Markierungskomponente ein Stück von dem Bereich 15 wegtransportiert.
Die Menge an markierter immobilisierter Substanz in dem Bereich 15 wird dann in entsprechender Weise gemessen und
steht in Beziehung zu der Menge des Liganden in der zu untersuchenden Probe. Es ist besonders günstig, als Markierung eine
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radioaktive Form des Liganden oder eines bindenden Analogen dazu zu verwenden. Wenn die radioaktive Markierung ein Jod-Isotop
ist, tritt ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Prüfmittels dadurch auf, daß eine Verunreinigung in
Form von radioaktivem freiem Jod die Messung in dem Bereich 15 nicht stört, da dieses freie Jod ein Stück von dem
Bereich 15 wegtransportiert wird durch die fortschreitende Entwicklerflüssigkeit.
Eine Abwandlung des erfindungsgemäßen Prüfmittels des vorigen Absatzes ist in den Figuren 3 und 4 der Zeichnungen
angegeben. Das Prüfmittel 20 umfaßt einen Streifen 21, der auf einem inerten Trägerstreifen 22 befestigt ist, üblicherweise
aus einem halbstarren Kunststoff, und der einen Anfangsteil 23, einen Endteil 28 und einen die Probe aufnehmenden
Bereich 25 besitzt, der sich bei dieser Ausführungsform zwischen den in den Bereichen 24 und 26 enthaltenen
Reagentienfindet. Der Bereich 24 des Streifens enthält die Markierungskomponente und der Bereich 26 den spezifischen
Bindungspartner, der bei dieser Ausführungsform gegenüber der Entwicklerflüssigkeit nicht immobilisiert«ist, sondern
von ihr mittransportiert v/erden kann. Bei der Anwendung werden die Probe und die Markierungskomponente mit Fortschreitender
Entwicklerflüssigkeit vermischt und treten in Konkurrenz um die bindenden Stellen des Bindungspartners in dem
Bereich 26. Mt weiter fortschreitender Entwicklerflüssigkeit werden die entstehenden Komplexe aus Markierungskomponente
und Bindungspartner entlang dem Streifen 21 zusammen mit der Probe und der freien Markierungskomponente transportiert,
wobei jedoch die Komplexe mit geringerer Geschwindigkeit sich fortbewegen alskie freie Markierungskomponente.
Wenn die Front der Entwicklerflüssigkeit den Endteil 28 er-
hat
reicht befinden sich die Komplexe aus Markierungskomponente und Bindungspartner in dem Bereich 27» während die freie Markierungskomponente weiter auf den Endteil 28 hin transportiert worden ist. Die Messung kann dann in dem Bereich 27 des Streifens 21 durchgeführt werden. Wahlweise kann der Bereich 27 ein immobilisiertes Mittel für die Komplexe aus
reicht befinden sich die Komplexe aus Markierungskomponente und Bindungspartner in dem Bereich 27» während die freie Markierungskomponente weiter auf den Endteil 28 hin transportiert worden ist. Die Messung kann dann in dem Bereich 27 des Streifens 21 durchgeführt werden. Wahlweise kann der Bereich 27 ein immobilisiertes Mittel für die Komplexe aus
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Markierungskomponente und Bindungspartner enthalten, wie einen zweiten Antikörper oder ein proteinausfällendes Mittel, um die
Lokalisierung dieser Komplexe in dem Bereich 27 sicherzustellen.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Prüfmittels ist in den Figuren 5 bis 9 der Zeichnungen angegeben.
Das Prüfmittel 30 umfaßt einen Streifen 31, der über ein Ende eines inerten Trägerstreifens 32 gefaltet ist
und zwar so, daß die Kante des Anfangsteils 33 des Streifens 31 ungefähr in einer Ebene liegt mit der anderen Kante
des Trägers 32 und die Kante des Endbereichs 37 des Streifens 31 sich in einem kurzen Abstand von dem gleichen Ende
des Trägers 32 befindet. Der die Probe aufnehmende Bereich und die das Reagenssystem enthaltenden Bereiche 35 und 36 entsprechen
den Bereichen 13» 14 bzw. 15 des in den Figuren 1 und 2 angegebenen Prüfmittels 10. Wenn zum Beispiel das
Prüf mittel 30 angewandt werden soll, um einen Liganden in einer flüssigen Probe nachzuweisen, kann der Bereich 35 eine
Markierungskomponente und der Bereich 36 einen immobilisierten Bindungspartner enthalten. Bei dieser Ausführungsform
wirkt das Prüfmittel 30 auf ähnliche Weise wie das Prüfmittel 10, wobei sich die vorbestimmte Meßstelle in dem Bereich 36
befindet.
Die Figur 8 zeigt ein Verfahren zur Anwendung eines bevorzugten Prüfgeräts 40 nach der Erfindung. Nachdem die zu
untersuchende Probe auf den probeaufnehmenden Bereich 34 des Streifens 31 aufgebracht worden ist, wird das Prüfmittel 30
mit dem Anfangsteil 33 nach unten in ein Reagensröhrchen 41 gestellt, das ein Volumen einer Entwicklerflüssigkeit 42
enthält. Die Größe des Reagensröhrchens 41 und die Dimensionen des Streifens 31 werden vorzugsweise so gewählt, daß
das Volumen der Entwicklerflüssigkeit 42 genau der Menge entspricht, die von dem Streifen 31 aufgenommen ist ., wenn die
Front der Entwicklerflüssigkeit 42 den Endteil 37 erreicht hat, sodaß der Endteil 37 nicht mit der Entwicklerflüssigkeit 42
in Kontakt kommt, wenn das Prüf mittel 30 anfangs in das Reagensglas
41 eingetaucht wird. Nachdem das mit der Probe be-
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impfte Prüfmittel 30 in das Reagensröhrchen 41 eingeführt
worden ist, wird eine Kappe 43 auf das Reagensröhrchen aufgesetzt, um eine dicht verschlossene Kammer zu bilden
und ein Verdampfen der Entwicklerflüssigkeit 42 während der Fortbewegung entlang des Streifens 31 zu vermeiden.
Die Figur 9 zeigt eine bevorzugte V/eise zur Messung der Reaktion des Reagenssystems in dem Bereich 36 des
Streifens 31. Man kann daraus ersehen, daß die Messung der Reaktion des Reagenssystems bequem durchgeführt werden
kann, wenn der die Probe aufnehmende Teil 34 und die das Reagenssystem enthaltenden Teile 35 und 36 sich in geeigneter
Stellung auf dem Streifen 31 befinden, sodaß der Meßbereich an oder nahe bei der Faltung des Streifens 31
sich befindet und der gesamte Streifen 31 markiert wird mit Ausnahme des Bereichs nahe an der Faltung des Streifens
31. Das Prüfgerät 40 wird in eine Hülse 50 eingesetzt,
die für die physikalischen Eigenschaften der Reaktion des Reagenssystems opak ist. Die entstehende Anordnung
wird umgedreht und in die Vertiefung 52 eines Geräts 51 zur Messung der Reaktion des Reagenssysteins, eingeführt.
