CN106248898B - 利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法 - Google Patents

利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法。本方法通过获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，实现检测待测水体的污染。本方法利用鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，可敏感地监测镉等重金属污染的污染程度和危害程度，还可以敏感检测菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。

Description

利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法
技术领域
本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体污染，更具体地说，本发明涉及一种利用鱼的总蛋白含量检测水体污染程度的方法。
背景技术
随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧。水域中的水体污染物也各有不同，有的为单一污染物，也有多种污染物混合污染。对于未知水域中，不管是单一污染物的污染，还是多种污染物的污染，怎样获悉水体是否被污染，甚至知道其污染程度，并能直观判断该水域的污染对生物的危害已达到何种程度。对于水体中受到重金属或菲一种或两种污染时，用化学方法可以定性、定量检测到污染，但是无法检测其危害性和危害程度以及污染程度的准确性。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法，本方法利用鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，可敏感地监测镉等重金属污染的污染程度和危害程度，还可以敏感检测菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物。
优选的是，所述鱼的总蛋白含量与水体中重金属镉的浓度呈负相关。
优选的是，所述鱼的总蛋白含量与水体中菲的浓度呈负相关。
优选的是，建立鱼的总蛋白含量与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的总蛋白含量与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物浓度。
优选的是，所述标准曲线为鱼的总蛋白含量与重金属镉浓度关系的曲线，或者鱼的总蛋白含量与菲浓度关系的曲线。
优选的是，采用微量凯式定氮法测定全鱼总蛋白含量。
优选的是，所述采用微量凯式定氮法测定全鱼总蛋白含量的步骤如下：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、消化：称取待测样本0.5-1g于500ml凯式烧瓶中，依次加入20ml浓H2SO4、10g K2SO4及0.5g CuSO4，并加入2-10颗玻璃珠；将凯式烧瓶置于定氮仪中消化，直至液体蓝绿透明后，微沸30min；室温放凉，于100ml容量瓶蒸馏水定容，得测定消化液；将待测样本替换为蒸馏水，重复上述步骤，得对照消化液，作为空白对照；
步骤三、将测定消化液和对照消化液分别蒸馏：在水蒸气发生瓶内加蒸馏水至2/3处，依次加入3滴对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，10ml浓硫酸，2-10颗玻璃珠；加热后，产生的蒸汽经反应管至冷凝管；反应管依次加入测定消化液10ml，氢氧化钠10ml；将一只盛有浓度为40g/L的硼酸10ml和2滴指示剂的50ml锥形瓶置于冷凝管下端，冷凝管插入锥形瓶液面以下用于收集氨；当50ml锥形瓶中硼酸由紫色变成绿色时，开始计时5min；然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用蒸馏水清洗冷凝管口，再蒸馏1min，以尽量减少管壁残留导致的误差，并防止倒吸，完成测定消化液蒸馏；将测定消化液替换为对照消化液，重复上述步骤，完成对照消化液蒸馏；
步骤四、分别滴定测定消化液和对照消化液蒸馏后收集到的氨：用浓度为0.01mol/L的盐酸标准溶液，滴定从50ml锥形瓶内收集的氨，直至H3BO3指示剂混合液由绿色转为淡紫色，停止，并记录滴定测定消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为测定滴定体积，而滴定对照消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为空白滴定体积；根据如下公式计算全鱼总蛋白含量：
优选的是，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65％的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离心用冷冻离心机，离心力为11028g,4℃，离心10min。
优选的是，所述步骤二中称取待测样本1g，所述步骤三中的指示剂为0.1％甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1％甲基红乙醇溶液200ml混合配成的。
优选的是，所述鱼为海水青鳉或淡水青鳉。
本发明至少包括以下有益效果：本发明以水域中鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，通过对比总蛋白含量就可以检测出水体是否受到污染，不但检测准确和敏感，而且直观反映该水域的污染对生物的危害程度。特别是鱼的总蛋白含量与水体中重金属镉或菲的一种或两种的浓度均呈负相关，所以检测到鱼的总蛋白含量越低，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到重金属镉或菲的一种或多种的污染。通过建立鱼的总蛋白含量与重金属镉浓度关系的标准曲线，或者鱼的总蛋白含量与菲浓度关系的曲线，可以将待检测水域中与建立标准曲线同种同大小的鱼的总蛋白含量比对，获得水域中重金属镉浓度或菲浓度或综合污染浓度值，并且能反映出目前的污染程度对生物是否在安全范围或受到危害。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。
实施例1
本方案利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，通过检测鱼的总蛋白含量，然后比对同类同大小的鱼的总蛋白含量与某污染物浓度关系的标准曲线，就可以检测出水体是否受到某污染物的污染，不但检测准确，且敏感度高，而且能直观反映该水域的某污染物的污染程度及其对生物的危害程度。
实施例2
本方案利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，根据鱼的总蛋白含量与水体中重金属镉的浓度呈负相关，通过测定鱼的总蛋白含量，然后比对同类同大小的鱼的总蛋白含量与镉浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的总蛋白含量比正常情况下的同类同大小的鱼的总蛋白含量低，则判断水域受到镉的污染；如果比正常情况下的同类同大小的鱼的总蛋白含量越低，则判断水域的镉污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
实施例3
本方案利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，根据鱼的总蛋白含量与水体中菲(Phe)等多环芳烃的浓度呈负相关，通过测定鱼的总蛋白含量，然后比对同类同大小的鱼的总蛋白含量与菲浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的总蛋白含量比正常情况下的同类同大小的鱼的总蛋白含量低，则判断水域受到菲的污染；如果比正常情况下的同类同大小的鱼的总蛋白含量越低，则判断水域的菲污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
实施例4
本方案利用鱼的总蛋白含量检测水体污染的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的总蛋白含量与某污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的总蛋白含量与所述标准曲线比对，得到待检测水域中某污染物的浓度。
通过实验建立鱼的总蛋白含量与重金属镉浓度关系的标准曲线如下：
本实验的检测样本以海水青鳉为例，分十组,每组3个平行在下述各组镉浓度中进行养鱼实验,养鱼结束每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的总蛋白含量大小。各组镉浓度分别为0，80，160，240，320，400，480，560，640，720μg/L，养殖条件是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天投喂饲料三次，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体镉的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(暂存保鲜)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组总蛋白含量分别是：24.89、24.33、23.49、20.89、17.76、16.16、14.63、13.26、12.93、12.48(％)。海水青鳉的总蛋白含量与水体中重金属镉的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
通过实验建立鱼的总蛋白含量与菲(Phe)浓度关系的标准曲线如下：
本实验的检测样本以海水青鳉为例，分五组，每组3个平行在下述各组菲浓度中进行养鱼实验，养鱼结束每个平行取3尾鱼测定样品，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的总蛋白含量大小。各组菲浓度分别为0、250、500、750、1000μg/L，养殖条件是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天三次投喂饲料，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体菲的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(暂存保鲜)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组总蛋白含量分别是：24.333、19.437、17.618、15.633、13.933(％)。海水青鳉的总蛋白含量与水体中菲(Phe)的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
