JPH02116751A - 指示試薬およびそれを用いたアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、指示試薬およびそれを診断アッセイ
に適用することに関する。さらに詳しくは、有機ポリマ
ーラテックス粒子を標識成分としてそのような指示試薬
に用いることに関し、本発明は特にイムノアッセイにお
いて有用である。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）試験
試料（体液など）中における興味のもたれるもしくは臨
床的に重要な物質の存在および／または量を決定するた
めの診断アッセイにおいて、種々の分析手順が一般に用
いられている。これら臨床的に重要なもしくは興味のも
たれる物質は、−般に分析対象物と呼ばれている。診断
アッセイは、抗原と該抗原に対する抗体との間における
免疫反応を典型とする、分析対象物と特異的結合成分と
の間の相互反応を用いることにより、試験試料中の分析
対象物を検出するためのなくてはならない手段になって
きている。

免疫反応の検出においては、追跡可能な物質からなる標
識を用い、これを抗体のような特異的結合成分に結合さ
せ、該特異的結合成分を今度は分析対象物と結合させる
。標識抗体／分析対象物複合体または未結合標識抗体を
検出することにより、試験試料中の分析対象物の存在ま
たは量を決定する。

免疫反応法として一般に用いられているのはラジオイム
ノアッセイ（以下、ｒＲＩＡＪともいう）および酵素イ
ムノアッセイ（以下、ｒＥＩ　ＡＪともいう）の２つで
あって、両者ともに標識特異的結合成分、すなわち指示
試薬を使用する。ＲＩＡでは、特異的結合成分に結合し
た追跡可能な物質として放射性同位体を使用する。放射
性同位体は非常に少量で検出することが可能なので、Ｒ
ＩＡは少量の分析対象物を検出または定量するために用
いられる。しかしながら、ＲＩＡには数多くの実質的な
欠点がある。これらの欠点には、放射性物質を取り扱う
のに特別の設備と細心の注意を要すること、そのような
試薬のコストが高いこと、および特別の廃棄物処理の必
要があることが含まれる。

ＥＩＡでは、特異的結合成分に結合した標識として５Ｉ
素を用い、免疫反応を検出するのに酵素活性を利用する
。ＥＴＡはＲＩＡと同じ欠点は有しないが、多くのＥＩ
Ａ法では検出可能な酵素反応を引き起こすために基質を
添加することが要求される。加えて、酵素は温度感受性
であるため、−般に４５°Ｃの出荷温度のような上昇温
度では安定性が低下する。

最近になって金属ゾル粒子を標識として用いるアッセイ
法が開発された。これらの方法では、金属（たとえば、
金、銀、プラチナなど）、金属化合物、または金属もし
くは金属化合物でコーティングした非金属物質を用いて
粒子の水分散液を生成させる。標識すべき特異的結合成
分を、吸着によって金属ゾル粒子上にコーティングする
。このような金属ゾル粒子は、視覚によって検出するこ
ともでき器具によって測定することもできるシグナルを
生成するという利点を有するが、そのような有用性にも
かかわらず無機粒子は幾つかの欠点を有する。すなわち
、金属粒子は色強度に制限があるため、アッセイにおい
て検出を容易にするためにはそのような標識の量を増加
させる必要があるということである。加えて、金のよう
な無機金属コロイド粒子の表面は、特異的結合成分が容
易に共有結合しない。従って、結合アッセイでの使用に
際して、無機粒子に吸着している特異的結合成分が他の
タンパク質または界面活性剤を代わりに用いることおよ
び洗浄に伴う剪断力により除かれないように注意を要す
る。

イムノアッセイ試薬において標識として用いる粒子はま
た、染料ポリマーからも生成されている。

この種のものにおいては、染料分子、すなわち色原体モ
ノマーを重合させて発色ポリマー粒子を生成させている
。染料粒子は、ついでアッセイに使用するために特異的
結合成分と結合させることができる。そのような染料の
例としては、コンゴーレッド、トリパン（Ｔ　ｒｙｐａ
ｎ）ブルーおよびリッサミン（Ｌ　ｉｓｓａｍｉｎｅ）
ブルーが挙げられる。

（課題を解決するための手段） 本発明は、試験試料中の分析対象物の存在または量を決
定するのに有用な指示試薬であって、（ａ）複数の実質
的に非発色性の七ツマ−からなる有機ポリマーラテック
ス粒子であって、該粒子の吸光度特性が実質的に重合過
程に基づくものであるもの：および （ｂ）該粒子に結合した特異的結合成分からなる指示試
薬：および 試験試料中の分析対象物の存在または量の決定方法であ
って、 （ａ）試験試料を指示試薬および捕捉試薬と連続的にま
たは同時に接触させ、その際、該指示試薬は上記のもの
であって特異的結合成分に結合した有機ポリマーラテッ
クス粒子からなり、その際、該指示試薬の該特異的結合
成分は、サンドイッチアッセイにおける分析対象物、競
合アッセイにおける捕捉試薬および間接アッセイにおけ
る補助特異的結合成分よりなる群から選ばれた物質に対
して特異的であり、 （ｂ）該指示試薬を、分析対象物、捕捉試薬、補助特異
的結合成分およびそれらの組合わせよりなる群から選ば
れた物質と結合させ、 （ｃ）該指示試薬を検出し、ついで （ｄ）試験試料中の分析対象物の存在または量を決定す
る ことを特徴とする方法を提供するものである。

本発明は、試験試料中の分析対象物の存在および／また
は量を決定するための指示試薬、アッセイ法および試験
キットに関する。本発明の指示試薬は、複数の非発色性
モノマーからなる有機ポリマーラテックス粒子である標
識が、特異的結合成分に直接または間接に結合したもの
からなる。本発明のアッセイ法は、試験試料を捕捉試薬
および指示試薬と接触させ、指示試薬を試験試料中の分
析対象物または捕捉試薬に結合させ、指示試薬を視覚も
しくは器具により検出し、それから試験試料中の分析対
象物の存在および／または量を決定することを特徴とす
る。本発明の試験キットは、本発明の指示試薬およびア
ッセイに使用される他の試薬からなる。有機ポリマーラ
テックス粒子は視覚で検出可能な発色粒子であるのが好
ましく、その具体例としては、ポリ（ピロール）、ポリ
アセチレン、ポリフェニレン、ポリ（アニリン）、ポリ
（チオフェン）、ポリ（ナフタレン）、ポリ（チオフェ
ノール）、ポリ（ｐ−フェニレンジエチニル）およびそ
れらの誘導体などのポリマーが挙げられる。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

すでに述べたように、本発明は、試験試料中の分析対象
物の存在および／または量を決定するための指示試薬、
アッセイ法および試験キットに関するが、その際、指示
試薬は特異的結合成分に直接または間接に結合した有機
ポリマーラテックス粒子からなる。本発明の好ましい態
様において、実質的に無色の有機モノマーを重合させて
発色有機ポリマーコロイドを生成させ、しかる後に特異
的結合成分（たとえば抗体）を該発色ポリマー粒子に直
接または間接に結合させる。たとえば、特異的結合成分
を粒子上に吸着させることもできるし、または特異的結
合成分が粒子に共有結合できるように粒子を官能的に適
合させることもできる。

