CN106153924B - 试剂盒、检测系统，其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种试剂盒、检测系统，其制备方法及应用。该试剂盒包括：试纸条，包括依次设置的过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；以及，免疫多孔金，包含纳米多孔金颗粒以及结合在纳米多孔金颗粒上的第三抗体；其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。藉由本发明，可以大幅提高对目标物质，例如食源性致病菌的检测灵敏度，增加检测范围，且操作简单，检测速度快，适用于现场检测。

Description

试剂盒、检测系统，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金的检测试剂盒，特别涉及一种可用于检测食源性致病菌的试剂盒、检测系统、其制备方法及应用，属于微生物检测领域。

技术背景

近年来，随着人民生活水平的提高，食品安全已经成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是构成食品安全的重大隐患，目前，常见的食源性致病菌包括：沙门氏菌、肠道出血性大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌、阪崎肠杆菌和志贺氏杆菌，它们主要通过食品、饮水感染人类引发相应的食源性疾病，严重危害人体健康。

传统分离鉴定法、PCR方法、电化学方法和生物传感器法等因具有高的灵敏度成为检测食源性致病菌常用的方法，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。

胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对食源性致病菌的检测限通常不高于10⁴CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为食源性致病菌的检测提供简单、高效的途径。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种新型的试剂盒，其检测性能较之现有的胶体金免疫层析试纸条具有大幅提升。

本发明的另一目的在于提供一种基于所述试剂盒的检测系统，例如一种食源性致病菌检测系统。

本发明的再一目的在于提供一种制备所述试剂盒的方法。

本发明的再一目的在于提供所述试剂盒及检测系统的用途，例如，利用所述试剂盒和检测系统实现的食源性致病菌检测方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种试剂盒，包括：

试纸条，包括依次设置的过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；

以及，免疫多孔金，包含纳米多孔金颗粒以及结合在纳米多孔金颗粒上的第三抗体；

其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。

其中所述纳米多孔金颗粒的粒径为:15-200nm，所含孔的孔径为2-10nm，可以稳定保存1年(相同粒径实心金纳米颗粒通常可保存1-3个月)，比表面积是相同粒径实心金纳米颗粒的3-5倍，且在应用时，T、C线吸光强度是相同粒径实心金纳米颗粒的10-100倍。

进一步的，本发明的试剂盒在应用时，其中目标物与所述免疫多孔金以及检测线上对应的第一抗体是利用抗原抗体之间的特异性结合的原理呈夹心模式结合，因而，所述试剂盒对于某些生物、化学物质的检测都是适用的，特别适合于以双抗夹心模式检测的细菌、细胞、大分子蛋白质等物质。

进一步的，所述试纸条还可包括依次分布的过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。

在一实施方案之中，所述试剂盒为食源性致病菌检测试剂盒，其中，所述目标物为食源性致病菌，所述第一抗体为由目标物免疫获得的兔多抗，所述第二抗体为能与所有单抗特异性结合的驴抗鼠二抗，所述第三抗体为由目标物免疫获得的单克隆抗体。

如本领域技术人员所知晓的，在前述试纸条中，各组成部分的功能大致如下：

过滤垫，主要用于初步过滤样品基质；

样本垫，样本垫经特定处理液处理，具有一定的pH缓冲作用，用于调节待检物的pH以及协助待检物和免疫多孔金在试纸条上的流动；

检测垫，检测垫表面分布有彼此不重合的检测线和质控线。

进一步的，所述试纸条还可包括：吸水纸，用于吸收多余的免疫多孔金以及未参加反应的液体样品。

进一步的，所述过滤垫可采用聚酯膜，检测垫采用硝酸纤维膜，但均不限于此。

在一实施例中，可以将聚酯垫、样本垫、检测垫、吸水纸依次重叠组装成所述试纸条。

在本发明中所述食源性致病菌检测试剂盒对于食源性致病菌的检测限可以达到10¹-10³CFU/mL。

一种检测系统，包括：

所述的试剂盒，

以及，检测设备，用以监测在所述试纸条上施加待检样品与免疫多孔金的混合物前后，于所述试纸条的质控线和检测线处的信号变化情况，从而实现对待检样品中目标物的定性和/或定量判断。

