JPH087214B2 - 指示試薬およびそれを用いたアッセイ法 - Google Patents

指示試薬およびそれを用いたアッセイ法

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JPH087214B2
JPH087214B2 JP1247853A JP24785389A JPH087214B2 JP H087214 B2 JPH087214 B2 JP H087214B2 JP 1247853 A JP1247853 A JP 1247853A JP 24785389 A JP24785389 A JP 24785389A JP H087214 B2 JPH087214 B2 JP H087214B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、指示試薬およびそれを診断アッセ
イに適用することに関する。さらに詳しくは、有機ポリ
マーラテックス粒子を標識成分としてそのような指示試
薬に用いることに関し、本発明は特にイムノアッセイに
おいて有用である。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 試験試料（体液など）中における興味のもたれるもし
くは臨床的に重要な物質の存在および／または量を決定
するための診断アッセイにおいて、種々の分析手順が一
般に用いられている。これら臨床的に重要なもしくは興
味のもたれる物質は、一般に分析対象物と呼ばれてい
る。診断アッセイは、抗原と該抗原に対する抗体との間
における免疫反応を典型とする、分析対象物と特異的結
合成分との間の相互反応を用いることにより、試験試料
中の分析対象物を検出するためのなくてはならない手段
になってきている。
免疫反応の検出においては、追跡可能な物質からなる
標識を用い、これを抗体のような特異的結合成分に結合
させ、該特異的結合成分を今度は分析対象物と結合させ
る。標識抗体−分析対象物複合体または未結合標識抗体
を検出することにより、試験試料中の分析対象物の存在
または量を決定する。
免疫反応法として一般に用いられているのはラジオイ
ムノアッセイ（以下、「RIA」ともいう）および酵素イ
ムノアッセイ（以下、「EIY」ともいう）の２つであっ
て、両者ともに標識特異的結合成分、すなわち指示試薬
を使用する。RIAでは、特異的結合成分に結合した追跡
可能な物質として放射性同位体を使用する。放射性同位
体は非常に少量で検出することが可能なので、RIAは少
量の分析対象物を検出または定量するために用いられ
る。しかしながら、RIAには数多くの実質的な欠点があ
る。これらの欠点には、放射性物質を取り扱うのに特別
の設備と細心の注意を要すること、そのような試薬のコ
ストが高いこと、および特別の廃棄物処理の必要がある
ことが含まれる。
EIAでは、特異的結合成分に結合した標識として酵素
を用い、免疫反応を検出するのに酵素活性を利用する。
EIAはRIAと同じ欠点は有しないが、多くのEIA法では検
出可能な酵素反応を引き起こすために基質を添加するこ
とが要求される。加えて、酵素は温度感受性であるた
め、一般に45℃の出荷温度のような上昇温度では安定性
が低下する。
最近になって金属ゾル粒子を標識として用いるアッセ
イ法が開発された。これらの方法では、金属（たとえ
ば、金、銀、プラチナなど）、金属化合物、または金属
もしくは金属化合物でコーティングした非金属物質を用
いて粒子の水分散液を生成させる。標識すべき特異的結
合成分を、吸着によって金属ゾル粒子上にコーティング
する。このような金属ゾル粒子は、視覚によって検出す
ることもでき器具によって測定することもできるシグナ
ルを生成するという利点を有するが、そのような有用性
にもかかわらず無機粒子は幾つかの欠点を有する。すな
わち、金属粒子は色強度に制限があるため、アッセイに
おいて検出を容易にするためにはそのような標識の量を
増加させる必要があるということである。加えて、金の
ような無機金属コロイド粒子の表面は、特異的結合成分
が容易に共有結合しない。従って、結合アッセイでの使
用に際して、無機粒子に吸着している特異的結合成分が
他のタンパク質または界面活性剤を代わりに用いること
および洗浄に伴う剪断力により除かれないように注意を
要する。
イムノアッセイ試薬において標識として用いる粒子は
また、染料ポリマーからも生成されている。この種のも
のにおいては、染料分子、すなわち色原体モノマーを重
合させて発色ポリマー粒子を生成させている。染料粒子
は、ついでアッセイに使用するために特異的結合成分と
結合させることができる。そのような染料の例として
は、コンゴーレッド、トリパン（Trypan）ブルーおよび
リッサミン（Lissamine）ブルーが挙げられる。
（課題を解決するための手段） 本発明は、試験試料中の分析対象物の存在または量を
決定するのに有用な指示試薬であって、 （ａ）複数の非発色性のモノマーの重合により調製され
た有機ポリマーラテックス粒子、該粒子は、該モノマー
の重合による共役構造の結果としての吸光度特性を有
し、該モノマーに比べて可視領域スペクトルにおいて増
加した吸光度を示す；および （ｂ）該粒子に直接または間接的に結合した特異的結合
成分 からなる指示試薬；および 試験試料中の分析対象物の存在または量の決定方法で
あって、 （ａ）試験試料を指示試薬および捕捉試薬と連続的にま
たは同時に接触させ、その際、該指示試薬は上記のもの
であって特異的結合成分に結合した有機ポリマーラテッ
クス粒子からなり、その際、該指示試薬の該特異的結合
成分は、サンドイッチアッセイにおける分析対象物、競
合アッセイにおける捕捉試薬および間接アッセイにおけ
る補助特異的結合成分よりなる群から選ばれた物質に対
して特異的であり、 （ｂ）該指示試薬を、分析対象物、捕捉試薬、補助特異
的結合成分およびそれらの組合わせよりなる群から選ば
れた物質と結合させ、 （ｃ）該指示試薬を検出し、ついで （ｄ）試験試料中の分析対象物の存在または量を決定す
る ことを特徴とする方法を提供するものである。
本発明は、試験試料中の分析対象物の存在および／ま
たは量を決定するための指示試薬、アッセイ法および試
験キットに関する。本発明の指示試薬は、複数の非発色
性モノマーからなる有機ポリマーラテックス粒子である
標識が、特異的結合成分に直接または間接に結合したも
のからなる。本発明のアッセイ法は、試験試料を捕捉試
薬および指示試薬と接触させ、指示試薬を試験試料中の