本発明の種々の態様について記載する前に、幾つかの用
語の定義をする。本発明の指示試薬を用いることのでき
る種々のアッセイ法もまた記載する。

ｌ−堕 本明細書にいう「特異的結合成分」とは、特異的結合ペ
アの成分、すなわち、２つの異なる分子のうち一方の分
子が化学的または物理的手段により第二の分子に特異的
に結合するようなものをいう。

抗原と抗体との特異的結合ペアに加えて、他の特異的結
合ペアの例としては、ビオチンとアビジン、炭水化物と
レクチン、相補的ヌクレオチド配列（標的核酸配列を検
出するためのＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイに
用いられるプローブおよび捕捉核酸配列を含む）、相補
的ペプチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、
酵素補助因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などが挙げられ
る。さらに特異的結合ペアには、もともとの特異的結合
成分の類似体成分も含まれる。たとえば、分析対象物の
断片の誘導体すなわち分析対象物類似体も、分析対象物
と共通のエピトープを少なくとも１つ有している限り使
用可能である。免疫反応性特異的結合成分の例としては
、抗原、ハプテン、抗体、およびそれらの複合体（組換
えＤＮＡ法またはペプチド合成により生成したものを含
む）が挙げられる。

本明細書にいう「分析対象物」とは、本発明により試験
試料中で検出すべき物質をいう。分析対象物は、それに
対する天然の特異的結合成分（たとえば抗体）が存在す
るか、またはそれに対する特異的結合成分を調製するこ
とのできる物質であればいかなるものであってよく、分
析対象物はアッセイ中の１または２以上の特異的結合成
分と結合することができる。分析対象物にはまた、抗原
性物質、ハプテン、抗体およびそれらの組合わせも含ま
れる。分析対象物には、タンパク質、ペプチド、アミノ
酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、医薬（治療目的
で投与するものおよび不法目的で投与するものを含む）
、細菌、ウィルス、およびこれら物質の代謝産物または
これら物質に対する抗体が含まれる。

本明細書にいう「指示試薬」とは、特異的結合成分に直
接または間接に付着した検出可能な標識をいう。本発明
の検出可能な標識は、有機ポリマーラテックス粒子であ
る。

本発明にいう「捕捉試薬」とは、分析対象物または指示
試薬を結合させることができ、かつ実質的に固体の物質
に直接または間接に付着することのできる特異的結合成
分をいう。固相：捕捉試薬複合体は、アッセイの結合成
分および未結合成分を分離させるために用いることがで
きる。

本明細書にいう「補助特異的結合成分」とは、捕捉試薬
および指示試薬の特異的結合成分とは別に用いられる特
異的結合成分であって、最終的な結合複合体の一部とな
るものをいう。！または２以上の補助特異的結合成分を
アッセイに用いることができる。たとえば、補助特異的
結合成分は、アッセイにおいて、指示試薬が補助特異的
結合成分に結合することができ、該補助特異的結合成分
が今度は分析対象物に結合することのできるような場合
に用いることができる。

■、試薬および物質 一般に結合アッセイにおいては、試験試料中の分析対象
物の存在または量を検出するための指示試薬、および観
察を容易にするために分析対象物を試験試料から分離す
るための固相：捕捉試薬が用いられる。所望のアッセイ
法に従って任意の物質を存在させることができ、またア
ッセイ法自体を変化させることもできる。たとえば、均
一イムノアッセイの場合のように固相を含まないように
することもできる。

（ａ）指示試薬： 本発明において、指示試薬は、特異的結合成分に直接ま
たは間接に付着した、検出可能な標識としての有機ポリ
マーラテックス粒子からなる。有機ポリマーラテックス
粒子かまたは特異的結合成分を変えることにより、種々
の異なる指示試薬を生成させることができる。たとえば
、本発明の指示試薬には、黒色ポリ（ピロール）ラテッ
クス粒子に付着したモノクローナル抗体または青紫色ポ
リ（アニリン）ラテックス粒子に付着した合成ペプチド
配列が含まれる。一般に指示試薬は、相補的な特異的結
合成分により捕捉された後に検出または測定されるが、
アッセイの結果を決定するために未結合指示試薬を測定
することもできる。

免疫反応性特異的結合ペアの抗原または抗体成分に加え
て、指示試薬の特異的結合成分はいかなる特異的結合ペ
アの成分であってらよい。免疫反応性の特異的結合成分
は、サンドイッチアッセイの場合におけるように分析対
象物に、競合アッセイの場合におけるように捕捉試薬に
、または間接アッセイの場合におけるように補助特異的
結合成分に結合することのできる、抗体、抗原、または
抗体／抗原複合体であってよい。抗体を用いる場合には
、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片
、組換え抗体、それらの混合物、または抗体と他の特異
的結合成分との混合物であってよい。そのような抗体の
調製法およびそのような抗体が特異的結合成分としての
使用に適していることは、当業者によく知られている。

（ｂ）捕捉試薬： 本発明の捕捉試薬は、サンドイッチアッセイの場合にお
けるように分析対象物に対して、競合アッセイの場合に
おけるように指示試薬および分析対象物に対して、また
は間接アッセイの場合におけるようにそれ自身分析対象
物に特異的な補助特異的結合成分に対して特異的な特異
的結合成分であってよい。従って、特異的結合成分は、
指示試薬の特異的結合成分の場合と全く同じように、他
の成分と特異的に結合することのできるいかなる分子で
あってもよい。固相アッセイにおいては、捕捉試薬は固
相物質に付着される。固相は、捕捉試薬に結合した分析
対象物および他の試薬を試験溶液から分離するのを可能
にする。一般に特異的結合成分と固相物質との結合は実
質的に不可逆的であり、共有結合も含まれる。

本発明のアッセイ装置は多くの形態をとることかでき、
その幾つかは固相に選択した物質に依存する。しばしば
固相物質は、あらゆる適当なりロマトグラフ物質、吸湿
性物質、多孔質物質または毛管物質である。本発明にお
いて固相には、ｌまたは２以上のアッセイ試薬を含有す
る１または２以上の層を有するフロースルー（ｆ　ｌｏ
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）アッセイ装置に使用するためのＩ
ＩＩガラス、セルロースまたはナイロンパッド；デイツ
プ・アンド・リード（ｄｉｐ　ａｎｄ　ｒｅａｄ）アッ
セイのためのデイツプスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）
；単一ストリップまたは固相物質の別々のゾーン中に１
または２以上の試薬が含まれているクロマトグラフ法の
ための試験ストリップ（たとえば、紙またはガラス繊維
）または薄層クロマトグラフのための試験ストリップ（
たとえばニトロセルロース）：または当業者によく知ら
れた吸着物質が含まれる。固相物質にはまた、ポリアク
リルアミドビーズ、ポリスチレンビーズまたはチューブ
、マグネティックビーズ、マイクロタイタープレートま
たはガラスまたはプラスチック試験管が含まれるが、こ
れらに限られるものではない。