进一步的，所述检测设备包括试纸条读取仪。

所述试剂盒的制备方法包括：

提供试纸条，包括：

至少取样本垫、检测垫、吸水垫依次设置，并使样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，

将第一抗体和第二抗体分别施加至检测垫上，形成彼此不重合的检测线和质控线；

以及，提供所述的免疫多孔金，包括：

制备纳米银粒子，

取所述纳米银粒子均匀分散于十六烷基三甲基氯化铵水溶液中，并静置1天以上，之后与HAuCl₄溶液充分反应，获得纳米多孔金颗粒，

将所述纳米多孔金颗粒颗粒与所述第三抗体充分混合，并以BSA或者酪蛋白封闭，再除去未标记的第三抗体。

在一实施方案之中，所述制备方法可以包括：将柠檬酸三钠、鞣酸和AgNO₃在水相反应体系中240-250℃恒温回流加热，获得所述纳米银粒子，所述鞣酸包括单宁酸。

在一更为具体的实施方案之中，所述免疫多孔金的制备工艺包括：将柠檬酸三钠、单宁酸和AgNO₃在水相反应体系中240-250℃恒温回流加热，获得纳米银粒子，改变纳米银表面活性剂用十六烷基三甲基氯化铵替代，将获得的纳米银粒子与HAuCl₄溶液反应，得到纳米多孔金颗粒；其中，通过调控单宁酸的用量和HAuCl₄的添加量得到不同粒径的纳米多孔金颗粒，再将所述纳米多孔金颗粒与食源性致病菌对应的单抗混合搅拌，并用BSA或者酪蛋白封闭，离心除去未标记的抗体，用复溶液复溶，备用。

在一更为具体的实施方案之中，所述试纸条的制备工艺可以包括：将过滤垫、样本垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在基板上，并将食源性致病菌免疫得到的单抗和驴抗鼠二抗分别施加至检测垫上，形成检测线和和质控线。

一种检测方法，例如一种食源性致病菌的检测方法，其包括：

提供所述的试剂盒，

将液态的待检样品与免疫多孔金混合后，再施加至所述试纸条上，

以及，以裸眼判读和/或试纸条读取仪检测作为检测手段，对样品内的目标物进行定性和/或定量判断。

进一步的，所述的检测方法具体可包括：

将免疫多孔金与液态的待检样品充分混合后，再滴加到试纸条的样本垫上，经设定时间后，通过裸眼观察试纸条上检测线和质控线的颜色变化，定性分析待检样品中是否存在目标物，或者以试纸条读取仪记录T、C值和T/C值，并与预先建立的标准曲线对照，从而定量检测待检样品中目标物的含量。

进一步的，前述标准曲线可通过业界悉知的方式建立，例如，可以通过下列方法获得，即：制备一系列不同浓度的目标物，例如食源性致病菌的标准样品，依照前述检测方法，分别获得和记录与不同浓度标准样品对应的T、C值和T/C值，并探知检测结果与样品浓度存在的数学关系，从而建立标准曲线。

其中，T、C值分别为试纸条读取仪测得的检测线(T线)和和质控线(C线)的检测值，例如吸光度值等，这应是本领域技术人员依据常识及本说明书可很容易且明确的知悉的。

与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

(1)本发明的试剂盒及检测系统具有操作简单、检测时间短(10-15min)等优点，适于进行现场检测；

(2)本发明使用的纳米多孔金颗粒比实心金纳米颗粒具有更强的光灵敏性，从而使试纸条T、C线的颜色强度大幅提高；

(3)本发明使用的纳米多孔金颗粒比实心金纳米颗粒具有更大的比表面积，有利于结合更多的生物大分子(抗体)，从而提高免疫多孔金捕获目标菌的效率，提高试纸条的灵敏度；

(4)本发明使用的纳米多孔金颗粒比实心金纳米颗粒能有效的避免粒子聚集，从而提高试纸条的稳定性；

(5)本发明将免疫多孔金添加到ELISA板孔，使免疫多孔金与待检物充分反应5min，而非将免疫多孔金喷在结合垫上与待检物瞬时反应，因而可大幅提高抗体对待检物的捕获效率，从而提高试纸条的灵敏度，另外还可避免喷在结合垫上瞬时反应的随机性，可提高试纸条的稳定性。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案之中使用纳米多孔金颗粒免疫层析试纸条检测阴性样本的示意图；

