DE3727590A1

DE3727590A1 - Verfahren und vorrichtung zur ermittlung eines antigens oder antikoerpers in einer fluessigen probe

Info

Publication number: DE3727590A1
Application number: DE19873727590
Authority: DE
Inventors: Rainer Brodt; Guenther Dipl Chem Dr Gorka; Peter Fehse
Original assignee: Flemming GmbH
Current assignee: Flemming GmbH
Priority date: 1987-08-19
Filing date: 1987-08-19
Publication date: 1989-03-02

Description

Es gibt eine Reihe bekannter Verfahren zur Ermittlung eines An tigens in einer flüssigen Probe, bei denen man einen Festkörper, an dessen Oberfläche ein das Antigen spezifisch bindender Anti körper fixiert ist, in die flüssige Probe eintaucht und außerdem mit einem konjugierten Antikörper behandelt, der entweder di rekt mit einem Farbstoff gelabelt oder mit einem in einer Nach reaktion einen Farbstoff bildenden Enzym konjugiert ist. Wenn sich das gesuchte Antigen in der flüssigen Probe befindet, wird dieses an den auf dem Festkörper fixierten Antikörper gebunden, während der konjugierte oder gelabelte weitere Antikörper, der sich im Überschuß befindet, andererseits an das Antigen gebun den wird. Auf diese Weise bekommt man auf dem Festkörper dann eine Farbstoffixierung oder -bildung, wenn das gesuchte Antigen in der Probe enthalten ist, andernfalls nicht.

Es sind auch schon verschiedene Vorrichtungen zur Ermittlung eines Antigens in einer flüssigen Probe bekannt, wie beispiels weise aus der US-PS 46 32 901. Diese Vorrichtung besteht aus einer Hülse, die mit einem porösen Absorbensmaterial gefüllt ist, über dem sich am oberen Ende der Hülse eine querliegende Membran anschließt, über der ein Trichterteil angeordnet ist. An die Membran ist der entsprechende Antikörper gebunden, der seinerseits das Antigen binden soll.

Bei der Benutzung dieser Vorrichtung wird die zu untersuchende Probe in das Trichterteil gegossen und wird von dem Absorbens material durch die Membran hindurchgesaugt, wobei das gegebenen falls enthaltene Antigen an den an der Membran fixierten Anti körper gebunden wird.

Eine solche Vorrichtung ist allenfalls für Laboratorien geeig net, da ein bestimmtes Volumen der zu untersuchenden Probe in das Trichterteil einpipettiert werden muß, weil das untersuchte Probenvolumen nicht zu groß und nicht zu klein sein darf. Ein solches Pipettieren oder Volumenmessen kann im Heimgebrauch, beispielsweise bei Schwangerschaftstests, nicht durchgeführt werden, da die meisten Menschen im Umgang mit Einrichtungen, wie Pipetten, nicht geübt sind, so daß zu große Fehlergefahren mit solchen Methoden und Vorrichtungen verbunden sind.

Für den Heimgebrauch muß die Durchführung des Tests möglichst einfach und sicher ohne die Möglichkeit von Fehlerquellen sein.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Ermittlung eines Anti gens oder Antikörpers in einer flüssigen Probe zu bekommen, das besonders einfach und sicher durchzuführen ist und bei dem ungeübte Personen praktisch keine Fehler machen können. Insbe sondere soll bei dem Verfahren ein Zupipettieren von Flüssig keit oder eine andere Volumenmessung vermieden werden. Bevor zugt sollte sogar ein Umgießen der Probenlösung, wie Urin, ver mieden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Ermittlung eines Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Probe bei dem man die Probe mit einer porösen Membran, an die ein entsprechender An tikörper bzw. entsprechendes Antigen gebunden ist und an die sich ein Flüssigkeit aufnehmendes poröses Absorbensmaterial anschließt und einem sich an das Antigen bzw. den Antikörper bindenden konjugierten oder gelabelten Antikörper in Berührung bringt und gegebenenfalls diesen Antikörper unter Bildung eines Farbstoffes entwickelt, ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Behälter ein solches Volumen der flüssigen Probe, daß mit ihm das Porenvolumen des Absorbensmaterials nur teilweise füll bar ist, vorlegt, die Membran mit dem daran anschließenden Ab sorbensmaterial derart in die flüssige Probe eintaucht, daß diese im wesentlichen vollständig oder in einem vorbestimmten Volumen entgegen der Schwerkraft durch die Membran in das Ab sorbensmaterial gesaugt wird, und gegebenenfalls schließlich nach Entfernung der Membran aus der Probe sie in eine Entwick lerlösung eintaucht und diese entgegen der Schwerkraft in das Absorbensmaterial einsaugen läßt.