固相物質としては、天然物質、合成物質、または合成的
に修飾した天然物質を用いることができ、多糖類、たと
えば紙やセルロース誘導体（酢酸セルロース、ニトロセ
ルロースなど）のようなセルロース物質；シリカ；ケイ
素粒子；不活化アルミナのような無機物質、または多孔
質ポリマーラテックス中に均一に分散した他の無機細粉
物質（この場合、ポリマーとしては塩化ビニル、プロピ
レンとの塩化ビニルコポリマー、および酢酸ビニルとの
塩化ビニルコポリマーなど）；天然に存在する布（たと
えば綿）および合成布（たとえばナイロン）；シリカゲ
ル、アガロース、デキストラン、およびゼラチンのよう
な多孔質ゲル：ポリアクリレートのようなポリマー性フ
ィルム：タンパク質結合成分などを用いることができる
。固相物質は妥当な強度を有しているかまたは支持体に
よって強度が提供されることが必要であり、また検出可
能なシグナルの生成を妨害してはならない。

しかしながら、本発明の捕捉試薬は、固相物質に結合し
た特異的結合成分に限られるものではない。凝集アッセ
イにおいては、ウシ血清アルブミンのような可溶性の担
体物質に捕捉試薬の特異的結合成分を結合させることも
できる。

（ｃ）補助物質。

捕捉試薬の特異的結合成分を粒子（たとえば微細粒子）
に任意に付着さけることができる。これらの微細粒子は
固相物質としての役目を果たし、カラム中に保持するか
、可溶性試薬と試験試料との混合物中に懸濁させるか、
または他の固相基体物質により固定化させることができ
る。ここで［保持および固定化」とは、固相基体物質に
結合した微細粒子が、該固相基体物質内のいかなる位置
へも実質的に移動できないことを意味する。微細粒子は
、あらゆる適当なタイプの粒状物質（ポリスチレン、ポ
リメチルアクリレート、ポリプロピレン、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネ
ートまたは同様の物質から構成されるものを含む）から
当業者により選択することができる。微細粒子の大きさ
は重要ではないが、固相基体物質を用いた場合の平均孔
径よりも微細粒子の平均粒径の方が小さいことが好まし
い。微細粒子および固相基体物質を用いたアッセイ装置
は、アボット・ラボラトリーズの出願による米国特許出
願第２１７，４０３号明細書に開示されている。

本発明はまた、本発明のアッセイ法を行うための試薬お
よび他の成分を含むキットをも提供する。

たとえば、本発明のキットは、指示試薬および所望のア
ッセイ法を行うのに必要な他のあらゆる試薬からなって
いてよい。緩衝液、安定化剤および細菌抑制剤のような
他の成分が含まれていてもよい。

■９診断アッセイ 本発明の有機ポリマー標識は、種々のイムノアッセイ様
式において使用することができる。しかしながら、本発
明はイムノアッセイに限定されるものではない。一般に
、特異的結合成分および本発明の有機ポリマーラテック
ス粒子のような検出可能な標識を使用するいかなるアッ
セイ態様も行うことができる。

一般に結合アッセイは、均一アッセイと不均一アッセイ
との２つの主要なアッセイの１つに類別される。均一ア
ッセイにおいては、反応成分または試薬は試験溶液中に
存在して、指示試薬により生成したシグナルを検出する
前には分離されることはない。一方、不均一アッセイに
おいては、固相物質を用いて結合反応成分を未結合反応
成分から分離させるか、または最初の溶液の試薬を沈澱
させた後に試袷溶液から取り除く。本発明の指示試薬は
、結合形態と未結合形態との両方で検出可能であり、均
一アッセイおよび不均一アッセイの両方で使用すること
ができろ。これらのアッセイは、さらにザンドイッヂア
ッセイ、競合アッセイおよびこれらの変法に分けること
ができる。

本発明の指示試薬は、種々のタイプの結合アッセイに適
用することができる。つぎに抗原および抗体分針対象物
のアッセイのための幾つかのタイプの例を図示して説明
する。しかしながら、抗原まｊコは抗体以外の分析対象
物のためのアッセイであって本発明の発明概念を適用し
得ろアッセイを含む他の多くのタイプのアッセイも、当
業者により想起され得ることを認識４−る必要かある。

不均一アッセイ （１）直接アッセイ： 指示試薬の特異的結合成分は、捕捉試薬の特異的結合成
分と同じであっても同じでなくてもよい。

抗原および抗体分析対象物は、上記反応様式に従って測
定することができる。その他の反応様式としては下記の
ものが挙げられるが、これらに限られるものではない。

固相：捕捉試薬　　　　分析対象物 指示試薬 固体匈 油 ＾ｂ−標識 的に結合し、該補助特異的結合成分が今度は分析対象物
と結合する。

固体：ＡｂＰＱＡｂＡｂ−標識 ある場合には、以下のように分析対象物を固相上に直接
結合させることも好ましい。

固体−Ａｇ 鳩 へ〇、標識 （２）間接アッセイ： この種のアッセイでは、検出可能な結合複合体を生成さ
せるために、指示試薬および捕捉試薬とともにさらに別
の特異的結合成分を用いる。たとえば、補助特異的結合
成分を用いることができ、その際、指示試薬は該補助特
異的結合成分と特異別法として、捕捉試薬、分析対象物
および指示試薬からなる均一な混合物中でサンドイッチ
複合体を前景て生成させ、ついで結合指示試薬を検出す
るために該サンドイッチ複合体を混合物から分離させる
ことができる。こういったアッセイは、第一の荷電物質
に結合した捕捉試薬を用い、ついで該第−の荷電物質に
関して反対に荷電した固体物質に接触させることによっ
て反応混合物から反応複合体を分離させることによって
行うことができる。このアッセイ法は、アボット・ラボ
ラトリーズの出願による米国特許出願第１５０，２７８
号明細書に開示されている。

（３）競合アッセイ： 固相：捕捉試薬 試験試料中の分析対象物および指示試薬の特異的結合成
分の両方が、捕捉試薬の特異的結合成分と結合すること
ができる。かくして結合した指示試薬の量は、試験試料
中の分析対象物の量を反映する。補助特異的結合成分も
また競合アッセイに用いることができる。本発明の指示
試薬を用いたサンドイッチアッセイおよび競合アッセイ
を以下に一般化して例示する。本発明の指示試薬を用い
て行う好ましいアッセイ手順については、以下の実施例
に挙げである。

固相サンドイッチアッセイにおいては、用いる固相は捕
捉試薬を含んでいる、すなわち特異的結合成分が固体支
持体に結合している。捕捉試薬が免疫反応剤であるとき
は、捕捉試薬は目的とする分析対象物に特異的な抗体、
抗原、またはそれらの複合体であってよく、また抗体を
用いるときは抗体はモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体、抗体断片、または組換え抗体、並びにそれ
らの混合物、まかば抗体と他の特異的結合成分との混合
物であってよい。捕捉試薬を、分析対象物を含んでいる
と思われる試験試料、および標識した第二の特異的結合
成分を含む指示試薬、たとえば有機ポリマーラテックス
粒子で標識した抗体と接触させる。試薬の添加は、単独
または組み合わせて同時または連続的に行うことができ
る。結合反応の結果、固相物質上に固定化された捕捉試
薬／分析対象物／＠示試薬複合体が生成される。アツセ
イにはまた、得られた複合体を過剰の試薬および試験試
料から分離する工程も含まれる。固相上に保持された複
合体の検出は、指示試薬について固相を調べることによ
り行う。分析対象物が試料中に存在しているなら固相物
買上に標識が存在する。固相上の標識の量は試料中の分
析対象物の量の関数である。

