JP6849678B2 - 液体試料検査キット用膜担体、液体試料検査キット及び液体試料検査キットの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)液体試料中の被検出物質を検出する検査キット用の膜担体であって、
液体試料を輸送できる少なくとも一つの流路を備え、
流路の底面に、液体試料を輸送するための毛細管作用を生じせしめる微細構造が設けられ、
微細構造が、液体試料の輸送方向に沿って変化するように設けられている、液体試料検査キット用膜担体。
(2)微細構造は、流路内における液体試料の流速が流路内で変化するように設けられている、(1)に記載の液体試料検査キット用膜担体。
(3)微細構造は、流路内における液体試料の、最も小さい流速と最も大きい流速との比が1以上10以下となるように設けられている、(1)又は(2)に記載の液体試料検査キット用膜担体。
(4)微細構造は、流路内における液体試料の最も小さい流速と最も大きい流速とが、いずれも0.30mm/s以上5.0mm/s以下となるように設けられている、(1)〜(3)の何れかに記載の液体試料検査キット用膜担体。
(5)微細構造の高さが、流路内で10μm以上500μm以下である、(1)〜(4)の何れかに記載の液体試料検査キット用膜担体。
(6)微細構造の底面積が、流路内で75μm2以上250000μm2以下である、(1)〜(5)の何れかに記載の液体試料検査キット用膜担体。
(7)微細構造同士の最近接距離が、流路内で500μm以下である、(1)〜(6)の何れかに記載の液体試料検査キット用膜担体。
(8)微細構造のアスペクト比が、0.1以上2.0以下である(1)〜(7)の何れかに記載の液体試料検査キット用膜担体。
(1)〜(8)の何れかに記載された液体試料検査キット用膜担体を備え、
膜担体は、液体試料中の被検出物質を検出するための検知ゾーンを有し、
検知ゾーンにおいて被検出物質が検出された際に、検出されたことが光学的手法で確認可能な色変化が生じる、液体試料検査キット。
(10)液体試料中の記被検出物質と特異的に反応する抗体又はその抗原結合性断片を有する標識体が、被検出物質と反応し得るように液体試料検査キットの少なくとも一部に設けられており、
上記色変化は、被検出物質と結合した標識体によって生じる、(9)に記載の液体試料検査キット。
(11)上記標識体が、着色ラテックス粒子又は蛍光ラテックス粒子に前記抗体又は前記抗原結合性断片が結合した粒子である、(10)に記載の液体試料検査キット。
(12)検知ゾーンには、被検出物質を検出する検出物質が固定されており、
上記色変化は、標識体が前記検出物質により検知ゾーンに保持されて呈色することによって生じる、(10)又は(11)に記載の液体試料検査キット。
(13)(9)〜(12)の何れかに記載された液体試料検査キットの製造方法であって、
検知ゾーンに、被検出物質を検知ゾーンに保持することによって上記色変化を生じせしめる検出物質を固定する工程を備える、液体試料検査キットの製造方法。
(14)(9)〜(12)の何れかに記載された液体試料検査キットを用いる、液体試料の検査方法であって、
前記液体試料と、前記液体試料中の被検出物質と特異的に結合する標識体とを混合して混合液体試料を調製し、前記被検出物質と前記標識体とを互いに結合させる工程と、
前記混合液体試料を前記膜担体に設けられた滴下ゾーンに滴下する工程と、
前記微細構造により、前記混合液体試料を前記滴下ゾーンから前記検知ゾーンへ輸送する工程と、
前記検知ゾーンにおける色変化を検知する工程と、を備える、液体試料の検査方法。
<モールドの準備>
モールドは、レーザー加工及び機械切削によって作製した。図10に微細構造を作成するためのモールド20を示す。図10に示すモールド20は、複数の領域(第一の領域A、第二の領域B及び第三の領域C)を有し、その表面には、図8に示す微細構造(凸部)に対応する凹部が形成されている(図示せず)。モールド20はアルミ合金A5052製である。このモールド(金型)の中心部には、30mm×30mmの範囲に微細加工が施されている。モールド20の加工範囲のうち、特定の一辺(20A)から加工範囲内側に16mm分の領域(領域A)と、特定の一辺の対辺(20B)から加工範囲内側に11mm分の領域(領域C)には、径が10μm、深さ(表では高さということもある)10μmの円錐型の凹部が、微細構造同士の最近接距離(5A、5C)を5μmとして図8のような三角配列形式で並んでいる。上記加工範囲のそれ以外の範囲(領域B)では、径が10μm、深さ10μmの円錐型の凹部が、領域Bにおける微細構造の最近接微細構造間距離最近接距離(5B)を5μmとして図8のような三角配列形式(千鳥状)で並んでいる。なお、領域A、B間及び領域B、C間境界での緩衝距離5Dはどちらも5μmである。
上記のモールドの凹凸面に対し、転写した際のモールドと熱可塑性プラスチックの剥離を容易かつ確実にするため、離型処理を施した。離型処理は、ダイキン工業社製オプツールHD−2100THに約1分間浸し、乾燥させたのち、一晩静置することで行った。
上記のようにして得られたモールドを用いて、熱可塑性プラスチックに微細構造を転写した。熱可塑性プラスチックとしては、ポリスチレン(デンカ株式会社製デンカスチレンシート、膜厚300μm)を用いた。加工方法として熱インプリントを用い、装置はSCIVAX社製X−300を用いた。成形温度は120℃、印加圧力は5.5MPaとし、10分間転写を行った。転写後は、圧力を印加したまま熱可塑性プラスチックとモールドを80℃まで冷却し、その後圧力を除くことで、一端側から順に領域A、領域B及び領域Cを有する膜担体を作製した。