图2是本发明一典型实施方案之中使用纳米多孔金颗粒免疫层析试纸条检测阳性样本的示意图。

图3是本发明一典型实施例之中制备的纳米多孔金颗粒的透射电镜图。

具体实施方式

本发明主要是利用纳米多孔金颗粒(简称“多孔金”)比实心金纳米颗粒具有更大的光灵敏性、稳定性和比表面积等特点，用纳米多孔金颗粒替代实心胶体金制备相应的纳米多孔金颗粒免疫层析试纸条，从而大幅提高了试纸条对于目标物质，例如食源性致病菌的检测性能。

进一步的讲，本发明用纳米多孔金颗粒作为标记物，然后利用纳米多孔金颗粒与目标物免疫的单抗，例如食源性致病菌单抗之间的静电作用(主要作用力)得到免疫多孔金，免疫多孔金、目标物以及目标物对应的兔多抗以双抗夹心模式在检测线聚集，多余的免疫多孔金和第三抗体，例如驴抗鼠二抗特异性反应在控制线聚集，检测线和控制线处的信号强度来源于纳米多孔金颗粒光学性质，由于纳米多孔金颗粒强的光灵敏性，所以可以大幅提高试纸条的灵敏度。

例如，在本发明的一典型实施案例中，本发明可通过如下技术方案实现：

(1)制备具有不同粒径的纳米多孔金颗粒：纳米多孔金颗粒的制备是根据纳米银和HAuCl₄的置换反应合成，主要有3个步骤。第一，纳米银粒子的合成：取合适浓度的，例如100mL 5mM柠檬酸三钠溶液和0.1mM单宁酸溶液在240-250℃恒温回流加热，沸腾后加入合适浓度的，例如1mL 25mM AgNO₃水溶液，溶液颜色从无色→浅黄色→亮黄色，当溶液颜色稳定后，继续搅拌2-3min，停止加热，避光冷却至室温。第二，纳米银粒子表面活性剂的转换：将制得的纳米银粒子12000rpm离心15min，去上清等体积加入合适浓度的，例如80mM十六烷基三甲基氯化铵水溶液，超声10-15min，放置1天。第三，纳米银置换为纳米多孔金颗粒：将合适浓度的，例如0.01mM的HAuCl₄逐滴加入第二步制备的纳米银溶液，当溶液颜色从黄色→橙色→红色→紫色→蓝色时，停止反应，常温静置1夜，吸取上清液即得到纳米多孔金颗粒溶液。调控单宁酸溶液的浓度和HAuCl₄的添加量可以得到不同粒径的纳米多孔金颗粒。

(2)纳米多孔金颗粒的标记：取一定量的，例如10mL纳米多孔金颗粒溶液，调节pH，加入一定量的，例如1mL食源性致病菌免疫的鼠单抗，搅拌30min，加入1mL 5％-10％BSA或者酪蛋白封闭30min，12000rpm离心20min，去上清，加入一定量的，例如1mL复溶液复溶，得到免疫多孔金，4℃保存备用。

(3)免疫层析试纸条的制备：将样本垫以一定的处理液，例如pH 8.50.1M Tris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)处理，置于60℃鼓风干燥箱，3h后取出置于干燥缸中备用；将食源性致病菌免疫的兔多抗和驴抗鼠二抗喷到检测垫(可选用硝酸纤维膜)上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0-2.0mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，30℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、检测垫、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡。将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

(4)试纸条对样品的检测：取一定量的，例如4-8uL制备好的免疫多孔金颗粒滴加到ELISA板孔中，将一定量的，例如100μL稀释好的不同浓度梯度的菌液加入含有免疫多孔金的ELISA板孔，孵育一定的时间，例如3-5min后，取出纳米多孔金颗粒-抗体-抗原复合物滴加到试纸条的样品孔中，反应一定时间，例如10-15min后用肉眼观察试纸条T、C线的颜色变化，并用试纸条读取仪记录T、C值和T/C的值。