分析対象物または捕捉試薬に結合させ、指示試薬を視覚
もしくは器具により検出し、それから試験試料中の分析
対象物の存在および／または量を決定することを特徴と
する。本発明の試験キットは、本発明の指示試薬および
アッセイに使用される他の試薬からなる。有機ポリマー
ラテックス粒子は視覚で検出可能な発色粒子であるのが
好ましく、その具体例としては、ポリ（ピロール）、ポ
リアセチレン、ポリフェニレン、ポリ（アニリン）、ポ
リ（チオフェン）、ポリ（ナフタレン）、ポリ（チオフ
ェノール）、ポリ（ｐ−フェニレンジエチニル）および
それらの誘導体などのポリマーが挙げられる。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
すでに述べたように、本発明は、試験試料中の分析対
象物の存在および／または量を決定するための指示試
薬、アッセイ法および試験キットに関するが、その際、
指示試薬は特異的結合成分に直接または間接に結合した
有機ポリマーラテックス粒子からなる。本発明の好まし
い態様において、実質的に無色の有機モノマーを重合さ
せて発色有機ポリマーコロイドを生成させ、しかる後に
特異的結合成分（たとえば抗体）を該発色ポリマー粒子
に直接または間接に結合させる。たとえば、特異的結合
成分を粒子上に吸着させることもできるし、または特異
的結合成分が粒子に共有結合できるように粒子を官能的
に適合させることもできる。
本発明の種々の態様について記載する前に、幾つかの
用語の定義をする。本発明の指示試薬を用いることので
きる種々のアッセイ法もまた記載する。
I.定義 本明細書にいう「特異的結合成分」とは、特異的結合
ペアの成分、すなわち、２つの異なる分子のうち一方の
分子が化学的または物理的手段により第二の分子に特異
的に結合するようなものをいう。抗原と抗体との特異的
結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアの例としては、
ビオチンとアジピン、炭水化物とレクチン、相補的ヌク
レオチド配列（標的核酸配列を検出するためのDNAハイ
ブリダイゼーションアッセイに用いられるプローブおよ
び捕捉核酸配列を含む）、相補的ペプチド配列、エフェ
クター分子とレセプター分子、酵素補助因子と酵素、酵
素阻害剤と酵素などが挙げられる。さらに特異的結合ペ
アには、もともとの特異的結合成分の類似体成分も含ま
れる。たとえば、分析対象物の断片の誘導体すなわち分
析対象物類似体も、分析対象物と共通のエピトープを少
なくとも１つ有している限り使用可能である。免疫反応
性特異的結合成分の例としては、抗原、ハプテン、抗
体、およびそれらの複合体（組換えDNA法またはペプチ
ド合成により生成したものを含む）が挙げられる。
本明細書にいう「分析対象物」とは、本発明により試
験試料中で検出すべき物質をいう。分析対象物は、それ
に対する天然の特異的結合成分（たとえば抗体）が存在
するか、またはそれに対する特異的結合成分を調製する
ことのできる物質であればいかなるものであってよく、
分析対象物はアッセイ中の１または２以上の特異的結合
成分と結合することができる。分析対象物にはまた、抗
原性物質、ハプテン、抗体およびそれらの組合わせも含
まれる。分析対象物には、タンパク質、ペプチド、アミ
ノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、医薬（治療目
的で投与するものおよび不法目的で投与するものを含
む）、細菌、ウイルス、およびこれら物質の代謝産物ま
たはこれら物質に対する抗体が含まれる。
本明細書にいう「指示試薬」とは、特異的結合成分に
直接または間接に付着した検出可能な標識をいう。本発
明の検出可能な標識は、有機ポリマーラテックス粒子で
ある。
本発明にいう「捕捉試薬」とは、分析対象物または指
示試薬を結合させることができ、かつ実質的に固体の物
質に直接または間接に付着することのできる特異的結合
成分をいう。固相：捕捉試薬複合体は、アッセイの結合
成分のよび未結合成分を分離させるために用いることが
できる。
本明細書にいう「補助特異的結合成分」とは、捕捉試
薬および指示試薬の特異的結合成分とは別に用いられる
特異的結合成分であって、最終的な結合複合体の一部と
なるものをいう。１または２以上の補助特異的結合成分
をアッセイに用いることができる。たとえば、補助特異
的結合成分は、アッセイにおいて、指示試薬が補助特異
的結合成分に結合することができ、該補助特異的結合成
分が今度は分析対象物に結合することのできるような場
合に用いることができる。
II.試薬および物質 一般に結合アッセイにおいては、試験試料中の分析対
象物の存在または量を検出するための指示試薬、および
観察を容易にするために分析対象物を試験試料から分離
するための固相：捕捉試薬が用いられる。所望のアッセ
イ法に従って任意の物質を存在させることができ、また
アッセイ法自体を変化させることもできる。たとえば、
均一イムノアッセイの場合のように固相を含まないよう
にすることもできる。
（ａ）指示試薬： 本発明において、指示試薬は、特異的結合成分に直接
または間接に付着した、検出可能な標識としての有機ポ
リマーラテックス粒子からなる。有機ポリマーラテック
ス粒子かまたは特異的結合成分を変えることにより、種
々の異なる指示試薬を生成させることができる。たとえ
ば、本発明の指示試薬には、黒色ポリ（ピロール）ラテ
ックス粒子に付着したモノクローナル抗体または青紫色
ポリ（アニリン）ラテックス粒子に付着した合成ペプチ
ド配列が含まれる。一般に指示試薬は、相補的な特異的
結合成分により捕捉された後に検出または測定される
が、アッセイの結果を決定するために未結合指示試薬を
測定することもできる。
免疫反応性特異的結合ペアの抗原または抗体成分に加
えて、指示試薬の特異的結合成分はいかなる特異的結合
ペアの成分であってもよい。免疫反応性の特異的結合成
分は、サンドイッチアッセイの場合におけるように分析
対象物に、競合アッセイの場合におけるように捕捉試薬
に、または間接アッセイの場合におけるように補助特異
的結合成分に結合することのできる、抗体、抗原、また
は抗体／抗原複合体であってよい。抗体を用いる場合に
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断
片、組換え抗体、それらの混合物、または抗体と他の特
異的結合成分との混合物であってよい。そのような抗体
