CN112293306A

CN112293306A - 一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法

Info

Publication number: CN112293306A
Application number: CN202011238398.4A
Authority: CN
Inventors: 张钰霆; 陈梦云; 穆景利; 王飞鹏
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN112293306B

Abstract

本发明提供一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法，通过对受精卵的收集、分离和筛选、受精卵的杀菌处理、无菌受精卵的培养和孵化，制备获得无菌海水青鱂仔鱼。本发明制备的无菌海水青鱂仔鱼的孵化率和成活率较高，且杀菌过程对仔鱼的正常发育没有影响。本发明在制备无菌海水青鱂仔鱼的过程中，所需要特殊仪器设备少、成本低、操作方便。本发明制备的无菌海水青鱂仔鱼的体内含细菌量低，约为正常仔鱼体内含细菌量的8.6%，可作为后续环境毒理学实验的材料。

Description

一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法

技术领域

本发明属于生物样品制备领域，具体涉及一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法。

背景技术

海水青鱂（Oryzias melastigma）主要分布在中国，韩国，日本及印度海域。由于海水青鱂小巧的体型、较短的生长周期、较高的繁殖率以及较宽的盐度范围等特点，被国内外认定为海洋鱼类研究的重要模式动物之一。此外，海水青鱂仔鱼具有对环境变化较为敏感，被国际生命科学学会健康和环境科学研究所（HESI）认定为环境毒理学研究的重要工具。

近几年，随着对动物肠道微生物研究的深入，肠道微生物群落对宿主的多种生理调节功能被陆续发现，包括：营养代谢、免疫应答、神经发育和生殖健康等。因此，肠道微生物也被认为是宿主的“第二基因组”和“另一个器官”。在对海水鱼类（如：海水青鱂）进行环境毒理学研究中，往往遇到一个棘手的问题：海水鱼类的肠道微生物群落结构在个体之间差异较大，且与生活环境和区域有较强的相关性。学者们很难排除肠道微生物对宿主的影响，准确且科学地评估环境污染物对海水鱼类的真实毒性作用，并将研究结果推导至不同海区的其他同种生物。其中一个较为合理的解决方法是：制备无菌海水鱼类，在该生物模型上进行环境毒理学的研究。除此以外，无菌海水鱼类的制备还可为研究海水鱼类肠道微生物与宿主之间的相互作用提供方便的材料，对进一步研究海水鱼类肠道微生物和宿主之间关系的内在机制提供可能。因此，迫切需要一种制备无菌海水鱼类仔鱼的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：采用以下技术方案：

（1）受精卵的收集、分离和筛选：前一天下午，将健康活泼的海水青鱂雌雄鱼（雌雄比例1：1）置于洁净的产卵缸中交配产卵。当天早上，收集海水青鳉新受精卵置于无菌培养皿中，用无菌海水冲洗3次。由于海水青鱂受精卵粘性较强，使用无菌手套将受精卵团轻轻揉搓，使得受精卵各个分离。利用体视镜对受精卵进行筛查，挑选受精和发育正常的海水青鳉受精卵。

（2）受精卵的杀菌处理：按以下步骤对受精卵进行杀菌清洗，1）将受精卵浸泡在含有0.008%次氯酸钠的杀菌培养液中5 min，浸泡过程中轻轻摇晃培养皿。2）浸泡完成后，用无菌海水浸泡5 min，浸泡过程中轻轻摇晃培养皿。3）重复步骤1）和2）2次，在保证受精卵健康的情况下，杀灭细菌。4）浸泡完成后，用无菌海水冲洗3次，洗去残留的杀菌培养液。5）将受精卵浸泡在抑菌培养液（含有100 μg/ml氨苄青霉素、5 μg/ml卡那霉素、250 ng/ml两性霉素B）6小时。6）浸泡完成后，用无菌海水冲洗3次；7）将受精卵浸泡在含有0.04%聚乙烯吡咯烷酮的抗生素清洗液中40秒。8）浸泡完成后，用无菌海水冲洗3次，浸泡在含有0.008%次氯酸钠的杀菌培养液中15 min。9）用无菌海水冲洗3次。10）将杀菌完成后的受精卵转移至无菌培养皿中，加入无菌海水，置于无菌培养箱中培养。受精卵密度为20枚/培养皿，培养皿直径60mm；