本発明の方法は、順（ｆｏｒｖａｒｄ）アッセイ、逆ア
ッセイおよび同時アッセイを含むあらゆるアッセイ形態
を用いて行うことができる。一般に類アッセイでは試験
試料を捕捉試薬に接触させ、ついで、ある期間インキュ
ベートし、さらに指示試薬を加える。逆アッセイでは指
示試薬を試験試料に加え、ある期間インキュベートした
後に捕捉試薬を加える。同時アッセイでは、捕捉試薬と
指示試薬とを同時に試験試料に接触させるので単一のイ
ンキュベーション工程しか含まない。

本発明はさらに、捕捉試薬／分析対象物／分析対象物特
異的結合成分／指示試薬複合体の生成を伴って間接サン
ドイッチアッセイにおいても用いることかできる。この
場合の分析対象物特異的結合成分は補助特異的結合成分
である。

本発明はまた競合アッセイにおいても用いることができ
る。固相競合アッセイ形態においては、固相は固体支持
体に付着した捕捉試薬を含み、試験試料および指示試薬
の両方と接触させる。しかしながら、指示試薬は有機ポ
リマーラテックス粒子で標識した分析対象物または分析
対象物類似体から生成させる。結合反応が起こって、（
１）固定化捕捉試薬／分析対象物複合体および（２）固
定化捕捉試薬／指示試薬複合体が生成する。競合アッセ
イでは固相上の標識の量は試料中の分析対象物の量に反
比例する。従って、陽性の試験試料はシグナルの減少を
もたらす。

たとえば、テオフィリンアッセイにおいては、抗テオフ
ィリン抗体（モノクローナルかまたはポリクローナル捕
捉試薬）を固体支持体上にコーティングして固相を生成
させる。この抗体への結合に関し、有機ポリマーラテッ
クス粒子標識テオフィリンの指示試薬と試験試料中の未
標識テオフィリンとの間で競合が確立される。免疫反応
の結果、テオフィリンが試験試料中に存在しないときま
たは閾値量のテオフィリンが存在しないといは固定化捕
捉試薬／指示試薬複合体が生成する。試験試料中のテオ
フィリンレベルが増加すると固相に結合した指示試薬の
量が減少する。

均一アッセイ 均一アッセイは、指示試薬の観察に先立って試験溶液と
指示試薬の分離を必要としない。この広い分類には、本
発明の指示試薬を用いた下記のようなものや当業者に明
らかなものなどの多くの形態が含まれる。

均一アッセイの主要カテゴリーは凝集アッセイであり、
これはまた本発明の指示試薬を用いて行うことができる
。凝集反応およびその手順については当該技術分野でよ
く知られている。典型的な凝集反応は、分析対象物特異
的結合成分の存在下、懸濁液中で分析対象物を一緒に凝
集させることからなる。この図芯成分の凝集をモニター
して、検出しようとする分析対象物の存在または量を決
定する。凝集反応のモニターは、反応成分、たとえば特
異的結合成分を有機ポリマーラテックス粒子で標識し、
凝集反応物かまたは非凝集反応物に付随するシグナルを
検出することによって行うことができる。シグナルの検
出は、反応媒体の凝集を観察すること、重力場での指示
試薬の沈降またはベレット化、光散乱の変化、または指
示試薬のスペクトル特性の変化により視覚的に行うこと
ができる。

（１）直接アッセイ： 指示試薬　分析対象物　指示試薬　分析対象物指示試薬 直接凝集アッセイにおいてもまた、指示試薬は、有機ポ
リマーラテックス粒子標識に直接または間接的に付着し
た分析対象物特異的結合成分からなる。多価分析対象物
の存在下、２またはそれ以上の標識した特異的結合成分
が分析対象物に結合し、指示試薬と分析対象物とを凝集
させる。凝集の増加は、試験試料中に存在する分析対象
物量の増加を示している。

（２）間接／競合アッセイ： 間接凝集アッセイは補助的結合成分を用いて行うことが
でき、該補助的結合成分は指示試薬への結合について分
析対象物と競合する。こういったアッセイ形態は、単価
分析対象物の分析にとりわけ有用である。このアッセイ
においては、１以上の補助的結合成分を担体物質に付着
させ、指示試薬および試験試料と接触させる。分析対象
物が存在しないかまたは閾値未満のレベルであるときは
、１以上の指示試薬の担体物質への結合により凝集が起
こる。一方、分析対象物が試験試料中に存在するときは
、分析対象物は指示試薬に競合的に結合し、そのことに
よって指示試薬の担体物質への結合をブロッキングする
。よって分析対象物の存在は指示試薬の凝集の減少によ
って示される。

■、有機ポリマーラテックス粒子 本発明のポリマー粒子は、非発色性モノマーを重合する
ことによって生成させる。ここで非発色性モノマーとは
、有機モノマーであって顔料または染料のいずれでもな
く、未重合では検出可能な標識として使用するには不適
当な色または吸光度特性を有するものをいう。生成ポリ
マー粒子は、出発モノマーが吸収しない１または２以上
の波長において可視領域、紫外領域または赤外領域の光
を吸収する。ポリマー粒子の吸光度特性は、重合過程の
結果生成する長い結合構造によるものである。従って、
ポリマー粒子の特徴的な色または吸光度は、出発物質の
モノマーの色や吸光度、あるいは染料や顔料（すなわち
色原体）の添加によるよりもむしろポリマー粒子の構造
に基づくものである。たとえば、純粋な七ツマーピロー
ルは実質的に非発色性物質であるが、ポリ（ピロール）
ラテックス粒子は、長い結合構造および不対非局在電子
（安定ラジカル）のため黒色である。アニリンは実質的
に非発色性モノマーであるが、ポリ（アニリン）ラテッ
クス粒子は、重合中のポリマーの酸化レベルに依存して
黄色から青紫色にわたる色を有する。「実質的に」非発
色性であるとは、モノマーの純粋形態は一般に透明かま
たは無色であるが、不純物の存在によってモノマーに色
が付くことがあるという事実を意味する。

本発明の有機ポリマーラテックス粒子は、少なくとも６
つのクラスに分けることができる。第一のクラスは、単
一の非発色性モノマー物質からなるポリマー粒子である
。そのようなポリマー粒子の例としては、ポリ（ピロー
ル）；ポリアセチレン；ポリフェニレン；ポリ（アニリ
ン）；ポリ（チオフェン）：ポリ（ナフタレン）；ポリ
（チオフェノール）；ポリ（ｎ−メチルピロール）、ポ
リ（ｎ−ベンジルピロール）、ポリ（ｎ−フェニルピロ
ール）［たとえばポリ（１−フェニル２．５−ピローリ
レン）］およびポリ（ｐ−フェニレンジエチニル）すな
わち（−ｃ＝ｃ−ＣａＨ。

ａ＝Ｃ−）：およびそれらの等価物からなる粒子が挙げ
られるが、これらに限られるものではない。

ポリマー粒子の第二のクラスは、重合により発色ポリマ
ーを生成する非発色性モノマーと、重合により一般に８
色ポリマーを生成しない非発色性モノマーとの混成から
なるしのである。混成粒子は、上９己ポリマーのｌｆｌ
またはそのオリゴマーを、ポリ（塩化ビニル）、ポリス
チレンおよびポリ（ビニルトルエン）のような成形可能
なポリマー物質並びにポリ（アクリルアミド）およびポ
リ（Ｎ−ビニルピロリドン）のような親水性ポリマー物
質、およびそれらの誘導体と組み合わせることにより生
成することができる。混和物質からなる混成粒子は、粒
子標識の加工を容易にする。