Während das erfindungsgemäße Prüfmittel besonders geeignet ist zur Durchführung von Bindungsbestimmungen,
wie oben näher diskutiert, können verschiedene andere Bestimmungsarten ebenfalls mit Hilfe dieses Prüfmittels durchgeführt
werden. Übliche kolorimetrische Bestimmungen können durchgeführt werden bei entsprechender Auswahl der Reagenssysteme
und entsprechender Orientierung der Bestandteile des Reagenssystems und einem die Probe aufnehmenden Tteil
auf dem Streifen, sodaß die gewünschte Farbreaktion in einem vorbestimmten Meßbereich nach Beendigung des Tests
auftritt. Bei einer solchen Bestimmung bietet das Prüfmittel den Vorteil, daß aufeinanderfolgende Testreaktionen
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durchgeführt werden können und daß es einen hohen Grad an Genauigkeit ergibt, da eine genau angegebene Menge der zu
untersuchenden Probe angewandt wird.
Ein weiteres Beispiel für die verschiedenen Arten von Bestimmungen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Prüfmittels durchgeführt werden können, wird im folgenden beschrieben für die quantitative Bestimmung von Proteinen
in einer flüssigen Probe. Der in den Figuren 3 und 4 der Zeichnungen angegebene Streifen 21 enthält einen die Probe
aufnehmenden Bereich 24 und Bereiche 25 bzw. 26, die eine Markierungssubstanz und ein Mittel zur Kupplung der Markierungskomponente
mit Proteinen enthalten. Ein Beispiel für eine Kombination von Markierungskomponente und Kupplungsmittel
ist radioaktives Jod und 1,3»^>6-Tetrachlor-3(V,6Or-diphenyl-glykoluril
(IODO-GEN Pierce Chemical Co., Rockford, IL.). Durch das durch die Kapillarwirkung verursachte
Fortschreiten der Entwicklerflüssigkeit werden die zu untersuchende Probe und die Markierungskomponente vermischt
und, wenn das entstehende Gemisch in den Bereich 26 eintritt, wird die Markierungskomponente . mit den
in der Probe vorhandenen Proteinen gekuppelt und bildet markierte Derivate. Mit weiter fortschreitender Entwicklerflüssigkeit
werden die markierten Derivate und die freie Markierungskomponente durch ihre unterschiedlichen Transportgeschwindigkeiten
über den Streifen 21 mit Hilfe der Entwicklerflüssigkeit getrennt. Nach vollständigem Durchgang
der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen 21 ergibt die Reaktion der Markierungskomponente in dem Bereich
des Streifens 21, an dem sich die markierten Derivate befinden,
ein Maß für den Proteingehalt in der Probe. Diese Art von Prüfmittel kann auch angewandt werden zur quantitativen
Bestimmung eines speziellen Proteins, indem man den das Kupplungsmittel enthaltenden Teil des Streifens in
einem vorbestimmten Abstand von dem Meßbereich anordnet, d.h. indem man den Bereich 26 in einem vorbestimmten Abstand
von dem Bereich 27 anordnet, wobei dieser vorbestimmte Ab-
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../13
über
stand dem Abstand entspricht ,/den das markierte Derivat des interessierenden Proteins während der Zeit transportiert wird, die die Entwicklerflüssigkeit von dem das Kupplungsmittel enthaltenden Bereich zu dem Endbereich des Streifens fortschreitet, d.h. dem Bereich 28. Der Meßpunkt, d.h. der Bereich 27 enthält dann nur das markierte Derivat des interessierenden Proteins.
stand dem Abstand entspricht ,/den das markierte Derivat des interessierenden Proteins während der Zeit transportiert wird, die die Entwicklerflüssigkeit von dem das Kupplungsmittel enthaltenden Bereich zu dem Endbereich des Streifens fortschreitet, d.h. dem Bereich 28. Der Meßpunkt, d.h. der Bereich 27 enthält dann nur das markierte Derivat des interessierenden Proteins.
Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann auch so ausgebildet sein, daß es geeignet ist zur quantitativen Bestimmung
von Substanzen, die mit einem Reagenssystem unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren.Nach den Figuren 5 bis
7 enthält der Streifen 31 einen probeaufnehmenden Bereich und Bereiche 35 und 36, die radioaktives Jod bzw. das oben
erwähnte Reagenssystem enthalten. Ein bevorzugtes Reagenssystem umfaßt ein Oxidaseenzym, das für die zu bestimmende
Substanz spezifisch ist. Um z.B. Glucose oder Cholesterin nachzuweisen, sollte das Reagenssystem Glucoseoxidase bzw.
Cholesterinoxidase enthalten. Bei der Anwendung wird durch die Entwicklerflüssigkeit die Probe mit dem radioaktiven
Jod markiert. Wenn das Gemisch mit dem Reagenssystem zusammenkommt,
wird Wasserstoffperoxid gebildet im Verhältnis zu der in der Probe vorhandenen Menge an zu bestimmender
Substanz mit einer entsprechenden proportionalen Umwandlung von radioaktivem Jodid in radioaktives Jod, wobei das
letztere von dem Streifen 31 stark adsorbiert wird. Wenn die Entwicklerflüssigkeit weiter fortschreitet, wird das
verbleibende radioaktive Jodid von dem adsorbierten radioaktiven Jod getrennt. Der Endbereich jeder radioaktiven Art
nach Beendigung des Versuchs kann als Meßbereich herangezogen werden.
In Form der speziellen Ausführungsformen, wie sie oben und in den folgenden Beispielen beschrieben sind, kann das
Prüfmittel angewandt werden zur Bestimmung einer Eigenschaft
709886/0608
../14
einer Probe und umfaßt (a) einen Streifen üblicherweise in länglicher Form mit einem Anfangsteil und einem Endteil
und einem Bereich zur Aufnahme der Probe.der sich an einer vorbestimmten Stelle befindet, und der Streifen besteht aus
einem Material, das imstande ist, eine Entwicklerflüssigkeit zu transportieren, üblicherweise in Längsrichtung durch
Kapillarwirkung, und (b) einem Reagenssystem, das in dem Streifen an zumindest einer vorbestimmten Stelle eingebaut
ist, um eine nachweisbare Reaktion zu ergeben als Punktion der zu bestimmenden Eigenschaft in einem vorbestimmten Meßbereich
auf dem Streifen durch Fortschreiten der Entwicklerflüssigkeit vom Anfang- nach dem Endteil des Streifens. Die
Auswahl des Materials, aus dem der Streifen besteht, der Zusammensetzung der Entwicklerflüssigkeit, der Dimensionen des
Streifens und der Orientierung bzv/. Lage des die Probe aufnehmenden Bereichs auf dem Streifen und der Bereiche, die das
Reagenssystem enthalten, hängt natürlich ab von der zu bestimmenden
Eigenschaft und dem ausgev/ählten Reagenssystem.