Der konjugierte oder gelabelte Antikörper kann zusammen mit der flüssigen Probe oder anschließend an diese durch die Membran gesaugt werden. Hierzu ist er entweder in der flüssigen Probe bei deren Einsaugen enthalten oder befindet sich in einer se paraten Lösung, die nach der flüssigen Probe eingesaugt wird.

Es ist wesentlich, das Absorbensvolumen und das einzusaugende Volumen der flüssigen Probe so aufeinander abzustimmen, daß beim Einsaugen der flüssigen Probe die Poren des Absorbensmate rials zur teilweise gefüllt werden. Der Grund ist der, daß das Absorbensmaterial genügende Saugkraft behalten muß, bis das erwünschte Volumen der flüssigen Probe eingesaugt ist. Dies wäre nicht der Fall wenn die Poren vorzeitig mit Flüs sigkeit gefüllt wären. Außerdem muß das Absorbensmaterial ge gebenenfalls noch Saugkapazität für anschließendes Einsaugen der Lösung des konjugierten oder gelabelten Antikörpers oder der Entwicklerlösung behalten.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man also sowohl Anige ne als auch Antikörper in der flüssigen Probe ermitteln. Im ersteren Fall ist an die Membran ein Antikörper gebunden, an den sich das gesuchte Antigen bindet, an welches sich seiner seits der konjugierte oder gelabelte zweite Antikörper bindet. Im letzteren Fall ist an die Membran ein Antigen gebunden, an welches sich der gesuchte Antikörper bindet. Der konjugierte oder gelabelte zweite Antikörper bindet sich dann seinerseits an den an das Antigen gebundenen ersten Antikörper.

Bevorzugt verwendet man als konjugierten Antikörper einen mit einem Farbstoffbildner konjugierten Antikörper, wie einen sol chen, der mit einem in einer Nachreaktion einen Farbstoff bil denden Enzym oder einer durch nachfolgende Oxidation oder Reduk tion einen Farbstoff bildenden Gruppe konjugiert ist. Durch Vermeidung eines direkt mit Farbstoff gelabelten Antikörpers erreicht man, daß in der Nachreaktion oder Entwicklung aus schließlich dann und dort Farbstoff gebildet wird, wo der kon jugierte Antikörper über das Antigen und den fixierten Antikör per bzw. über den ersten Antikörper und das fixierte Antigen an die Membran gebunden ist, und nicht anderweitig Farbstoff an der Membran adsorbiert ist, was das Ergebniss verfälschen könnte.

Die Nachreaktion oder Entwicklung des Farbstoffes ist ebenso einfach wie die Bindung des Antigens auf der Membran und bedarf einfach eines Eintauchens der Membran mit dem anschließenden Absorbensmaterial in die Entwicklerlösung. Dabei sollte das Absorbensmaterial noch ausreichend freie Poren haben, um die Entwicklerlösung durch die Membran saugen zu können, was bedeu tet, daß in der ersten Arbeitsstufe nur ein Teil des Porenvolu mens des Absorbensmaterials mit der flüssigen Probe gefüllt werden darf.

Im allgemeinen dürfte es zweckmäßig sein, zwischen dem Einsau gen der flüssigen Probe zur Fixierung des Antigens über den er sten Antikörper bzw. des ersten Antikörpers über das Antigen auf der Membran und vor dem Einsaugen der Entwicklerlösung die Membran von überschüssigem Probenmaterial und/oder konjugiertem oder gelabeltem Antikörper freizuspülen. Dies kann beispiels weise unter fließendem Wasser oder durch Eintauchen in und Ein saugen von Spülwasser geschehen.