の調製法およびそのような抗体が特異的結合成分として
の使用に適していることは、当業者によく知られてい
る。
（ｂ）捕捉試薬： 本発明の捕捉試薬は、サンドイッチアッセイの場合に
おけるように分析対象物に対して、競合アッセイの場合
におけるように指示試薬および分析対象物に対して、ま
たは間接アッセイの場合におけるようにそれ自身分析対
象物に特異的な補助特異的結合成分に対して特異的な特
異的結合成分であってよい。従って、特異的結合成分
は、指示試薬の特異的結合成分の場合と全く同じよう
に、他の成分と特異的に結合することのできるいかなる
分子であってもよい。固相アッセイにおいては、捕捉試
薬は固相物質に付着される。固相は、捕捉試薬に結合し
た分析対象物および他の試薬を試験溶液から分離するの
を可能にする。一般に特異的結合成分と固相物質との結
合は実質的に不可逆的であり、共有結合も含まれる。
本発明のアッセイ装置は多くの形態をとることがで
き、その幾つかは固相に選択した物質に依存する。しば
しば固相物質は、あらゆる適当なクロマトグラフ物質、
吸湿性物質、多孔質物質または毛管物質である。本発明
において固相には、１または２以上のアッセイ試薬を含
有する１または２以上の層を有するフロースルー（flow
−through）アッセイ装置に使用するための繊維ガラ
ス、セルロースまたはナイロンパッド；ディップ・アン
ド・リード（dip and read）アッセイのためのディップ
スティック（dipstick）；単一ストリップまたは固相物
質の別々のゾーン中に１または２以上の試薬が含まれて
いるクロマトグラフ法のための試験ストリップ（たとえ
ば、紙またはガラス繊維）または薄層クロマトグラフの
ための試験ストリップ（たとえばニトロセルロース）；
または当業者によく知られた吸着物質が含まれる。固相
物質にはまた、ポリアクリルアミドビーズ、ポリスチレ
ンビーズまたはチューブ、マグネティックビーズ、マイ
クロタイタープレートまたはガラスまたはプラスチック
試験管が含まれるが、これらに限られるものではない。
固相物質としては、天然物質、合成物質、または合成
的に修飾した天然物質を用いることができ、多糖類、た
とえば紙やセルロース誘導体（酢酸セルロース、ニトロ
セルロースなど）のようなセルロース物質；シリカ；ケ
イ素粒子；不活化アルミナのような無機物質、または多
孔質ポリマーラテックス中に均一に分散した他の無機細
粉物質（この場合、ポリマーとしては塩化ビニル、プロ
ピレンとの塩化ビニルコポリマー、および酢酸ビニルと
の塩化ビニルコポリマーなど）；天然に存在する布（た
とえば綿）および合成布（たとえばナイロン）；シリカ
ゲル、アガロース、デキストラン、およびゼラチンのよ
うな多孔質ゲル；ポリアクリレートのようなポリマー性
フィルム；タンパク質結合成分などを用いることができ
る。固相物質は妥当な強度を有しているかまたは支持体
によって強度が提供されることが必要であり、また検出
可能なシグナルの生成を妨害してはならない。
しかしながら、本発明の捕捉試薬は、固相物質に結合
した特異的結合成分に限られるものではない。凝集アッ
セイにおいては、ウシ血清アルブミンのような可溶性の
担体物質に捕捉試薬の特異的結合成分を結合させること
もできる。
（ｃ）補助物質： 捕捉試薬の特異的結合成分を粒子（たとえば微細粒
子）に任意に付着させることができる。これらの微細粒
子は固相物質としての役目を果たし、カラム中に保持す
るか、可溶性試薬と試験試料との混合物中に懸濁させる
か、または他の固相基体物質により固定化させることが
できる。ここで「保持および固定化」とは、固相基体物
質に結合した微細粒子が、該固相基体物質内のいかなる
位置へも実質的に移動できないことを意味する。微細粒
子は、あらゆる適当なタイプの粒状物質（ポリスチレ
ン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ポリテ
トラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカ
ーボネートまたは同様の物質から構成されるものを含
む）から当業者により選択することができる。微細粒子
の大きさは重要ではないが、固相基体物質を用いた場合
の平均孔径よりも微細粒子の平均粒径の方が小さいこと
が好ましい。微細粒子および固相基体物質を用いたアッ
セイ装置は、アボット・ラボラトリーズの出願による米
国特許出願第217,403号明細書に開示されている。
本発明はまた、本発明のアッセイ法を行うための試薬
および他の成分を含むキットをも提供する。たとえば、
本発明のキットは、指示試薬および所望のアッセイ法を
行うのに必要な他のあらゆる試薬からなっていてよい。
緩衝液、安定化剤および細菌抑制剤のような他の成分が
含まれていてもよい。
III.診断アッセイ 本発明の有機ポリマー標識は、種々のイムノアッセイ
様式において使用することができる。しかしながら、本
発明はイムノアッセイに限定されるものではない。一般
に、特異的結合成分および本発明の有機ポリマーラテッ
クス粒子のような検出可能な標識を使用するいかなるア
ッセイ態様も行うことができる。
一般に結合アッセイは、均一アッセイと不均一アッセ
イとの２つの主要なアッセイの１つに類別される。均一
アッセイにおいては、反応成分または試薬は試験溶液中
に存在して、指示試薬により生成したシグナルを検出す
る前には分離されることはない。一方、不均一アッセイ
においては、固相物質を用いて結合反応成分を未結合反
応成分から分離させるか、または最初の溶液の試薬を沈
澱させた後に試験溶液から取り除く。本発明の指示試薬
は、結合形態と未結合形態との両方で検出可能であり、
均一アッセイおよび不均一アッセイの両方で使用するこ
とができる。これらのアッセイは、さらにサンドイッチ
アッセイ、競合アッセイおよびこれらの変法に分けるこ
とができる。
本発明の指示試薬は、種々のタイプの結合アッセイに
適用することができる。つぎに抗原および抗体分析対象
物のアッセイのための幾つかのタイプの例を図示して説
明する。しかしながら、抗原または抗体以外の分析対象
物のためのアッセイであって本発明の発明概念を適用し
得るアッセイを含む他の多くのタイプのアッセイも、当
業者により想起され得ることを認識する必要がある。
不均一アッセイ （１）直接アッセイ： 指示試薬の特異的結合成分は、捕捉試薬の特異的結合
成分と同じであっても同じでなくてもよい。抗原および
抗体分析対象物は、上記反応様式に従って測定すること