Der Streifen kann aus irgendeinem Material bestehen, das in der Entwicklerflüssigkeit unlöslich ist und das imstande
ist, die Entwicklerflüssigkeit durch Kapillarwirkung zu transportieren. Der Streifen ist typischerweise verhältnismäßig
flexibel, während er eine ausreichende Naßfestigkeit besitzt, um bei der Anwendung fest zu bleiben. Natürlich
sollte er aus einem Material bestehen, das die Wechselwirkung zwischen der Entwicklerflüssigkeit der zu untersuchenden
Probe und dem Reagenssystem nicht nachteilig beeinflußt. Ein besonders geeignetes Material für den Streifen
ist saugfähiges Papier, wie Filterpapier, da die Entwicklerflüssigkeit üblicherweise wäßrig ist; es können jedoch auch
andere Materialien angewandt werden, wie verschiedene Arten von Filzen, Tuchen, Gele, Membranen und Filme bzw. Folien
aus natürlichen und synthetischen Substanzen einschließlich Polymeren. Während die Länge und Breite des Streifen weitgehend
variieren können, liegt die Dicke des Streifens üb-
709886/0601
../15
licherweise zwischen ungefähr 0,2 und 1,0 mm.
Der Streifen ist vorzugsweise zur Erhöhung der mechanischen Festigkeit an einem inerten Träger befestigt. Üblicherweise
sind der Streifen und der inerte Träger laminatartig miteinander verbunden, wobei beide ungefähr gleich
breit sind. Die Dicke des inerten Trägers kann variieren, in Abhängigkeit von der Festigkeit (Steifheit) des Materials,
aus dem er besteht. Typische Materialien sind verschiedene Vinylkunststoffe sowie Polyester, Polycarbonat,
Methylmethacrylatpolymer, Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen und gewachster Karton. Die Länge des inerten Trägers
variiert in Abhängigkeit von der gewünschten Form des Prüfmittels. Der inerte Träger kann ungefähr die gleiche
Länge haben wie der Streifen (wie in den Figuren 3 und 4
der Zeichnung angegeben) oder, wie besonders bevorzugt ist, kann er eine Länge haben von mehr als dem 0,5-Fachen
aber weniger als dem 1-Fachen der Länge des Streifens, sodaß das Querende des Anfangsteils des Streifens damit abschließen
oder sich etwas über das Ende des Trägers erstrecken kann und der Streifen quer über das ändere Ende
des Trägers gefaltet werden kann, wobei der Endteil des Streifens einen Abstand von dem zuerst genannten Ende des
Trägers besitzt (Figuren 5 bis 7). Die zuletzt
erwähnte, bevorzugte Ausgestaltung ist besonders vorteilhaft, wenn der das Reagenssystem enthaltende Teil bzw. die Teile
so angeordnet sind, daß der vorbestimmte Meßbereich sich an oder nahe bei dem Falz in dem Streifen befindet. Dadurch
wird eine bequeme Messung der Reaktion des Reagenssystems an der Meßstelle möglich, indem man alles bis auf einen
kleinen Teil des Streifens nahe an dem Falz maskiert. Der Endteil des Streifens enthält vorzugsweise einen Indikator,
der auf die Entwicklerflüssigkeit anspricht und als Signal dafür dient, daß die Entwicklerflüssigkeit vollständig durch
den Streifen durchgedrungen ist. Zum Beispiel kann das
708886/0608
../16
Indikatorsystem ein kolorimetrisches Reagens umfassen, das auf das Lösungsmittel oder den gelösten Stoff der Entwicklerflüssigkeit
anspricht. Wenn die Entwicklerflüssigkeit wäßrig ist, kann das Indikatorsystem ein wasserempfindliches.
Reagens, wie Kobaltchlorid, enthalten, und in diesem Falle kann das Indikatorsystem auch als Stabilitätsindikator dienen. Das Indikatorsystem kann auch alle Komponenten
einer kolorimetrischen Reaktion enthalten, die durch die Entwicklerflüssigkeit aktiviert wird. Wenn die Entwicklerflüssigkeit
z.B. wäßrig ist, kann das Indikatorsystem eine saure oder basische Substanz und einen pH-Indikator
enthalten.
Die Entwicklerflüssigkeit muß imstande sein, durch Kapillarwirkung entlang dem Streifen zu laufent und Lösungseigenschaften besitzen, die für die gewünschte Kombination
aus zu untersuchender Probe und Reagenssystem während des Durchgangs geeignet sind. Üblicherweise ist die Entwicklerlösung
ein Lösungsmittel für entsprechende Substanzen der zu untersuchenden Probe sowie für die nachzuweisende Substanz
und enthält verschiedene Hilfsmittel, wi«e Stabili-
oder Sierungsmittel, Konservierungsmittel / Hemmstoffe gegen
Störreaktionen.
Wenn ein Bestandteil des Reagenssystems in einem Teil des Streifens in immobilisiertem Zustand enthalten sein soll,
kann das auf übliche V/eise erreicht werden. Zum Beispiel kann der Bestandteil durch physikalische Adsorption oder
chemische Kupplung an dem Streifen immobilisiert werden. Ein alternatives Verfahren besteht darin, den Bestandteil
durch die Entwicklerflüssigkeit, z.B. durch Verbindung auf physikalische oder chemische Weise(mit großen unlöslichen
Teilchen unlöslich und unbeweglich zu machen. Wenn z.B. eine Bindungsbestimmung durchgeführt werden soll und einer
der Bestandteile des Reagenssystems ein Protein, wie ein Antikörper, ist, kann dieser wirksam durch Adsorption an
709886/0608
../17
Kunststoffperlen immobilisiert werden.