(5)检测结果的判定：本研究中采用双抗夹心为模板，在检测垫分别喷涂食源性致病菌免疫的兔多抗和驴抗鼠二抗作为检测线和质控线，如果样品中含有一定浓度的目标物时，目标物就会首先与免疫多孔金结合形成纳米多孔金颗粒-抗体-抗原复合物，该复合物流经检测线被兔多抗捕获在检测线区域聚集，聚集到一定浓度形成肉眼可见的条带或者试纸条读取仪可以检测的信号，多余的免疫多孔金移动到质控线被驴抗鼠二抗捕获聚集形成肉眼可见的条带，判断其为阳性(见图1)，如果样品中不含待检物，免疫多孔金只与控制线上的驴抗鼠二抗反应形成肉眼可见的条带，检测线不显色，判断其为阴性(见图2)。如果质控线处没有颜色或者没有明显信号，说明试纸条有质量问题，测试无效。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：纳米多孔金颗粒免疫层析系统对牛奶中大肠杆菌O157:H7的检测

(1)纳米多孔金颗粒的制备：纳米多孔金颗粒的制备是根据纳米银和HAuCl₄的置换反应合成，主要有3个步骤。第一，纳米银粒子的合成：取合100mL 5mM柠檬酸三钠溶液和0.1mM单宁酸溶液在240-250℃恒温回流加热，沸腾后加入1mL 25mM AgNO₃水溶液，溶液颜色从无色→浅黄色→亮黄色，当溶液颜色稳定后，继续搅拌2-3min，停止加热，避光冷却至室温。第二，纳米银粒子表面活性剂的转换：将制得的纳米银粒子12000rpm离心15min，去上清等体积加入80mM十六烷基三甲基氯化铵水溶液，超声10-15min，放置1天。第三，纳米银置换为纳米多孔金颗粒：将0.01mM的HAuCl₄逐滴加入第二步制备的纳米银溶液，当溶液颜色从黄色→橙色→红色→紫色→蓝色时，停止反应，常温静置1夜，吸取上清液即得到纳米多孔金颗粒，如图3所示。

(2)纳米多孔金颗粒的标记：取10mL纳米多孔金颗粒溶液，调节pH到8-9，加入1mL大肠杆菌O157:H7单抗，搅拌30min，加入1mL 10％BSA封闭30min，12000rpm离心20min，去上清，加入1mL复溶液复溶，得到免疫多孔金，4℃保存备用。

(3)取25mL灭过菌的牛奶，加入25mL超纯水稀释作为样品基质，接种一定量的大肠杆菌O157:H7(10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL)到牛奶中。

(4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH 8.50.1M Tris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)处理，置于60℃鼓风干燥箱，3h后取出置于干燥缸中备用；将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0-2.0mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，30℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、检测垫、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡。将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

(5)试纸条对样本检测：取4-8uL制备好的免疫多孔金颗粒滴加到ELISA板孔中，将100μL浓度为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL的大肠杆菌O157:H7样液加入含有免疫多孔金的ELISA板孔，孵育3-5min后，取出纳米多孔金颗粒-抗体-菌复合物滴加到试纸条的样品孔中，反应10-15min后，用肉眼观察试纸条T、C线的颜色变化，并用试纸条读取仪记录T、C值和T/C的值，以不同菌的浓度为横坐标，以T/C值为纵坐标绘制标准曲线。

(6)参考所做的标准曲线图，对普通牛奶样品中的检验结果进行确证。定量检验菌浓度的范围在10¹～10⁵CFU/mL。

实施例2：纳米多孔金颗粒免疫层析系统对鸡蛋中鼠伤寒沙门氏菌的检测

(1)纳米多孔金颗粒的制备：纳米多孔金颗粒的制备是根据纳米银和HAuCl₄的置换反应合成，主要有3个步骤。第一，纳米银粒子的合成：取合100mL 5mM柠檬酸三钠溶液和0.1mM单宁酸溶液在240-250℃恒温回流加热，沸腾后加入1mL 25mM AgNO₃水溶液，溶液颜色从无色→浅黄色→亮黄色，当溶液颜色稳定后，继续搅拌2-3min，停止加热，避光冷却至室温。第二，纳米银粒子表面活性剂的转换：将制得的纳米银粒子12000rpm离心15min，去上清等体积加入80mM十六烷基三甲基氯化铵水溶液，超声10-15min，放置1天。第三，纳米银置换为纳米多孔金颗粒：将0.01mM的HAuCl₄逐滴加入第二步制备的纳米银溶液，当溶液颜色从黄色→橙色→红色→紫色→蓝色时，停止反应，常温静置1夜，吸取上清液即得到纳米多孔金颗粒，如图3所示。