第三のクラスは、少なくとも２種の異なる非発色性モノ
マーの繰り返し単位を有するポリマー粒子である。従っ
て、コポリマーを生成することができ、本発明による標
識として用いることができる。コポリマーの例としては
、ポリ（ピロールチオフェン）およびポリ（ピロール−
フェニレン）が挙げられるが、これらに限られるもので
はない。

有機モノマーとしては、ピロール、ベンゼン、トルエン
、アニリン、チオフェン、ナフタレン、チオフェノール
および同等の芳香族モノマー；アセチレンおよび同等の
非芳香族モノマー；およびそれらの誘導体が挙げられる
。

ポリマー粒子の第四のクラスは、複数の非発色性モノマ
ーの重合によって生成したポリマーをコーティングする
ことのできる有機または無機核である。たとえば、金属
コロイド粒子を発色有機ポリマーラテックスでコーティ
ングすることができる。

第五のクラスは、複数の非発色性のモノマーを重合して
生成した実質的に無色のポリマー粒子からなり、これを
染料または顔料ではない物質とさらに反応させると発色
ポリマー粒子となるものである。そのようなポリマー粒
子の例としては、ポリ（フェニレンスルフィド）が挙げ
られ、これは通常は透明で実質的に無色のポリマー物質
であるが、五フッ化ヒ素とさらに反応させると青−緑、
最終的に青−黒色になる。

第六のクラスは、複数の非発色性モノマーからなり重合
によって検出可能なフリーラジカルを有する粒子を生成
するが、生成した粒子は発色させまたは実質的に無色と
することができるものである。そのような無色の粒子は
視覚的には検出することができないが、これら粒子の安
定なフリーラジカル特性により電子常磁性共鳴分光計で
検出および測定することが可能である。

本発明のポリマー粒子は、特異的結合成分を標識するた
めに用いることができ、標識された特異的結合成分は種
々の結合アッセイ法に使用するための指示試薬となる。

本発明のポリマー粒子は、上記均一アッセイ法および不
均一アッセイ法の両者において用いることができるが、
上記間接サンドイッチイムノアッセイのような不均一固
相アッセイに用いるのが好ましい。さらに、試験試料中
の分析対象物の存在または量を決定するのに標識の直接
的な視覚観察に依存する固相アッセイにおける標識とし
て用いるのが最も好ましい。本発明は上記結合アッセイ
法に用いることができるのみならず、本明細書に開示の
発明概念から離れない限り他の均一および不均一特異的
結合アッセイを行うために当業者により改変することが
できる。

たとえば、本発明の有機ポリマーラテックス粒子は、組
織学、比濁分析および組織化学における標識成分として
用いるために改変することができる。

有機ポリマーラテックス粒子のサイズは重要ではなく、
特定のアッセイ形態または所望の吸光度に従って変わる
。粒子のサイズを含むアッセイのすべての要素および試
薬の最適化は、当業者により日常的な試験を用いて決定
することができる。

実質的に約１０ｎｍ〜約１５μ肩の範囲のサイズの粒子
を公知のアッセイ形態において用いることができる。粒
子のサイズは、実質的に約５０ｎｍ〜約１．０μ肩の範
囲であるのが好ましく、実質的に約１１００ｎ〜約５０
０ｒ＋ｎ＋の範囲であるのが最も好ましい。

本発明の有機ポリマーラテックス粒子は、直接視覚観察
することによって検出するか、または簡単な比色計、反
射計もしくは濃度計のような器械により測定することが
できる。加えて、本発明の粒子物質の安定なフリーラジ
カル特性により、粒子の電子常磁性共鳴を検出および測
定することもできる。ポリマー粒子標識が光を可視スペ
クトルにおいて吸収しない場合には、適当な器械手段に
より検出することが必要である。別の場合Ｉこは、存在
する指示試薬の量を定量するために器械手段が必要とさ
れる。ポリマー粒子は、使用を容易ならしめるため視覚
で検出可能なことが好ましい。

有機特異的結合成分を有機ポリマーラテックス粒子標識
に共有結合的に付着させて本発明の指示試薬を生成させ
ることは比較的容易である。特異的結合成分の該粒子へ
の付着は、吸着、結合基または表面の官能基により行う
ことができる。特異的結合成分を標識表面に共有結合的
に付着させることにより、表面濃度の増加および置換に
対する安定性が達成される。共有結合的付着は、カルボ
キシル基、アミノ基、アルデヒド基、ブロモアセチル基
、ヨードアセチル基、チオール基、エポキシ基および他
の反応性もしくは結合基並びに残留フリーラジカルおよ
びラジカルカチオンを用いて行うことができ、これによ
りタンパク質結合反応を達成することができる。ポリマ
ー粒子の表面は極性基の表面心変が比較的高いので、表
面官能基は官能化コモノマーとして導入することができ
る。

本発明の有機ポリマーラテックス粒子は一般に合成後に
官能化されるか、ある場合（たとえばポリ（チオフェノ
ールン）には、さらに修飾することなく粒子をタンパク
質に直接共存結合的に結合することができる。

有機ポリマーラテックス粒子の調製： （ａ）ポリ（ピロール）ラテックス粒子；「エークアス
・ディスバージョンズ・オブ・エレクトリカリ−・コン
ダクティング・モノデイスパース・ポリ（ピロール）・
パーティクルズ（Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏ
ｎｓ　ｏｒ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ　Ｃｏｎｄｕｃ
ｔｉｎｇ　Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｐｏ１ｙ（ｐｙ
ｒｒｏｌｅ）　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）Ｊ（ニス・ピーψ
アームズ（Ｓ　、　Ｐ　、　Ａｒ＋ｏｅｓ）ら、Ｊ　ｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ　Ｉ　ｎｔ
ｅｒｆａｃｅ　５ｃｉｅｎｃｅＳＩ　Ｉ８：４１０〜４
１６．１９８７）に記載の変更法に従い、ポリ（ピロー
ル）ラテックス粒子を調製した。

６インチの未充填カラムを用い、試薬グレードピロール
（アルドリッチ・ケミカル、ミルウォーキー、ｗＢを真
空蒸留した（５３℃、３５ｚｘ）Ｉｇ）。

ポリ（ビニルアルコール８０．２９８９．８８％加水分
解、分子量１２５，０００：アルドリッチ）およびＦｅ
Ｃ１５・６Ｈ２Ｏ（アルドリッチ）を蒸留水（Ｉｏｏｌ
Ｑ、）中に溶解した。磁気的に撹拌している丸底フラス
コに溶液を移し、蒸留ピロール（ｔ　Ｘａ＞を加えた。

溶液は、約５秒でオレンジ色から黒色に変わった。２０
℃で撹拌しながら反応を４時間続けた。

コロイド懸濁液をガラス遠心管中に置き、１３゜０００
　Ｘ９で３５〜４５分間遠心分離することにより、得ら
れた有機ポリマーラテックス粒子を、精製した。上清を
蒸留水と置換し、緩やかに撹拌しながら粒子を再び分散
させた。ついでこの手順を繰り返した。