（3）无菌受精卵的培养和孵化：整个无菌培养孵化过程均在28℃下进行，光周期为14小时，暗周期为10小时。每隔2天用新的无菌海水替换每个培养皿50%体积的旧海水，并将旧海水进行LB涂板培养，对培养皿中的细菌污染情况进行分析。海水青鱂受精卵从受精至孵化大约需要12天。在仔鱼孵化后，随机挑选3-5尾仔鱼进行DNA提取和荧光定量PCR分析，对仔鱼的细菌量（16s rRNA）进行评估。若细菌量极显著低于对照组仔鱼，则可对无菌仔鱼进行后续的环境毒理学实验。

所述无菌海水为盐度为30‰的海水，使用0.22μm滤膜过滤，高压灭菌。使用冷却的无菌海水，配置含有0.008%次氯酸钠的杀菌培养液。取冷却的无菌海水，分别加入ampicillin（氨苄青霉素）、kanamycin（卡那霉素）、amphotericin B（两性霉素B），配制成含有100 μg/ml ampicillin、5 μg/ml kanamycin、250 ng/ml amphotericin B的抑菌培养液。使用冷却的无菌海水，配置含有0.04%聚乙烯吡咯烷酮溶液的抗生素清洗液。对三气培养箱进行75%酒精的全方位杀菌，将玻璃吸管、玻璃培养皿和镊子等工具进行高温灭菌，构建无菌培养环境。

本发明的优点在于：

1、本发明制备的无菌海水青鱂仔鱼的孵化率和成活率较高，且杀菌过程对仔鱼的正常发育没有影响。

2、本发明在制备无菌海水青鱂仔鱼的过程中，所需要特殊仪器设备少、成本低、操作方便。

3、本发明制备的无菌海水青鱂仔鱼的体内含细菌量低，约为正常仔鱼体内含细菌量的8.6%，可作为后续环境毒理学实验的材料。

附图说明

图1 无菌海水青鱂受精卵培养和孵化过程中，培养海水中细菌的监测。

图2 无菌海水青鱂仔鱼孵化后，体内细菌含量的检测。

具体实施方式

实施例1

1.前一天下午，将健康活泼的海水青鱂雌雄鱼（雌雄比例1：1）置于洁净的产卵缸中交配产卵。当天早上，收集海水青鳉新受精卵约30枚置于无菌培养皿中，用无菌海水冲洗3次。使用无菌手套将受精卵团轻轻揉搓，使得受精卵各个分离。利用体视镜对受精卵进行筛查，挑选受精和发育正常的海水青鳉受精卵。

2.（1）将受精卵浸泡在含有0.008%次氯酸钠的杀菌培养液中5min，浸泡过程中轻轻摇晃培养皿。（2）用无菌海水浸泡5 min，浸泡过程中轻轻摇晃培养皿。（3）重复步骤（1）和（2）2次，在保证受精卵健康的情况下，杀灭细菌。（4）用无菌海水冲洗3次，洗去残留的杀菌培养液。（5）将受精卵浸泡在抑菌培养液（含有100 μg/ml氨苄青霉素、5 μg/ml卡那霉素、250 ng/ml两性霉素B）6小时。（6）用无菌海水冲洗3次（7）将受精卵浸泡在含有0.04%聚乙烯吡咯烷酮的抗生素清洗液中40秒。（8）用无菌海水冲洗3次，浸泡在含有0.008%次氯酸钠的杀菌培养液中15 min。（9）用无菌海水冲洗3次。（10）将杀菌完成后的受精卵转移至无菌培养皿中，加入无菌海水，置于无菌培养箱中培养。