Weiterhin ist es zweckmäßig, die flüssige Probe vor dem Einsau gen durch die Membran zu filtrieren; um feste Bestandteile da raus zu entfernen, die die Poren der Membran verstopfen könn ten.

Im vorliegenden Verfahren ist es von Bedeutung, das Probenvolu men in etwa vorzubestimmen, um einerseits zu vermeiden, daß das gesamte Porenvolumen des Absorbensmaterials mit der Probe ge füllt wird und um andererseits das Einsaugen eines zu geringen Porenvolumens zu vermeiden, da dieses üblicherweise zu wenig Antigen bzw. Antikörper auf der Membran binden und damit eine zu geringe Farbreaktion ergeben würde.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist äußerst einfach durchzufüh ren und schließt praktisch auch für ungeübte Personen Fehler quellen aus.

Mit einem sich bis zum Rand füllenden kleinen Meßbecher, der beispielsweise für einen Schwangerschaftstests in den Urinstrahl gehalten wird, wird ohne Fehlermöglichkeit ein bestimmtes Flüs sigkeitsvolumen abgemessen und in einen Probenbehälter überführt, in dem der Test gemacht wird. Stattdessen kann der Probenbehäl ter auch selbst als Meßbecher ausgebildet sein und in den Urin strahl gehalten werden. Es erübrigt sich dann das Umkippen aus dem Meßbecher in den Probenbehälter, was seinerseits eine geringe Fehlerquelle durch Verschütten beinhaltet.

In beiden Fällen wird dann der Absorbensmaterial-Behälter mit der Membran am Ende in den Probenbehälter eingetaucht, worauf die Probenlösung durch die Membran in das Absorbensmaterial ge saugt wird. Wenn ein bestimmtes Volumen der Probe oder vorzugs weise im wesentlichen die gesamte Probe eingesaugt ist, wird der Absorbensmaterial-Behälter herausgenommen, gegebenenfalls gespült und anschließend gegebenenfalls in die Entwicklerlösung eingetaucht. Nach einer bestimmten Zeit wird der Absorbensmate rial-Behälter herausgenommen und die Membran visuell hinsicht lich der Farbreaktion geprüft.

Wenn hier von einem vorbestimmten Volumen der flüssigen Probe die Rede ist, so braucht dieses nicht genau eingehalten zu wer den, sondern kann beispielsweise um 20 oder 30% schwanken, ohne das qualitative Ergebnis zu beeinträchtigen.

Die Einfachheit und Sicherheit der Testdurchführung erlaubt es, das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung für den Heimgebrauch zu verwenden. Die Vorteile sind folgende: Es ent fällt ein Einpipettieren der Probenflüssigkeit. Es erübrigt sich, die Probenflüssigkeit in einem Trichter auf die Membran aufzugießen, was die Gefahr eines Verschüttens beinhaltet. Durch einfaches Eintauchen der Membran erfolgt ein selbsttätiger Durchtritt der Probe durch die Membran ohne die Gefahr eines Verschüttens. Selbst wenn der Test etwa durch Abrufen der Test person durch ein Telefongespräch oder dergleichen stehenbleibt, erfolgt kein Austrocknen der Membran, was für das Ergebnis schädlich wäre und beispielsweise bei Vorrichtungen gemäß der US-PS 46 32 901 möglich ist.

Durch die kleine Membranfläche und ein verhältnismäßig großes Durchtrittsvolumen bekommt man eine potentiell hohe Empfindlich keit. Infolge der kleinen Membranfläche bekommt man geringe Re agenzkosten, da nur wenig erster auf der Membran fixierter An tikörper benötigt wird.

Anzumerken ist noch, daß der zweite konjugierte oder gelabelte Antikörper im Überschuß gegenüber dem ersten Antikörper bzw. da ran zu bindenden Antigen vorliegt und in dem Probenbehälter un tergebracht ist, so daß sich der zweite konjugierte oder gela belte Antikörper beim Eingießen der Probe mit dieser vermischt.