ができる。その他の反応様式としては下記のものが挙げ
られるが、これらに限られるものではない。
（２）間接アッセイ： この種のアッセイでは、検出可能な結合複合体を生成
させるために、指示試薬および捕捉試薬とともにさらに
別の特異的結合成分を用いる。たとえば、補助特異的結
合成分を用いることができ、その際、指示試薬は該補助
特異的結合成分と特異的に結合し、該補助特異的結合成
分が今度は分析対象物と結合する。
ある場合には、以下のように分析対象物を固相上に直
接結合させることも好ましい。
別法として、捕捉試薬、分析対象物および指示試薬か
らなる均一な混合物中でサンドイッチ複合体を前以て生
成させ、ついで結合指示試薬を検出するために該サンド
イッチ複合体を混合物から分離させることができる。こ
ういったアッセイは、第一の荷電物質に結合した捕捉試
薬を用い、ついで該第一の荷電物質に関して反対に荷電
した固体物質に接触させることによって反応混合物から
反応複合体を分離させることによって行うことができ
る。このアッセイ法は、アボット・ラボラトリーズの出
願による米国特許出願第150,278号明細書に開示されて
いる。
（３）競合アッセイ： 試験試料中の分析対象物および指示試薬の特異的結合
成分の両方が、捕捉試薬の特異的結合成分と結合するこ
とができる。かくして結合した指示試薬の量は、試験試
料中の分析対象物の量を反映する。補助特異的結合成分
もまた競合アッセイに用いることができる。本発明の指
示試薬を用いたサンドイッチアッセイおよび競合アッセ
イを以下に一般化して例示する。本発明の指示試薬を用
いて行う好ましいアッセイ手順については、以下の実施
例に挙げてある。
固相サンドイッチアッセイにおいては、用いる固相は
捕捉試薬を含んでいる、すなわち特異的結合成分が固体
支持体に結合している。捕捉試薬が免疫反応剤であると
きは、捕捉試薬は目的とする分析対象物に特異的な抗
体、抗原、またはそれらの複合体であってよく、また抗
体を用いるときは抗体はモノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体、抗体断片、または組換え抗体、並びに
それらの混合物、または抗体と他の特異的結合成分との
混合物であってよい。捕捉試薬を、分析対象物を含んで
いると思われる試験試料、および標識した第二の特異的
結合成分を含む指示試薬、たとえば有機ポリマーラテッ
クス粒子で標識した抗体と接触させる。試薬の添加は、
単独または組み合わせて同時または連続的に行うことが
できる。結合反応の結果、固相物質上に固定化された捕
捉試薬／分析対象物／指示試薬複合体が生成される。ア
ッセイにはまた、得られた複合体を過剰の試薬および試
験試料から分離する工程も含まれる。固相上に保持され
た複合体の検出は、指示試薬について固相を調べること
により行う。分析対象物が試料中に存在しているなら固
相物質上に標識が存在する。固相上の標識の量は試料中
の分析対象物の量の関数である。
本発明の方法は、順（forward）アッセイ、逆アッセ
イおよび同時アッセイを含むあらゆるアッセイ形態を用
いて行うことができる。一般に順アッセイでは試験試料
を捕捉試薬に接触させ、ついで、ある期間インキュベー
トし、さらに指示試薬を加える。逆アッセイでは指示試
薬を試験試料に加え、ある期間インキュベートした後に
捕捉試薬を加える。同時アッセイでは、捕捉試薬と指示
試薬とを同時に試験試料に接触させるので単一のインキ
ュベーション工程しか含まない。
本発明はさらに、捕捉試薬／分析対象物／分析対象物
特異的結合成分／指示試薬複合体の生成を伴って間接サ
ンドイッチアッセイにおいても用いることができる。こ
の場合の分析対象物特異的結合成分は補助特異的結合成
分である。
本発明はまた競合アッセイにおいても用いることがで
きる。固相競合アッセイ形態においては、固相は固体支
持体に付着した捕捉試薬を含み、試験試料および指示試
薬の両方と接触させる。しかしながら、指示試薬は有機
ポリマーラテックス粒子で標識した分析対象物または分
析対象物類似体から生成させる。結合反応が起こって、
（１）固定化捕捉試薬／分析対象物複合体および（２）
固定化捕捉試薬／指示試薬複合体が生成する。競合アッ
セイでは固相上の標識の量は試料中の分析対象物の量に
反比例する。従って、陽性の試験試料はシグナルの減少
をもたらす。
たとえば、デオフィリンアッセイにおいては、抗テオ
フィリン抗体（モノクローナルかまたはポリクローナル
捕捉試薬）を固体支持体上にコーティングして固相を生
成させる。この抗体への結合に関し、有機ポリマーラテ
ックス粒子標識テオフィリンの指示試薬と試験試料中の
未標識テオフィリンとの間で競合が確立される。免疫反
応の結果、テオフィリンが試験試料中に存在しないとき
または閾値量のテオフィリンが存在しないときは固定化
捕捉試薬／指示試薬複合体が生成する。試験試料中のテ
オフィリンレベルが増加すると固相に結合した指示試薬
の量が減少する。
均一アッセイ 均一アッセイは、指示試薬の観察に先立って試験溶液
と指示試薬の分離を必要としない。この広い分類には、
本発明の指示試薬を用いた下記のようなものや当業者に
明らかなものなどの多くの形態が含まれる。
均一アッセイの主要カテゴリーは凝集アッセイであ
り、これはまた本発明の指示試薬を用いて行うことがで
きる。凝集反応およびその手順については当該技術分野
でよく知られている。典型的な凝集反応は、分析対象物
特異的結合成分の存在下、懸濁液中で分析対象物を一緒
に凝集させることからなる。この反応成分の凝集をモニ
ターして、検出しようとする分析対象物の存在または量
を決定する。凝集反応のモニターは、反応成分、たとえ
ば特異的結合成分を有機ポリマーラテックス粒子で標識
し、凝集反応物かまたは非凝集反応物に付随するシグナ
ルを検出することによって行うことができる。シグナル
の検出は、反応媒体の凝集を観察すること、重力場での
指示試薬の沈降またはペレット化、光散乱の変化、また
は指示試薬のスペクトル特性の変化により視覚的に行う
ことができる。
（１）直接アッセイ： 直接凝集アッセイにおいてもまた、指示試薬は、有機
ポリマーラテックス粒子標識に直接または間接的に付着
した分析対象物特異的結合成分からなる。多価分析対象
物の存在下、２またはそれ以上の標識した特異的結合成
分が分析対象物に結合し、指示試薬と分析対象物とを凝
集させる。凝集の増加は、試験試料中に存在する分析対
象物量の増加を示している。