Im Falle eines Prüfmittels, das ein Reagenssystem enthält, umfassend eine Markierungskomponente, z.B. wenn eine
Bindungsbestimmung durchgeführt werden soll, kann eine solche Markierungskomponente irgendeine chemische Substanz
oder Gruppe sein, die eine nachweisbare Eigenschaft besitzt, die einzigartig ist, verglichen mit den anderen bei der
Durchführung des Tests verwendeten Substanzen. Besonders bevorzugt sind Substanzen, die radioaktiv sind, aufgrund der
hohen Empfindlichkeit, mit der sie nachgewiesen werden können. Radioaktive Markierungskomponenten, besonders radio-
125 1 ·51
aktives Jod,wie "V und ^ J, sind besonders geeignet zur Durchführung von Bindungsbestimmungen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Prüfmittels. Während radioaktive Markierungskomponenten, die mit einem Liganden oder einem bindenden Analogen davon eingebaut werden, eine meßbare Eigenschaft besitzen, die die gleiche ist, unabhängig davon, ob ein solcher Ligand oder ein Analoges an einen Bindungspartner gebunden ist oder nicht, können auch Markierungskomponenten angewandt werden, die, wenn sie mit einem Liganden oder einem Analogen davon eingebaut werden, zu Eigenschaften führen, die meßbar unterschiedlich sind, wenn der Ligand oder das Analoge in gebundener Form vorliegt, verglichen mit dem freien Zustand.
aktives Jod,wie "V und ^ J, sind besonders geeignet zur Durchführung von Bindungsbestimmungen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Prüfmittels. Während radioaktive Markierungskomponenten, die mit einem Liganden oder einem bindenden Analogen davon eingebaut werden, eine meßbare Eigenschaft besitzen, die die gleiche ist, unabhängig davon, ob ein solcher Ligand oder ein Analoges an einen Bindungspartner gebunden ist oder nicht, können auch Markierungskomponenten angewandt werden, die, wenn sie mit einem Liganden oder einem Analogen davon eingebaut werden, zu Eigenschaften führen, die meßbar unterschiedlich sind, wenn der Ligand oder das Analoge in gebundener Form vorliegt, verglichen mit dem freien Zustand.
Das erfindungsgemäße Prüfmittel kann zu Bin-
und
dungsbestimmungen auch zum Nachweis irgendeines anderen Liganden ausgebildet sein, für den es einen spezifischen Bindungspartner gibt. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glykoprotein, Steroid oder ein anderes organisches oder anorganisches Molekül oder Ion, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu,
dungsbestimmungen auch zum Nachweis irgendeines anderen Liganden ausgebildet sein, für den es einen spezifischen Bindungspartner gibt. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glykoprotein, Steroid oder ein anderes organisches oder anorganisches Molekül oder Ion, für das ein spezifischer Bindungspartner in biologischen Systemen existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand wird üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu,
709880/0*0· ../18
Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologisehen Mitteln
und ihren Rezeptoren und bindenden Substanzen. Spezifische Beispiele für Liganden, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Prüfmittels nachgewiesen werden können, sind: Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Trijodthyronin,
Östriol, Testosteron, Androsteron, Äquilenin, östron, Progesteron, Pregnenolon, Cortison, 17-Hydroxydeoxy-corticosteron
und Aldosteron; pharmakologische Mittel und ihre Metaboliten, wie Dilantin, Digoxin, Morphin,
Digitoxin, Barbiturate, Catecholamine, Glutethimid, Kokain, Diphenylhydantoin, Meprobamat, Benzdiazocycloheptane
und Phenothiazine; Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinin, Prostoglandine, Hämoglobin, Enzyme,
Myoglobin, und tumorspezifische Antigene; Vitamine, wie Biotin, die B-Vitamingruppe, Vitamin A, die D-Vitamine,
Vitamine E und K1 Folsäure und Ascorbinsäure; bindende Proteine, wie Antikörper, Thyroxin-bindendes Globulin,
Avidin, Intrinsikfaktor und Transcobalamin und andere Substanzen, einschließlich Antikörpern, Pesticiden, Fungiciden,
Nematociden, lebenden oder nicht-lebenden Zellen, die abgeleitet sind von Bakterien, Protozoen,Pilzen, Viren und Tieren
höherer Ordnung, und Mineralen , wie Calci\im-,Eisen-III-
und Eisen-II-Ionen und Oxalate Phosphat- und Chloridionen.
Neben dem Nachweis spezieller Substanzen oder Gruppen von Substanzen in einer Testprobe können andere Charakteristika
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Prüfmittels bestimmt werden. Zum Beispiel können Liganden-Bindungskapazitäten bestimmt
werden, wenn ein Ligand in der Probe in freier Form und in gebundener Form vorliegt. Die Liganden-Bindungskapazität
der Probe ist die Menge oder der Prozentsatz an exogener freier Form des Liganden, die in die gebundene Form
umgewandelt wird, wenn sie zu der Probe zugegeben wird (wie Trijodthyronin-Bindungskapazität, wie in Beispiel 2
angegeben).
../19 7098SS/0S0«
In den meisten Fällen kann die Testreaktion erfolgreich bei Raumtemperatur durchgeführt werden, aber allgemein
kann die Temperatur, bei der der Test durchgeführt wird, von ungefähr 3°C bis ungefähr 45°C variieren, wobei
die Reaktionsgeschwindigkeit im allgemeinen direkt mit der Temperatur zusammenhängt.
Die zu untersuchende Probe kann ein Feststoff sein, aber im allgemeinen ist es eine natürlich vorkommende oder
künstlich hergestellte Flüssigkeit, von der angenommen wird oder bekannt ist, daß sie die nachzuweisende bzw. bestimmende
Substanz oder Eigenschaft enthält. Das erfindungsgemäße Prüfmittel ist besonders geeignet zur Bestimmung von
biologischen Flüssigkeiten oder Verdünnungen oder anderen daraus gewonnenen Produkten (or other treatments thereof),
wie Serum, Plasma, Urin und amniotische, cerebrale und spinale Flüssigkeiten. Feststoffe, wie Gewebe oder Zellen,
oder Gase können ebenfalls bestimmt werden, indeffl^ie in
flüssige Form überführt, z.B. durch Lösen des Feststoffes oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigkeitsextraktion eines Feststoffs.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 Bestimmung von Thyroxin in Serum A. Herstellung des Prüfmittels
Ein Blatt Filterpapier (Whatman Nr. 17 von W. & R. Baiston Ltd. Maidstone, Kent, England) wurde in Streifen
mit einer Länge von 188 mm und einer Breite von 6 mm geschnitten. Jeder Streifen wurde quer über ein Ende eines
Kunststoffstreifens mit einer Dicke von 0,38 mm, einer
Länge von 102 mm und einer Breite von 6,3 mm so gefaltet,
709886/OSQ8
../20
daß ein Ende des Papierstreifens (als Anfangsteil bezeichnet) ungefähr gleich mit dem Ende des Kunststoffstreifens
abschnitt und das andere Ende des Papierstreifens (als Endteil bezeichnet) ungefähr 19 mm vor dem Ende des Kunststoff
streif ens auf der Rückseite dieses endete. Der gefaltete Papierstreifen wurde mit Hilfe eines doppelseitigen
Klebebandes an einem Kunststoffstreifen befestigt.