Nach einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform wird die er findungsgemäß verwendete Membran gleichzeitig mit einer Kontroll möglichkeit versehen, mittels derer gleichzeitig festgestellt werden kann, ob der Test noch in Ordnung oder etwa durch über lange Lagerung oder dergleichen unbrauchbar ist. Hierzu wird der erste Antikörper bzw. das Antigen nur auf einem Teil der Membran gebunden, während auf einem anderen Teil entweder das spezifische Antigen oder ein anderer den zweiten, konjugierten oder gelabelten Antikörper bindender Antikörper fixiert wird. In beiden Fällen wird, wenn der Test noch in Ordnung ist, der im Überschuß in der Probe vorliegende konjugierte oder gela belte zweite Antikörper gebunden. Wenn an der Membran nicht ein Antigen sondern ein vom zweiten Antikörper verschiedener Antikörper zur Bindung des zweiten Antikörpers fixiert ist, kann diese Fixierung direkt über den zweiten Antikörper oder über das an ihn gebundene Enzym erfolgen.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Vorrichtung unterscheidet sich ebenfalls wesentlich von anderen nach dem Stand der Technik verwendeten Vorrichtungen. Die erfindungsge mäße Vorrichtung mit einem porösen Membranteil, an das ein sich an das Antigen bindender Antikörper gebunden ist, und einer sich an das Membranteil anschließenden Säule eines porösen Ab sorbensmaterials ist gekennzeichnet durch einen Probenbehälter und einen rohrförmigen Absorbensmaterial-Behälter, der letzterer an einem Ende durch das Membranteil verschlossen und am anderen Ende offen ist, wobei Probenbehälter und Absorbensmaterial-Be hälter so bemessen sind, daß der Absorbensmaterial-Behälter mit der Membran nach unten in den Probenbehälter eintauchbar ist.

Wenn bei dieser Vorrichtung eine von dem Absorbensmaterial ge trennte Membran verwendet wird, ist diese aufgrund ihrer gerin gen Dicke und Flexibilität in der Gefahr, beim Eindrücken des Absorbensmaterials nach außen gebogen zu werden. Deswegen ist es zweckmäßig, zwischen dem Absorbensmaterial und der Membran einen porösen starren Stützkörper anzuordnen. Das Absorbensmate rial kann dabei stückig sein oder aus einer einstückigen Säule bestehen.

Bevorzugt ist es, wenn das Absorbensmaterial aus einer Säule be steht und einstückig mit dem Membranteil verbunden ist. Solche Absorbensmaterialien bestehen beispielsweise aus einem porigen Kunststoffstab, der an seiner einen Stirnseite einstückig mit einer porösen Membran aus einem Cellulosematerial oder derglei chen verbunden ist.

Wesentlich ist, daß das Absorbensmaterial von einer flüssig keitsundurchlässigen Hülle umgeben ist, die gewährleistet, daß Flüssigkeit in das Absorbensmaterial ausschließlich durch die Membran eingesaugt wird. Dabei kann es sich um einen rohr förmigen Metallbehälter oder um eine die Absorbensmaterialsäule umgebende flüssigkeitsundurchlässige Kunststoffhaut handeln.

Besonders in letzterem Falle kann der rohrförmige Absorbensma terial-Behälter auch zu mehreren aneinanderhängend in den Han del gebracht und im Bedarfsfall einzeln abgerissen oder abge brochen werden, und hierzu ist es zweckmäßig, zwischen den ein zelnen zusammenhängenden Absorbensmaterial-Behältern Bruchlini en oder Schwächungslinien vorzusehen, die ein leichtes Abreißen, etwa durch seitliches Umbiegen, ermöglichen.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung können auch meh rere der Absorbensmaterial-Behälter fest miteinander verbunden sein, um etwa in Laboratorien oder Arztpraxen Reihentests durch zuführen. Diese Mehrfachbehälter können beispielsweise in Ver bindung mit Verdünnungstestplatten benutzt werden, wobei die Vertiefungen in den Verdünnungstestplatten als Probenbehälter dienen. Mit einer solchen Vorrichtung können gleichzeitig meh rere Tests auf einmal gemacht werden, da die zusammenhängenden Absorbensmaterial-Behälter gleichzeitig in mehrere Vertiefungen der Verdünnungstestplatten eingetaucht werden.