実験例1における領域A、B及びCの微細構造を、径が100μm、深さ100μmの円錐型の凹部としたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例1における領域A、B及びCの微細構造を、径が500μm、深さ500μmの円錐型の凹部としたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例1における領域A及びCの微細構造を、径が100μm、深さ100μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が30μm、深さ30μmの円錐型の凹部としたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が250μm、深さ250μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が30μm、深さ30μmの円錐型の凹部としたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が250μm、深さ250μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が10μm、深さ10μmの円錐型の凹部としたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が100μm、深さ100μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が10μm、深さ10μmの円錐型の凹部としたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が500μm、深さ500μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が10μm、深さ10μmの円錐型の凹部とした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Aの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ16区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径及び深さが100μmから4.7μmずつ減少していく(つまり、輸送方向に沿って、100μmから4.7μmずつ減少していく)ものとし、更に領域Cの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ11区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径及び深さが100μmから7μmずつ減少していく(つまり、輸送方向に沿って、100μmから7μmずつ増大していく)ものとしたこと以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Aの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ16区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径及び深さが250μmから14.7μmずつ減少していくものとし、更に領域Cの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ11区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径及び深さが250μmから22μmずつ減少していくものとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造の径を50μmとし、領域Bの微細構造の径を15μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造の径を50μmとし、領域Bの微細構造の径を300μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造の径を500μmとし、領域Bの微細構造の径を300μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Bの微細構造を径が200μm、深さ100μmの円錐型の凹部とした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Bの微細構造を径が500μm、深さ100μmの円錐型の凹部とした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Aの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ16区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径が100μmから10μmずつ増加していくものとし、更に領域Cの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ11区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径が100μmから15μmずつ増加していくものとし、領域Bの円錐型凹部の径を250μm、深さを100μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Aの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ16区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の径が100μmから26.7μmずつ増加していくものとし、更に領域Cの微細構造を1mm幅ずつ11区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの円錐型凹部の深さが100μmから40μmずつ増加していくものとし、領域Bの円錐型凹部の径を500μm、深さを100μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Bの微細構造を、径が100μm、深さ100μmの円錐型の凹部とし、更に微細構造同士の最近接距離を30μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Bの微細構造を、径が100μm、深さ100μmの円錐型の凹部とし、更に微細構造同士の最近接距離を100μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が500μm、深さ500μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が500μm、深さ500μmの円錐型の凹部とし更に微細構造同士の最近接距離を100μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が500μm、深さ500μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が500μm、深さ500μmの円錐型の凹部とし更に微細構造同士の最近接距離を500μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が250μm、深さ250μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が250μm、深さ250μmの円錐型の凹部とし更に微細構造同士の最近接距離を100μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域A及びCの微細構造を、径が250μm、深さ250μmの円錐型の凹部とし、領域Bの微細構造を径が250μm、深さ250μmの円錐型の凹部とし更に微細構造同士の最近接距離を250μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
実験例4における領域Aの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ16区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの微細構造同士の最近接距離が5μmから1.7μmずつ増加していくものとし、更に領域Cの微細構造を輸送方向と垂直方向に1mm幅ずつ11区画に分割し、領域Bに近づくにつれそれぞれの区画ごとの微細構造同士の最近接距離が5μmから2.5μmずつ増加していくものとし、更に領域Bの微細構造を径が100μm、深さ100μmの円錐型の凹部、微細構造同士の最近接距離を30μmとした以外は、実験例1と同様の条件で膜担体を作製した。
上記のように作製した膜担体の領域Bの構造を転写した部分のみにUV処理を施した。その部分に、抗A型インフルエンザNP抗体浮遊液、並びに抗B型インフルエンザNP抗体浮遊液を各々線幅1mmで塗布し(塗布量は各3μL)、温風下で良く乾燥させ、検出物質を固定化した。
精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体(上記と別の抗体)及び精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体(上記と別の抗体)を使用した。抗A型インフルエンザウイルスNP抗体に粒子径0.394μmの青色ラテックス粒子(CM/BL セラダイン製)を共有結合で標識し、糖、界面活性剤及びタンパク質を含むトリス緩衝液にラテックス粒子の濃度が0.025w/v%になるように懸濁し、ソニケーションを行って充分に分散浮遊させた抗A型標識体を調製した。同様に抗B型インフルエンザウイルスNP抗体に青色ラテックス粒子を標識した抗B型標識体を調製した。
上記のように作製された液体試料検査キットの端部の標識体パッド上(滴下ゾーン)に、液体試料を100μL滴下した。液体サンプルは、希釈溶液としてデンカ生研社製クイックナビ―Fluに付属している検体浮遊液を用い、A型インフルエンザウイルス A/Beijing/32/92(H3N2)を4×104倍に希釈したものと、B型インフルエンザウイルス B/Shangdong/7/97を4×103倍に希釈したものの2種を用いた。滴下後の液体試料の移動する様子を直上からデジタルカメラで録画した。この動画から、領域A〜Cそれぞれにおける液体試料の移動する流速を評価した。流速は、A型インフルエンザウイルスを希釈したものの流速と、B型インフルエンザウイルスを希釈したものの流速との、平均値を平均流速として用いた。また、流速比は、最も大きい流速を最も小さい流速で割った際の比である。この結果を表1〜3に示した。
濃さが安定するまでの時間は、A型の濃さが安定するまでの時間と、B型の濃さが安定するまでの時間との平均値を、濃さが安定するまでの時間として用いた。
A:判定時間4分以内にA型で5×104以上、B型で5×103以上の希釈倍率で判定可能なもの、又は、判定時間6分以内にA型で7×104以上、B型で7×103以上の希釈倍率で判定可能なもの。
B:総合評価がA、Cいずれにもあてはまらないもの。
C:判定時間が7分以上のもの、又は、判定可能な希釈倍率がA型で4×104以下、又は、B型で4×103以下のもの。
実験例25〜45における膜担体の作製は、領域A〜Cにおいて、表4に示すとおりの微細構造(凸部)同士の最近接距離、凸部の径及び凸部の高さとなるようにすること以外は、実験例1と同様にして行った。
次いで、用いる粒子を着色ラテックス粒子から蛍光ラテックス粒子(micromer-F 蛍光ラテックス粒子 材料ポリスチレン コアフロント社製)に変更し、試験開始後4分後に着色ラインの有無をイムノクロマトリーダ(C11787 浜松ホトニクス社製)で読み取りできなくなる倍率(蛍光判定限界倍率)を求めたこと以外は、実験例1〜24と同様にして、検知ゾーンの作製、標識体のセット及び検知評価を行った。結果を表4〜5に示した。
A:試験開始後4分での蛍光判定可能な限界倍率が、A型で3×106以上、B型で3×105以上であるもの。
B:総合評価がA、Cいずれにもあてはまらないもの。
C:試験開始後4分での蛍光判定可能な限界倍率が、A型で2×106未満、B型で2×105未満であるもの。