Es wurden die folgenden flüssigen Gemische hergestellt:
Gemisch A;
Ein Gemisch aus
Gemisch A;
Ein Gemisch aus
1.)0,2 ml Ziegenantiserum gegen ein Konjugat von Thyroxin
und Humanserumalbumin (das Antiserum war ähnlich gebildet
worden, wie in J. Clin. Endo. 33, S. 509-516 (1971) beschrieben);
2.)0,4 ml einer wäßrigen Suspension von Polystyrolperlen, enthaltend 10 % Feststoffe, bestehend aus Perlen mit
einem mittleren Durchmesser von 0,11 /um (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO);
3.)2,4 ml von 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend
694 mg Kaliumdihydrogenphosphat, 509 mg 'Dinatriumphosphat-heptahydrat, 200 mg Thimerosal (K & K Labs,
Plainvies, NY) und 0,5 mg Kristallviolett;
4.)0,2 ml einer 5-96igen wäßrigen Lösung von Natriumlaurylsulfat;
5.)20 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 50 mg Gentamicin (Schering Corp., Bloomfield, NJ) pro ml, und
6.)eine Spur (ungefähr 1 /ul) Siliconantischaummittel
(AF 60, Emulsion der General Electric, erhalten von Harwick Standard Chemical Co., Boston, MA).
Gemisch B;
Ein Gemisch aus
1.) 20 /uCi mit «J-markiertes Thyroxin (Cambridge
Radiopharmaceuticals Corp., Billerica, MA) in 0,2 ml 50-%igem Propylenglykol (spezifische Aktivität ungefähr
600 yuCi pro mg);
700886/QSOt
../21
- vr-
2.) 3 ml einer 100 ml wäßrigen Lösung, enthaltend 5,32 g
Natriumbarbital, 1,44 ml 2n Salzsäure, 400 mg Thimerosal, 10 mg Dinatriumäthylendiamin-tetraacetat
und 0,5 mg Kristallviolett;
3.) 8 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 50 mg
Gentamicin pro ml und
4.) 8 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 250 mg Humanserumalbumin
pro ml.
Gemisch C:
Eine wäßrige Lösung, enthaltend 400 mg/100 ml Thimerosal und 10 mg/100 ml roten Farbstoff Ponceau S.
Gemisch D;
Eine wäßrige Lösung, enthaltend 0,05m Salzsäure und 50 mg/100 ml Bromcresolrot.
Die oben angegebenen flüssigen Gemische wurden dann folgendermaßen auf die Papierstreifen aufgetropft:
Gemisch Volumen (/Ul) Aufbringpunkt, gemessen vom
108 80 60
185
Die Streifen wurden bei Raumtemperatur getrocknet.
Es wurde eine Entwicklerflüssigkeit hergestellt, bestehend aus 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 5,32 g
Natriumbarbital, 1,44 ml 2n Salzsäure, 400 mg Thimerosal und 10 mg Dinatriumäthylendiamin-tetraacetat.
709886/0608
../22
A |
/
20 |
B | 20 |
C | 10 |
D | 10 |
- Vf-
Die in den Figuren 5 bis 7 angegebenen Prüfmittel
enthielten jeweils (a) einen die Probe aufnehmenden Teil 34 (Punkt, in dem das Gemisch C aufgebracht wurde), der angezeigt
wird durch den getrockneten Eeck des roten Farbstoffs Ponceau S, (b) den die Markierungskomponente enthaltenden
Bereich 35 (Punkt, auf den das Gemisch B aufgetragen
wurde), enthaltend radioaktiv-markiertes Thyroxin,
(c) den den spezifischen Bindungspartner enthaltenden Bereich 36 (Punkt, auf den das Gemisch A aufgebracht wurde),
enthaltend immobilisierten Antikörper zu Thyroxin und
(d) Endbereich (Punkt, auf den das Gemisch D aufgebracht wurde), enthaltend als Indikator eine Kombination einer
Säure und eines pH-Indikators, der bei Berührung mit einer
alkalischen Flüssigkeit eine Farbänderung ergibt.
B. Bestimmungsverfahren
10 yul einer zu untersuchenden Serumprobe wurden
auf den die Probe aufnehmenden Bereich 34 eines Prüfmittels
30 aufgebracht. Das Prüfmittel 30 wurde dann mit dem
Endteil 33 nach unten in ein Reagensröhrchen 41 (Fig. 8) gestellt, das 1 ml Entwicklerflüssigkeit enthielt. Die
Größe des Reagensröhrchens wurde so gewählt, daß die Entwicklerflüssigkeit mit dem Prüfmittel 30 nur an dem Anfangsteil
33 zusammenkommt und keine Berührung eintritt mit dem Endteil 37 (wie in Fig. 8 angegeben). Das Reagensröhrchen
wurde mit einer Kappe verschlossen und bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine Farbänderung von gelb nach
blau in dem Endteil 37 beobachtet wurde (ungefähr 1 Stunde). Zu diesem Zeitpunkt war die gesamte Entwicklerflüssigkeit
in dem Reagensröhrchen in den Streifen 31 des Prüfmittels 30 aufgesogen. Das Reagensröhrchen wurde dann umgedreht,
das gesamte Prüfmittel bis auf 12,2 mm, gemessen von dem
Falz des Papierstreifens her, wurde umhüllt, indem
jedes Reagensröhrchens in einer Länge von 16 mm in ein Kupferroßl^uR^das Rohr in die Zählkammer
52 (Fig. 9) einer In-V-Tron 200-Gamma-Zählvorrichtung
( Nuclear Systems, Inc., Garland, Texas) gesetzt wurde, um
709883/0*0*
../23
die Menge der emittierten Gamma-Strahlung an und nahe bei
dem spezifischen Bindungspartner des Bereichs 36 zu messen.
C. Prinzip des Tests
Indem die Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen 31 durch Kapillarwirkung transportiert wird, wird zunächst
die in dem Bereich 34 aufgebrachte Serumprobe erreicht.