（２）間接／競合アッセイ： 間接凝集アッセイは補助的結合成分を用いて行うこと
ができ、該補助的結合成分は指示試薬への結合について
分析対象物と競合する。こういったアッセイ形態は、単
価分析対象物の分析にとりわけ有用である。このアッセ
イにおいては、１以上の補助的結合成分を担体物質に付
着させ、指示試薬および試験試料と接触させる。分析対
象物が存在しないかまたは閾値未満のレベルであるとき
は、１以上の指示試薬の担体物質への結合により凝集が
起こる。一方、分析対象物が試験試料中に存在するとき
は、分析対象物は指示試薬に競合的に結合し、そのこと
によって指示試薬の担体物質への結合をブロッキングす
る。よって分析対象物の存在は指示試薬の凝集の減少に
よって示される。
IV.有機ポリマーラテックス粒子 本発明のポリマー粒子は、非発色性モノマーを重合す
ることによって生成させる。ここで非発色性モノマーと
は、有機モノマーであって顔料または染料のいずれでも
なく、未重合では検出可能な標識として使用するには不
適当な色または吸光度特性を有するものをいう。生成ポ
リマー粒子は、出発モノマーが吸収しない１または２以
上の波長において可視領域、紫外領域または赤外領域の
光を吸収する。ポリマー粒子の吸光度特性は、重合過程
の結果生成する長い共役構造によるものである。従っ
て、ポリマー粒子の特徴的な色または吸光度は、出発物
質のモノマーの色や吸光度、あるいは染料や顔料（すな
わち色原体）の添加によるよりもむしろポリマー粒子の
構造に基づくものである。たとえば、純粋なモノマーピ
ロールは実質的に非発色性物質であるが、ポリ（ピロー
ル）ラテックス粒子は、長い共役構造および不対非局在
電子（安定ラジカル）のため黒色である。アニリンは実
質的に非発色性モノマーであるが、ポリ（アニリン）ラ
テックス粒子は、重合中のポリマーの酸化レベルに依存
して黄色から青紫色にわたる色を有する。「実質的に」
非発色性であるとは、モノマーの純粋形態は一般に透明
かまたは無色であるが、不純物の存在によってモノマー
に色が付くことがあるという事実を意味する。
本発明の有機ポリマーラテックス粒子は、少なくとも
６つのクラスに分けることができる。第一のクラスは、
単一の非発色性モノマー物質からなるポリマー粒子であ
る。そのようなポリマー粒子の例としては、ポリ（ピロ
ール）；ポリアセチレン；ポリフェニレン；ポリ（アニ
リン）；ポリ（チオフェン）；ポリ（ナフタレン）；ポ
リ（チオフェノール）；ポリ（ｎ−メチルピロール）、
ポリ（ｎ−ベンジルピロール）、ポリ（ｎ−フェニルピ
ロール）［たとえばポリ（１−フェニル2,5−ピローリ
レン）］およびポリ（ｐ−フェニレンジエチニル）すな
わち（−Ｃ≡Ｃ−C6H4C≡Ｃ−）；およびそれらの等価
物からなる粒子が挙げられるが、これらに限られるもの
ではない。
ポリマー粒子の第二のクラスは、重合により発色ポリ
マーを生成する非発色性モノマーと、重合により一般に
発色ポリマーを生成しない非発色性モノマーとの混成か
らなるものである。混成粒子は、上記ポリマーの１種ま
たはそのオリゴマーを、ポリ（塩化ビニル）、ポリスチ
レンおよびポリ（ビニルトルエン）のような成形可能な
ポリマー物質並びにポリ（アクリルアミド）およびポリ
（Ｎ−ビニルピロリドン）のような親水性ポリマー物
質、およびそれらの誘導体と組み合わせることにより生
成することができる。混和物質からなる混成粒子は、粒
子標識の加工を容易にする。
第三のクラスは、少なくとも２種の異なる非発色性モ
ノマーの繰り返し単位を有するポリマー粒子である。従
って、コポリマーを生成することができ、本発明による
標識として用いることができる。コポリマーの例として
は、ポリ（ピロール−チオフェン）およびポリ（ピロー
ル−フェニレン）が挙げられるが、これらに限られるも
のではない。有機モノマーとしては、ピロール、ベンゼ
ン、トルエン、アニリン、チオフェン、ナフタレン、チ
オフェノールおよび同等の芳香族モノマー；アセチレン
および同等の非芳香族モノマー；およびそれらの誘導体
が挙げられる。
ポリマー粒子の第四のクラスは、複数の非発色性モノ
マーの重合によって生成したポリマーをコーティングす
ることのできる有機または無機核である。たとえば、金
属コロイド粒子を発色有機ポリマーラテックスでコーテ
ィングすることができる。
第五のクラスは、複数の非発色性のモノマーを重合し
て生成した実質的に無色のポリマー粒子からなり、これ
を染料または顔料ではない物質とさらに反応させると発
色ポリマー粒子となるものである。そのようなポリマー
粒子の例としては、ポリ（フェニレンスルフィド）が挙
げられ、これは通常は透明で実質的に無色のポリマー物
質であるが、五フッ化ヒ素とさらに反応させると青−
緑、最終的に青−黒色になる。
第六のクラスは、複数の非発色性モノマーからなり重
合によって検出可能なフリーラジカルを有する粒子を生
成するが、生成した粒子は発色させまたは実質的に無色
とすることができるものである。そのような無色の粒子
は視覚的には検出することができないが、これら粒子の
安定なフリーラジカル特性により電子常磁性共鳴分光計
で検出および測定することが可能である。
本発明のポリマー粒子は、特異的結合成分を標識する
ために用いることができ、標識された特異的結合成分は
種々の結合アッセイ法に使用するための指示試薬とな
る。本発明のポリマー粒子は、上記均一アッセイ法およ
び不均一アッセイ法の両者において用いることができる
が、上記間接サンドイッチイムノアッセイのような不均
一固相アッセイに用いるのが好ましい。さらに、試験試
料中の分析対象物の存在または量を決定するのに標識に
直接的な視覚観察に依存する固相アッセイにおける標識
として用いるのが最も好ましい。本発明は上記結合アッ
セイ法に用いることができるのみならず、本明細書に開
示の発明概念から離れない限り他の均一および不均一特
異的結合アッセイを行うために当業者により改変するこ
とができる。たとえば、本発明の有機ポリマーラテック
ス粒子は、組織学、比濁分析および組織化学における標
識成分として用いるために改変することができる。
有機ポリマーラテックス粒子のサイズは重要ではな
く、特定のアッセイ形態または所望の吸光度に従って変
わる。粒子のサイズを含むアッセイのすべての要素およ
び試薬の最適化は、当業者により日常的な試験を用いて
決定することができる。実質的に約10nm〜約15μｍの範
囲のサイズの粒子を公知のアッセイ形態において用いる
ことができる。粒子のサイズは、実質的に約50nm〜約1.