3,3a,13 微細構造が設けられた膜担体
3x,13x 滴下ゾーン
3y,13y 検知ゾーン
4,4a,4b,4c,4d 凸部の底面における代表長さ(凸部の底面の径)
4A 微細構造が変化する箇所での前方(輸送方向の上流側)の底面の代表長さ(第一の領域Aにおける凸部の底面の径)
4B 微細構造が変化する箇所での後方の底面の代表長さ(第二の領域Bにおける凸部の底面の径)
4C 微細構造が変化する箇所での後方の底面の代表長さ(第三の領域Cにおける凸部の底面の径)
5 最近接微細構造間距離
5A 微細構造が変化する箇所での前方の最近接微細構造間距離(第一の領域Aにおける微細構造(凸部)同士の最近接微細構造間距離)
5B 微細構造が変化する箇所での後方の最近接微細構造間距離(第二の領域Bにおける微細構造(凸部)同士の最近接微細構造間距離)
5C 微細構造が変化する箇所での後方の最近接微細構造間距離(第三の領域Cにおける微細構造(凸部)同士の最近接微細構造間距離)
5D 緩衝距離(微細構造が変化する箇所での緩衝距離)
6,6a,6b,6c,6d 凸部の高さ
7,7a,7b,7c,7d 微細構造
8,8a,8b,8c,8d 凸部
9 平坦部
10,10a,10b,10c,10d 凸部の底面
18 液体試料用の検査キット
18a 筐体
18b 第一開口部
18c 第二開口部
20 モールド
20A 特定の一辺
20B 特定の一辺の対辺
A 第一の領域
B 第二の領域
C 第三の領域
d 液体試料の流れる方向(輸送方向)
Claims (14)
- 液体試料中の被検出物質を検出する検査キット用の膜担体であって、
前記液体試料を輸送できる少なくとも一つの流路を備え、
前記膜担体が、その表面に前記液体試料が滴下される滴下ゾーンと、前記液体試料中の前記被検出物質を検出するための検知ゾーンと、を有し、
前記流路の底面に、前記液体試料を輸送するための毛細管作用を生じせしめる微細構造が設けられ、
前記微細構造が、少なくとも前記滴下ゾーンと前記検知ゾーンとの間に位置し、
前記微細構造が、前記液体試料の輸送方向に沿って変化するように設けられ、
前記微細構造が、円錐、多角錐、円錐台、多角錐台、円柱、半球、又は半楕円体の形状の複数の凸部を有する、液体試料検査キット用膜担体。 - 前記微細構造は、前記流路内における前記液体試料の流速が前記流路内で変化するように設けられている、請求項1に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 前記微細構造は、前記流路内における前記液体試料の、最も小さい流速と最も大きい流速との比が1以上10以下となるように設けられている、請求項1に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 前記微細構造は、前記流路内における前記液体試料の最も小さい流速と最も大きい流速とが、いずれも0.30mm/s以上5.0mm/s以下となるように設けられている、請求項1〜3の何れか一項に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 前記微細構造の高さが、前記流路内で10μm以上500μm以下である、請求項1〜4の何れか一項に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 前記微細構造の底面積が、前記流路内で75μm2以上250000μm2以下である、請求項1〜5の何れか一項に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 前記微細構造同士の最近接距離が、前記流路内で500μm以下である、請求項1〜6の何れか一項に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 前記微細構造のアスペクト比が、0.1以上2.0以下である、請求項1〜7の何れか一項に記載の液体試料検査キット用膜担体。
- 液体試料中の被検出物質を検出する液体試料検査キットであって、
請求項1〜8の何れか一項に記載された液体試料検査キット用膜担体を備え、
前記膜担体は、前記液体試料中の前記被検出物質を検出する検知ゾーンを有し、
前記検知ゾーンにおいて、前記被検出物質が検出された際に色変化が生じる、液体試料検査キット。 - 前記液体試料中の前記被検出物質と特異的に反応する抗体又はその抗原結合性断片を有する標識体が、前記被検出物質と反応し得るように前記液体試料検査キットの少なくとも一部に設けられており、
前記色変化は、前記被検出物質と結合した前記標識体によって生じる、請求項9に記載の液体試料検査キット。 - 前記標識体が、着色ラテックス粒子又は蛍光ラテックス粒子に前記抗体又は前記抗原結合性断片が結合した粒子である、請求項10に記載の液体試料検査キット。
- 前記検知ゾーンには、前記被検出物質を検出する検出物質が固定されており、
前記色変化は、前記標識体が前記検出物質により前記検知ゾーンに保持されて呈色することによって生じる、請求項10又は11に記載の液体試料検査キット。 - 請求項9〜12の何れか一項に記載された液体試料検査キットの製造方法であって、
前記検知ゾーンに、前記被検出物質を前記検知ゾーンに保持することによって前記色変化を生じせしめる検出物質を固定する工程を備える、液体試料検査キットの製造方法。 - 請求項9〜12の何れか一項に記載された液体試料検査キットを用いる、液体試料の検査方法であって、
前記液体試料と、前記液体試料中の被検出物質と特異的に結合する標識体とを混合して混合液体試料を調製し、前記被検出物質と前記標識体とを互いに結合させる工程と、
前記混合液体試料を前記膜担体に設けられた滴下ゾーンに滴下する工程と、
前記微細構造により、前記混合液体試料を前記滴下ゾーンから前記検知ゾーンへ輸送する工程と、
前記検知ゾーンにおける色変化を検知する工程と、を備える、液体試料の検査方法。
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