Mit Fortschreitender Entwicklerflüssigkeit wird die Serumprobe mittransportiert, einschließlich dem darin enthaltenen
Thyroxin, bis zu dem die Markierungskomponente enthaltenden Bereich 35. Endogenes, nicht-radioaktives
Thyroxin wird mit dem markierten Thyroxin vermischt, indem die Entwicklerflüssigkeit gegen den Falz des Streifens 31
hin fortschreitet. Das Thyroxingemisch wird über den Falz in dem Streifen 31 mit der Entwicklerflüssigkeit transportiert
und kommt dann in Berührung mit' dem Antiserum gegen Thyroxin, das in dem Bereich 36 immobilisiert ist. Wenn
sich das Thyroxingemisch durch den Bereich 36 bewegt, treten
endogenes, nicht-radioaktives Thyroxin und markiertes Thyroxin in Konkurrenz um die Bindungsstellen .des Antikörpers.
Wenn das Thyroxingemisch durch den Bereich 36 hindurchgegangen ist, ist die Menge an markiertem Thyroxin,
das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist und dadurch selbst im Bereich 36 immobilisiert worden ist, umgekehrt
proportional der in der Serumprobe vorhandenen Thyroxinmenge. Ein vollständiger Durchgang der Entwicklerflüssigkeit
durch den Streifen 31 wird angezeigt durch eine Farbänderung in dem Endteil 27, die beim Benetzen mit der
Entwicklerflüssigkeit eintritt.
D. Ergebnisse
Die Bestimmung wurde doppelt mit zwei Sgrumproben mit
bekannten Thyroxingehalten durchgeführt (Thyroid Profile
Control Sera der Oxford Laboratories, Inc., Foster City, CA) Die Ergebnisse sind im folgenden angegeben:
709886/0608
../24
Art des Vergleichs- normaler Vergleich erhöhter Vergleich serums
Nr. 14221 14222
angegebener Thyroxin- 6,2+0,6 /Ug/100 ml 13,9+0,7 /Ug/IOOml
gehalt ~ ' " '
Zählung/min (Tausend) 13,71, 13,51 9,56, 9,70
Mittel 13,61 Mittel 9,63
Diese Daten zeigen, daß die Menge an markiertem Thyroxin, das an und nahe beim Falz des Prüf mittels vorliegt,
nach Durchgang der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen eine Umkehrfunktion ist zu der Menge an Thyroxin, die in der
untersuchten Serumprobe vorhanden war.
Beispiel 2 Verfahren zur Bestimmung von Trijodthyronin-
Bindungskapazität im Serum
A. Herstellung der Prüfmittel
Es wurden Prüf mittel ohne Reagentien (blank test
devices) hergestellt durch Schneiden der Papierstreifen und Falten und Befestigen über dem Kunststoffstreifen, wie in
Teil A des Beispiels 1 beschrieben.
Es wurden die folgenden flüssigen Gemisch hergestellt:
Gemisch E:
Ein Gemisch aus
Gemisch E:
Ein Gemisch aus
1.) 9*12 g Citronensäuremonohydrat
2.) 14,2 g Trinatriumcitrat-dihydrat und 2.) entionisiertes Wasser auf 1 1.
Gemisch F;
Wäßrige Lösung, enthaltend 10 mg roten Farbstoff Ponceau S pro 100 ml.
700886/oeO« "/25
Gemisch G; Gemisch aus
1.) 100 /uCi ^J-markiertes Trijodthyronin (Cambridge
RadiopharmaceuticaTs Corp., Billerica, MA) in 1 ml
50-%igem Propylenglykol;
2.) 20 ml von 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 5,32 g Natriumbarbital, 1,44 ml 2n Salzsäure und
2.) 20 ml von 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 5,32 g Natriumbarbital, 1,44 ml 2n Salzsäure und
1mg Kristallviolett;
3.) 50 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 50 mg
3.) 50 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 50 mg
Gentamicin pro ml und
4.) 50 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 250 mg
4.) 50 /Ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 250 mg
Humanserumalbumin pro ml.
Gemisch H; Gemisch aus
1.) 50 mg Hydroxypropylguargummi (Januar HP-11-brand der
Stein-Hall Specialty Chemical, New York, NY); 2.) 2 g mikrofein ausgefällte Kieselsäure (QUSO 32-brand
der Philadelphia Quarth Co., Valley Forge, Pennsylvania); 3.) 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von 500 mg Kristallviolett auf 100 ml und
- 4.) 150 ml Gemisch E.
- 4.) 150 ml Gemisch E.
Gemisch J:
Wäßrige Lösung, enthaltend 0,02m Natriumhydroxid und mg/100 ml Bromcresol^rot.
Die oben angegebenen flüssigen Gemische wurden dann folgendermaßen auf die Papierstreifen aufgetropft.
Aufbringpunkt vom Anfangsteil des Streifens an (mm)
54 108 185
709886/0608
•· / do
Gemisch | Volumen (/ul; |
F | 10 |
G | 10 |
H | 30 |
J | 10 |
Die Streifen wurden bei Raumtemperatur getrocknet.
Das Gemisch £ wurde als Entwicklerflüssigkeit verwendet.
Bei den in Figuren 5 bis 7 angegebenen Prüfmitteln 30 enthielt jedes (a) einen probeaufnehmenden Bereich 34
(Punkt, auf dem das Gemisch F aufgebracht worden war), der durch den roten Fleck des trockenen roten Farbstoffs
Ponceau S angegeben war, (b) Markierungskomponente im Bereich 35 (Punkt, auf dem das Gemisch G aufgebracht worden
war), enthaltend radioaktiv-markiertes Trijodthyronin, (c) Bindungsmittel im Bereich 36 (Punkt, auf dem das Gemisch
H aufgebracht worden war),enthaltend immobilisierte Kieselsäure, die imstande ist, freies Trijodthyronin zu
adsorbieren aber nicht Trijodthyronin, das an Serumproteine
gebunden ist, und (d) Endteil 37 (Punkt, auf dem
als
das Gemisch J aufgebracht worden war), enthaltend Indikator eine Kombination einer alkalischen Substanz und
eines pH-Indikators.
B. Be stimmungsve rfahren
Das in Teil B des Beispiels 1 beschriebene Verfahren wurde angewandt.
C. Prinzip des Tests
Von der durch Kapillarwirkung durch den Streifen 31 transportierten Entwicklerflüssigkeit wurde zuerst die in
dem Bereich JM aufgebrachte Serumprobe erreicht. Die fortschreitende
Entwicklerflüssigkeit trägt die Serumprobe mit zu der Markierungskomponente, die in Bereich 35 enthalten
ist, wo sie mit dem markierten Trijodthyronin vermischt
wird. Das in der Serumprobe vorhandene Thyroxin-bindende Globulin bindet eine Menge an markiertem Trijodthyronin,
709886/0608
../27
die dem Grad der ungesättigten Stellen (degree of its unsaturation)
proportional ist. Wenn das entstehende Gemisch durch das in dem Bereich 36 enthaltene bindende Mittel
hindurchgeht, wird freies markiertes Trijodthyronin,
d.h. solches, das nicht an das Thyroxin-bindende Globulin gebunden ist, von den immobilisierten Kieselsäureteilchen
adsorbiert. Nach vollständigem Durchgang der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen 31 steht die Menge an markiertem
Trijodthyronin, die in dem Bereich 36 immobilisiert
ist, in direkter Beziehung zu der prozentualen Sättigung des Thyroxin-bindenden Globulins in der Serumprobe.