测定待测水域中的海水青鳉的总蛋白含量的具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、消化：称取待测样本1g于500ml凯式烧瓶中，依次加入20ml浓H2SO4、10gK2SO4及0.5g CuSO4，并加入2-10颗玻璃珠；将凯式烧瓶置于定氮仪中消化，直至液体蓝绿透明后，微沸30min；室温放凉，于100ml容量瓶蒸馏水定容，得测定消化液；将待测样本替换为蒸馏水，重复上述步骤，得对照消化液，作为空白对照；
步骤三、将测定消化液和对照消化液分别蒸馏：在水蒸气发生瓶内加蒸馏水至2/3处，依次加入3滴对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，10ml浓硫酸，2-10颗玻璃珠；加热后，产生的蒸汽经反应管至冷凝管；反应管依次加入测定消化液10ml，氢氧化钠10ml；将一只盛有浓度为40g/L的硼酸10ml和2滴指示剂的50ml锥形瓶置于冷凝管下端，冷凝管插入锥形瓶液面以下用于收集氨；当50ml锥形瓶中硼酸由紫色变成绿色时，开始计时5min；然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用蒸馏水清洗冷凝管口，再蒸馏1min，完成测定消化液蒸馏；将测定消化液替换为对照消化液，重复上述步骤，完成对照消化液蒸馏；其中，指示剂为0.1％甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1％甲基红乙醇溶液200ml混合配成的；
步骤四、分别滴定测定消化液和对照消化液蒸馏后收集到的氨：用浓度为0.01mol/L的盐酸标准溶液，滴定从50ml锥形瓶内收集的氨，直至H3BO3指示剂混合液由绿色转为淡紫色，停止，并记录滴定测定消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为测定滴定体积，而滴定对照消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为空白滴定体积；根据如下公式计算全鱼总蛋白含量：
然后将计算得海水青鳉的总蛋白含量大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
实施例5
利用实验可以建立任何水体任何鱼种的鱼的总蛋白含量与重金属镉浓度关系的标准曲线，或者建立不同种类的鱼的总蛋白含量与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
测定待测水域中的鱼的总蛋白含量具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g,4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、消化：称取待测样本0.5g于500ml凯式烧瓶中，依次加入20ml浓H2SO4、10gK2SO4及0.5g CuSO4，并加入2-10颗玻璃珠；将凯式烧瓶置于定氮仪中消化，直至液体蓝绿透明后，微沸30min；室温放凉，于100ml容量瓶蒸馏水定容，得测定消化液；将待测样本替换为蒸馏水，重复上述步骤，得对照消化液，作为空白对照；
步骤三、将测定消化液和对照消化液分别蒸馏：在水蒸气发生瓶内加蒸馏水至2/3处，依次加入3滴对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，10ml浓硫酸，2-10颗玻璃珠；加热后，产生的蒸汽经反应管至冷凝管；反应管依次加入测定消化液10ml，氢氧化钠10ml；将一只盛有浓度为40g/L的硼酸10ml和2滴指示剂的50ml锥形瓶置于冷凝管下端，冷凝管插入锥形瓶液面以下用于收集氨；当50ml锥形瓶中硼酸由紫色变成绿色时，开始计时5min；然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用蒸馏水清洗冷凝管口，再蒸馏1min，完成测定消化液蒸馏；将测定消化液替换为对照消化液，重复上述步骤，完成对照消化液蒸馏；其中，本步骤所用指示剂为0.1％甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1％甲基红乙醇溶液200ml混合配成的；
步骤四、分别滴定测定消化液和对照消化液蒸馏后收集到的氨：用浓度为0.01mol/L的盐酸标准溶液，滴定50ml锥形瓶内收集的氨，直至H3BO3指示剂混合液由绿色转为淡紫色，停止，并记录滴定测定消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为测定滴定体积，而滴定对照消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为空白滴定体积；根据如下公式计算全鱼总蛋白含量：
将计算得鱼的总蛋白含量大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
实施例6
利用实验建立20日龄的淡水青鳉的总蛋白含量与重金属镉浓度关系的标准曲线、总蛋白含量与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
取得待测水域中20日龄的淡水青鳉做样本，然后测定待测水域中的该鱼的总蛋白含量具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、消化：称取待测样本1g于500ml凯式烧瓶中，依次加入20ml浓H2SO4、10gK2SO4及0.5g CuSO4，并加入2-10颗玻璃珠；将凯式烧瓶置于定氮仪中消化，直至液体蓝绿透明后，微沸30min；室温放凉，于100ml容量瓶蒸馏水定容，得测定消化液；将待测样本替换为蒸馏水，重复上述步骤，得对照消化液，作为空白对照；