0μｍの範囲であるのが好ましく、実質的に約100nm〜約
500nmの範囲であるのが最も好ましい。
本発明の有機ポリマーラテックス粒子は、直接視覚観
察することによって検出するか、または簡単な比色計、
反射計もしくは濃度計のような器械により測定すること
ができる。加えて、本発明の粒子物質の安定なフリーラ
ジカル特性により、粒子の電子常磁性共鳴を検出および
測定することもできる。ポリマー粒子標識が光を可視ス
ペクトルにおいて吸収しない場合には、適当な器械手段
により検出することが必要である。別の場合には、存在
する指示試薬の量を定量するために器械手段が必要とさ
れる。ポリマー粒子は、使用を容易ならしめるため視覚
で検出可能なことが好ましい。
有機特異的結合成分を有機ポリマーラテックス粒子標
識に共有結合的に付着させて本発明の指示試薬を生成さ
せることは比較的容易である。特異的結合成分の該粒子
への付着は、吸着、結合基または表面の官能基により行
うことができる。特異的結合成分を標識表面に共有結合
的に付着させることにより、表面濃度の増加および置換
に対する安定性が達成される。共有結合的付着は、カル
ボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ブロモアセチル
基、ヨードアセチル基、チオール基、エポキシ基および
他の反応性もしくは結合基並びに残留フリーラジカルお
よびラジカルカチオンを用いて行うことができ、これに
よりタンパク質結合反応を達成することができる。ポリ
マー粒子の表面は極性基の表面濃度が比較的高いので、
表面官能基は官能化コモノマーとして導入することがで
きる。本発明の有機ポリマーラテックス粒子は一般に合
成後に官能化されるが、ある場合（たとえばポリ（チオ
フェノール））には、さらに修飾することなく粒子をタ
ンパク質に直接共有結合的に結合することができる。
有機ポリマーラテックス粒子の調製： （ａ）ポリ（ピロール）ラテックス粒子： 「エークアス・ディスパージョンズ・オブ・エレクト
リカリー・コンダクティング・モノディスパース・ポリ
（ピロール）・パーティクルズ（Aqueous Dispersions
of Electrically Conducting Monodisperse Poly（pyrr
ole）Particles）」（エス・ピー・アームズ（S.P.Arme
s）ら、Journal of Colloid and Interface Science、1
18:410〜416、1987）に記載の変更法に従い、ポリ（ピ
ロール）ラテックス粒子を調製した。
６インチの未充填カラムを用い、試薬グレードピロー
ル（アルドリッチ・ケミカル・ミルウォーキー、WI）を
真空蒸留した（53℃、35mmHg）。ポリ（ビニルアルコー
ル）（0.298g、88％加水分解、分子量125,000;アルドリ
ッチ）およびFeCl3・6H2O（アルドリッチ）を蒸留水（1
00ml）中に溶解した。磁気的に攪拌している丸底フラス
コに溶液を移し、蒸留ピロール（1ml）を加えた。溶液
は、約５秒でオレンジ色から黒色に変わった。20℃で攪
拌しながら反応を４時間続けた。
コロイド懸濁液をガラス遠心管中に置き、13,000×ｇ
で35〜45分間遠心分離することにより、得られた有機ポ
リマーラテックス粒子を精製した。上清を蒸留水と置換
し、緩やかに攪拌しながら粒子を再び分散させた。つい
でこの手順を繰り返した。
有機ポリマーラテックス粒子懸濁液の固形分％の決定
は、前以て重量を計っておいたガラスバイアル中で湿潤
試料を計量し、110℃にセッティングしたオーブン中に
バイアルを４時間置くことにより行った。乾燥物質を含
有するバイアルを再び計量し、乾燥による重量損失に基
づいて固形分を計算した。合成後直ちに未精製反応混合
物の固形分を分析したところ、開始剤および安定化剤に
ついて補正を加えて、モノマーのポリマーへの変換は95
％であることが示された。
希釈水性懸濁液を光子相関分光測光により測定して粒
径を決定した。一般に平均直径が190nmの粒子で個々の
ロットを単分散した。
固形分0.00216％での物質の吸収スペクトルを第１図
に示す。紫外部および長波長部で吸収が高いことがわか
った。約510nmでわずかに傾斜がある他は、可視部は本
質的に平坦であった。700nmにおける吸光度と固形分％
とは直線関係にあった（第２図）。0.001％の固形分に
おける吸光度は約0.175AUであった。広い範囲の波長で
吸光度が高いことにより、有機ポリマーラテックス粒子
標識の検出または定量は、特定のピーク波長でよりもあ
らゆる可視波長で行うことができる。
（ｂ）ブロモアセチル化ポリ（ピロール）ラテックスの
調製： 未精製ポリ（ピロール）ラテックス（200ml、実質的
に上記工程（ａ）と同様にして調製）を遠心分離し、等
量の蒸留水で洗浄した。ついで調製物をＮ−メチル−２
−ピロリドン中に溶媒交換し、固形分1.9％の試料懸濁
液（57g）とした。1,4−ジオキサン（64ml）を懸濁液に
加えて残留水を除き、水／ジオキサン共沸混合物を40
℃、減圧下、回転エバポレーター上で除いた。
乾燥したポリ（ピロール）懸濁液［1.09gポリ（ピロ
ール）＝0.0162当量］を氷浴中のマグネティックスター
ラー上に置いた。臭化ブロモアセチル（3.2ml＝4.92g＝
0.0243当量）を冷却懸濁液に滴下した。20分後、トリエ
チルアミン（3.4ml＝2.46g＝0.0243当量）を滴下し、つ
いでフラスコを氷浴から除いた。反応を一夜間進行させ
た。トリエチルアミンハイドロブロマイドの白色沈澱を
懸濁液から濾過し、得られた有機ポリマーラテックス粒
子を等量のジオキサンで２回洗浄した。懸濁液の試料を
110℃のオーブン中で４時間乾燥させた。分光分析的証
拠（質量分光分析）により、ブロモアセチル表面官能性
が生成したことが示された。質量分光分析は、臭素の79
および81同位体に基づく特徴的な二重線を有するポリマ
ー断片を示した。臭素の元素分析は、ブロモアセチル誘
導体への30％の変換を示した。
（ｃ）ポリ（アニリン）ラテックス粒子 ポリ（アニリン）ラテックス粒子の調製は、沈澱ポリ
（アニリン）の調製に用いた方法（J.Chem.Soc.Faraday
Trans.1、82:2385〜2400;1986）の変法により行った。
ポリ（ビニルアルコール）（0.298g;88％加水分解）をH