D. Ergebnisse
Das Bestimmungsverfahren wurde doppelt an zwei Serumproben mit bekannten Trijodthyronin-Bindungskapazitäten
durchgeführt (ausgedrückt als prozentuale T-3-Aufnähme)
(Vergleichsseren von Lederle Diagnostics, Pearl River, NY.).
Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
Art des Serumvergleichs "RIA Vergleich I" "RIA Vergleich II"
Nr. 2945-301 2946-301
angegebene prozentuale 42,0 68,9
T-3-Aufnähme
Zählungen/min (Tausend) 10,35» 11,49 18,60, 18,02
Mittel 10,92 Mittel 18,31
Diese Daten zeigen, daß die Menge an markiertem Trijodthyronin, die sich an und nahe bei dem Falz des Prüfmittels
nach Durchgang der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen findet, eine direkte Funktion ist der prozentualen Sättigung von
Trijodthyronin-bindenden Proteinen in der untersuchten Serumprobe.
709886/0€08 ../28
3j 2729372
Beispiel 3 Test für Folsäure und deren Analoge in Serum A. Herstellung der Prüfmittel
Prüf mittel ohne Reagentien wurden hergestellt durch
Schneiden und Falten von Papierstreifen und Befestigen an einem Kunststoffstreifen auf die in Beispiel 1, Teil A, beschriebene
Weise.
Es wurden die folgenden flüssigen Gemische hergestellt.
Gemisch K
150 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 100 mg Baker
Gelatine (Doe and Ingalls Co., Medford, MA), 500 mg 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol,
100 mg Ascorbinsäure, 67 mg Natriumazid und 0,383 ml 1n Natriumhydroxid.
Gemisch L
20 ml des Gemisches K, enthaltend 20 mg ß-Lactoglobulin
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Gemisch M
0,5 ml Gemisch K, enthaltend 1,2 yuCi ^J-markierte
Folsäure (Diagnostic Biochemistry Inc., San Diego, CA).
Die oben angegebenen flüssigen Gemische und das Gemisch D aus Beispiel 1 wurden folgendermaßen auf die Papierstreifen
aufgetropft:
Gemisch Volumen (/Ul) Aufbringpunkt, gemessen vom
/ Anfang des Streifens (mm)
L | 20 | 92 |
M | 10 | 80 |
D | 10 | 185 |
709886/0608 .#/29
Eine leichte Bleistiftmarkierung wurde ebenfalls auf jedem Papierstreifen in 67 nun Entfernung vom Anfang angebracht.
Die Streifen wurden bei Raumtemperatur getrocknet.
Das Gemisch K wurde als Entwicklerflüssigkeit verwendet.
Das in den Figuren 8 und 9 angegebene Prüf mittel 30
enthielt (a) einen probeaufnehmenden Bereich 34 (angegeben
durch die Bleistiftmarkierung), (b) eine Markierungskomponente im Bereich 35 (Punkt, auf dem das Gemisch M aufgebracht
worden ist), enthaltend radioaktiv-markierte Folsäure, (c) spezifischen Bindungspartner im Bereich 36
(Punkt, auf dem das Gemisch L aufgebracht worden ist), enthaltend ß-Lactoglobulin und (d) einen Endteil 37 (Punkt,
auf dem das Gemisch D aufgebracht worden ist^ enthaltend
als Indikator eine Kombination einer Säure und eines pH-Indikators.
B. Bestimmungsverfahren
Es wurde entsprechend Teil B in Beispiel 1 gearbeitet.
C. Prinzip des Tests
Wenn die Entwicklerflüssigkeit durch Kapillarwirkung durch den Streifen 31 wandert,erreicht sie zuerst die Serumprobe
und dann die radioaktiv-markierte Folsäure. Die Folsäure und ihre Analogen, die in der Probe vorhanden sind, und
die radioaktiv-markierte Folsäure werden vermischt, wenn die Entwicklerflüssigkeit zu dem im Bereich 36 enthaltenden Bindungspartner
fortschreitet. ß-Lactoglobulin besitzt eine begrenzte Fähigkeit, Folsäure und ihre Analogen zu binden, und
daher wird, wenn das Gemisch aus Probe und Markierungskomponente durch den Bereich 36 geht, ein Teil der Folsäuremenge
und ihrer Analogen in dem Gemisch an das ß-Lactoglobulin gebunden. Wenn die Entwicklerflüssigkeit weiter über den Falz
709886/0608
../30
in dem Streifen 31 aufsteigt, werden die Komplexe aus ß-Lactoglobulin
und Folsäure oder ihren Analogen entlang dem Streifen 31 transportiert aber mit einer Geschwindigkeit, die geringer
ist als die Transportgeschwindigkeit der freien Folsäure und ihrer Analogen. Der Bereich 36 des Streifens 31 befindet sich
an einer solchen Stelle , daß bei vollständigem Durchgang der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen 31 im wesentlichen
die gesamten Komplexe aus ß-Lactoglobulin und markierter Folsäure,
die entstanden sind, sich an oder nahe bei dem Falz des Streifens 31 befinden. Die freie markierte Folsäure ist in der
Zeit bis zum Endbereich 37 transportiert worden. Daher ist die Menge an radioaktiv-markierter Folsäure, die sich an oder nahe
bei dem Falz des Streifens 31 befindet, umgekehrt proportional der Menge an Folsäure und ihren Analogen in der Serumprobe.
D. Ergebnisse
Die Bestimmung wurde doppelt an zwei Sera mit bekannten Folatgehalten durchgeführt (Vergleichssera der Lederle
Diagnostics, Pearl River, NY). Man erhielt die folgenden Ergebnisse:
Ax't des Vergleichsserums "RIA Vergleich I" "RIA Vergleich II"
Nr. 2945-301 2946-301
angegebener Folatgehalt
(bestimmt durch drei verschiedene Verfahren)
(bestimmt durch drei verschiedene Verfahren)
1. Verfahren 4,0 mg/ml 3,8 mg/ml
2. Verfahren 3,6 mg/ml 2,9 mg/ml
3. Verfahren 2,5 mg/ml 2.%2. mg/ml
Zählung/min (Tausend) 5,92, 6,06 8,49, 8,02
Mittel 5,99 Mittel 8,26
Diese Daten zeigen, daß die Menge an markierter Folsäure, die sich an oder nahe dem Falz des Prüfmittels nach
Durchgang der Entwicklerflüssigkeit durch den Streifen befindet,umgekehrt
proportional ist (indirect function) der in der untersuchten Serumprobe vorhandenen Folatmenge.