Da es zweckmäßig ist, zur Vermeidung einer Verstopfung der Mem branporen feste Teilchen aus der Probe zu entfernen, bevor diese mit dem Membran in Berührung kommt, ist es bevorzugt, dem Mem branteil in Strömungsrichtung der Probe entgegen der Schwerkraft ein Filter vorzuschalten. Dieses kann eine Filterplatte sein, die unmittelbar vor der Membran liegt und an dem Absorbensmate rial-Behälter befestigt ist. Der Filter kann aber auch an geeig neter Stelle in dem Probenbehälter derart eingebaut sein, daß die gesamte flüssige Probe den Filter passieren muß, bevor sie zu der Membran gelangt.

Durch die Zeichnung wird die Erfindung weiter erläutert. In die ser bedeuten

Fig. 1 einen senkrechten Schnitt durch eine erste Ausführungs form einer Vorrichtung nach der Erfindung,

Fig. 2 einen senkrechten Schnitt durch eine zweite Ausführungs form einer Vorrichtung nach der Erfindung und

Fig. 3 eine Draufsicht auf eine bevorzugte Ausführungsform eines Adsorbensmaterial-Behälters von unten.

Die in Fig. 1 dargestellte Ausführungsform einer Vorrichtung nach der Erfindung zeigt einen Probenbehälter 1 etwa in der Form eines Reagenzglases. In diesem ist konzentrisch ein zweiter Be hälter 2 eingesetzt, der am unteren Ende von einem Filter 9 ver schlossen ist. In dem Behälter 2 ist der Absorbensmaterial-Be hälter 3 eingesetzt, der mit Absorbensmaterial 7 gefüllt ist. Das untere Ende des Absorbensmaterial-Behälters 3 ist von einer Kappe 4 verschlossen, die eine Membran 5 haltert. Zwischen der Membran 5 und dem Absorbensmaterial 7 ist ein poröses starres Stützteil 6 angeordnet.

Bei Benutzung dieser Testvorrichtung gemäß Fig. 1 wird zunächst vor dem Einsetzen des Behälters 2 und des Absorbensmaterial- Behälters 3 mit einem kleinen Meßbecher Probenflüssigkeit 8 eingegossen. Daraufhin wird der Behälter 2 mit dem Filter 9 am unteren Ende eingesetzt, wobei die Probenflüssigkeit durch den Filter 9 in den Behälter 2 hingedrückt wird. Daraufhin wird der Absorbensmaterial-Behälter 3 mit der Kappe 4 nach unten einge setzt. Daraufhin wird automatisch Flüssigkeit 8 durch die Mem bran 5 hindurch in das Absorbensmaterial 7 gesaugt. Wenn die Flüssigkeit 8 bis zur Höhe des Filters 5 eingesaugt ist, bleibt noch genügend Kapazität im Porenvolumen des Absorbensmaterials 7, um bei der Überführung des Absorbensmaterial-Behälters 3 in eine Entwicklerflüssigkeit von dieser in ausreichender Menge in das Absorbensmaterial einzusaugen.

Die in Fig. 2 dargestellte Ausführungsform einer Vorrichtung nach der Erfindung ist bevorzugt, da kein zusätzlicher Meßbe cher und kein Umgießen der Probenflüssigkeit erforderlich ist.

Der in Fig. 2 dargestellte Probenbehälter 10 besitzt einen rohr förmigen Ansatz 14, der gleichzeitig als Handgriff verwendet wird, um den Probenbehälter 10 mit der Öffnung 15 in den Urin strahl zu halten. Der Probenbehälter 10 läuft über, wenn der Raum zwischen der Öffnung 15 und dem Filter 9, der Außenwandung und der Trennwand 11 mit der Probenflüssigkeit gefüllt ist. Die ser definierte Raum begrenzt daher das im Test erwünschte Volu men der Probenflüssigkeit.