步骤三、将测定消化液和对照消化液分别蒸馏：在水蒸气发生瓶内加蒸馏水至2/3处，依次加入3滴对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，10ml浓硫酸，2-10颗玻璃珠；加热后，产生的蒸汽经反应管至冷凝管；反应管依次加入测定消化液10ml，氢氧化钠10ml；将一只盛有浓度为40g/L的硼酸10ml和2滴指示剂的50ml锥形瓶置于冷凝管下端，冷凝管插入锥形瓶液面以下用于收集氨；当50ml锥形瓶中硼酸由紫色变成绿色时，开始计时5min；然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用蒸馏水清洗冷凝管口，再蒸馏1min，完成测定消化液蒸馏；将测定消化液替换为对照消化液，重复上述步骤，完成对照消化液蒸馏；其中，本步骤所用指示剂为0.1％甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1％甲基红乙醇溶液200ml混合配成的；
步骤四、分别滴定测定消化液和对照消化液蒸馏后收集到的氨：用浓度为0.01mol/L的盐酸标准溶液，滴定50ml锥形瓶内收集的氨，直至H3BO3指示剂混合液由绿色转为淡紫色，停止，并记录滴定测定消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为测定滴定体积，而滴定对照消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为空白滴定体积；根据如下公式计算得全鱼总蛋白含量为20.01％：
将计算得鱼的总蛋白含量大小，分别比对总蛋白含量与重金属镉浓度关系的标准曲线、总蛋白含量与菲浓度关系的标准曲线，得到待测水域的镉污染浓度为255μg/L，菲浓度为237μg/L。通过比对确定是否为单一污染或混合污染；这样既可以知道水体已受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地另行修改他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (6)

1.一种利用鱼的总蛋白含量检测水体菲污染的方法，其特征在于，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的总蛋白作为敏感生物标记物，所述鱼的总蛋白含量与水体中菲的浓度呈负相关，建立鱼的总蛋白含量与菲浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的总蛋白含量与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体菲浓度。
2.根据权利要求1所述的利用鱼的总蛋白含量检测水体菲污染的方法，其特征在于，采用微量凯式定氮法测定全鱼总蛋白含量。
3.根据权利要求2所述的利用鱼的总蛋白含量检测水体菲污染的方法，其特征在于，所述采用微量凯式定氮法测定全鱼总蛋白含量的步骤如下：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、消化：称取待测样本0.5-1g于500ml凯式烧瓶中，依次加入20ml浓H2SO4、10gK2SO4及0.5g CuSO4，并加入2-10颗玻璃珠；将凯式烧瓶置于定氮仪中消化，直至液体蓝绿透明后，微沸30min；室温放凉，于100ml容量瓶蒸馏水定容，得测定消化液；将待测样本替换为蒸馏水，重复上述步骤，得对照消化液，作为空白对照；
步骤三、将测定消化液和对照消化液分别蒸馏：在水蒸气发生瓶内加蒸馏水至2/3处，依次加入3滴对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，10ml浓硫酸，2-10颗玻璃珠；加热后，产生的蒸汽经反应管至冷凝管；反应管依次加入测定消化液10ml，氢氧化钠10ml；将一只盛有浓度为40g/L的硼酸10ml和2滴指示剂的50ml锥形瓶置于冷凝管下端，冷凝管插入锥形瓶液面以下用于收集氨；当50ml锥形瓶中硼酸由紫色变成绿色时，开始计时5min；然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用蒸馏水清洗冷凝管口，再蒸馏1min，完成测定消化液蒸馏；将测定消化液替换为对照消化液，重复上述步骤，完成对照消化液蒸馏；
步骤四、分别滴定测定消化液和对照消化液蒸馏后收集到的氨：用浓度为0.01mol/L的盐酸标准溶液，滴定从50ml锥形瓶内收集的氨，直至H3BO3指示剂混合液由绿色转为淡紫色，停止，并记录滴定测定消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为测定滴定体积，而滴定对照消化液收集的氨所用的盐酸标准溶液体积为空白滴定体积；根据如下公式计算全鱼总蛋白含量：
4.根据权利要求3所述的利用鱼的总蛋白含量检测水体菲污染的方法，其特征在于，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65％的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离心用冷冻离心机，离心力为11028g,4℃，离心10min。
5.根据权利要求3所述的利用鱼的总蛋白含量检测水体菲污染的方法，其特征在于，所述步骤二中称取待测样本1g，所述步骤三中的指示剂为0.1％甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1％甲基红乙醇溶液200ml混合配成的。
6.根据权利要求1-5任一项所述的利用鱼的总蛋白含量检测水体菲污染的方法，其特征在于，所述鱼为海水青鳉或淡水青鳉。
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