Cl（400ml、1N）中に溶解した。この溶液に過硫酸カリ
ウム（5.93g、0.0219モル）を加えた。マグネティック
スターラーを備えた丸底フラスコに混合物を移し、攪拌
しながらアニリン（1.022g）を加えた。混合物は、アニ
リン添加後約15分で暗緑色になった。pHと酸化の程度に
応じて色の変化を伴いながら有機ポリマーラテックス粒
子が生成した。凝集物は、低速遠心分離によりコロイド
物質から分離した。
（ｄ）ポリフェニレンラテックス粒子 丸底フラスコ（250ml）にマグネティックスターラ
ー、加熱マントル、冷却器およびヘリウムの出入り口を
取り付けた。フラスコ中、ヘリウム流下でポリ（ビニル
アルコール）（0.31g、88％加水分解、分子量125,000）
を蒸留水（100ml）中に溶解して溶液を生成した。塩化
鉄（III）六水化物（13.5g;0.050モル）をこの溶液に加
えた。攪拌しながらベンゼン（1ml）を溶液に加え、温
度を70〜75℃に上昇させた。この温度で10分間後、ベン
ゼン（1ml）をさらに加え、溶液を攪拌し、全部で70分
間加熱した。この間に溶液は透明な黄色から濁った赤さ
び色のポリフェニレンコロイド懸濁液となり、ヘリウム
出口流でHClガスの発生が認められた。有機ポリマーラ
テックス粒子の懸濁液を冷却し、アリコートを遠心分離
し、蒸留水で洗浄した。ポリフェニレン粒子のサイズ
は、光学顕微鏡で測定したところ0.7〜3.0ミクロンであ
った。
つぎに、本発明の指示試薬の調製法および該指示試薬
を用いたアッセイ手順に関する実施例に基づいて本発明
をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られる
ものではない。
実施例１（Ｂ型肝炎表面抗原のイムノアッセイ） （ａ）抗ビオチン抗体／ポリ（ピロール）指示試薬の調
製： 10ml容のポリ（ピロール）ラテックス粒子（蒸留水中
に0.1％、実質的に上記と同様にして調製）をバイアル
中に置いた。攪拌しながらトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（トリス、1ml、100mM、pH7.5）を
加え、ついで１％ウシ血清アルブミン（BSA、蒸留水中
に50μ）およびウサギ抗ビオチン抗体（500μ、1mg
/ml）を加えた。混合物を室温で１時間インキュベート
し、その後、遠心分離により有機ポリマーラテックス粒
子を上清液から分離した。BSAを含有するトリス緩衝液
中に粒子を再び懸濁した。
（ｂ）Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）の間接サンドイッチ
アッセイ： ニトロセルロース試験ストリップ上に抗HBsAg抗体を
固定化することにより捕捉試薬を調製した。ついで、所
定量のHBsAgを含有するヒト血漿（120μ）を含む試料
にストリップを接触させた。試料は毛管作用によりスト
リップを上昇してゆき、固定化した捕捉抗体を通過し、
その際、試料中のHBsAgが固定化抗HBsAg抗体により捕捉
された。同様にしてビオチン化抗HBsAg抗体（補助特異
的結合成分、２μg/ml溶液10μ）をストリップと接触
させ、固定化HBsAg分析対象物に結合させた。その後、
ストリップを上記工程（ａ）の指示試薬（15μ）に接
触させると、該指示試薬の抗ビオチン部分が補助特異的
結合成分に結合した。
閾値量のHBsAgを含有する試料においては、該抗原は
捕捉試薬と反応し、ニトロセルロース試験ストリップ上
に固定化される。ついでビオチン化抗HBsAg抗体が該抗
原と反応し、指示試薬がビオチン化抗HBsAg抗体に結合
することにより免疫複合体が完成される。固定化された
指示試薬はストリップ上の暗領域として検出することが
でき、色の強度は試料中のHBsAgの量に正比例した。下
記第１表は、種々の濃度のHBsAg分析対象物について得
られた色の強度を示す。その結果は、試料中の分析対象
物の濃度が増加すると試験ストリップ上の指示試薬従っ
て検出可能な色も増加することを示している。
実施例２（AIDS抗体のイムノアッセイ） （ａ）HIV−p24抗原／ポリ（ピロール）指示試薬の調
製： ポリ（ピロール）ラテックス粒子（1ml、蒸留水中に
0.1％、実質的に上記プロトコールに従って調製）をバ
イアル中に置いた。攪拌しながらホウ酸緩衝液（100μ
、100mM、pH8.0）を加え、ついでHIV−p24抗原（HIV
の主要コアタンパク質、20μ、0.75mg/ml）を加え
た。混合物を室温で１時間インキュベートし、ついで得
られた指示試薬にBSAを加えた。
（ｂ）HIV−p24抗体のサンドイッチアッセイ： HIV−p24抗原をニトロセルロースフィルターストリッ
プ上に固定化することにより捕捉試薬を調製した。試験
試料（HIV−p24に特異的な抗体を種々の希釈で含むヒト
血漿）を、上記工程（ａ）の等量のHIV−p24抗原／ポリ
（ピロール）指示試薬と混合した。ついで指示試薬／試
薬試料混合物（40μ）をニトロセルロースストリップ
に適用すると流体はストリップを上昇し固定化抗原を通
過した。HIV−p24に対する抗体を含有する試料において
は、該抗体は固相上の抗原および指示試薬の抗原と反応
して抗原／抗体／抗原サンドイッチ免疫複合体をニトロ
セルロース試験ストリップ上に生成した。固定化された
指示試薬はストリップ上の暗領域として検出することが
でき、下記第２表の結果で示されるように色の強度は試
料中の抗HIV−p24抗体の量に正比例した。その結果は、
試料中の分析対象物の濃度が増加すると試験ストリップ
上の指示試薬従って検出可能な色も増加することを示し
ている。
以下の実施例は、本発明の指示試薬を固相フロースル
ーイムノアッセイ法に使用することに関し、ニトロセル
ロース固相物質およびガラス繊維固相物質の両方を用い
る。
実施例３（ジゴキシンのニトロセルロースフロースルー
アッセイ） （ａ）抗ジゴキシン抗体／ポリ（ピロール）指示試薬の
調製： 指示試薬は、ビス−トリス（２−ヒドロキシエチル−
トリス、25mM、pH6.5）中、室温にて１時間インキュベ
ートすることにより黒色ポリ（ピロール）ラテックス粒
子（固形分2.3％、直径213nm、実質的に上記プロコトー
ルに従って調製）に吸着させたアフィニティー精製ヒツ
ジ抗ジゴキシン抗体（75mM PO4および300mM NaCl、pH6.