Bei kurzem Stehen läuft dann die Probenflüssigkeit so weit durch den Filter 9 in den Raum 16, bis die Flüssigkeit 8 den in der Zeichnung gezeigten Flüssigkeitsstand erreicht hat.

Sodann wird der Absorbensmaterial-Behälter 3 mit der Membran 5 nach unten in den rohrförmigen Ansatz 14 eingeführt, worauf die Flüssigkeit bis zur Höhe der Membran in das Absorbensmaterial 7 eingesaugt wird.

Bei der in Fig. 2 dargestellten bevorzugten Ausführungsform be steht das Absorbensmaterial 7 aus einer von Poren durchsetzten Kunststoffsäule, die an ihrem unteren Ende einstückig mit der Membran 5 verbunden ist und die von einer flüssigkeitsundurch lässigen Stoffhaut umgeben ist.

In Fig. 3 ist eine bevorzugte Ausführungsform der in Fig. 1 wie dergegebenen Kappe 4 des Absorbensmaterial-Behälters wiederge geben. Diese Kappe besitzt zwei voneinander getrennte Eintritts öffnungen über der Membran, wobei der Membranteil 12 den fixier ten Antikörper trägt, der für das gesuchte Antigen spezifisch ist, während der Membranteil 13 fixiertes Antigen oder einen vom konjugierten oder gelabelten zweiten Antikörper verschiedenen Antikörper trägt, wobei sowohl das Antigen als auch der andere Antikörper in der Lage sind, den zweiten Antikörper zu binden. Dieses Teil 13 der Membran dient der Kontrolle der Funktionsfä higkeit des Tests.

Selbstverständlich kommt der Probenbehälter 1 bzw. 10 den kon jugierten oder gelabelten zweiten Antikörper enthaltend in den Handel, so daß sich dieser zweite Antikörper beim Eingießen der Probe automatisch oder gegebenenfalls bei kurzem Schütteln mit der Probenflüssigkeit vermischt.

Beispiel 1

In ein rundes Gefäß, dessen Innendurchmesser 2 mm größer ist als der Außendurchmesser des Absorbensmaterial-Behälters, wer den 0,2 ml Urin pipettiert, der mit zweitem Antikörper gegen HCG⁽¹⁾, gelabelt mit alkalischer Phosphatase, gemischt ist und der jeweils 0,50, 100, 200 I.U. HCG/1 enthält. Vor das Absor bensmaterial ist eine Membran mit der Porengröße 3 µ plaziert, die mit erstem Antikörper gegen HCG auf einer Hälfte, mit HCG auf der anderen Hälfte beschichtet wurde.

Der Absorbensmaterial-Behälter (Außendurchmesser 11 mm) wird in den Urin eingetaucht und darin belassen, bis das gesamte Volumen durchgesaugt ist (ca. 30 sec). Danach wird der Absor bensmaterial-Behälter in ein zweites rundes Gefäß überführt, das eine Lösung von 3 mMol/l Indoxylphosphat in 1 M Diethanol amin, pH 9,8, enthält (0,5 ml).

Der Absorbensmaterial-Behälter wird ebenfalls hierin belassen, bis das gesamte Volumen der zweiten Lösung, die gleichzeitig als Waschlösung und als Substrat für alkalische Phosphatase dient, durch die Membran gesaugt wurde (ca. 1 min).

Folgende Resultate wurden erhalten:

Die Hälfte der Membran, die mit HCG beschichtet ist, zeigt nach Entnahme des Absorbensbehälters aus dem zweiten Gefäß eine dunkelblaue Färbung bei jeder im Experiment verwendeten Urin lösung. Die andere Hälfte, die mit Antikörper gegen HCG be schichtet ist, zeigt bei dem Urin, der kein HCG enthält, einen weißen Hintergrund, der sich im Laufe der Zeit leicht bläulich verfärbt, während bei den HCG enthaltenden Urinen eine deutli che, mit zunehmender Konzentration intensiver blau werdende Färbung sichtbar ist.