709886/0608
Claims (17)
- PatentansprüchePrüfmittel zur Bestimmung einer Eigenschaft einer Probe, bestehend aus(a) einem Streifen mit einem Anfangs- und einem Endteil und einem Teil zur Aufnahme der Probe, der sich an einer vorbestimmten Stelle befindet, wobei der Streifen aus einem Material besteht, das imstande ist, eine Entwicklerflüssigkeit durch Kapillarwirkung zu transportieren, und(b) einem Reagenssystem, das in dem Streifen an mindestens einer vorbestimmten Stelle enthalten ist und eine nachweisbare Reaktion ergibt als Funktion dieser Eigenschaft der in den probeaufnehmenden Bereich aufgebrachten Probe an einer bestimmten Meßstelle auf'dem Streifen bei Durchgang der Entwicklerflüssigkeit vom Anfang- zum Endteil hin.
- 2. Prüfmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Träger umfaßt, an dem der Streifen befestigt ist.
- 3. Prüfmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine dünne Folie aus einem inerten Material ist mit einer Breite, die im wesentlichen gleich ist der Breite des Streifens und einer Länge, die größer ist als die Hälfte, aber weniger als die Länge des Streifens, und wobei der Streifen laminatartig an dem Träger befestigt ist, wobei die Schmalseite des Streifens am Anfangteil ungefähr gleich abschließt mit dem Ende des Trägers und der Streifen quer709886/0008ORIGINAL!NSPECTED■ · 2 —über das andere Ende des Streifens gefaltet ist, wobei der Endteil des Streifens sich in einem gewissen Abstand von dem zuerst erwähnten Ende des Trägers befindet.
- 4. Prüfmittel nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die vorbestimmte Meßstelle sich an oder nahe bei dem Falz des Streifens befindet.
- 5· Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich einen Indikator im Endteil des Streifens enthält, der auf Berührung mit der Entwicklerflüssigkeit anspricht.
- 6. Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß es zur quantitativen Bestimmung eines Liganden in einer Probe einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und eine Markierungskomponente enthält, die eine markierte Form des Liganden oder einem bindenden Analogen davon umfaßt, wobei sich die Markierungskomponente und der Bindungspartner in vorbestimmten Mengen und an vorbestimmten Stellen auf dem Streifen befinden, sodaß eine meßbare Menge eines meßbaren Charakteristikums der Markierungskomponente an der vorbestimmten Meßstelle auftritt, die eine Funktion der Menge des Liganden in der Probe ist.
- 7. Prüfmittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das meßbare Charakteristikum der Markierungskomponente, wenn diese an den spezifischen Bindungspartner gebunden ist, im wesentlichen die gleiche ist wie diejenige der freien Markierungskomponente.
- 8. Prüfmittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das meßbare Charakteristikum der Markierungskomponente, wenn diese an den spezifischen Bindungspartner gebunden ist, sich von dem Charakteristikum der nicht gebundenen Markierungskomponente unterscheidet.709886/0608
- 9. Prüfmittel nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungskomponente eine radioaktive Form des Liganden oder eines bindenden Analogen davon ist.
- 10. Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß es zur quantitativen Bestimmung von Proteinen in einer flüssigen Probe eine Markierungskomponente und ein Mittel zur Kupplung der Markierungskomponente an Proteine umfaßt, wobei eine vorbestimmte Menge der Markierungskomponente sich in einem Bereich des Streifens an einer vorbestimmten Stelle befindet und eine vorbestimmte Menge des Kupplungsmittels sich in einem Bereich des Streifens an einer vorbestimmten Stelle befindet zwischen dem Endteil des Streifens und dem die Probe aufnehmenden Bereich und die Markierungskomponente sich weiter nach dem Ende des Streifens hin befindet.
- 11. Prüfmittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß es zur quantitativen Bestimmung eines speziellen Proteins das Kupplungsmittel in einem vorbestimmten Abstand von der Meßstelle im Anfangsteil davon enthält, wobei der vorbestimmte Abstand dem Abstand entspricht, den das bei Kupplung der Markierungskomponente mit dem Protein entstehende Produkt durch die Entwicklerflüssigkeit während der Zeit transportiert wird, in der die Entwicklerflüssigkeit von dem das Kupplungsmittel enthaltenden Teil bis zum Endteil des Streifens läuft.
- 12. Prüfmittel nach Anspruch 10 oder 11, dadurch g e kennzeichnet, daß die Markierungskomponente radioaktiv ist.
- 13. Prüfmittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die Markierungskomponente radioaktives Jodid ist.709886/0608
- 14. Prüfmittel nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zur quantitativen Bestimmung einer Substanz, die mit einem Reagenssystem unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert in einer Probe, wobei das Prüfmittel dieses Reagenssystem und radioaktives Jod enthält, sich eine Menge radioaktives Jodid in einem Bereich des Streifens an einer vorbestimmten Stelle befindet und eine vorbestimmte Menge des Reagenssystems sich in einem Bereich des Streifens an einer ebenfalls vorbestimmten Stelle befindet zwischen dem Endteil des Streifens und dem die Probe aufnehmenden Bereich und der Teil, der das radioaktive Jodid enthält sich näher an dem Endteil befindet.
- 15. Prüfmittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß es zur quantitativen Bestimmung einer flüssigen Probe ein Substrat für eine Oxidaseenzymreaktion enthält, die Wasserstoffperoxid bildet, und wobei das Reagenssystem das Oxidaseenzym enthält.
- 16. Anwendung des Prüfmittels nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß man(a) die zu untersuchende Probe auf den in die Probe aufnehmenden Bereich aufbringt,(b) den Anfangsteil des Streifens in eine Entwicklerflüssigkeit taucht, die durch Kapillarwirkung entlang dem Streifen transportiert werden kann,(c) den Transport der Entwicklerflüssigkeit entlang dem Streifen abbricht, wenn die Front der Entwickle rf lüssigkeit den Endbereich des Streifens erreicht hat, und(d) die entstehende Reaktion des Reagenssystems an einer vorbestimmten Meßstelle auf dem Streifen als Funktion der zu bestimmenden Eigenschaft mißt.
- 17. Anwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß man alle Stellen einer möglichen Reaktion auf dem Streifen mit Ausnahme der Meßstelle maskiert bzw. abdeckt.709886/0908
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