8中に75μg/ml）からなっていた。ついで、回転しなが
ら４℃で一夜インキュベートした。得られた指示試薬を
遠心分離にかけることにより遊離の抗体を除いた。0.5
％BSAおよび0.02％ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート（ツイーン20）で有機ポリマーラテックス粒
子の表面をブロッキングした。
（ｂ）ニトロセルロース固相の調製： ５ミクロンの孔を有するニトロセルロースフィルター
物質を10％ジゴキシン−BSA（0.005％ツイーン20）（50
μ）で処理し、室温で15分間放置した。ジゴキシン−
BSAの調製は、実質的にバットラー（Butler V.P.）およ
びチェン（Chen J.P.）のProc.Natl.Acad.Sci.USA,57:7
1〜78（1967）に記載の方法に従って行った。20μg/m
l、30μg/mlおよび40μg/mlのジゴキシン−BSAストック
溶液（50μ）を用い、約1.0μｇ、1.5μｇおよび2.0
μｇのジゴキシン−BSAを固相上に置いた。ついでブロ
ッキング剤（50μ、10％BSA、0.05％ツイーン20）を
固相に加え、室温で５分間放置した。ついでニトロセル
ロースフィルター物質をアッセイバッファー洗浄液（50
μ;25mMビス−トリス、0.5％BSA、0.02％ツイーン20
および0.02％NaN3、pH6.5）で濯いだ。
（ｃ）ジゴキシン競合イムノアッセイ： 試験試料を、上記工程（ａ）の指示試薬とともに37℃
で10分間インキュベートした。混合物を処理ニトロセル
ロースパッドに適用し、このパッドを高吸収性の支持物
質上に置いた。パッドをアッセイ緩衝液（300μ）で
２回洗浄した。ついで表面反射率読み取り機を用いてパ
ッド上のシグナルを読み取った。
指示試薬の抗ジゴキシン抗体はニトロセルロース上の
ジゴキシン−BSAに結合し、低反射率の発色表面を生成
した。試験試料にジゴキシンが含まれていたときは、抗
体部位はブロックされ、ニトロセルロースに結合する指
示試薬は減少した。その結果、試験試料中のジゴキシン
量が増加したときに反射率も増加した。。
アッセイの結果を第３表に示す。第３表は、分析対象
物の濃度および捕捉試薬の濃度を、測定した反射率と相
対単位で比較して示す。各濃度の分析対象物について２
つの試料を用い、平均および標準偏差を決定した。第３
表の結果は、試験試料中のジゴキシンの量が増加すると
ニトロセルロースに結合する指示試薬の量が減少するこ
とを示している。
実施例４（ジゴキシンのガラス繊維フロースルーアッセ
イ） （ａ）ガラス繊維固相の調製： ニトロセルロースについて実施例３工程（ｂ）で記載
したプロトコールに実質的に従い、ガラス繊維フィルタ
ー［ホリングスワース・アンド・ボス（Hollingsworth
and Voss）、ウエスト・グロトン（West Groton）、M
A］を調製した。125μg/ml、250μg/mlおよび500μg/ml
のジゴキシン−BSAストック溶液を用い、約6.25μｇ、1
2.5μｇおよび25.0μｇのジゴキシン−BSAをフィルター
上に置いた。
（ｂ）ジゴキシン競合アッセイ： 実質的に実施例３工程（ｃ）に記載のプロトコールに
従ってアッセイを行った。アッセイ結果を第４表に示
す。その結果、試験試料中のジゴキシンの量が増加する
とガラス繊維パッドに結合する指示試薬の量は減少し
た。
本発明概念は、種々のタイプの結合アッセイに適用す
ることができる。しかしながら、抗原または抗体以外の
分析対象物のアッセイを含む他のアッセイも当業者には
想到し得るものであり、これらにも本発明概念を適用す
ることができる。記載した態様やその別態様は単なる例
示に過ぎず、何等本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】 第１図は、200〜800nmの波長における本発明のポリ（ピ
ロール）ラテックス粒子の吸収スペクトルを示すグラ
フ、第２図は、種々の固形分％の粒子調製物についての
700nmの波長における本発明のポリ（ピロール）ラテッ
クス粒子の吸光度を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 マーチン・ウォング アメリカ合衆国イリノイ 60030 グレイ スレイク、ブラックホーク・トレイル 30947番 (56)参考文献 特開 昭62−195556（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−206764（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試験試料中の分析対象物の存在または量を
    決定するのに有用な指示試薬であって、 （ａ）複数の非発色性のモノマーの重合により調製され
    た有機ポリマーラテックス粒子、該粒子は、該モノマー
    の重合による共役構造の結果としての吸光度特性を有
    し、該モノマーに比べて可視領域スペクトルにおいて増
    加した吸光度を示す；および （ｂ）該粒子に直接または間接的に結合した特異的結合
    成分 からなる指示試薬。
  2. 【請求項２】試験試料中の分析対象物の存在または量を
    決定するのに有用な指示試薬であって、 （ａ）複数の非発色性のモノマーの重合により調製され
    た有機ポリマーラテックス粒子、該粒子は、該モノマー
    の重合による共役構造の結果としてのフリーラジカルを
    有し、電子常磁性共鳴により検出可能である；および （ｂ）該粒子に直接または間接的に結合した特異的結合
    成分 からなる指示試薬。
  3. 【請求項３】有機ポリマーラテックス粒子が、ポリ（ピ
    ロール）、ポリフェニレン、ポリ（アニリン）、ポリ
    （チオフェン）、ポリ（ナフタレン）、ポリ（チオフェ
    ノール）、ポリアセチレンおよびそれらの誘導体よりな
    る群から選ばれたものである請求項（１）または（２）
    記載の指示試薬。
  4. 【請求項４】有機ポリマーラテックス粒子が、ポリ（塩
    化ビニル）、ポリスチレン、ポリ（ビニルトルエン）、
    ポリ（アクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリド
    ン）およびそれらの誘導体よりなる群から選ばれたポリ
    マー物質をさらに含む複合粒子である請求項（１）また
    は（２）記載の指示試薬。
  5. 【請求項５】有機ポリマーラテックス粒子が、少なくと
    も２種の異なるモノマーからなるコポリマーである請求
    項（１）または（２）記載の指示試薬。
  6. 【請求項６】モノマーが、ピロール、ベンゼン、トルエ
    ン、アニリン、チオフェン、ナフタレン、チオフェノー
    ル、アセチレンおよびそれらの誘導体よりなる群から選
    ばれたものである請求項（５）記載の指示試薬。
  7. 【請求項７】有機ポリマーラテックス粒子が、ポリ（ピ
    ロール）、ポリアセチレン、ポリフェニレン、ポリ（ア
    ニリン）、ポリ（チオフェン）、ポリ（ナフタレン）、
    ポリ（チオフェノール）およびそれらの誘導体よりなる
    群から選ばれた有機ポリマーラテックスでコーティング
    した粒子からなる請求項（１）または（２）記載の指示
    試薬。
  8. 【請求項８】特異的結合成分が、ビオチン、アビジン、
    炭水化物、レクチン、相補的核酸配列、非免疫応答レセ
    プター分子、該非免疫応答レセプター分子に相補的な成
    分、酵素補助因子、酵素、酵素阻害剤および免疫反応剤
    よりなる群から選ばれたものである請求項（１）または
    （２）記載の指示試薬。
  9. 【請求項９】特異的結合成分が、モノクローナル抗体、
    ポリクローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、組換えタ
    ンパク質ハプテン、抗原およびそれらの複合体よりなる
    群から選ばれたものである請求項（１）または（２）記
    載の指示試薬。
  10. 【請求項１０】試験試料中の分析対象物の存在または量
    の決定方法であって、 （ａ）試験試料を指示試薬および捕捉試薬と連続的にま
    たは同時に接触させ、その際、該指示試薬は請求項
    （１）ないし（９）のいずれかに記載のものであって特
    異的結合成分に結合した有機ポリマーラテックス粒子か
    らなり、その際、該指示試薬の該特異的結合成分は、サ
    ンドイッチアッセイにおける分析対象物、競合アッセイ
    における捕捉試薬および間接アッセイにおける補助特異
    的結合成分よりなる群から選ばれた物質に対して特異的
    であり、 （ｂ）該指示試薬を、分析対象物、捕捉試薬、補助特異
    的結合成分およびそれらの組合わせよりなる群から選ば
    れた物質と結合させ、 （ｃ）該指示試薬を検出し、ついで （ｄ）試験試料中の分析対象物の存在または量を決定す
    る ことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】捕捉試薬を固相物質に結合してある請求
    項（10）記載の方法。
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