有機ポリマーラテックス粒子懸濁液の固形分％の決定は
、前置て重量を計っておいたガラスバイアル中で湿潤試
料を計量し、１１０℃にセツティングしたオーブン中に
バイアルを４時間置くことにより行った。乾燥物質を含
有するバイアルを再び計１し、乾燥による重量損失に基
づいて固形分を計算した。合成後直ちに未精製反応混合
物の固形分を分析したところ、開始剤および安定化剤に
ついて補正を加えて、モノマーのポリマーへ）変換は９
５％であることが示された。

希釈水性＠濁液を光子相関分光測光により測定して粒径
を決定した。一般に平均直径が１９ＯｎＩ１１の粒子で
個々のロットを単分散した。

固形分０．００２１６％での物質の吸収スペクトルを第
１図に示す。紫外部および長波長部で吸収が高いことが
わかった。約５１０ｎｍでわずかに傾斜がある他は、可
視部は本質的に平坦であった。

７００ｎｍにおける吸光度と固形分％とは直線関係にあ
った（第２図）。０．００１％の固形分における吸光度
は約０．１７５ＡＵであった。広い範囲の波長で吸光度
が高いことにより、有機ポリマーラテックス粒子標識の
検出または定量は、特定のピーク波長でよりもあらゆる
可視波長で行うことができる。

（ｂ）ブロモアセチル化ポリ（ピロール）ラテックスの
調製： 未精製ポリ（ピロール）ラテックス（２００ｍ９、実質
的に上記工程（ａ）と同様にして調製）を遠心分離し、
等量の蒸留水で洗浄した。ついで調製物をＮ−メチル−
２−ピロリドン中に溶媒交換し、固形分１．９％の試料
懸濁液（５７９）とした。１．４＝ジオキサン（６４１
１Ｑ）を懸濁液に加えて残留水を除き、水／ジオキサン
共沸混合物を４０’Ｃ１減圧下、回転エバポレーター上
で除いた。

乾燥したポリ（ピロール）懸濁液［１，０９９ポリ（ピ
ロール）＝０．０１６２当量］を水浴中のマグネティッ
クスターシー上に置いた。臭化ブロモアセチル（３，２
ｍ（＝４．９２ｇ＝０．０２４３当量）を冷却懸濁液に
滴下した。２０分後、トリエチルアミン（３，４ｍ（１
＝２．４６９＝０．０２４３当量）を滴下し、ついでフ
ラスコを水浴から除いた。反応を一夜間進行させた。ト
リエチルアミンハイドロブロマイドの白色沈澱を懸ＰＡ
液から濾過し、得られた有機ポリマーラテックス粒子を
等量のジオキサンで２回洗浄した。懸濁液の試料を１１
０℃のオーブン中で４時間乾鵬させた。分光分析的証拠
（質量分光分析）により、ブロモアセチル表面官能性が
生成したことが示された。質量分光分析は、臭素の７９
および８１同位体に基づく特徴的な二重線を有するポリ
マー断片を示した。臭素の元素分析は、ブロモアセチル
誘導体への３０％の変換を示した。

（Ｃ）ポリ（アニリン）ラテックス粒子ポリ（アニリン
）ラテックス粒子の調製は、沈澱ポリ（アニリン）の調
製に用いた方法（Ｊ、ＣｈｅｔＳｏｃ、Ｆａｒａｄａｙ
　Ｔｒａｎｓ、　１．８２：２３Ｂ５〜２４００．１９
８６）の変法により行った。ポリ（ビニルアルコールＸ
０．２９８９．８８％加水分解）を）（ＣＩ（４００ｘ
Ｑ、ＩＮ）中に溶解した。この溶液に過硫酸カリウム（
５，９３ｇ、０．０２１９モル）を加えた。マグネティ
ックスターラーを備えた丸底フラスコに混合物を移し、
撹拌しながらアニリン（１，０２２９）を加えた。混合
物は、アニリン添加後約１５分で暗緑色になった。ｐｌ
（と酸化の程度に応じて色の変化を伴いながら有機ポリ
マーラテックス粒子が生成した。凝集物は、低速遠心分
離によりコロイド物質から分離した。

（ｄ）ポリフェニレンラテックス粒子 丸底フラスコ（２５Ｍりにマグネティックスターラー、
加熱マントル、冷却器およびヘリウムの出入り口を取り
付けた。フラスコ中、ヘリウム流下でポリ（ビニルアル
コール）（０，３１ｇ、８８％加水分解、分子量１２５
，０００）を蒸留水（１００１１Ｑ）中に溶解して溶液
を生成した。塩化鉄（ＩＩＩ）水氷化物（１３，５９二
０．０５０モル）をこの溶液に加えた。撹拌しながらベ
ンゼン（１１ｒＱ＞を溶液に加え、温度を７０〜７５℃
に上昇させた。この温度で１０分間後、ベンゼン（１ｘ
ｆ２）をさらに加え、溶液を撹拌し、全部で７０分間加
熱した。この間に溶液は透明な黄色から濁った赤さび色
のポリフェニレンコロイド懸詞液となり、ヘリウム出口
流でＨＣｌガスの発生が認められた。有機ポリマーラテ
ックス粒子の懸濁液を冷却し、アリコートを遠心分離し
、蒸留水で洗浄した。ポリフェニレン粒子のサイズは、
光学顕微鏡で測定したところ０゜７〜３．０ミクロンで
あった。

つぎに、本名明の指示試薬の調製法および該指示試薬を
用いたアッセイ手順に関する実施例に基づいて本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるし
のではない。

実施例１．（Ｂ型肝炎表面抗原のイムノアッセイ）（ａ
）抗ビオチン抗体／ポリ（ピロール）指示試薬の調製： １０ｘＱ容のポリ（ピロール）ラテックス粒子（蒸留水
中に０１％、実質的に上記と同様にして調製）をバイア
ル中に置いた。撹拌しなからトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン緩衝液（トリス、１ｘＱＳ　１００ｍＭ
、ｐＨ７，５）を加え、ついで１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ、蒸留水中に５０Ｍｇ）およびウサギ抗ビオチ
ン抗体（５００μｍ２，１３１９／１１２）を加えた。

混合物を室温で１時間インキュベートし、その後、遠心
分離により有機ポリマーラテックス粒子を上清液から分
離した。ＢＳＡを含有するトリス緩衝液中に粒子を再び
懸濁した。

（ｂ）　Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の間接サンド
イッチアッセイ： ニトロセルシース試験ストリップ上に抗ＨＢｓＡｇ抗体
を固定化することにより捕捉試薬を調製した。ついで、
所定ｍのＨＢｓＡｇを含有するヒト血漿（１２０μＱ）
を含む試料にストリップを接触させた。試料は毛管作用
によりストリップを上昇してゆき、固定化した捕捉抗体
を通過し、その際、試料中のＨＢｓＡｇが固定化洗ＨＢ
ｓＡｇ抗体により捕捉された。同様にしてビオチン化洗
ＨＢｓＡｇ抗体（補助特異的結合成分、２ｕ９７ｍ（２
溶液１０μＱ）をストリップと接触させ、固定化ＨＢｓ
Ａｇ分析対象物に結合させた。その後、ストリップを上
記工程（ａ）の指示試薬（１５μＱ）に接触させると、
該指示試薬の抗ビオチン部分が補助特異的結合成分に結
合した。