Durch kurzes Waschen der Membran in fließendem Leitungswasser (5 bis 10 sec) direkt nach Entnahme aus der zweiten Lösung kann die leichte Blauverfärbung, die sich beim Urin ohne HCG ergab, verhindert werden.

Beispiel 2

Die Durchführung geschieht analog zu Beispiel 1 mit dem Unter schied, daß zuerst der Urin aufgesaugt (0,2 ml) wird, an schließend in einem zweiten Gefäß der gelabelte Antikörper auf gesaugt wird (0,2 ml) und dann die Substrat- und Waschlösung aufgesaugt wird (0,5 ml). Die Ergebnisse sind identisch, wobei die in diesem Beispiel angeführte Durchführungsweise den Vor teil hat, daß ein positives Ergebnis auch noch bei sehr hohen HCG-Konzentrationen (über 2 000 000 I.U. HCG/l) erhalten wird, ohne daß sehr hohe Mengen an zweitem Antikörper eingesetzt wer den müssen.

Beispiel 3

Die Durchführungsweise geschieht analog zu Beispiel 1, wobei der erste Antikörper und HCG kreuzweise auf die Membran aufge bracht werden, dergestalt, daß der erste Antikörper einen Bal ken und HCG den anderen Balken des Kreuzes darstellt. Bei die ser Gestaltung zeigt bei nicht HCG enthaltenden Urinen ein Balken eine Blaufärbung, nämlich der aus HCG bestehende, was als negativ oder minus zu interpretieren ist, während bei HCG enthaltenden Urinen beide Balken eine Blaufärbung zeigen, was als positiv oder plus deutlich sichtbar wird. Gerade im Heimge brauch ist diese Version als vorteilhaft anzusehen, da sie leicht und eindeutig abzulesen ist.

Beispiel 4

Die Durchführungsweise geschieht analog zu Beispiel 2, wobei ein Teil der Membran mit Rubella⁽⁴⁾-Antikörpern aus Kaninchen, gerichtet gegen IgG⁽²⁾ aus Schafen, beschichtet ist. Es werden zunächst Humanseren (0,2 ml) in Probenbehälter pipettiert und anschließend der Absorbensbehälter in die Proben eingetaucht, bis die Gesamtmenge des Serums durchgesaugt ist (ca. 1 min).

Dann werden die Absorbensbehälter in ein zweites Gefäß über führt das Antikörper aus Schafen gerichtet gegen humanes IgG und gelabelt mit alkalischer Phosphatase, enthält (0,2 ml). Die Gesamtmenge wird durchgesaugt (ca. 1 min), dann wird in ein drittes Gefäß überführt, das gepufferte Kochsalzlösung (0,9 %) mit 0,2% Tween 20⁽³⁾, enthält (0,5 ml, Dauer ca. 90 sec).

Anschließend wird in einem vierten Gefäß Substratlösung durch gesaugt (0 5 ml, Dauer ca. 2 min).

Die entstandene Färbung kann anschließend entweder durch Spü len mit Leitungswasser, wie im Beispiel 1 beschrieben, oder durch Überführen in ein weiteres Gefäß, das wieder gepufferte Kochsalzlösung mit 0,2% Tween 20 enthält, stabilisiert werden.

Alle Seren zeigen im mit Kaninchen-Antikörper, gerichtet gegen Schafs-IgG, beschichteten Feld eine Blaufärbung, die durch die aufgebrachte Menge des Kaninchen-Antikörpers regulierbar ist und die so eingestellt wurde, daß die entstehende Blaufärbung der Menge an Antikörpern im Humanserum entspricht, die im mit Rubella-Antigen beschichteten Feld dann auftritt, wenn das Humanserum eine ausreichende Immunität gegen Rubella aufweist (in der Regel ein Titer von 1 : 8 bis 1 : 16 im Hämagglutina tionshemmtest, der als Referenzmethode dient).