3.整个无菌培养孵化过程均在28℃下进行，光周期为14小时，暗周期为10小时。每隔2天用新的无菌海水替换每个培养皿50%体积的旧海水，并将旧海水进行涂板培养，对培养皿中的细菌污染情况进行分析。在仔鱼孵化后，随机挑选4尾仔鱼进行DNA提取和荧光定量PCR分析。细菌16s rRNA引物为：GGGTTGCGCTCGTTGC和ATGGYTGTCGTCAGCTCGTG。荧光定量PCR反应条件为：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 30s，共40个循环；72℃ 10min。此方法参照已发表学术论文：Li J, Cao J, Zhu Y, et al. Global survey of antibioticresistance genes in air[J]. Environmental science & technology, 2018, 52(19):10975-10984. 海水青鱂18s rRNA引物为：CCTGCGGCTTAATTTGACCC和GACAAATCGCTCCACCAACT。荧光定量PCR反应条件为：94℃ 10min；94℃ 20s，60℃ 20s，72℃20s共40个循环；72℃ 10min。荧光定量PCR结果用相对定量ΔΔCT法进行分析和t-test显著性分析。

本发明的方法对海水青鱂受精卵的正常发育影响小，对体内微生物的去除效果好。海水青鱂受精卵成活率高（表1），孵化仔鱼未见畸形。杀菌结束后以及无菌培养和孵化的过程中均未发生细菌污染（附图1）。孵化的仔鱼体内含菌量极显著低于正常的仔鱼，可低至8.6%（附图2）。可用于后续的实验。

采用AB-GZM溶液对斑马鱼胚胎进行灭菌处理。所述 AB-GZM 溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：250ng/mL的两性霉素B、5μg/ mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的链霉素、59μg/mL的所述海盐。我们对AB-GZM和本申请中的灭菌培养液进行对比实验。使用AB-GZM进行灭菌处理，海水青鱂胚胎在6 dpf的存活率为0%（表2）；而使用本申请中的灭菌培养液，海水青鱂胚胎在6 dpf的存活率为100%，并有91.9%的胚胎在12 dpf成功孵化（表1、2）。

表1海水青鱂受精卵成活率。

注：所述正常孵化组是指不进行无菌培养的孵化结果。

表2

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 闽江学院

<120> 一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggttgcgct cgttgc 16

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggytgtcg tcagctcgtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgcggctt aatttgaccc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacaaatcgc tccaccaact 20

Claims

1.一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）受精卵的收集、分离和筛选：前一天下午，将健康活泼的雌雄比例1：1的海水青鱂雌雄鱼置于洁净的产卵缸中交配产卵，当天早上，收集海水青鳉新受精卵置于无菌培养皿中，用无菌海水冲洗3次；利用体视镜对受精卵进行筛查，挑选受精和发育正常的海水青鳉受精卵；

（2）受精卵的杀菌处理：1）将受精卵浸泡在含有0.008wt.%次氯酸钠的杀菌培养液中5min，浸泡过程中轻轻摇晃培养皿；2）将杀菌培养液倒出，加入无菌海水浸泡5 min，浸泡过程中轻轻摇晃培养皿；3）重复步骤1）和2）2次，在保证受精卵健康的情况下，杀灭细菌；4）用无菌海水冲洗3次，洗去残留的杀菌培养液；5）将受精卵浸泡在抑菌培养液6小时；6）用无菌海水冲洗3次；7）将受精卵浸泡在含有0.04wt.%聚乙烯吡咯烷酮的抗生素清洗液中40秒；8）用无菌海水冲洗3次后，将受精卵浸泡浸泡在含有0.008wt.%次氯酸钠的杀菌培养液中15min；9）用无菌海水冲洗3次；10）将杀菌完成后的受精卵转移至无菌培养皿中，加入无菌海水，置于无菌培养箱中培养，受精卵密度为20枚/培养皿；

（3）无菌受精卵的培养和孵化：整个无菌培养孵化过程均在28℃下进行，光周期为14小时，暗周期为10小时；每隔2天用新的无菌海水替换每个培养皿50%体积的旧海水，并将旧海水进行LB涂板培养，对培养皿中的细菌污染情况进行分析；海水青鱂受精卵从受精至孵化需要12天；在仔鱼孵化后，随机挑选3-5尾仔鱼进行DNA提取和荧光定量PCR分析，对仔鱼的细菌量进行评估；当细菌量极显著低于对照组仔鱼，则可对无菌仔鱼进行后续的环境毒理学实验。

2.根据权利要求1所述的一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法，其特征在于：所述抑菌培养液为含有100 μg/ml氨苄青霉素、5 μg/ml卡那霉素、250 ng/ml两性霉素B的无菌海水。