閾値量のＨＢｓＡｇを含有する試料においては、該抗原
は捕捉試薬と反応し、ニトロセルロース試験ストリップ
上に固定化される。ついでビオチン化洗ＨＢｓＡｇ抗体
が該抗原と反応し、指示試薬がビオチン化洗ＨＢｓＡｇ
抗体に結合することにより免疫複合体が完成される。固
定化された指示試薬はストリップ上の暗領域として検出
することができ、色の強度は試料中のＨＢｓＡｇの量に
正比例した。下記第１表は、種々の濃度のＨＢｓＡｇ分
析対象物について得られた色の強度を示す。その結果は
、試料中の分析対象物の濃度が増加すると試験ストリッ
プ上の指示試薬従って検出可能な色も増加することを示
している。

１１表（ＨＢｓＡｇの間接サンドイッチアッセイ） 実施例２（ＡＩＤＳ抗体のイムノアッセイ）（ａ）ＨＩ
　Ｖ　−ｐ２４抗原／ポリ（ピロール）指示試薬の調製
： ポリ（ピロール）ラテックス粒子（１１（！、蒸留水中
に０．１％、実質的に上記プロトコールに従って調製）
をバイアル中に置いた。撹拌しながらホウ酸緩衝液（１
００ｔｔＱ、１００ｍＭ、ｐＨ８，０）を加え、ついで
ＨＩＶ−ｐ２４抗原（ＨＩ　Ｖの主要コアタンパク質、
２０μｃ、　０　、７５　ｘｖ／ｘ（１）を加えた。混
合物を室温で１時間インキュベートし、ついで得られた
指示試薬にＢＳＡを加えた。

（ｂ）ＨＩ　Ｖ　−ｐ２４抗体のサンドイッチアッセイ
：ＨＩＶ−ｐ２４抗原をニトロセルロースフィルタース
トリップ上に固定化することにより捕捉試薬を調製した
。試験試料（ＨＩＶ−ｐ２４に特異的な抗体を種々の希
釈で含むヒト血漿）を、上記工程（ａ）の等量のＨＩＶ
−ｐ２４抗原／ポリ（ピロール）指示試薬と混合した。

ついで指示試薬／試験試料混合物（４０μｇ）をニトロ
セルロースストリップに適用すると流体はストリップを
上昇し固定化抗原を通過した。ＨＩＶ−９２４に対する
抗体を含有する試料においては、該抗体は固相上の抗原
および指示試薬の抗原と反応して抗原／抗体／抗原サン
ドイッチ免疫複合体をニトロセルロース試験ストリップ
上に生成した。固定化された指示試薬はストリップ上の
暗領域として検出することができ、下記第２表の結果で
示されるように色の強度は試料中の抗ＨＩＶ−９２４抗
体の量に正比例した。その結果は、試料中の分析対象物
の濃度が増加すると試験ストリップ上の指示試薬従って
検出可能な色も増加することを示している。

第２表（Ｉ−１１Ｖ　−ｐ２４のサンドイッチアッセイ
） 以下の実施例は、本発明の指示試薬を同相フロースルー
イムノアッセイ法に使用することに関し、ニトロセルロ
ース固相物質およびガラスミｓ固相物質の両方を用いる
。

実施例３（ジゴキシンのニトロセルロースフロースルー
アッセイ） （ａ）抗ジゴキシン抗体／ポリ（ピロール）指示試薬の
調製： 指示試薬は、ビス−トリス（２−ヒドロキシエチル−ト
リス、２５μＭ、ｐＨ６，５）中、室温にて１時間イン
キュベートすることにより黒色ポリ（ピロール）ラテッ
クス粒子（固形分２．３％、直径２１３ｎｍ、実質的に
上記プロコトールに従って調製）に吸着させたアブイニ
ティー精製ヒツジ抗ジゴキシン抗体（７５ａ＋ＭＰＯ，
および３００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ６，８中に７５μｇ
／１１２）からなっていた。ついで、回転しながら４℃
で一夜インキユベートした。

得られた指示試薬を遠心分離にかけることにより遊離の
抗体を除いた。０５％ＢＳＡおよび０，０２％ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）
で有機ポリマーラテックス粒子の表面をブロッキングし
た。

（ｂ）ニトロセルロース固相の調製： ５ミクロンの孔を有するニトロセルロースフィルター物
質を１０％ジゴキシン−ＢＳＡ（０，００５％ツイーン
２０）（５０μｍ２）で処理し、室温で１５分間放置し
た。ジゴキシン−ＢＳＡの調製は、実質的にバラトラ−
（Ｂｕｔｌｅｒ　Ｖ、Ｐ、）およびチェノ（Ｃｈｅｎ　
Ｊ　、Ｐ、）のＰ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔｌ、　Ａ　ｃａ
ｄ、　Ｓ　ｃｉ、　ＵＳＡ、５７：７１、〜７８（１９
６７）に記載の方法に従って行った。２０μ９／ｊ１１
２．３０μｆ／３１１２および４０μ９／１．Ｑのジゴ
キシン−ＢＳＡストック溶液（５０μＱ）を用い、約１
．０μ９．１．５μ９および２゜０μ９のジゴキシン−
ＢＳＡを固相上に置いた。

ついでブロッキング剤（５０μｍ２．１０％ＢＳＡ。

０．０５％ツイーン２０）を固相に加え、室温で５分ｉ
ｆｆ放置した。ついでニトロセルロースフィルター物質
をアッセイバッファー洗浄液（５０μＱ；２５ｍＭビス
−トリス、０．５％ＢＳＡ、０．０２％ツイーン２０お
よび０．０２％ＮａＮ、、ｐＨ６，５）で濯いだ。

（Ｃ）ジゴキシン競合イムノアッセイ：試験試料を、上
記工程（ａ）の指示試薬とともに３７℃で１０分間イン
キュベートした。混合物を処理ニトロセルロースパッド
に適用し、このパッドを高吸収性の支持物質上に置いた
。パッドをアッセイ緩衝液（３００μ（１）で２回洗浄
した。ついで表面反射率読み取り機を用いてパッド上の
シグナルを読み取った。

指示試薬の坑ジゴキシン抗体はニトロセルロース上のジ
ゴキシン−ＢＳＡに結合し、低反射率の発色表面を生成
した。試験試料にジゴキシンが含まれていたときは、抗
体部位はブロックされ、ニトロセルロースに結合する指
示試薬は減少した。

その結果、試験試料中のジゴキシン量が増加したときに
反射率も増加した。。

アッセイの結果を第３表に示す。第３表は、分析対象物
の濃度および捕捉試薬の濃度を、測定した反射率と相対
単位で比較して示す。各濃度の分析対象物について２つ
の試料を用い、平均および標準偏差を決定し、た。第３
表の結果は、試験試料中のジゴキシンの量か増加すると
ニトロセルロースに結合する指示試薬の量が減少するこ
とを示している。