Durch Vergleich der beiden Felder kann leicht festgestellt wer den, ob der Untersuchte keine ausreichende Immunität aufweist (Blaufärbung im Rubella-beschichteten Feld geringer als im Kaninchen-Antikörper-beschichteten Feld) oder die Immunität gegeben ist (Blaufärbung gleich stark oder stärker).

Es kann leicht gesehen werden, daß Tests dieser Art auf viele verschiedene Antigene und Antikörper anwendbar sind.

(1) HCG = Human-Chorion-Gonadotropin
(2) IgG = Immunglobulin G
(3) Tween 20 = Nichtionisches Detergenz, Markenname
(4) Rubella = das Röteln-Virus

Claims

Verfahren zur Ermittlung eines Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Probe bei dem man die Probe mit einer porösen Membran, an die ein entsprechender Antikörper bzw. entsprechendes Antigen gebunden ist und an die sich ein Flüssigkeit aufnehmendes poröses Absorbensmaterial an schließt, und einem sich an das Antigen bzw. den Antikörper bindenden konjugierten oder gelabelten Antikörper in Be rührung bringt und gegebenenfalls diese Antikörper unter Bildung eines Farbstoffes entwickelt, dadurch gekennzeich net, daß man in einem Behälter ein solches Volumen der flüssigen Probe, daß mit ihm das Porenvolumen des Absor bensmaterials nur teilweise füllbar ist, vorlegt die Mem bran mit dem daran anschließenden Absorbensmaterial derart in die flüssige Probe eintaucht, daß diese im wesentlichen vollständig oder mit vorbestimmtem Volumen entgegen der Schwerkraft durch die Membran in das Absorbensmaterial ge saugt wird, und gegebenenfalls schließlich nach Entfernung der Membran aus der Probe sie in eine Entwicklerlösung ein taucht und diese entgegen der Schwerkraft in das Absorbens material einsaugen läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die flüssige Probe vor dem Einsaugen durch die Membran fil triert.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß man nach dem Einsaugen der flüssigen Probe und vor dem Einsaugen der Entwicklerlösung die Membran von über schüssigem Probenmaterial und/oder konjugiertem oder gela beltem Antikörper freispült.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man die flüssige Probe mit dem konjugierten oder gelabelten Antikörper darin vorlegt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man die flüssige Probe ohne den konjugierten oder gelabelten Antikörper darin vorlegt und nach deren Einsaugen die Membran in eine Lösung des konjugierten oder gelabelten Antikörpers eintaucht und diese einsaugt.
6. Vorrichtung zur Ermittlung eines Antigens oder Antikörpers in einer flüssigen Probe mit einem porösen Membranteil, an das ein sich an das Antigen bindender Antikörper bzw. an den Antikörper bindendes Antigen gebunden ist, und einer sich an das Membranteil anschließenden Säule eines porösen Absorbensmaterials, gekennzeichnet durch einen Probenbehäl ter (1, 10) und einen rohrförmigen Absorbensmaterial-Behäl ter (3), der an einem Ende durch das Membranteil (5) ver schlossen und am anderen Ende offen ist, wobei Probebehäl ter (1, 10) und Absorbensmaterial-Behälter (3) so bemessen sind, daß der Absorbenmaterial-Behälter mit der Membran (5) nach unten in den Probenbehälter eintauchbar ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorbensmaterial (7) und die Membran (5) voneinander ge trennt sind und zwischen ihnen ein Stützkörper (6) angeord net ist (Fig. 1).
8. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorbensmaterial (7) eine Säule bildet und einstückig mit dem Membranteil (5) verbunden ist (Fig. 2).
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch ge kennzeichnet, daß der Antikörper bzw. das Antigen nur an einen Teilchenbereich (12) oder Oberfläche des Membranteils (5) gebunden ist, während an einen anderen Teilbereich (13) des Membranteils (5) des Antigen oder ein anderer Antikörper gebunden ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch ge kennzeichnet daß dem Membranteil in Strömungsrichtung der Probe entgegen der Schwerkraft ein Filter (9) vorgeschaltet ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter (9) in dem Absorbensmaterial-Behälter (3) befe stigt ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter (9) in dem Probenbehälter (10) befestigt ist.