(2)纳米多孔金颗粒的标记：取10mL纳米多孔金颗粒溶液，调节pH到6-8，加入1mL鼠伤寒沙门氏菌单抗，搅拌30min，加入1mL 5％酪蛋白封闭30min，12000rpm离心20min，去上清，加入1mL复溶液复溶，得到免疫多孔金，4℃保存备用。

(3)取25g灭过菌的鸡蛋，加入25mL超纯水稀释作为样品基质，接种一定量的大肠杆菌O157:H7(10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL)到鸡蛋中。

(4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH 8.50.1M Tris-HCl缓冲液(1％BSA，0.5％Tween-20)处理，置于60℃鼓风干燥箱，3h后取出置于干燥缸中备用；将鼠伤寒沙门氏菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线，浓度均为1.0-2.0mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，30℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、结合垫、检测垫、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡。将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

(5)试纸条对样本的检测：取4-8uL制备好的免疫多孔金颗粒滴加到ELISA板孔中，将100μL浓度为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌样液加入含有免疫多孔金的ELISA板孔，孵育3-5min后，取出纳米多孔金颗粒-抗体-菌复合物滴加到试纸条的样品孔中，反应10-15min后用肉眼观察试纸条T、C线的颜色变化，并用试纸条读取仪记录T、C值和T/C的值，以不同菌的浓度为横坐标，以T/C值为纵坐标绘制标准曲线。

(6)参考所做的标准曲线图，对鸡蛋样品中的检验结果进行确证。定量检验菌浓度的范围在10¹～10⁵CFU/mL。

利用本发明的试剂盒、检测系统及方法，可大幅提高食源性致病菌的检测灵敏度，增加检测范围，实现高灵敏度的定量检测，且该发明操作简单、检测时间短、适宜于现场检测。

应当指出，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，包括：

试纸条，包括依次设置的过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；

其特征在于所述试剂盒还包括免疫多孔金，所述免疫多孔金包含纳米多孔金颗粒以及结合在纳米多孔金颗粒上的第三抗体；

其中，所述纳米多孔金颗粒的粒径为15-200nm，所含孔的孔径为2-10nm，比表面积是相同粒径实心金纳米颗粒的3-5倍；

所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条包括依次分布的过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述目标物为食源性致病菌，所述第一抗体为由目标物免疫获得的兔多抗，所述第二抗体为能与所有单抗特异性结合的驴抗鼠二抗，所述第三抗体为由目标物免疫获得的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒对于食源性致病菌的检测限为10¹-10³CFU/mL。

5.一种检测系统，其特征在于包括：

权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，

以及，检测设备，用以监测在所述试纸条上施加待检样品与免疫多孔金的混合物前后，于所述试纸条的质控线和检测线处的信号变化情况，从而实现对待检样品中目标物的定性和/或定量判断。

6.根据权利要求5所述的检测系统，其特征在于所述检测设备包括试纸条读取仪。

7.如权利要求1-4中任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括：

提供试纸条，包括：

至少取样本垫、检测垫、吸水垫依次设置，并使样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，

将第一抗体和第二抗体分别施加至检测垫上，形成彼此不重合的检测线和质控线；

以及，提供所述的免疫多孔金，包括：

制备纳米银粒子，

取所述纳米银粒子均匀分散于十六烷基三甲基氯化铵水溶液中，并静置1天以上，之后与HAuCl₄溶液充分反应，获得纳米多孔金颗粒，

将所述纳米多孔金颗粒与所述第三抗体充分混合，并以BSA或者酪蛋白封闭，再除去未标记的第三抗体。

8.如权利要求7所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括：将柠檬酸三钠、鞣酸和AgNO₃在水相反应体系中240-250℃恒温回流加热，获得所述纳米银粒子，所述鞣酸包括单宁酸。

9.一种检测方法，其特征在于包括：

提供权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，

将液态的待检样品与免疫多孔金混合后，再施加至所述试纸条上，

以及，以裸眼判读和/或试纸条读取仪检测作为检测手段，对样品内的目标物进行定性和/或定量判断。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于具体包括：将免疫多孔金与液态的待检样品充分混合后，再滴加到试纸条的样本垫上，经设定时间后，通过裸眼观察试纸条上检测线和质控线的颜色变化，定性分析待检样品中是否存在目标物，或者以试纸条读取仪记录T、C值和T/C值，并与预先建立的标准曲线对照，从而定量检测待检样品中目标物的含量。