第３表にトロセルロースフロースルーアッセイにおける
反射率測定） ジゴキシン−ＢＳＡ　ｕｇ　　Ｌｎ ｌ、０Ｇ　　　　５９．３，５Ｌ２ 平均＊ｓＡ　　５ａＪｔＯＪ １．５０　　　５４．２，４６．１ 平均ｔｓ、ｄ、　　５０．２ｔ５．７ ２．０　　　　３８．４，３７．９ 平均±ｓ、１．　３８．２±０．４ Ｌ五 ６５．２．７１．１ ６８．２±４．０ ５６、乙　５７．３ ５７．０±０．４ ５３．０．４５．４ ４９．２±５．４ ジゴキシン（ｎｇ／鵬ｌ） ８４，４，８６，５１３１，１３０ ８５，５±１．５　　　１３１±０．７７３．３．７６
．２　１２０．１２０ ７４．８±２．１　　　１２０±０．０６５．３．６４
．０　１１２．１１４ ６４．７±０．９　　　　ｊｌＱ±１．４Ｌ旦 １６６、　１７２ １６９±４．２ １６６．１６７ １６７±０．７ １６９±４．９ 実施例４（ジゴキシンのガラス繊維フロースルーアッセ
イ） （ａ）ガラス繊維固相の調製： ニトロセルロースについて実施例３工程（ｂ）で記載し
たプロトコールに実質的に従い、ガラス繊維フィルター
［ホリンゲスワース・アンド・ボス（Ｈｏｌｌｉｎｇｓ
ｗｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｖｏｓｓ）、ウェスト・グロトン
（Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｔｏｎ）、ＭＡ］を調製した。Ｉ　
２５　ｔｔ９／ｘ（１゜２５０μ９／村および５００μ
９／ＩＩＱのノゴキシンーＢＳＡストック溶液を用い、
約６．２５μ９．１２．５μ９および２５．０μ９のジ
ゴキシン−ＢＳＡをフィルター上に置いた。

（ｂ）ジゴキシン競合アッセイ： 実質的に実施例３工程（ｃ）に記載のプロトコールに従
ってアッセイを行った。アッセイ結果を第４表に示す。

その結果、試験試料中のジゴキシンの量が増加するとガ
ラス１ａ維パツドに結合する指示試薬の量は減少した。

第４表（ガラス繊維）ａ−スルーアッセイにおける反射
率測定） ジゴキシン−ＢＳＡμｚＱＪＩ　　　　　Ｑｊ　　　　
　Ｌ１２．２５　　８７．５，１１３．２　　ａ６．１
，８５．５　　Ｔｏｏ、９１１．８ＩＪＩＩＩＪ１ １２６、　１２５　１６１．　１８３ 平均±ｍ、ｄ、　　７９．９±２．３　８３．６±０．
８　９４．３±０．６　１２７±４．９　１６０±０．
０２５．００　　７８．４．７３．５　８０．６．８３
．２　９１．３．９０．０　１２５．　　＋２３　１５
５．１５９平均ｔｓ、ｄ、　　７６．０±３．５　８１
．９ｔ１．ｌ］　　９０．７ｔ０．９　１２４±１．４
　１５７±２．８本発明概念は、種々のタイプの結合ア
ッセイに適用することができる。しかしながら、抗原ま
たは抗体以外の分析対象物のアッセイを含む他のアッセ
イら当業者には想到し得るものであり、これらにも本発
明概念を適用することができる。記載した態様やその別
懇様は単なる例示に過ぎず、同等本発明を限定するもの
ではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２００〜８００ｎｍの波長における本発明の
ポリ（ピロール）ラテックス粒子の吸収スペクトルを示
すグラフ、第２図は、種々の固形分％の粒子調製物につ
いての７０Ｏｒ＋ｍの波長における本発明のポリ（ピロ
ール）ラテックス粒子の吸光度を示すグラフである。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）試験試料中の分析対象物の存在または量を決定す
   るのに有用な指示試薬であって、（ａ）複数の実質的に
   非発色性のモノマーからなる有機ポリマーラテックス粒
   子であって、該粒子の吸光度特性が実質的に重合過程に
   基づくものであるもの；および （ｂ）該粒子に結合した特異的結合成分 からなる指示試薬。
2. （２）有機ポリマーラテックス粒子が、ポリ（ピロール
   ）、ポリフェニレン、ポリ（アニリン）、ポリ（チオフ
   ェン）、ポリ（ナフタレン）、ポリ（チオフェノール）
   、ポリアセチレンおよびそれらの誘導体よりなる群から
   選ばれたものである請求項（１）記載の指示試薬。
3. （３）有機ポリマーラテックス粒子が、ポリ（塩化ビニ
   ル）、ポリスチレン、ポリ（ビニルトルエン）、ポリ（
   アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）およ
   びそれらの誘導体よりなる群から選ばれたポリマー物質
   をさらに含む複合粒子である請求項（１）記載の指示試
   薬。
4. （４）有機ポリマーラテックス粒子が、少なくとも２種
   の異なるモノマーからなるコポリマーである請求項（１
   ）記載の指示試薬。
5. （５）モノマーが、ピロール、ベンゼン、トルエン、ア
   ニリン、チオフェン、ナフタレン、チオフェノール、ア
   セチレンおよびそれらの誘導体よりなる群から選ばれた
   ものである請求項（４）記載の指示試薬。
6. （６）有機ポリマーラテックス粒子が、ポリ（ピロール
   ）、ポリアセチレン、ポリフェニレン、ポリ（アニリン
   ）、ポリ（チオフェン）、ポリ（ナフタレン）、ポリ（
   チオフェノール）およびそれらの誘導体よりなる群から
   選ばれた有機ポリマーラテックスでコーティングした粒
   子からなる請求項（１）記載の指示試薬。
7. （７）特異的結合成分が、ビオチンとアビジン、炭水化
   物とレクチン、相補的核酸配列、エフェクター分子とレ
   セプター分子、酵素補助因子と酵素、酵素阻害剤と酵素
   および免疫反応剤よりなる群から選ばれたものである請
   求項（１）記載の指示試薬。
8. （８）有機ポリマーラテックス粒子が、さらに少なくと
   も１つの非発色性物質と反応することにより発色粒子と
   なる請求項（１）記載の指示試薬。
9. （９）有機ポリマーラテックス粒子が、電子常磁性共鳴
   により検出可能な請求項（１）記載の指示試薬。
10. （１０）試験試料中の分析対象物の存在または量の決定
    方法であって、 （ａ）試験試料を指示試薬および捕捉試薬と連続的にま
    たは同時に接触させ、その際、該指示試薬は請求項（１
    ）ないし（９）のいずれかに記載のものであって特異的
    結合成分に結合した有機ポリマーラテックス粒子からな
    り、その際、該指示試薬の該特異的結合成分は、サンド
    イッチアッセイにおける分析対象物、競合アッセイにお
    ける捕捉試薬および間接アッセイにおける補助特異的結
    合成分よりなる群から選ばれた物質に対して特異的であ
    り、（ｂ）該指示試薬を、分析対象物、捕捉試薬、補助
    特異的結合成分およびそれらの組合わせよりなる群から
    選ばれた物質と結合させ、 （ｃ）該指示試薬を検出し、ついで （ｄ）試験試料中の分析対象物の存在または量を決定す
    る ことを特徴とする方法。
11. （１１）捕捉試薬を固相物質に結合してある請求項（１
    ０）記載の方法。
12. （１２）請求項（１）ないし（９）のいずれかに記載の
    指示試薬を含むことを特徴とする、試験試料中の分析対
    象物の存在または量を決定するためのキット。